Summary
ただし、異翅亜目の多くの昆虫 (昆虫綱: 半翅目) は毒、毒組成とその毒の毒素の機能はほとんど知られてないです。このプロトコルでは、さらに特性評価、電気刺激、嫌がらせや腺の解剖を使用してのかめむし類の毒を収穫する方法について説明します。
Abstract
かめむし類昆虫サシガメ (サシガメ科) や巨大な水のバグ (タガメ) などの捕食性と毒の先祖から子孫し、現存する heteropterans の大半は、この栄養戦略を保持します。いくつかの heteropterans は、脊椎動物の血を主食に移行した (キスのバグ、クロタマゴバチ; などとベッドのバグ、Cimicidae) 餌植物 (ほとんどの Pentatomomorpha) に戻っている他の中。ただし、唾液キスのバグが吸血、少し容易にするために使用を除いてかめむし類の毒クモ、サソリやヘビの毒に比べてについて知られています。
かめむし類の毒の毒素の解析への 1 つの障害は、構造と両方は形態学的に複雑な複数の生物学的役割 (防衛、獲物のキャプチャ、および口腔外消化) を実行毒/口唇腺の機能です。この記事ではカメムシ毒を収集するを用いて正常に 3 つの方法をについて説明します。まず、便利な方法は頻繁に注入されるときに致命的な毒を収集する捕食動物、腺組織で汚染がなくなると電気刺激を示します。第二に、動物の穏やかな嫌がらせが毒テングや heteropterans のいくつかのグループで吐く毒から押し出しを生成するのに十分であることを示します。第三に、我々 は毒液腺を取得する麻酔動物の解剖によって毒の毒素を収穫する方法を説明します。この方法は他の方法を補完するものではなく電気刺激と嫌がらせが効果的なイチイから毒素の収穫を可能性があります。これらのプロトコルは、研究者かめむし類の構造機能解析と応用医学と農業の昆虫から毒素を収穫する有効になります。
Introduction
かめむし類の毒は、強力生理活性物質1です。たとえば、キスのバグ (クロタマゴバチ)、ベッドのバグ (Cimicidae) などのカメムシの吸血の毒/唾液分泌を容易に止血2を破壊して給餌。これらの毒の毒素は、凝固、血小板凝集と血管収縮、痛みなど複数の経路をターゲットし、経路をかゆみ。他のほとんどのかめむし類種から毒は吸血するのではなく、捕食を容易にするために合わせられます。その毒は、麻痺、死および無脊椎動物3,4に注入する組織の液状化を引き起こします。脊椎動物に注入される毒液抜本的な効果はあります。例えば、脊椎動物にサシガメHolotrichius innesiから毒の注入により痛み、筋麻痺、出血;このバグによってマウス envenomated は呼吸麻痺5のためすぐに死にます。
トランスクリプトームおよびプロテオーム研究は、いくつかのかめむし類の毒のタンパク質組成を明らかにしました。捕食性の種の毒は、プロテアーゼ他酵素とペプチド及びタンパク質の未知構造と機能6,7、8に富んでいます。バグ キス毒は、血液凝固、血小板凝集や血管収縮2,9メンバーに深く影響を与える triabin タンパク質ファミリーが豊富です。ただし、どの毒素の根底にある毒のほとんどの生物活性は知られていません。たとえば、キス バグブラジルサシガメ ジャガイモの毒は、鎮痛剤、ナトリウム チャンネル10を阻害すると報告されているが、解明する責任のコンポーネントが残っています。同様に、どのコンポーネントのサシガメ毒麻痺や痛みの原因は知られていません。特定毒生物活性と構造と、新しい毒の毒素の機能を特徴づける担当の毒素を識別するための前提条件は、毒を得ています。
電気5,6,7,8,11,12,13守備の挑発が毒を heteropterans から入手します。応答4,8、機械的に圧迫、胸郭12,14,15,16毒液腺8,17 を解剖 ,18,19,20,21,22、および23ムスカリン性アセチルコリン受容体のアゴニストのアプリケーション。2 つの独立したルーメン、前方メイン腺 (AMG) と後部主な腺 (PMG) 主な腺から成っているかめむし類の毒腺の形態は複雑に潜在的な長所と短所の任意のメソッドを判断として付属腺 (AG) を関連付けられています。これらの異なる腺コンパートメント獲物の捕獲や防衛、口腔外消化8,17を含むさまざまな生物学的機能特化する可能性があります異なるタンパク質の分泌物を生成します。Peiratine と ectrichodiine の暗殺者バグで AMG は獲物の捕獲および口腔外消化17PMG に関連付けられています。しかし、harpactorine の AMG8防御毒を分泌する仮説があるに対し、 Pristhesancus plagipennis PMG のバグは獲物の捕獲や消化を特化されています。AG は、サシガメ8小さな分泌機能を持つ、巨大な水のバグ23プロテアーゼ ストレージの主要なサイトに記載されています。明らかに、さらに作業は様々 なカメムシ サブグループ間で各腺区画の機能を明らかにする最も毒の毒素の機能を決定する必要があります。本報告ではこの目標に向かって heteropterans から毒の毒素を収穫するためのプロトコルについて述べる。
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Protocol
このプロトコルは、レスポンシブル ・ ケアと教育・研究における動物の使用(PPL 4.20.11) と同様に、国立健康医学研究議会ののケアのためのオーストラリアのコードとの使用でクイーンズランド大学のポリシーに準拠します。科学的な目的のための動物(8th版 2013)。
注意: すべき envenomated は暗殺者のバグを処理するとき注意してください。守備の毒を吐く種を処理するとき、目を保護するために注意してください。全体で世話をする実験動物を傷つけないように。これには、輪ゴムなどの拘束圧の監視、および、テングが壊れていないことが含まれます。
注: 必要に応じて、0.5-2 の CO2の露出によって動物を anaesthetize 分や毒で収穫前の 4-10 ° C に冷却を目指す 1-3 安全な移送と拘束を容易にします。Anaesthetization は必須ではないが、アジャイルまたは強力な標本の安全制限を容易にする可能性があります。しかし、動物は毒を収穫できるように目がさめている必要があります。プロテアーゼ阻害薬を追加するかどうかを決定するときダウン ストリーム アプリケーションを覚えておいてください。
1. 電気刺激による毒の毒素の収穫
- ライブ標本から毒素を収穫するを取得します。
- 正極・負極の事前に用意されたプラスチック ピンセットは、どちらかの先端にマウント。電化のピンセットを electrostimulator または電圧の調整が可能な定電圧源に接続します。
- 小さな (~ 10 mm) と大 (〜 25 mm) サシガメ、15 と 25 V のピーク電圧をそれぞれ使用します。
- 巨大な水のバグなど大きな heteropterans は、最大 40 V を使用します。
- 胸部にゴムバンドを使用して、プラットフォームにそれらのストラップがライブのバグを抑制します。
- 適切な収集のヒントに口吻の先端を配置します。サシガメ、P200 ピペット チップを使用します。巨大な水のバグ、P200 先端開口部のサイズを増やすために下肢をカットします。
- 優しく清潔なピンセットの閉じたペアでテングを持ち上げ、テングの終わり上コレクション先端の開口を押してください。
- 必要に応じて、収集に口吻を配置する前に取り込み 〜 5 μ L の純水がヒントします。これは収穫された毒が薄くなることが毒、チップ内部の残りの損失を低減します。
- 電気刺激を適用します。2.5 M NaCl/50% グリセロールなどの導電性ゲルの刺激電極を浸しなさい。胸部に電極を適用します。Belostomatids、頭の背側後面に 2 つの電極を適用します。
- Autodegradation を防ぐために毒を格納します。毒を押し出し後、-60 ° C または-20 ° C でチューブやプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含むチューブにすばやく転送します。
- 1.5 と 1.6 の手順を繰り返して十分な毒を取得または今後さらに毒はありません。
2. ハラスメントによる毒の毒素の収穫
- 毒を収穫するため動物を準備し、1.1 と 1.3 1.4 のサブセクションで説明するようコレクション前庭で口吻の先端を配置します。
- 毒が自然に押し出されて、2.3 の手順に進みます。ない場合は、優しく触って脚、腹部と触角にピンセットで毒を生成まで動物を苦しめます。
- すぐに必要な場合、管含むプロテアーゼ抑制剤のカクテル、-60 ° C または-20 ° C の管へ毒を転送します。
3.「吐き」種の毒から嫌がらせで毒の毒素の収穫
- Anaesthetize、または、部分的に anaesthetize、任意の時期尚早守備吐きようにエンクロージャから取り外す前に昆虫。
- 毒吐く動作を引き起こします。含まれており、標準 90 x 16 mm ペトリ皿の深い蓋を使用して虫の位置を変更します。防ぐため飛行する昆虫の上 1-4 cm のやや後方の蓋を保持します。ほとんどの昆虫はしばしば立て続けに数回を吐き出すでしょう。すべての毒を皿の下側に収集します。
- ペトリ皿の下側に毒を収集するには、10 μ L の純水で洗浄します。すばやく-60 ° C または-20 ° C でチューブやプロテアーゼ阻害剤のカクテルを含む管にそれを転送します。
4. 腺解剖によって毒の毒素の収穫
- 動物を犠牲に。大きく anaesthetize またはを使用して動物を殺す > CO2を 5 分露出。動物のハウジング筐体の空気穴に直接パイプを純粋な CO2 。
- ピン昆虫解剖トレイ。暗殺者のバグの腹側表面 (4.3) を解剖します。巨大な水のバグの背側表面 (4.4) を解剖します。
- 腹側郭清
- 毒液腺に穴をあけることがなく昆虫を押しながら後部の腹部に 3 本のピンを挿入します。
- 小型のメスを使用して腹部の腹側表面に短い正中切開をカットします。外骨格のみをカットし、内部構造を損傷しないように注意しながら、頭を前方正中切開を拡張するのにミニチュアはさみを使用します。
- 内部構造を公開するには、するには、正中切開から昆虫の側に伸びる複数の水平カットを確認します。内部構造を明らかにする腹側の外骨格の各フラップ、ピンバックします。
- 大きなサシガメの中間腹部、前腹部、最初と 2 番目の足の間と第 1 戦の前に 4 つの横切開を作る。
- 背郭清
- 基地の近くの翼を削除します。毒液腺に穴をあけることがなく昆虫を押しながら後部の腹部に 3 本のピンを挿入します。
- ミニチュアはさみやメス、外骨格のみをカットし、内部構造を損傷しないように注意しながら使用して腹部に頭から正中切開をカットします。
- 昆虫の 2 つの半分を離れて強制的に。公開されている内部の空洞を残して昆虫の長さに沿って横方向にいくつかのピンを配置します。
- ピンセットを使用して飛行筋肉を削除します。
- 郭清トレイを洪水します。簡単に可視化バグが内部構造をフロートし、するを許可する浸水までは、PBS を追加します。
- マイクロ剪刀、ピンセットを使用すると、気管や神経組織結合を慎重に取り外します。毒液腺のように細長い、消化管の各側面に沿って延びる透過する構造体です。
- 前葉および後葉門部で会った 2 つのダクトとその特徴的な外観、主な腺を識別します。
- 必要な場合は、肺門からダクトをトレースして付属腺を識別します。門部から発せられる 2 つのダクトを切断することによって主要な腺を無料します。
- 必要な腺ルーメンを収穫します。30 μ L の PBS または PBS を含有した氷の腺を遠心機に転送プラスのプロテアーゼ抑制剤のカクテル。鋭いピンで腺を槍します。
- 10 s および腺ルーメンを空にして (1 分、5,000 × g、4 ° C) 遠心分離機の渦。ピンセットを使用して腺組織を削除します。
- 毒素抽出物を明らかにします。遠心分離機 (5 分、17,000 × g、4 ° C) 任意の固体粒子、上澄みを保持とペレットを破棄を削除します。Autoproteolytic の劣化を防ぐため-60 ° C または-20 ° C で保存します。
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Representative Results
P. plagipennis harpactorine と reduviine Platymeris ラダマンテュスなどのいくつかのかめむし類種は確実に電気刺激 (表 1) への応答では毒の大量 (5-20 μ L) をもたらします。一般に、ほとんどの peiratine、reduviine、および harpactorine のバグは、このメソッドへの応答で毒を生成します。Stenopodaine バグの間では、電気刺激はOncocephalus sp. Thodelmus sp ないから毒を誘発しました。サンプリング holoptiline および分類のバグには、電気刺激への応答の重要な毒 (例えば十分な質量分析法による解析) が出なかった。Belostomatid バグや略奪ハモグリムシから毒を収穫する電気刺激を使用もできます。しかし、サソリ (タイコウチ) の電気刺激は毒テングからではなく頭部腺のみの内容のリリースを誘発しました。いくつかの種の電気刺激による毒を収穫する失敗は毒液腺と毒8のリリースを制御する生理学的メカニズムの形態学的複雑さのためらしい。
電気刺激、 P. plagipennis、Havinthus rufovariusreduviids、 P. ラダマンテュスと belostomatidタガメ幼虫 distinctifemur意志のための毒を自発的に解放に加えて、テングから毒を取り出す中に処理します。このような毒吐出よく守備表示と一緒に伴われます。P. ラダマンテュスは、守備も毒吐く4を我々 が気づいていない他のサシガメ種のヘビ24やスパイダー25で発生します動作します。
SDS-PAGE およびプロテオミクス実験は、電気刺激や嫌がらせによって収穫される毒がタンパク質が豊富な6,7,8だと示します。蛋白質は、無機イオンや他の物質に毒が含まれている可能性がありますでもあるが、材料の存在の大部分を占めています。電気刺激や嫌がらせによって通常得られるサシガメ毒は、100 ペプチドやタンパク質 (図 1図 2) を含んでいます。Belostomatid の毒は、リゾリン13で金持ちになる以前報告されています。Belostomatine 水バグDiplonychus 大らかから毒の赤外線吸光度スペクトルは蛋白質とリゾリンの両方のコンテンツと一致しています。Lethocerine L. distinctifemur、蛋白質およびないリゾリン6のみで証拠が分かった。
クモ毒26の報告、かめむし類昆虫から採取した毒濃度と使用される昆虫および収穫する方法によって組成が変化する可能性があります。希薄化後の毒サンプルの紫外分光 50 〜 250 の高蛋白質濃度と一致して、原液の毒 50-250 (10 mm パスの長さ) の吸光度値 (280) によって示される mg/mL7,12,19。獲物の剥奪は、pH27の連続の減少と同様、毒濃度と中風の人に潜在的な3連続増加が発生する報告されています。ただし、長期の飢餓は、条件と死の損失になります。濃度だけでなく、heteropterans から収穫される毒、メソッドはその組成は影響可能性があります。サシガメP. plagipennisから毒の毒素組成は、それが電気刺激や嫌がらせ8で収穫されるかどうかによって著しく異なっていた。P. plagipennis、場合これは嫌がらせが AMG の内容を得られたに対し、電気刺激、PMG の内容を降伏に起因する示されました。毒を用いて電気刺激、しかしない嫌がらせ、強力麻痺した獲物の昆虫 (図 3)。しかし、それは明らか他のサシガメ科または他のカメムシ目にどの程度この結果を一般化できます。
毒腺を解剖によって直接毒を収穫と腺組織 (非毒) 蛋白質の汚染を犠牲にして回避に毒腺の制御メカニズムことができます。関係なく、切り裂かれた材料から得られるエキスは、活性/毒性の試金に使用できます。たとえば、PMG、AMG、 P. plagipennis、上記のプロトコルを使用して準備の AG のエキスを液体クロマトグラフィー/タンデム質量分析法による8を使用して行った。このプロセスは、合計 182、114、うちは、45、51、12 は推定ハウスキーピング タンパク質として分類される残りのタンパク質とアミノ酸シーケンスの特性に基づいて推定毒腺タンパク質として分類された合計で 71 蛋白質を識別されます。昆虫に PMG、しかしない AMG や AG のエキスの注射は、まひ状態および死8で起因しました。
| サギ科 | 家族 | 亜科 | 二項名前 | 共通名 | 電気刺激 | 嫌がらせ | 郭清 |
| Cimicomorpha | サシガメ科 | Harpactorinae | Pristhesancus plagipennis | 一般的なブリスベン サシガメ | √ | √ | √ |
| Havinthus rufovarius | レッドタイガー サシガメ | √ | √ | √ | |||
| Scipinia arenacea | 赤とげのあるサシガメ | √ | nd | √ | |||
| Gminatus属 | オレンジ色の大型の暗殺者虫 | √ | nd | √ | |||
| Trachylestes aspericollis | 小さな赤いサシガメ | √ | nd | nd | |||
| Reduviinae | Platymeris属 | 巨大なアフリカ暗殺バグ | √ | √ | √ | ||
| Psytalla 接種 | とげのあるサシガメ | √ | nd | √ | |||
| Peiratinae | Ectomocoris属 | オレンジ サシガメ | √ | nd | √ | ||
| Peirates属 | 暗殺者の黒い虫 | √ | nd | nd | |||
| Stenopodainae | Oncocephalus属 | - | √ | nd | √ | ||
| Thodelmus属 | - | x | nd | √ | |||
| Holoptilinae | Ptilocnemus キツネザル | 羽足バグ | x | x | nd | ||
| Emesinae | Stenolemus属 | スレッド足バグ | x | x | x | ||
| Pentatomomorpha | カメムシ科 | Asopinae | Amyotea hamata | 黄色の捕食性カメムシ | √ | nd | nd |
| Nepomorpha | タイコウチ | Ranatrinae | ミズカマキリ区 | 水スコーピオン | x, cg | x | √ |
| タガメ | Belostomatinae | Diplonychus 大らか | 水のバグ | √ | nd | nd | |
| タガメ | Lethocerinae | タガメ幼虫sp。 | 巨大な水のバグ | √ | √ | √ | |
| 目盛りは、成功した;クロス、失敗した;nd、未定。cg、頭部腺放電のみ | |||||||
表 1: 分類群の特異性 heteropterans から毒を収穫するための方法。
図 1: 2D SDS-PAGE スポットのクロマトグラフィー-タンデム質量分析と毒の HPLC 分画によって検出される蛋白質で採集されたP. plagipennis (プロトコル 1) 電気刺激による、豊富なプロテアーゼ、カブ ドメイン蛋白質とかめむし類毒家族 1 蛋白質を示すします。(A) 第 2 SDS ページのゲル原油のp. plagipennis毒、蛋白質家族 LC ・ MS/MS ゲル スポットの識別を示します。高速液体クロマトグラフィー (B) 収集した分数のクロマトグラフィー-タンデム質量分析によって識別されるタンパク質ファミリーを示す、 p. plagipennis毒の分別からクロマト グラム。許可7で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: シーケンスの毒で各主要蛋白質クラスに属するの割合P. plagipennis.許可7で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:P. plagipennis 電気刺激、しかしない嫌がらせによって得られる毒麻痺昆虫。(A) 電気刺激や嫌がらせ、または水、クリケットの脱出によって得られる毒を注射する効果。腹部と上を向いたシャーレのふたを脱出する時間に注入された 0.17 μ L 毒と同じ毒条件ごとに (最大 300 s で s、平均 ± SD) 得点されました。(B) 用量-反応曲線のP. plagipennisから電気刺激によって得られた毒によって脱出成功を阻害します。許可8で再現。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
サシガメ毒を収穫の最も重要なステップは、研究の目的に応じて適切な方法を選択します。かめむし類の毒を収穫のために提示する 3 つの方法のそれぞれが長所と短所下流のアプリケーションに応じて。
テング (プロトコル 1-3) から毒を追放するバグを誘発する腺組織で毒の汚染を回避します。さらに、これらのメソッドは非殺傷、バグズ ・ ライフのコースで何度も繰り返すことができます。電気刺激は通常、毒の最大量を提供し、いくつか研究5,8によると昆虫を捕食する強力な毒性を持つ毒を得られます。防御的な応答を刺激、テングと電気8異なるたんぱく毒をもたらす可能性があります 1 つの毒を引き出すために別の方法です。ただし、多くの種の電気刺激と挑発が動作しません、毒液腺の分泌の出力の平行調査なしは不明だが腺腔 (または腺ルーメンの組み合わせ) が収穫されています。
相補的な多くの方法では郭清 (プロトコル 4) によって毒を収穫です。郭清はストアド毒にアクセスするための直接的な方法を表し、毒腺の各区画を別々 に収穫またはプールすることができます (すなわち、'間違った' 毒が収穫されている可能性は除外される)。ただし、メソッドは致命的、さらに組織によって毒のわずかな汚染を引き起こします。多くのカメムシ亜目が小さすぎる (または Emesinae、スレッド脚バグの場合あまりにも細長い) 郭清によって毒を収穫できるように。郭清を別々 に個々 の腺コンパートメントからタンパク質を抽出する使用する場合、すぐに葉を分離し、個別にクロス汚染を避けるために内容を抽出する重要です。
紹介した方法は、勉強した特定の種に応じて変更する必要があります。電気刺激による毒のコレクションを最適化するための主な側面がどのようにバグは拘束されました。たとえば、ほとんどの reduviids は運動の広い範囲にわたっての口吻を拡張することができます。これらの種は、ゴムバンドを使用するプラットフォームで単に拘束された右の方法アップでき、テングが手動で外反し。Belostomatids より柔軟なテングと種のレトルトやメカニカル アームを使用して正しい角度でコレクションの容器を上下逆さまに位置に昆虫を抑制する必要は代わりに。大きさと電気適用のパターンも最適化する必要がありますと、この場合、それは良い低起動し、致死率を避けるために印加電圧を徐々 に増やします。
研究の目的は、特定の種が生成し、毒を使用する方法の詳細な理解を達成するためには、綿密な調査複数収穫方法と同様、質量分析法、RNA シーケンス実験などの技術を組み合わせることがあります。必須。目的は、生体分子のライブラリとしていくつかの目的の生物活性のために上映されるとかめむし類の毒を使用することです、嫌がらせ、電気刺激で得られる毒サンプルのパネルや郭清が適さない場合があります。ただし、収穫毒の正常な生物学的役割はどのような生物活性が存在を決定する可能性があります。たとえば、防衛用の毒です (痛みを引き起こす) algogenic エージェントを含む可能性が高いに対し、捕食のため使用される毒は殺虫化合物を含有する可能性が高いです。
このプロトコルでは、ムスカリン性アセチルコリン受容体のアゴニスト ピロカルピンによる毒収穫は掲載していません。今後の実験計画は、上記の方法に比べてピロカルピン誘導毒追放の特性を決定する必要があります。
この記事で私たちはかめむし類昆虫から毒を取得する研究者が許可される方法を発表しました。成功した毒コレクションは、カメムシ目にさらに生産、構成、機能および毒の進化への調査に許可されます。さらに、いくつかのかめむし類毒素は、環境にやさしい殺虫剤、鉛分子治療学を開発する、または生物学的システムを検討する科学的な用具としてのユーティリティを見つけるかもしれない。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
我々 は金融を認めるオーストラリア国立保健・医学研究評議会 (主要研究員、オーストラリアの研究評議会 (助成金 DP130103813 と G.F.K.、EABU に DECRA 交わり DE160101142 に LP140100832) からサポートG.F.K. に APP1044414)、クイーンズランド大学 (A.A.W. に員) など。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electostimulator | Grass Technologies | S48 Square Pulse Stimulator | Electrostimulator allowing pulsed electrostimulation |
| Featherlight tweezers | Australian Entomological Supplies | E122B | For handling live venomous insects |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma | 4693124001 | For preventing autoproteolytic digestion of venom |
| Dissection equipment | Australian Entomological Supplies | E152Micro | For fine dissections |
| Insect pins | Australian Entomological Supplies | E162 | For fine dissections |
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