Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran

Published: April 21, 2018 doi: 10.3791/57729
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Institute for Molecular Bioscience, The University of Queensland, 2Centre for Advance Imaging, The University of Queensland

Summary

למרות חרקים רבים, המאפיין פשפשים (Insecta: פשפשאים) הם ארסיים, קומפוזיציה הארס שלהם, הפונקציות של רעלים הארס שלהם ידועות בעיקר. פרוטוקול זה מתאר שיטות למסוק heteropteran venoms עבור נוספות אפיון, באמצעות electrostimulation, הטרדה, ניתוח בלוטת.

Abstract

Heteropteran חרקים כגון חרקים טורפים (Reduviidae) ומים ענק באגים (Belostomatidae) צאצאי אב קדמון משותף של בריתרן, ארסי, ולשמר רוב heteropterans הקיימים אסטרטגיה זו עם מחלות. כמה heteropterans יש מעבר מיגדרי ליזון חוליות דם (כגון חרקים נשיקות, Triatominae; פשפשים, Cimicidae) בעוד אחרים יש להחזירה ליזון צמחים (רוב Pentatomomorpha). עם זאת, למעט בשימוש על ידי באגים לנשק כדי להקל על האכלה דם, קצת רוק ידוע על venoms heteropteran לעומת את venoms של עכבישים, עקרבים ונחשים.

מכשול אחד לאפיון מרעלים ארס heteropteran הוא המבנה והתפקוד של בלוטות ארס/שפתני, אשר הן מורכבות מורפולוגית ולבצע מספר תפקידים ביולוגי (ההגנה ללכוד טרף, עיכול אקסטרה אוראלי). במאמר זה, אנו מתארים שלוש שיטות שבהצלחה השתמשנו כדי לאסוף את heteropteran venoms. ראשית, אנו מציגים electrostimulation כמו טרף דרך נוחה כדי לאסוף את ארס כי היא לעיתים קרובות קטלני כאשר הוא מוזרק לבעלי חיים, אשר obviates זיהום על ידי רקמת הבלוטות. שנית, אנו מראים כי הטרדה עדין של בעלי חיים מספיקה לייצר ארס ההבלטה חוטם ו/או ארס יריקה בקבוצות מסוימות של heteropterans. שלישית, אנו מתארים שיטות כדי לקצור ארס רעלים על ידי ניתוח של מרדימים בעלי החיים כדי להשיג את בלוטות ארס. שיטה זו היא משלימה לשיטות אחרות, כפי שהוא יאפשר קציר של רעלים מן taxa בו electrostimulation והטרדה אינם יעילים. פרוטוקולים אלה תאפשר חוקרים לקצור רעלים מן heteropteran חרקים אפיון מבנה פונקציה ויישומים אפשרי רפואה וחקלאות.

Introduction

Heteropteran venoms הם חומרים מנע בעוצמה ביו1. לדוגמה, ההפרשות ארס/רוק של מדם פשפשים באגים לנשק (Triatominae) ו באגים המיטה (Cimicidae) מקלה על האכלה באמצעות שיבוש hemostasis2. רעלנים אלה venoms יעד מרובים מסלולים כולל קרישת דם, הצטברות של vasoconstriction, כמו גם את הכאב, לגרד מסלולים. Venoms של רוב המינים heteropteran אחרים מותאמים כדי להקל על טריפה יותר מאשר האכלה דם. Venoms שלהם לגרום לשיתוק, מוות ניזול רקמות כאשר הוא מוזרק חסרי חוליות3,4. כאשר הוא מוזרק חולייתנים, הארס שלהם יכול להיות גם השפעות דרסטית. לדוגמה, הזרקה של ארס של הבאג מתנקש Holotrichius innesi לתוך חולייתנים גורם לשיתוק שרירים וכאב, דימום; עכברים envenomated בחיידק הזה למות במהירות עקב שיתוק נשימה5.

מחקרים Transcriptomic פרוטיאומיה מבנית נחשפו הרכב החלבון של כמה venoms heteropteran. Venoms של מינים בריתרן עשירים פרוטאזות, אחרים אנזימים, ופפטידים וחלבונים של המבנה לא ידוע של פונקציה-6,-7,-8. נשיקות באגים ארס הוא עשיר משפחת חלבון triabin, שחבריה להשפיע עמוקות על קרישת דם, הצטברות של טסיות דם,2,vasoconstriction9. עם זאת, לא ידוע איזה רעלים מושתתות רוב bioactivities של ארס. לדוגמה, ארס של באג נשיקות תפוחי האדמה Triatoma דווחה לעכב נתרן ערוצים10ולהיות שיכוך כאב, אבל הרכיבים אחראי להישאר להיות הובהר. כמו כן, לא ידוע איזה רכיבים של מתנקש באג ארס לגרום לשיתוק או כאב. תנאי הכרחי לזיהוי רעלים ממונה על שיועמדו bioactivities, ועל אפיון של מבנה ותפקוד של רעלים ארס הרומן, היא קבלת ארס.

ארס התקבל מ heteropterans על ידי electrostimulation5,6,7,8,11,12,13, פרובוקציה של ההגנה תגובות4,8, מכנית לסחוט את החזה12,14,15,16, לנתח את ארס בלוטות8,17 ,18,19,20,21,22, ויישום של אגוניסטים של קולטני אצטילכולין מוסקריניים23. אם לשפוט את פוטנציאל היתרונות והחסרונות של כל שיטה, זה מורכב על ידי המורפולוגיה של בלוטות ארס heteropteran, אשר מורכב בלוטה הראשי עם שני לומן נפרד, בלוטת הראשי הקדמי (AMG) ואת בלוטת הראשי האחורי (PMG), כמו גם בלוטת אביזר המשויך (AG). אלו תאי בלוטת שונים מייצרים חלבונים שונים הפרשות, אשר עשוי להיות מתמחה עבור תפקודים ביולוגיים שונים, לרבות לכידת הטרף, הגנה, עיכול אקסטרה אוראלי8,17. חרקים טורפים peiratine ו- ectrichodiine, AMG כבר קשור ללכידת טרף את PMG עם אקסטרה אוראלי עיכול17. עם זאת, ב- harpactorine באג Pristhesancus plagipennis PMG מתמחה עבור לכידת הטרף ועיכול ואילו AMG המשוערות להפריש ארס הגנתית8. היועץ המשפטי לממשלה תואר כבעל תפקוד הפרשה הקטנה ב חרקים טורפים8 או כאתר העיקרי של אחסון פרוטאז באגים מים ענק23. . בבירור, עבודה נוספת נדרשת כדי להבהיר את הפונקציה של כל תא בלוטת בין תת-קבוצות heteropteran שונים, וכן לקבוע את הפונקציה של רוב הרעלים ארס. בדו ח זה נתאר פרוטוקולים עבור קציר ארס רעלים מן heteropterans לקראת מטרה זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה תואם מדיניות של אוניברסיטת קווינסלנד שנקבעו טיפול אחראי ובעלי חיים להשתמש של הוראה ומחקר (PPL 4.20.11) וכן הבריאות הלאומיים למחקר רפואי של המועצה קוד אוסטרלי על הטיפול ואת השימוש בעלי חיים למטרות מדעיות (8th מהדורה 2013).

התראה: להקפיד כדי לא להיות envenomated בעת טיפול חרקים טורפים. לטפל כדי להגן על העיניים בעת טיפול מינים יורק ארס באופן הגנתי. . שמור על עצמך בכל רחבי לא לפגוע החיות ניסיוני. זה כולל ניטור לחץ על ריסון כגון גומיות ולהבטיח כי החדק אינה שבורה.

הערה: לחלופין, להרדים בעלי חיים על ידי חשיפה CO2 ב 0.5-2 דקות או קירור ל- 4-10 ° C לפני ארס קציר ב שואף 1-3 כדי להקל על העברה בטוחה ואיפוק. Anaesthetization לא נדרשת בקפדנות אך עשוי להקל על איפוק בטוח של דגימות זריז או חזק. עם זאת, בעלי חיים חייב להיות ער כדי לאפשר ארס קציר. כאשר אתה מחליט אם ברצונו להוסיף מעכבי פרוטאז, זכור יישומים במורד הזרם.

1. קצירת ארס רעלים על ידי Electrostimulation

  1. להשיג דגימות בשידור חי כדי לקצור רעלים.
  2. פינצטה פלסטיק מוכן מראש לשימוש עם אלקטרודות חיוביים ושליליים רכוב על או עצה. להתחבר פינצטה חשמלית של electrostimulator או מקור מתח קבוע המאפשר התאמה של המתח.
    1. קטן (~ 10 מ מ), חרקים טורפים גדולים (~ 25 מ מ), השתמש מתח שיא של 15 ו-25 V בהתאמה.
    2. לשימוש heteropterans גדולים יותר כגון חרקים מים ענק, עד 40 V.
  3. לרסן חרקים חיים על ידי חסון אותם כדי פלטפורמה, באמצעות גומייה על פני בית החזה.
  4. מניחים בקצה החדק בעצה איסוף מתאימים. לשימוש חרקים טורפים, טיפ פיפטה P200. מחרקים מים ענק, חותכים את הגפיים טיפ P200 כדי להגדיל את גודל הצמצם.
    1. בעדינות להרים את חוטם עם זוג מלקחיים נקי סגור ודחף את הצמצם פתוח של קצה אוסף מעל לקצה של החדק.
    2. אם רצונך בכך, ספיגת ~ 5 µL מים הנדסה גנטית לפני הצבת החדק לתוך איסוף עצה. זה מפחית הפסדים של ארס שנותרו בתוך הטיפ, למרות ארס שנקטפו להיות מדולל.
  5. החל electrostimulation. טובלים את האלקטרודות מגרה בג'ל מוליך, כגון גליצרול NaCl/50% 2.5 מטר. האלקטרודות חלות על בית החזה. עבור belostomatids, להחיל את שתי אלקטרודות על המשטח הגבי האחורי. של הראש.
  6. חנות ארס כדי למנוע autodegradation. לאחר ארס הנמתח, במהירות להעביר אותו צינור ב-20 ° C או C º 60, או שפופרת המכילה קוקטייל מעכב פרוטאז.
  7. חזור על שלבים 1.5 ו- 1.6 עד ארס מספיק נרכשת או ארס נוסף הוא המתקרב.

2. קצירת מרעלים ארס על ידי הטרדה

  1. להכין חיות ארס קציר, מניחים בקצה החדק פרוזדור אוסף, כפי שמתואר בסעיפים 1.1 ו- 1.3-1.4.
  2. אם ארס הנמתח באופן ספונטני, עבור לשלב 2.3. אם לא, להטריד את בעלי החיים על ידי בעדינות לגעת בה על הרגליים, הבטן אנטנות עם פינצטה עד ארס הוא מיוצר.
  3. במהירות העברת ארס צינור ב-20 ° C עד C º 60 או שפופרת המכילה פרוטאז מעכב קוקטייל, אם רצונך בכך.

3. קצירת מרעלים ארס על ידי הטרדה של ארס "יריקה" מינים

  1. להרדים, או חלקית להרדים, החרק לפני הסרתו של מארז שלה כדי למנוע כל יריקה הגנתית מוקדמת.
  2. לעורר ארס יריקה התנהגות. מכילים ולמקם מחדש את החרק באמצעות המכסה עמוק של תקן 90 x 16 מ מ פטרי. החזק את המכסה האחורי מעט ו- 1-4 ס מ מעל החרק כדי למנוע הטיסה. חרקים ברוב יורק מספר פעמים, לעתים קרובות ברצף מהיר. ודא שכל הארס נאסף על החלק התחתון של המנה.
  3. לאסוף את הארס בצד התחתון של הפטרי על ידי שטיפה עם 10 µL של מים הנדסה גנטית. במהירות להעביר אותו צינור ב-20 ° C או C º 60, או שפופרת המכילה קוקטייל מעכב פרוטאז.

4. קצירת ארס רעלים על ידי ניתוח בלוטת

  1. להקריב את בעלי החיים. בכבדות להרדים או להרוג בעלי חיים באמצעות > 5 דקות חשיפה CO2. צינור CO טהור2 ישירות לתוך החורים-האוויר של מארז דיור של החיה.
  2. חרק pin למגש לנתיחה. עבור חרקים טורפים, לנתח דרך השטח הגחון (4.3). מחרקים מים ענק, לנתח דרך המשטח הגבי (4.4).
  3. דיסקציה הגחון
    1. הכנס שלושה פינים לתוך הבטן האחורי להחזיק את החרק ללא תקר בלוטות ארס.
    2. חותכים חתך קצר קו האמצע (גחוני) של הבטן בעזרת אזמל מיניאטורי. להשתמש במספריים מיניאטורי להרחיב את החתך קו האמצע anteriorly לראש, מקפיד לא נזק למבנים פנימיים גזורה שלד חיצוני בלבד.
    3. כדי לחשוף את המבנים הפנימיים, להפוך מספר חתכים לרוחב המשתרעת החתך קו האמצע לצד של החרק. לאחר מכן, להצמיד בחזרה כל כנף של שלד הגחון כדי לחשוף את המבנים הפנימיים.
    4. עבור חרקים טורפים גדולים, להפוך ארבעה חתכים לרוחב הבטן הבטן התיכונה, קדמי, בין הרגליים הראשון והשני, ולפני השלב הראשון.
  4. דיסקציה הגבי
    1. הסר את הכנפיים בקרבת הבסיס. הכנס שלושה פינים לתוך הבטן האחורי להחזיק את החרק ללא תקר בלוטות ארס.
    2. חותכים חתך קו האמצע מהראש אל הבטן בעזרת מספריים זעירים ואזמל, מקפיד לא נזק למבנים פנימיים גזורה שלד חיצוני בלבד.
    3. לכפות בהפרש את שני החצאים של החרק. במקום מספר סיכות רוחבית לאורכו של החרק לעזוב את חלל פנימי חשוף.
    4. הסר את השרירים טיסה באמצעות פינצטה.
  5. להציף את המגש לנתיחה. הוסף PBS עד החרק שקוע כדי לאפשר המבנים הפנימיים לעוף ולהיות דמיינו בקלות רבה יותר.
  6. באמצעות פינצטה ומספריים מיקרו, הסר בזהירות החיבור ואת רקמות עצבים וקנה הנשימה. בלוטות ארס מופיעות מוארך, מבנים שקוף המשתרעת לאורך כל צד של הטבעת.
    1. לזהות בלוטת הראשי על פי מראהו האופייני, עם האחורי האונות הקדמיות, שני צינורות נפגשים? hilus.
    2. אם רצונך בכך, לזהות בלוטת אביזר ע י איתור את צינור מ- hilus. חינם בלוטת הראשי על ידי חיתוך צינוריות שני שמקורם hilus.
  7. הקציר לומן בלוטת הרצוי. להעביר את בלוטת microcentrifuge על קרח המכילה 30 µL של PBS או PBS פלוס מעכב פרוטאז קוקטייל. לאנס הבלוטות עם סיכה חדה נקייה.
    1. מערבולת עבור 10 s ו צנטריפוגה (1 דקות, 5,000 × g, 4 ° C) כדי לרוקן את לומן בלוטת. הסרת רקמת בלוטות באמצעות פינצטה.
  8. להבהיר את תמצית הרעלן. צנטריפוגה (5 דקות, 17,000 × g, 4° C) כדי להסיר את כל חלקיקי מוצק, שמירה על תגובת שיקוע ומחיקת בגדר. לאחסן ב-20 ° C או C º 60 כדי למנוע השפלה autoproteolytic.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מינים מסוימים של heteropteran, את harpactorine plagipennis פ ו reduviine את Platymeris ראדאמאנטיס, תשואה בצורה אמינה כמויות גדולות (5-20 µL) של ארס, בתגובה electrostimulation (טבלה 1). באופן כללי, רוב החרקים peiratine, reduviine ו- harpactorine תשואה ארס בתגובה בשיטה זו. בין חרקים stenopodaine, electrostimulation elicited ארס Oncocephalus sp. אבל לא Thodelmus sp. החרקים holoptiline ו- emesine שנדגמו לא נכנע ארס משמעותית (למשל מספיק לניתוח באמצעות ספקטרומטר מסה) בתגובה electrostimulation. Electrostimulation יכול לשמש גם כדי לקצור ארס belostomatid חרקים, חיפושיות הזבל דורסנית. עם זאת, electrostimulation של המים עקרבים (Nepidae) המושרה שחרור תוכן של בלוטות cephalic בלבד, ולא ארס של החדק. כשל לקצור ארס על ידי electrostimulation במינים מסוימים סביר בשל המורכבות המורפולוגית של בלוטות ארס, המנגנונים הפיזיולוגיים שליטה על שחרורו של ארס8.

בנוסף שחרור ארס electrostimulation, reduviids פ plagipennis, Havinthus rufovarius, ראדאמאנטיס פ וכתוצאה belostomatid את Lethocerus distinctifemur, רצון באופן ספונטני להוציא ארס של החדק במהלך הטיפול. הוצאה ארס כזה מלווה לעתים קרובות מציג הגנתית. ראדאמאנטיס פ גם יורקת ארס באופן הגנתי4, תופעה המתרחשת נחשים24 ו עכבישים25 אבל של אשר אנחנו לא מודעים של כל מיני reduviid אחרים.

ניסויים מרחביות-דף ו פרוטאומיקס מדגימים כי venoms לקצור ידי electrostimulation והטרדות הם עשירים בחלבון6,7,8. חלבונים מהווים אחוז גדול של ההווה החומרי, אך סביר גם כי venoms מכילים יונים אנאורגניים וחומרים אחרים. ארס מתנקש באג מתקבל על ידי electrostimulation והטרדה בדרך כלל מכיל למעלה ממאה פפטידים, חלבונים (איור 1, איור 2). ארס Belostomatid דווחה בעבר להיות עשיר lysophospholipids13. ספיגת אינפרא-אדום ספקטרום של ארס של הבאג מים belostomatine Diplonychus eques הם עקביים עם תוכן של חלבונים וגם lysophospholipids. עבור lethocerine ל' distinctifemur, נמצאו ראיות רק עבור חלבון ולא lysophospholipids6.

כפי שדווח על עכביש venoms26, ארס שנקטפו חרקים heteropteran סביר להניח נבדלים ריכוז והלחנה, בהתאם את החרק המשמש את השיטה שבאמצעותה היא נקצרת. UV ספקטרוסקופיה של ארס מדולל דגימות מציע ספיגת ערכים (280) של 50-250 (10 מ מ אורך נתיב) מדולל ארס, עקבי עם ריכוז חלבון גבוה של ~ 50-250 mg/mL7,12,19. מניעת טרף דווח לגרום עלייה רצופים ארס ריכוז ו המשותק פוטנציאליים3 , כמו גם ירידות רצופים pH27. עם זאת, הרעבה ממושכת תגרום לאובדן תנאי ומוות. כמו גם ריכוז, השיטה שבאמצעותה ארס הוא שנקטפו heteropterans עלול להשפיע על הקומפוזיציה שלה. ההרכב הרעלן של ארס של הבאג מתנקש plagipennis פ שונה במידה ניכרת בהתאם אם זה היה לקצור ידי electrostimulation או הטרדה8. במקרה של plagipennis פ, זה הוצגה להיות עקב electrostimulation מניב בתוכן PMG, ואילו הטרדה הניב את תוכן AMG. ארס מתקבל על ידי electrostimulation, אבל לא הטרדה, הטרף המשותק מנע בעוצמה חרקים (איור 3). עם זאת, לא ברור באיזו מידה תוצאה זו ניתן להכליל Reduviidae אחרים או פשפשים אחרים.

קציר ארס ישירות על-ידי לנתח בלוטות ארס מאפשרת מנגנוני הבקרה של בלוטות הארס בכדי שיפרו, במחיר של זיהום עם רקמת הבלוטות (הלא-ארס) חלבונים. ללא קשר, תמציות המתקבל ביתור חומר יכול לשמש עבור מבחני אתריים/רעילות. לדוגמה, תמציות של PMG, AMG AG של plagipennis פ, שהוכנו באמצעות פרוטוקול לעיל, נותחו באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית/טנדם ספקטרומטר מסה8. תהליך זה ניתן לזהות בסך 182, 114, וחלבונים 71 בסך הכל, מהן 45, 51 ו- 12 סווגו חלבונים בשם ארס בהתבסס על מאפייני רצף חומצות אמיניות, עם החלבונים שנותרו מסווגים חלבונים בשם משק בית. הזרקה של תמציות של PMG, אבל לא AMG או AG, לתוך חרקים גרמו לשיתוק ומוות8.

Infraorder המשפחה תת משפחה שם מדעי השם המקובל Electrostimulation הטרדה דיסקציה
Cimicomorpha Reduviidae Harpactorinae Pristhesancus plagipennis באג נפוץ של מתנקש בריסביין כהן כהן כהן
Havinthus rufovarius באג רוצח הנמר אדום כהן כהן כהן
Scipinia arenacea באג אדום מתנקש קוצני כהן nd כהן
Gminatus spp. באג מתנקש תפוזים גדולים כהן nd כהן
Trachylestes aspericollis באג מתנקש אדום קטן כהן nd nd
Reduviinae Platymeris spp. חרק מתנקש אפריקאי ענק כהן כהן כהן
Psytalla horrida באג מתנקש קוצני כהן nd כהן
Peiratinae Ectomocoris spp. באג מתנקש הקרקע כתום כהן nd כהן
Peirates spp. באג מתנקש שחור כהן nd nd
Stenopodainae Oncocephalus spp. - כהן nd כהן
Thodelmus spp. - x nd כהן
Holoptilinae למור Ptilocnemus נוצה-רגלי החרק x x nd
Emesinae Stenolemus spp. חוט-רגלי החרק x x x
Pentatomomorpha Pentatomidae Asopinae Amyotea hamata החרק המסריח דורסנית צהוב כהן nd nd
Nepomorpha Nepidae Ranatrinae Ranatra dispar מים עקרב x, cg x כהן
Belostomatidae Belostomatinae Diplonychus eques חרק מיימי כהן nd nd
Belostomatidae Lethocerinae Lethocerus sp.  חרק מים ענק כהן כהן כהן
. טיק, מוצלחת; קרוס, לא מוצלח; nd, לא לקבוע; cg, הפרשות בלוטת cephalic בלבד

טבלה 1: טקסון יחודיות של שיטות השתמשו כדי לקצור ארס של heteropterans.

Figure 1
איור 1 : חלבונים זוהה על ידי LC-MS/MS ניתוח של 2D מרחביות-דף כתמים ושברים HPLC של ארס שנאסף פ plagipennis על ידי electrostimulation (פרוטוקול 1), מראה שופע פרוטאזות, גור-תחום חלבונים וחלבונים heteropteran ארס המשפחה 1. (א) 2D מרחביות-דף ג'ל של גולמי ארס plagipennis פ , מציג משפחות חלבון המזוהה על-ידי LC-MS/MS המקומות ג'ל. (B) HPLC chromatogram מן fractionation של ארס plagipennis פ , מציג משפחות חלבון המזוהה על-ידי ניתוח LC-MS/MS של שברים שנאספו. מרובה עם הרשאה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : פרופורציה של רצפי השייכים לכל חלבון מרכזי בכיתה הארס של פ plagipennis. מרובה עם הרשאה7. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : Plagipennis פ מתקבל על ידי electrostimulation, אבל לא הטרדה, ארס משתק חרקים. (א) ההשפעה של הזרקת הארס מתקבל על ידי electrostimulation או הטרדה, או מים, קריקט הבריחה. עבור כל תנאי ארס, ארס µL 0.17 המקביל היה מוזרק לתוך הבטן ואת הזמן לברוח עם המכסה הפוכה צלחת פטרי-(ב- s, ל-300 s, זאת אומרת ± SD) היה הבקיע. (B) מנה-תגובה עקומת עבור עיכוב של הצלחה לברוח על ידי ארס המתקבל plagipennis פ על-ידי electrostimulation. מרובה עם הרשאה8. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

השלב הקריטי ביותר של קצירת מתנקש באג ארס הוא בחירת השיטה המתאימה בהתאם למטרת המחקר. בכל שלוש שיטות הציג קציר heteropteran venoms יש יתרונות וחסרונות בהתאם ליישומים במורד הזרם.

גרימת באגים לגרש את ארס של החדק (פרוטוקולים 1-3) מונע זיהום של ארס על ידי רקמות הבלוטות. בנוסף, שיטות אלה אינם קטלניים, יכולה להיות פעמים רבות במהלך לייף באג. Electrostimulation בדרך כלל מספק את הכמויות הגדול ביותר של ארס, ותשואות ארס עם רעילות חזק לטרף חרקים על-פי מחקרים מספר5,8. לעורר תגובה הגנתית הוא דרך נוספת להפיק ארס החדק, ואחד תניב ארס של חלבון שונות לתוכן electrostimulation8. עם זאת, electrostimulation, פרובוקציה לא עובדים עבור מינים רבים, ללא חקירות במקביל הפלט הפרשה של בלוטות הארס לא ברור איזו בלוטה לומן (או איזה צירוף של בלוטת לומן) הוא שנקטפו.

קציר ארס על ידי דיסקציה (פרוטוקול 4) היא במובנים רבים משלימים. דיסקציה מייצג דרך ישירה כדי לגשת ארס מאוחסנות ולאחר כל תא של בלוטת ארס ניתן לקצור בנפרד או איחדו (כלומר, האפשרות 'לא נכון' הארס שנקטפו זה obviated). עם זאת, השיטה הוא קטלני, בנוסף גורם זיהום קלה של ארס על ידי רכיבים של רקמות. פשפשים רבים הם קטנים מדי (או מוארך גם במקרה של Emesinae, החרקים חוט-רגלי) כדי לאפשר ארס קציר על ידי ניתוח. אם הקרע משמש כדי לחלץ חלבונים התאים בלוטת בודדים בנפרד, חשוב להפריד בין האונות במהירות ולהוציא את התוכן שלהם בנפרד כדי למנוע זיהום צולב.

השיטות המובאות כאן צריך להיות שונה בהתאם למין מסוים, למד. אוסף של ארס על ידי electrostimulation, היבטים מרכזיים כדי למטב הן כמה משחרר את הבאג. לדוגמה, רוב reduviids מסוגלים להרחיב את חוטם שלהם על מגוון רחב של התנועה. המינים הללו יכול להיות מאופקת פשוט נכון בעליות על פלטפורמה באמצעות גומייה, החדק everted באופן ידני. עבור מינים עם חוטם פחות גמישים, כגון belostomatids, יש במקום צורך לרסן חרקים בעמדה הפוכה ולהוריד כלי קיבול אוסף בזווית הנכונה באמצעות אביק או זרוע מכנית. הגודל ו דפוס של החשמל חלה עליך גם להיות ממוטבים, במקרה זה, זה יותר טוב להתחיל נמוך לאט תגביר את המתח יישומית להימנע הקטלניות.

אם מטרת המחקר היא להשיג הבנה מפורטת של איך למין מסוים מייצר ומשתמש ארס, חקירה מעמיקה המשלבת מספר האיסוף שיטות, כמו גם טכנולוגיות כגון ספקטרומטר מסה ו- RNA-Seq ניסויים, ייתכן נדרש. אם המטרה היא להשתמש heteropteran venoms ספריות של מולקולות ביולוגיות שיוקרנו פעילות ביולוגית הרצוי, ואז פאנל של ארס דוגמאות מתקבל על ידי electrostimulation, הטרדה, ו/או ניתוח עשויים להיות מתאימים. עם זאת, נציין כי התפקיד הביולוגי נורמלי של ארס שנקטפו יש סבירות גבוהה לקבוע איזה bioactivities נוכחים. לדוגמה, ארס משמש טריפה היא יותר עשוי להכיל חרקים תרכובות, ואילו ארס משמש הגנה הוא יותר עשוי להכיל סוכנים algogenic (גרימת כאב).

לא כללנו ארס הקציר באמצעות יישום של פילוקרפין אגוניסט קולטני אצטילכולין מוסקריניים ב פרוטוקול זה. ניסויים עתידיים נדרשים לקבוע את המאפיינים של ארס פילוקרפין-induced הגירוש לעומת השיטות שהוזכרו לעיל.

במאמר זה, הוצגו שיטות שיאפשרו החוקרים להשיג venoms של חרקים heteropteran. אוסף ארס מוצלח יאפשר עוד יותר חקירות ייצור, קומפוזיציה, פונקציה, האבולוציה של ארס, פשפשים. בנוסף, כמה רעלים heteropteran עלול למצוא כלי כמו קוטלי חרקים ידידותי לסביבה, עופרת מולקולות לפתח הרפוי האנושי, או כלים מדעיים לחקור מערכות ביולוגיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו להכיר כספי תמיכה מהמועצה מחקר אוסטרלי (מענקים DP130103813 ו- LP140100832 כדי G.F.K., DECRA DE160101142 אחוות כדי EABU), את הבריאות הלאומית האוסטרלית & המועצה למחקר רפואי (מחקר המנהל לאגודה APP1044414 אל G.F.K.), ואת באוניברסיטת קווינסלנד (בתר כדי A.A.W.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Electostimulator Grass Technologies S48 Square Pulse Stimulator Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation
Featherlight tweezers Australian Entomological Supplies E122B For handling live venomous insects
Protease inhibitor cocktail Sigma 4693124001 For preventing autoproteolytic digestion of venom
Dissection equipment Australian Entomological Supplies E152Micro For fine dissections
Insect pins Australian Entomological Supplies E162 For fine dissections

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Walker, A. A., Weirauch, C., Fry, B. G., King, G. F. Venoms of heteropteran insects: A treasure trove of diverse pharmacological toolkits. Toxins. 8 (2), 43 (2016).
  2. Ribeiro, J. M. C., Assumpção, T. C., Francischetti, I. M. B. An insight into the sialomes of bloodsucking Heteroptera. Psyche (Stuttg). 2012, 1-16 (2012).
  3. Ambrose, D. P., Maran, S. P. M. Quantification protein content and paralytic potential of saliva of fed and prey deprived reduviid Acanthaspis pedestris Stål (Heteroptera: Reduviidae: Reduviinae). Indian Journal of Environmental Science. 3 (1), 11-16 (1999).
  4. Edwards, J. S. The action and compostion of the saliva of an assassin bug Platymeris rhadamanthus Gaerst. (Hemiptera, Reduviidae). Journal of Experimental Biology. 38, 61-77 (1961).
  5. Zerachia, T., Bergmann, F., Shulov, A. Animal and Plant Toxins. Kaiser, E. , Goldman. 143-146 (1973).
  6. Walker, A. A., Hernández-Vargas, M. J., Corzo, G., Fry, B. G., King, G. F. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cellular and Molecular Life Sciences. , (2018).
  7. Walker, A. A., et al. Giant fish-killing water bug reveals ancient and dynamic venom evolution in Heteroptera. Cell. Mol. Life Sci. , (2018).
  8. Walker, A. A., et al. The assassin bug Pristhesancus plagipennis produces two distinct venoms in separate gland lumens. Nature Communications. 9 (1), 755 (2018).
  9. Hernández-Vargas, M. J., Santibáñez-López, C. E., Corzo, G. An insight into the triabin protein family of American hematophagous reduviids: Functional, structural and phylogenetic analysis. Toxins. 8 (2), 44 (2016).
  10. Dan, A., Pereira, M. H., Pesquero, J. L., Diotaiuti, L., Beirao, P. S. Action of the saliva of Triatoma infestans (Heteroptera: Reduviidae) on sodium channels. Journal of Medical Entomology. 36 (6), 875-879 (1999).
  11. Corzo, G., Adachi-Akahane, S., Nagao, T., Kusui, Y., Nakajima, T. Novel peptides from assassin bugs (Hemiptera: Reduviidae): isolation, chemical and biological characterization. FEBS Letters. 499 (3), 256-261 (2001).
  12. Sahayaraj, K., Kumar, S. M., Anandh, G. P. Evaluation of milking and electric shocks for venom collection from hunter reduviids. Entomon. 31 (1), 65-68 (2006).
  13. Silva-Cardoso, L., et al. Paralytic activity of lysophosphatidylcholine from saliva of the waterbug Belostoma anurum. Journal of Experimental Biology. 213 (19), 3305-3310 (2010).
  14. Noeske-Jungblut, C., et al. Triabin, a highly potent exosite inhibitor of Thrombin. Journal of Biological Chemistry. 270 (48), 28629-28634 (1995).
  15. Noeske-Jungblut, C., et al. An inhibitor of collagen-induced platelet aggregation from the saliva of Triatoma pallidipennis. Journal of Biological Chemistry. 269 (7), 5050-5053 (1994).
  16. Sahayaraj, K., Borgio, J. F., Muthukumar, S., Anandh, G. P. Antibacterial activity of Rhynocoris marginatus (Fab.) and Catamirus brevipennis (Servile) (Hemiptera: Reduviidae) venoms against human pathogens. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 12 (3), 487-496 (2006).
  17. Haridass, E. T., Ananthakrishnan, T. N. Functional morphology of the salivary system in some reduviids (Insecta-Heteroptera-Reduviidae). Proceedings of the Indian Academy of Sciences. Animal Sciences. 90 (2), 145-160 (1981).
  18. Ignacimuth, A., Sen, A., Janarthanan, S. Biotechnological Applications for Integrated Pest Management. , Oxford Publishing. 125-131 (2000).
  19. Maran, S. P. M., Selvamuthu, K., Rajan, K., Kiruba, D. A., Ambrose, D. P. Insect Pest Management, A Current Scenario. Ambrose, D. P. , Entomology Research Unit. 346-361 (2011).
  20. Pereira, M. H., et al. Anticoagulant activity of Triatoma infestans and Panstrongylus megistus saliva (Hemiptera/Triatominae). Acta Tropica. 61, 255-261 (1996).
  21. Ribeiro, J. M., Marinotti, O., Gonzales, R. A salivary vasodilator in the blood-sucking bug, Rhodnius prolixus. British Journal of Pharmacology. 101 (4), 932-936 (1990).
  22. Ribeiro, J. M., Schneider, M., Guimarães, J. A. Purification and characterization of prolixin-S (nitrophorin 2), the salivary anticoagulant of the blood-sucking bug Rhodnius prolixus. Biochem Journal. 308 (1), 243-249 (1995).
  23. Swart, C. C., Deaton, L. E., Felgenhauer, B. E. The salivary gland and salivary enzymes of the giant waterbugs (Heteroptera; Belostomatidae). Comparative Biochemistry and Physiology A Molecular & Integrative Physiology. 145 (1), 114-122 (2006).
  24. Rasmussen, S., Young, B., Krimm, H. On the 'spitting' behaviour in cobras (Serpentes: Elapidae). Journal of Zoology. 237 (1), 27-35 (1995).
  25. Fink, L. S. Venom spitting by the green lynx spider, Peucetia viridans (Araneae, Oxyopidae). Journal of Arachnology. 12, 372-373 (1984).
  26. Herzig, V. Ontogenesis, gender, molting influence the venom yield in the spider Coremiocnemis tropix (Araneae, Theraphosidae). Journal of Venomous Research. 1, 76-83 (2010).
  27. Sahayaraj, K., Subramanium, M., Rivers, D. Biochemical and electrophoretic analyses of saliva from the predatory reduviid species Rhynocoris marginatus (Fab). Acta Biochimica Polonica. 60 (1), 91-97 (2013).

Tags

מדעי הסביבה נושא 134 פשפשים באג אמיתי Reduviidae Belostomatidae ארס הרעלן רוק electrostimulation הטרדה בלוטת ארס בלוטת שפתיים בלוטת הרוק
קציר ארס מרעלים חרקים טורפים וחרקים אחרים Heteropteran
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Walker, A. A., Rosenthal, M.,… More

Walker, A. A., Rosenthal, M., Undheim, E. E. A., King, G. F. Harvesting Venom Toxins from Assassin Bugs and Other Heteropteran Insects. J. Vis. Exp. (134), e57729, doi:10.3791/57729 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter