Summary
على الرغم من أن الكثير من الحشرات في رتيبات هيتيروبتيرا (الحشرات: Hemiptera) هي سام وتركيبتها السم ومهام تلك السموم السم في معظمها غير معروف. ويصف هذا البروتوكول أساليب حصاد السموم هيتيروبتيران لمزيد من توصيف، استخدام اليكتروستيموليشن، والتحرش، وتشريح الغدة.
Abstract
هيتيروبتيران الحشرات مثل البق الحشاشين (Reduviidae) والبق المياه العملاقة (بيلوستوماتيداي) وينحدر من سلف مشترك المفترسة والسامة، وأغلبية هيتيروبتيرانس موجودة الاحتفاظ بهذه الاستراتيجية التغذوية. وقد انتقلت بعض هيتيروبتيرانس للتغذية على دم الفقاريات (مثل تقبيل البق، Triatominae؛ وبق الفراش، سيميسيداي) في حين أن البعض الآخر قد عادت إلى التغذية على النباتات (معظم بينتاتومومورفا). ومع ذلك، استثناء اللعاب المستخدمة من قبل الخلل تقبيل تيسيرا للتغذية بالدم، والقليل المعروف عن السموم هيتيروبتيران مقارنة بالسموم العناكب والعقارب والثعابين.
عقبة واحدة لتوصيف هيتيروبتيران السم السموم هو هيكل ووظيفة الغدد السم/بنية، على حد سواء معقدة شكلياً وأداء أدوار بيولوجية متعددة (الدفاع والتقاط الفريسة، والهضم خارج الفم). في هذه المقالة، نحن تصف الأساليب الثلاثة أننا قد استخدمت بنجاح لتجميع السموم هيتيروبتيران. أولاً، نقدم electrostimulation فريسة طريقة ملائمة لجمع السم التي غالباً ما تكون قاتلة عندما حقن الحيوانات، والذي يغني عن التلوث من الأنسجة الغدية. ثانيا، نحن تبين أن التحرش لطيف من الحيوانات كافية لإنتاج قذف السم من ململه و/أو البصق في بعض المجموعات من هيتيروبتيرانس السم. ثالثا، نحن تصف أساليب حصاد السم السموم بتشريح الحيوانات فظاعتها الحصول على غدد السم. هذا الأسلوب مكمل للأساليب الأخرى، كما أنها قد تسمح للحصاد من السموم من الأصناف التي اليكتروستيموليشن والمضايقة غير فعالة. هذه البروتوكولات سوف تمكن الباحثين من حصاد السموم من الحشرات هيتيروبتيران لتوصيف وظيفة الهيكل والتطبيقات الممكنة في مجال الطب والزراعة.
Introduction
السموم هيتيروبتيران هي المواد النشطة بيولوجيا حقاً1. على سبيل المثال، يسهل إفرازات السم/اللعاب من هيتيروبتيرا التغذية بالدم مثل تقبيل الحشرات (Triatominae) وبق الفراش (سيميسيداي) تغذية بتعطيل الأرقاء2. السموم في هذه السموم تستهدف مسارات متعددة بما في ذلك تخثر الدم، وتراكم الصفائح الدموية وتضيق الأوعية، فضلا عن الألم وحكة مسارات. يتم تكييف السموم من معظم الأنواع الأخرى هيتيروبتيران تيسيرا لافتراس بدلاً من تغذية الدم. هذه السموم تسبب الشلل، الموت وتسييل الأنسجة عند حقنها في اللافقاريات3،4. السم عند حقن الفقريات، كما قد آثار جذرية. على سبيل المثال، يؤدي الحقن بالسم من خلل قاتل إينيسي هولوتريتشيوس في الفقاريات الألم وشلل العضلات ونزيف؛ ويموت انفينوماتيد الفئران بهذا الخلل بسرعة بسبب شلل الجهاز التنفسي5.
وأظهرت الدراسات ترانسكريبتوميك والبروتين تكوين البروتين من بعض السموم هيتيروبتيران. السموم أنواع المفترسة غنية في البروتياز، والأنزيمات، والببتيدات والبروتينات غير معروف هيكل ووظيفة6،،من78الأخرى. تقبيل علة السم غنية بالبروتين تريابين الأسرة، وأعضاؤها تؤثر تأثيراً عميقا في تخثر الدم والصفيحات التجميع وتضيق الأوعية2،9. ومع ذلك، فإنه لا يعرف السموم التي تكمن وراء معظم بيواكتيفيتيس من السم. على سبيل المثال، أبلغ السم الشوائب تقبيل Triatoma عن مسكن وتمنع قنوات الصوديوم10، ولكن تظل العناصر المسؤولة توضيح. وبالمثل، فإنه لا يعرف ما المكون (المكونات) السم خطأ قاتل يسبب الشلل أو الألم. شرط أساسي لتحديد مسؤولية بيواكتيفيتيس السم خاصة، ووصف هيكل ووظيفة رواية السم السموم، السموم هو الحصول على السم.
وقد تم الحصول على السم من هيتيروبتيرانس electrostimulation5،6،7،8،11،،من1213، اﻻستفزاز من موقف دفاعي الردود4،8، ميكانيكيا عصر الصدر12،14،،من1516، تشريح بالسم الغدد8،17 ،،من1819،20،،من2122، والتطبيق ليضع مستقبلات أستيل المسكارينيه23. الحكم على مزايا وعيوب أي وسيلة محتملة يعقدها مورفولوجية الغدد السم هيتيروبتيران، والتي تتكون من غدة الرئيسي مع لومن منفصلة اثنين، الغدة الرئيسية الأمامي (AMG) والغدة الرئيسية الخلفي (فريق رصد السلام)، فضلا عن ترتبط الغدة التبعي (AG). هذه المقصورات الغدة مختلفة تنتج إفرازات البروتينات المختلفة، التي قد تكون متخصصة لمختلف الوظائف البيولوجية بما في ذلك القبض على الفريسة والدفاع والهضم خارج الفم8،17. في البق قاتل بيرتيني واكتريتشودييني، ارتبطت AMG مع التقاط الفريسة وفريق رصد السلام مع الهضم خارج الفم17. بيد في هارباكتوريني علة بلاجيبينيس بريسثيسانكوس فريق رصد السلام متخصصة لالتقاط الفريسة والهضم بينما هو الافتراض AMG لإفراز السم دفاعية8. ووصف النائب العام كوجود وظيفة افرازية قليلاً في البق قاتل8 أو كموقع رئيسي لتخزين حوزتي في البق المياه العملاقة23. ومن الواضح أن المزيد من العمل مطلوب لتوضيح وظيفة كل حجرة الغدة بين مختلف المجموعات الفرعية هيتيروبتيران، وتحديد وظيفة معظم السم السموم. في هذا التقرير يصف لنا البروتوكولات لحصاد السم السموم من هيتيروبتيرانس نحو تحقيق هذا الهدف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هذا البروتوكول تمتثل السياسة "جامعة كوينزلاند" المبينة في الرعاية المسؤولة واستخدام الحيوانات في التدريس والبحث (PPL 4.20.11)، فضلا عن الصحة الوطنية ومجلس البحوث الطبية في المدونة الأسترالية للرعاية واستخدام الحيوانات لأغراض علمية (8th طبعة عام 2013).
تنبيه: الحرص على عدم تكون انفينوماتيد عند التعامل مع الأخطاء قاتل. الحرص على حماية العينين عند التعامل مع الأنواع التي يبصقون السم دفاعيا. رعاية في جميع أنحاء لا تصيب الحيوانات التجريبية. ويشمل هذا الرصد للضغط على قيود مثل الأربطة المطاطية، وضمان أن ململه لم يتم كسر.
ملاحظة: بشكل اختياري، تخدير الحيوانات قبل التعرض ل أول أكسيد الكربون2 0.5-2 دقيقة أو التبريد إلى 4-10 درجة مئوية قبل الحصاد السم في يهدف 1-3 لتسهيل نقل آمنة وضبط النفس. التنويم غير مطلوب تماما ولكن قد يسهل ضبط النفس الآمنة للعينات السريع أو قوية. ومع ذلك، يجب أن تكون الحيوانات مستيقظا للسماح لحصاد السم. تبقى التطبيقات المتلقين للمعلومات في الاعتبار عند اتخاذ قرار بإضافة مثبطات البروتياز أم لا.
1-حصاد السم السموم التي اليكتروستيموليشن
- الحصول على عينات حية لحصاد السموم منه.
- استخدام ملاقط بلاستيكية معدّة سلفا مع أقطاب الإيجابية والسلبية التي شنت على أي تلميح. قم بتوصيل ملاقط مكهرب اليكتروستيمولاتور أو مصدرا للجهد المستمر الذي يسمح التعديل للجهد.
- الصغيرة (~ 10 مم) والكبيرة (~ 25 مم) قاتل البق، تستخدم الفولتية ذروة 15 و 25 الخامس على التوالي.
- لأكبر هيتيروبتيرانس مثل البق المياه العملاقة، استخدام يصل إلى 40 الخامس.
- كبح جماح البق يعيش بالربط منها إلى النظام الأساسي، باستخدام شريط المطاطي عبر الصدر.
- مكان غيض ململه في تلميح جمع مناسبة. قاتل الأخطاء، استخدام تلميح ماصة P200. للأخطاء المياه العملاقة، قص أقصى قبالة تلميح P200 لزيادة حجم الفتحة.
- بلطف مع زوج مغلقة من ملاقط نظيفة ململه رفع ودفع الفتحة مفتوحة من طرف جمع أكثر من نهاية ململه.
- إذا رغبت في ذلك، امتصاص ~ 5 ميليلتر الماء عالي النقاوة قبل وضع في ململه في جمع معلومات سرية. وهذا يقلل خسائر السم المتبقية داخل معلومات سرية، على الرغم من أن السم المقطوع سوف تضعف.
- تطبيق اليكتروستيموليشن. تراجع أقطاب كهربائية محفزة في هلام موصلة، مثل الجلسرين NaCl/50% 2.5 م. تطبيق أقطاب كهربائية للصدر. بيلوستوماتيدس، لا تنطبق قطبين الظهرية السطح الخلفي من الرأس.
- تخزين السم لمنع أوتوديجراديشن. بعد هو مقذوف السم، بسرعة نقلها إلى أنبوب في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية، أو أنبوب يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز.
- كرر الخطوات من 1.5 و 1.6 حتى يكتسب السم كافية أو لا السم آخر المقبلة.
2-حصاد السم السموم بالتحرش
- إعداد الحيوانات لحصاد السم ومكان غيض من ململه في دهليز جمع، كما هو موضح في الأقسام الفرعية 1.1 و 1.3-1.4.
- إذا كان السم هو مقذوف تلقائياً، انتقل إلى الخطوة 2، 3. إذا لم يكن الأمر كذلك، مضايقة الحيوانات بلطف لمسها في البطن والساقين وهوائيات مع الملقط حتى يتم إنتاج السم.
- بسرعة نقل السم لأنبوب في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية، أو أنبوب يحتوي على مبطلات مثبط كوكتيل، إذا رغبت في ذلك.
3-حصاد السم السموم بالمضايقة من السم "البصق" الأنواع
- تخدير أو تخدير جزئيا، الحشرة قبل إزالته من مرفقها لمنع أي البصق دفاعي سابق لأوانه.
- إثارة السم البصق السلوك. احتواء وتغيير موضع الحشرة باستخدام غطاء عميق على مستوى 90 × 16 مم طبق بيتري. عقد الغطاء الخلفي قليلاً و 1-4 سم فوق الحشرة للحيلولة دون هروب. معظم الحشرات سوف يبصقون عدة مرات، وكثيراً ما في تتابع سريع. كفالة يتم جمع جميع السم على الجزء السفلي الطبق.
- جمع السم على الجزء السفلي صحن بيتري قبل الشطف مع 10 ميليلتر من الماء عالي النقاوة. نقل بسرعة إلى أنبوب في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية، أو أنبوب يحتوي على كوكتيل مثبط البروتياز.
4-حصاد السم السموم بتشريح الغدة
- التضحية بالحيوانات. تخدير بشدة أو قتل الحيوانات باستخدام > 5 دقائق التعرض لأول أكسيد الكربون2. أنابيب خالصة CO2 مباشرة في الهواء-ثقوب الضميمة الإسكان للحيوان.
- رقم التعريف الشخصي للحشرات إلى علبة تشريح. لقاتل البق، تشريح عبر السطح البطني (4.3). لعملاق المياه البق، تشريح من خلال سطح الظهرية (4.4).
- التشريح البطني
- إدراج ثلاثة دبابيس في البطن الخلفي باستمرار الحشرات دون ثقب في الغدد السم.
- قص شق خط الوسط قصيرة في السطح البطني للبطن باستخدام مشرط مصغرة. استخدام مقص مصغرة لتوسيع شق خط الوسط الأسفل للرأس، مع الحرص على خفض الهيكل الخارجي فقط ولا تضر الهياكل الداخلية.
- للكشف عن الهياكل الداخلية، إجراء تخفيضات جانبية متعددة تمتد من شق خط الوسط إلى جانب الحشرة. ثم، دبوس مرة أخرى كل رفرف البطني الهيكل الخارجي للكشف عن الهياكل الداخلية.
- لكبير قاتل البق، جعل أربعة شقوق جانبية، في البطن منتصف البطن، الأمامي، بين الساقين الأولى والثانية، وأمام المحطة الأولى.
- تشريح الظهرية
- إزالة أجنحة قرب القاعدة. إدراج ثلاثة دبابيس في البطن الخلفي باستمرار الحشرات دون ثقب في الغدد السم.
- قص شق خط الوسط من الرأس إلى البطن باستخدام مقص مصغرة والمبضع، مع الحرص على خفض الهيكل الخارجي فقط ولا تضر الهياكل الداخلية.
- قوة إلى جانب النصفي للحشرة. ضع عدة دبابيس أفقياً على طول الحشرة ترك تجويف داخلي مكشوف.
- إزالة عضلات الطيران باستخدام الملقط.
- الفيضانات في علبة تشريح. إضافة برنامج تلفزيوني حتى الأخطاء هي مغمورة للسماح بتعويم حتى الهياكل الداخلية وتصور بسهولة أكبر.
- استخدام الملقط، والمقص الصغير، بعناية إزالة الضام والنسيج العصبي والقصبة الهوائية. تظهر غدد السم ممدود، الهياكل الشفافة التي تمتد على طول كل جانب من القناة الهضمية.
- تحديد الغدة الرئيسية بمظهره المميزة، مع الفصوص الأمامي والخلفي وهما القنوات اجتماعها نقير.
- إذا رغبت في ذلك، تحديد الغدة التبعي عن طريق تتبع القناة من نقير. مجاناً الغدة الرئيسية بقطع القنوات اثنين المنبثقة عن نقير.
- حصاد لومن الغدة المرجوة. نقل الغدة إلى ميكروسينتريفوجي على الجليد التي تحتوي على 30 ميليلتر من برنامج تلفزيوني أو برنامج تلفزيوني بالإضافة إلى مثبطات البروتياز كوكتيل. لانس في الغدد بدبوس حاد نظيفة.
- دوامة 10 s وأجهزة الطرد المركزي (1 دقيقة، ز × 5,000، 4 درجة مئوية) إفراغ لومن الغدة. إزالة الأنسجة الغدية استخدام الملقط.
- توضيح استخراج السم. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق، 17,000 ز ×، 4 درجة مئوية) لإزالة أي جزيئات صلبة، الاحتفاظ بالمادة طافية ونبذ بيليه. تخزين في-20 درجة مئوية أو-60 درجة مئوية لمنع تدهور أوتوبروتيوليتيك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعض أنواع هيتيروبتيران، مثل هارباكتوريني P. بلاجيبينيس وريدوفييني رهادامانثوس بلاتيميريس، العائد موثوق بها كميات كبيرة (5-20 ميليلتر) من السم وردا على اليكتروستيموليشن (الجدول 1). بشكل عام، تعطي معظم الأخطاء بيرتيني، ريدوفييني، وهارباكتوريني السم في الاستجابة لهذا الأسلوب. بين البق ستينوبوديني، أثارت اليكتروستيموليشن السم من أونكوسيفالوس sp. ولكن لا ثوديلموس sp. البق هولوبتيليني واميسيني عينات لم تسفر عن السم كبيرة (مثل ما يكفي لتحليل الطيف الكتلي) ردا على اليكتروستيمولاتيون. يمكن أيضا استخدام اليكتروستيموليشن حصاد السم من الأخطاء بيلوستوماتيد وستينكبوجس المفترسة. بيد اليكتروستيموليشن العقارب المائية (نبيد) الناجم عن الإفراج عن محتويات الغدد الرأسي فقط، بدلاً من السم من ململه. فشل حصاد السم من اليكتروستيموليشن في بعض الأنواع الأكثر احتمالاً بسبب تعقيد المورفولوجية غدد السم والآليات الفيزيولوجية التحكم في إطلاق السم8.
بالإضافة إلى الإفراج عن السم بسبب اليكتروستيموليشن، ريدوفييدس P. بلاجيبينيس، روفوفاريوس هافينثوس، P. رهادامانثوس وبيلوستوماتيد ديستينكتيفيمور ليثوسيروس، إرادة عفوية إخراج السم من ململه أثناء المناولة. كثيرا ما يرافق هذا قذف السم يعرض الدفاعية. رهادامانثوس P. كما يبصق السم دفاعيا4، وسلوك الذي يحدث في24 والعناكب الأفاعي25 ولكن من الذي نحن لا يدركون في أي من الأنواع الأخرى الرضوفي.
تجارب الحزب الديمقراطي الصربي صفحة والبروتيوميات تدلل على أن السموم تحصد electrostimulation والتحرش7،،الغنية بالبروتين68. البروتينات تستأثر بنسبة كبيرة في الوقت الحاضر المادي، على الرغم من أنه من المرجح أيضا أن السموم تحتوي على الأيونات غير العضوية وغيرها من المواد. السم قاتل الأخطاء التي حصل عليها اليكتروستيموليشن والتحرش عادة يحتوي على أكثر من مائة الببتيدات والبروتينات (الشكل 1و الشكل 2). السم بيلوستوماتيد قيل سابقا أن تكون غنية في ليسوفوسفوليبيدس13. طيف امتصاص الأشعة تحت الحمراء للسم من الشوائب المياه بيلوستوماتيني اكوس ديبلونيتشوس التي تتفق مع محتوى من البروتينات وليسوفوسفوليبيدس. ليثوسيريني ل. ديستينكتيفيمور، عثر على أدلة فقط للبروتين ولا ليسوفوسفوليبيدس6.
كما ذكرت ل السموم العنكبوت26، السم حصادها من الحشرات هيتيروبتيران من المرجح أن تختلف في تركيز وتكوينها، اعتماداً على الحشرة المستخدمة والطريقة التي يتم حصادها. مطيافية الأشعة فوق البنفسجية من عينات السم المخفف وتقترح امتصاص القيم (280) من 50-250 (طول المسار 10 ملم) للسم غير مخفف، تمشيا مع تركيز عالي بروتين ~ 50-250 ملغ/مل7،،من1219. أبلغ فريسة الحرمان يسبب الزيادة المتتالية في السم تركيز ومشلول المحتملة3 ، فضلا عن انخفاضات متتالية في الأس الهيدروجيني27. ومع ذلك، الجوع فترات طويلة سيؤدي إلى فقدان الشرط والموت. فضلا عن تركيز، قد يؤثر على الطريقة التي يتم حصادها السم من هيتيروبتيرانس تشكيلها. تكوين السم السم من خلل قاتل بلاجيبينيس P. تختلف اختلافاً ملحوظا اعتماداً على إذا أنه كان حصاد electrostimulation أو التحرش8. في حالة بلاجيبينيس P.، أبدى هذا بسبب اليكتروستيموليشن مما أسفر عن محتويات فريق رصد السلام، بينما التحرش أسفرت عن محتويات AMG. السم التي حصلت عليها اليكتروستيموليشن، ولكن ليس من التحرش وفريسة مشلولة حقاً الحشرات (الشكل 3). بيد أنه من غير الواضح إلى أي مدى يمكن أن يعمم هذه النتيجة إلى أخرى Reduviidae أو هيتيروبتيرا أخرى.
حصاد السم مباشرة بتشريح الغدد السم يسمح التحكم آليات غدد السم التحايل عليها، على حساب تلوث مع بروتينات الأنسجة الغدية (غير السم). بغض النظر، يمكن استخدام مقتطفات من مادة تشريح لفحوصات بيواكتيفيتي/سمية. على سبيل المثال، مقتطفات من فريق رصد السلام، AMG و AG بلاجيبينيس P.، أعدت باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه، وحللت باستخدام كروماتوغرافيا سائلة/جنبا إلى جنب الكتلي8. وحدد هذه العملية ما مجموعة 182، 114، والبروتينات 71 في المجموع، التي صنفت 45 و 51، و 12 كالبروتينات السم المفترضة استناداً إلى خصائص تسلسل الأحماض الأمينية، مع البروتينات المتبقية تصنف البروتينات التدبير المنزلي المفترضة. الحقن بمقتطفات من فريق رصد السلام، ولكن لا AMG أو AG، في الحشرات أدت إلى الشلل والموت8.
| إينفراوردير | الأسرة | الفصيلية | اسم ثنائي الحد | الاسم الشائع | اليكتروستيموليشن | التحرش | تشريح |
| سيميكومورفا | Reduviidae | هارباكتوريناي | بلاجيبينيس بريسثيسانكوس | خطأ قاتل بريسبان المشتركة | √ | √ | √ |
| روفوفاريوس هافينثوس | خطأ قاتل النمر الأحمر | √ | √ | √ | |||
| أريناسيا سسيبينيا | الأحمر علة قاتل شوكي | √ | وفيات المواليد | √ | |||
| جميناتوس spp. | خطأ قاتل البرتقال الكبيرة | √ | وفيات المواليد | √ | |||
| أسبيريكوليس تراتشيليستيس | خطأ قاتل حمراء صغيرة | √ | وفيات المواليد | وفيات المواليد | |||
| ريدوفييناي | بلاتيميريس spp. | خطأ قاتل الأفريقية العملاقة | √ | √ | √ | ||
| هريدا بسيتالا | خطأ قاتل شوكي | √ | وفيات المواليد | √ | |||
| بيرتيني | اكتوموكوريس spp. | خطأ قاتل أرضية برتقالية | √ | وفيات المواليد | √ | ||
| بيراتيس spp. | علة قاتل السوداء | √ | وفيات المواليد | وفيات المواليد | |||
| ستينوبودايناي | أونكوسيفالوس spp. | - | √ | وفيات المواليد | √ | ||
| ثوديلموس spp. | - | x | وفيات المواليد | √ | |||
| هولوبتيليناي | بتيلوكنيموس يمور | علة تدب ريشة | x | x | وفيات المواليد | ||
| اميسيناي | ستينوليموس spp. | علة تدب على الموضوع | x | x | x | ||
| بينتاتومومورفا | بينتاتوميداي | أسوبيناي | همتى أميوتيا | علة نتن المفترسة أصفر | √ | وفيات المواليد | وفيات المواليد |
| نيبومورفا | نبيد | راناتريناي | ديسبار راناترا | عقرب المياه | x، والفريق الاستشاري | x | √ |
| بيلوستوماتيداي | بيلوستوماتيناي | اكوس ديبلونيتشوس | علة الماء | √ | وفيات المواليد | وفيات المواليد | |
| بيلوستوماتيداي | ليثوسيريناي | ليثوسيروس sp. | عملاق المياه الشوائب | √ | √ | √ | |
| التجزئة، ناجحة؛ الصليب وناجحة؛ الثانية، عدم تحديدها؛ الفريق الاستشاري، أداء الغدة الرأسي فقط | |||||||
الجدول 1: توفر خصوصية للأساليب المستخدمة لحصاد السم من هيتيروبتيرانس.
الشكل 1 : البروتينات الكشف عنها بواسطة تحليل LC-MS/MS في 2D الحزب الديمقراطي الصربي صفحة البقع والكسور [هبلك] من السم التي جمعت من ص بلاجيبينيس من اليكتروستيموليشن (بروتوكول 1)، عرض البروتياز وفيرة وشبل-المجال البروتينات والبروتينات هيتيروبتيران السم الأسرة 1. هلام الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 2D (A) من النفط الخام السم بلاجيبينيس P. ، عرض الأسر البروتين حددها LC-MS/MS لجل البقع. (ب) [هبلك] chromatogram من تجزئة للسم بلاجيبينيس P. ، عرض الأسر البروتين يحددها التحليل LC-MS/MS للكسور التي تم جمعها. تتكرر مع إذن7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : نسبة تسلسل المنتمين إلى كل فئة رئيسية من البروتين في السم من بلاجيبينيس P.. تتكرر مع إذن7. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : بلاجيبينيس P. السم التي حصل عليها اليكتروستيموليشن، ولكن ليس من التحرش ويشل الحشرات. (أ) تأثير حقن السم التي حصل عليها اليكتروستيموليشن أو المضايقة، أو الماء، على الهروب لعبة الكريكيت. لكل شرط السم، تم حقن السم ميليلتر 0.17 مكافئ في البطن والوقت للهروب غطاء صحن بيتري مقلوبة (في ق، ما يصل إلى 300 s, SD ± يعني) وقد سجل. (ب) الاستجابة للجرعة منحنى لتثبيط النجاح الهروب من السم التي تم الحصول عليها من بلاجيبينيس P. اليكتروستيموليشن. تتكرر مع إذن8. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أن الخطوة الأكثر أهمية في حصاد السم خطأ قاتل واختيار الأسلوب المناسب تبعاً لأغراض الدراسة. كل من الأساليب الثلاثة المقدمة لحصاد هيتيروبتيران السموم على مزايا وعيوب اعتماداً على التطبيقات المتلقين للمعلومات.
حمل البق لطرد السم من ململه (البروتوكولات 1-3) تجنب تلوث السم عن طريق الأنسجة الغدية. وبالإضافة إلى ذلك، هذه الأساليب غير مميتة ويمكن أن تتكرر مرات عديدة على مدى حياة حشرة. اليكتروستيموليشن عادة ما يوفر كميات أكبر من السم، وغلة السم مع سمية قوية فريسة الحشرات وفقا لعدة دراسات5،8. إثارة رد فعل دفاعي هو طريقة أخرى لاستخلاص السم من ململه، والتي قد تسفر عن السم محتوى البروتين المختلفة إلى اليكتروستيموليشن8. ومع ذلك، لا تعمل اليكتروستيموليشن واستفزاز لكثير من الأنواع، ودون تحقيقات موازية للإخراج افرازية في الغدد السم الواضح يجري حصاد التجويف الغدة التي (أو أي تركيبة من لومن الغدة).
حصاد السم بتشريح (البروتوكول 4) مكمل من نواح عديدة. تشريح يمثل وسيلة مباشرة للوصول إلى مخزن السم، ويمكن حصادها بشكل منفصل كل حجرة غدة السم أو تجميع (أيإمكانية أن السم 'خطأ' قد تم حصادها يتم تفاديها). ومع ذلك، الطريقة قاتلة بالإضافة إلى ذلك يؤدي تلوث طفيف من السم بمكونات الأنسجة. هيتيروبتيرا العديد من صغيرة جداً (أو ممدود أيضا في حالة اميسيناي، البق تدب على مؤشر ترابط) للسماح لحصاد السم بالتشريح. إذا تم استخدام تشريح لاستخراج البروتينات من المقصورات الغدة كل على حدة، من الضروري فصل الفصوص سرعة واستخراج محتوياتها بشكل منفصل لتجنب التلوث عبر.
الأساليب المقدمة هنا سوف تحتاج إلى تعديل حسب الأنواع الخاصة التي شملتها الدراسة. لجمع السم اليكتروستيموليشن، الجوانب الرئيسية لتحسين كيفية مقيدة الشوائب. على سبيل المثال، معظم ريدوفييدس قادرة على بسط بهم ململه على مجموعة واسعة من الحركة. هذه الأنواع يمكن أن تكون مقيدة ببساطة الحق-طريقة-متابعة على منصة استخدام شريط المطاطي، وململه افيرتيد يدوياً. للأنواع مع ململه أقل مرونة، مثل بيلوستوماتيدس، بدلاً من ذلك أنها ضرورية لكبح جماح الحشرات في وضع مقلوب وخفض وعاء جمع في الزاوية الصحيحة باستخدام معوجة أو الذراع الميكانيكية. حجم ونمط من الكهرباء تطبق يجب أيضا أن يكون الأمثل، وفي هذه الحالة، من الأفضل أن تبدأ منخفضة وزيادة الجهد المطبق لتجنب الفتك ببطء.
وإذا كان الهدف من دراسة لتحقيق فهم مفصل كيف تنتج نوع معين ويستخدم السم، تحقيقا متعمقا الجمع بين عدة الحصاد الأساليب، فضلا عن التكنولوجيات مثل الطيف الكتلي والتجارب Seq الجيش الملكي النيبالي، وقد يكون مطلوب. إذا كان الهدف استخدام السموم هيتيروبتيران كمكتبات للجزيئات البيولوجية لفحص لبعض النشاط البيولوجي المطلوب، ثم فريق من السم العينات التي حصلت عليها اليكتروستيموليشن، المضايقات، و/أو التشريح قد تكون مناسبة. ومع ذلك، نلاحظ أن دور البيولوجي الطبيعي السم تحصد من المحتمل لتحديد ما هي بيواكتيفيتيس موجودة. على سبيل المثال، السم المستخدمة للافتراس من المرجح أن تحتوي على مركبات مبيدات الحشرات، بينما السم المستخدمة للدفاع من المرجح أن تحتوي على عوامل الجوجينيك (المسببة للألم).
لا أدرجنا الحصاد السم بتطبيق pilocarpine مؤثر مستقبلات أستيل المسكارينيه في هذا البروتوكول. التجارب المستقبلية المطلوبة لتحديد الصفات المميزة لطرد السم الناجم عن بيلوكاربيني مقارنة بالأساليب المذكورة أعلاه.
وقد قدمنا في هذا المقال، الأساليب التي سوف تسمح للباحثين الحصول على السموم من الحشرات هيتيروبتيران. سيسمح جمع السم ناجحة مواصلة التحقيقات في الإنتاج، وتكوين ووظيفة وتطور السم في هيتيروبتيرا. وبالإضافة إلى ذلك، قد تجد بعض السموم هيتيروبتيران الأداة المساعدة كصديقة لمبيدات الحشرات، والجزيئات يؤدي تطوير المداواة البشرية، أو أدوات علمية للتحقيق في النظم البيولوجية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ونحن نعترف بالمالية دعم من مجلس البحوث الأسترالي (DP130103813 المنح و LP140100832 إلى G.F.K.، DE160101142 زمالة ديكرا إلى إيبو) الأسترالية الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية (زمالة بحثية رئيسية APP1044414 إلى G.F.K.)، وجامعة كوينزلاند (زمالات ما بعد الدكتوراه إلى A.A.W.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
| Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
| Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
| Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |
References
- Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43 (2016).
- Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
- Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
- Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
- Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
- Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
- Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
- Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).
- Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44 (2016).
- Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
- Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
- Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
- Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
- Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
- Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
- Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
- Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
- Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
- Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
- Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
- Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
- Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
- Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
- Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
- Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
- Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
- Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).
