Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at syntetisere bioinspired silica materialer og immobilisere enzymer deri. Silica er syntetiseret ved at kombinere natriumsilicat og en Amin 'additiv', som neutraliserer på en kontrolleret hastighed. Materialeegenskaber og funktion kan ændres i situ enzym immobilisering eller post syntetiske syre eluering af indkapslede tilsætningsstoffer.
Abstract
Målet med de protokoller, der er beskrevet heri er at syntetisere bioinspired silica materialer, udføre enzym indkapsling deri, og delvist eller helt rense det samme ved syre eluering. Ved at kombinere natriumsilicat med en Polyfunktionelle bioinspired tilsætningsstof, dannes silica hurtigt på omgivelsesforholdene ved neutralisering.
Effekten af neutralisering sats og biomolekyle tilføjelse punkt på silica udbytte er undersøgt, og biomolekyle immobilisering effektivitet er rapporteret for varierende tilføjelse punkt. I modsætning til andre porøse silica syntese metoder, er det vist, at de milde betingelser for bioinspired silica syntese er fuldt kompatible med indkapsling af sarte biomolekyler. Derudover bruges milde betingelser på tværs af alle syntese og modifikation trin, hvilket gør bioinspired silica et lovende mål for opskalering og kommercialisering som både nøgne materiale og aktiv støtte medium.
Syntesen er vist sig at være meget følsom over for betingelser, dvs., neutralisering sats og endelige syntese pH, men stram kontrol over disse parametre er påvist ved hjælp af auto titrering metoder, hvilket fører til høj reproducerbarhed i reaktion progression pathway og udbytte.
Bioinspired silica er derfor en fremragende aktive materielle support valg, viser alsidighed mod mange aktuelle programmer, ikke begrænset til dem, der demonstrerede her, og styrken i fremtidige anvendelser.
Introduction
Brug af silica som en strukturel støtte for industrielle katalysatorer er veletableret, giver mulighed for forbedrede katalysator aktivitet, stabilitet og processability,1 dermed potentielt reducere den driftsomkostninger. Disse fordele forværres for enzymet immobilisering, som oplagring inden for en silica pore system kan give betydelige fordele på enzymet levetid over dens gratis modstykke. I overensstemmelse hermed, meget indsats har udnyttet i at finde den bedste metode til at knytte enzymer til silica arter, med flere anmeldelser sammenligne undersøgelser ved hjælp af forskellige metoder til immobilisering på kiselholdige solid understøtter. 2 , 3 , 4
Enzymer er typisk knyttet via physisorption eller kovalent binding, ud over indkapsling i et porøst materiale. 5 men der er betydelige ulemper relateret til hver metode: physisorption afhængig af forbigående overflade interaktioner mellem silica og biomolekyle, som meget let kan blive svækket reaktionsbetingelser fører til det uacceptable enzym udvaskning. Den meget stærkere kovalente vedhæftede resulterer normalt i lavere aktivitet på grund af den reducerede konformationelle frihed af den aktive arter. Indkapsling kan resultere i reducerede aktivitet af enzymet utilgængelighed eller diffusional begrænsninger. 6
Den seneste udvikling i feltet af mildere (ofte døbt ' bioinspired') silica synteser har etableret i situ -indkapsling af biomolekyler og andre aktive arter under den materielle syntese. 7 , 8 , 9 denne metode negerer mange af ulemperne ved konventionelle immobilisering - i modsætning til chemisorption tilgange konformationelle frihed af biomolekyle vedligeholdes ved hjælp af svagere noncovalent interaktioner, men som pore hulrum former omkring biomolekyle, udvaskning er stadig forhindret. Indkapsling er blevet påvist for at arbejde for en vifte af biomolekyler og endda hele celler,10 , og gennem indkapsling i bioinspired silica effekter såsom deaktivering på grund af barske proces betingelser kan undgås. 7 , 11
Målet med den metode beskrevet heri er at forberede en porøs silica med kontrollerbare egenskaber, omgivende betingelser, ved hjælp af en bioinspired organiske additiv. Metoden kan let ændres til at omfatte indkapsling af enten uorganiske eller bioorganisk molekyler, et udvalg af hvilke opføres. Yderligere viser vi en letkøbt metode til at ændre de som frembragt materialer for at opnå ønskede bulk egenskaber og rensning ved at fjerne skabelonen organisk gennem syre eluering.
I forhold til den traditionelle syntese af skabelonbaserede porøse silica understøtter (fxsilica materialer skabelonbaserede gennem Supramolekylær overfladeaktivt forsamlinger som MCM-41 eller SBA-15)12 denne metode er betydeligt hurtigere og mildere, aktivering skræddersyet, i situ indkapsling uden behov for talrige immobilisering trin og besværlige rensning. Desuden åbner brug af syre eluering snarere end kalcinering muligheden for økologisk overflade functionalization.
Denne metode er meget gælder for dem, der arbejder i aktive arter immobilisering, der har fundet physisorption eller kovalent immobilisering at være ineffektive. Det er også nyttigt for dem forske proces skala-up som bioinspired syntese er unikt positioneret for industrialisering i forhold til konventionelle skabelonbaserede silica materialer. 13 , 14 denne metode ikke er anbefalet til anvendelser, der kræver en ordnet række porer inden for den materielle f.eks.,for fotonik, som den materielle struktur er uorganiseret trods nogen lighed i bulk egenskaber.
Protocol
1. forberedelse af forløber løsninger (og valgfri Encapsulant løsninger)
- Til en 180 mL plastikbeholder, måle 1,5 mmol for natrium silikat pentahydrat (318.2 mg), og opløses i 20 mL deioniseret vand.
- På samme måde i en yderemballage, måle 0,25 mmol af pentaethylene hexamine (PEHA, 58,1 mg) og opløses i 20 mL deioniseret vand.
- Når du bruger alternative Amin-holdige forbindelser fxdiethylenetriamine (DETA) eller triethylenetetraamine (Langeskov), sikre, at det samlede Si:N muldvarp forhold forbliver konstant på 1 (dvs. svarende til 0,5 mmol af DETA eller 0.375 mmol af Langeskov i den beskrevne procedure)15.
- Når du bruger polymere Amin tilsætningsstoffer fxpoly(ethyleneimine) (PEI) eller poly(allylamine hydrochloride) (PAH), bevare koncentrationen af 1 mg/mL (endelige reaktion volumen)15.
Forsigtig: Håndtere disse aminer kun inde i et stinkskab, da de er ætsende eller giftigt i deres rene former (især som dampe).
- Hvis du vil udføre i situ indkapsling under syntesen, opløse en forudbestemte masse protein (heri 50 mg af bovin Serum Albumin, BSA) i 5 mL deioniseret vand. Trække dette beløb af vand fra deioniseret vand skal bruges til opløsning af natrium silikat pentahydrat volumen.
- For at lette proteinet opløsningen uden at ændre sin struktur, når blandet med deioniseret vand, cap beholderen og opbevares ved 4 ° C. Check lejlighedsvis på fremskridt, opløsning, helst uden omrøring.
2. silica syntese
- Kombinere løsninger for natrium silikat pentahydrat og PEHA i en af objektbeholderen 180 mL og tilsættes tilstrækkeligt deioniseret vand for at gøre endelige løsning bind 41 mL (eller 46 hvis i situ indkapsling udelades).
- Placer den frisk tilberedt blanding af natrium silikat og PEHA løsninger på toppen af en omrører plade, tilføje en omrører bar for at give ensartet blanding.
- I dette fartøj, suspendere en pH-sonde og optage den indledende pH.
- På dette tidspunkt, vælge, at fjerne en 750 µL alikvot af de startende blandingen for senere bestemmelse af den indledende [Si] koncentration ved hjælp af molybdæn blå spektrofotometriske assay, som beskrevet i trin 8,1.
- Begynde syntesen ved at tilføje et forudbestemt antal 1 M HCl, som beregnes fra figur 1, og observere de umiddelbare evolution af turbiditet (Se figur 2)
- Så snart den syre tilføjelse er, tilføje encapsulant løsning (hvis nogen) så hurtigt som muligt.
Bemærk: Endelige mængden givet disse mængder er 50 mL af samlede reaktionsblandingen, fører til Si og N koncentrationer af 30mM. Dette kan skaleres som ønsket ved at multiplicere alle ovennævnte mængder med en konstant mængde. - Registrere pH efter 5 min til at bestemme reaktion er afsluttet; sikre, at pH 7 ± 0,05.
3. syre eluering af materialer
- Ændre sammensætningen af producerede silica efter reaktionen har nået afslutning (enten som en som lavede koagel eller af resuspending en tidligere syntetiserede udsnit af silica) ved tilsætning af yderligere syre.
- Hvis resuspending silica, bland ca 150 mg som forberedt bioinspired silica med 100 mL deioniseret vand i en 180 mL plastikbeholder, og sted på toppen af en omrører plade.
- Når suspensionen er godt blandet, suspendere en pH-sonde i fartøjet.
- Titreres i yderligere HCl, indtil den ønskede pH-værdi (mellem 7 og 2) er nået og gør det muligt for at stabilisere for ca. 1 min.
- Vente en yderligere 5 min at sikre systemet har fuldt ekvilibreres, og derefter gå videre til at isolere den solide silica.
4. silica Separation og tørring
- Dekanteres bioinspired silica suspension til 50 mL centrifugeglas.
- Der centrifugeres suspension ved 5.000 g i 15 min.
- Fjern supernatanten efter centrifugering og butik for yderligere analyse (f.eks. Bradford assay, se nedenfor). Refill centrifugeglas med deioniseret vand og genopslæmmes silica brug en vortex-mixer.
- Gentag centrifugering, supernatanten opbevaring og resuspension to gange.
- Efter den sidste centrifugering, Fjern supernatanten og skrabe silica i en keramisk crucible.
- Tør i ovn overnatning på 85 ° C.
- Hvis indkapsling har fundet sted, skal du bruge en freeze-drying facilitet eller ovn opererer under vakuum til at undgå protein denaturering.
5. fremstilling af molybdæn blå reagens (MBR) [Si] bestemmelse
- En plast 1 L målekolbe, tilføje 8 mmol (10 g) ammonium molybdat tetrahydrat i et stinkskab.
- Opløs dette i 500 mL deioniseret vand under omrøring.
- Surt løsningen af omhyggeligt tilføjer 60 mL 10 M HCl løsning.
- Justere den endelige mængden til 1 L.
6. fremstilling af para-aminophenol sulfat reduktionsmiddel (RA) [Si] bestemmelse
- Placer en 500 mL glas målekolbe i et vandbad ved stuetemperatur på en omrører plade i et stinkskab.
- Tilføje 111 mmol (10 g) af vandfri oxalsyre, 19,5 mmol (3,35 g) af para-aminophenol sulfat og 16 mmol (2 g) af natrium sulfit, og opløses i 250 mL vand.
- Forsigtigt og langsomt tilføje 92 g (50 mL) af mættede svovlsyre under omrøring og vente på opklaring at køle.
- Endelig, fortyndes til 500 mL med deioniseret vand.
7. Silicomolybdic syre Assay på monomere Silica arter
- I en 5 mL plastik hætteglas produceret fortyndet 300 µL af MBR i trin 5.4 med 3 mL deioniseret vand.
- Tilsæt 10 µL af en kiselsalte lakmusprøve løsning og ryst til at blande.
Bemærk: Denne løsning vil langsomt bliver gule. - Efter nøjagtig 15 min, tilsættes 1,6 mL reduktionsmiddel forberedt fra afsnit 6 til at reducere den gule silicomolybdate komplekse til sin blå isomer.
- Tillade en blå farve til at udvikle for mindst 2, men ikke mere end 24 timer.
- Måle prøve absorbans ved 810 nm i en UV-vis Spektrofotometer og beregne [Si] mod en kalibreringskurve.
8. siliciummangan Molybdic syre Assay på polymere Silica arter
- For at måle koncentrationen af polysilicat arter ved hjælp af metoden molybdæn blå i et microcentrifuge rør, kombinere 750 µL 2 M natriumhydroxidopløsning med 750 µL silica suspension.
- Seal og sted i en microcentrifuge float.
- Sikre tilstrækkelig headspace er tilbage i røret at forhindre brister på grund af presset hober sig op.
Bemærk: En headspace af 500 µL er normalt tilstrækkelig til at undgå dette. Alternativt, proceduren kan udføres i åben hætteglas så længe flydende tab på grund af fordampning er tegnede sig for.
- Sikre tilstrækkelig headspace er tilbage i røret at forhindre brister på grund af presset hober sig op.
- Float microcentrifuge rør i et vandbad, opvarmes til 80 ° C og lad den opløses i 1 time.
- Efter 1 time er gået, Fjern microcentrifuge rør og tør uden for tør.
- Når afkølet, kan [Si] bestemmes som beskrevet ovenfor, som beskrevet i trin 7,2 til 7,5.
9. Bradford Assay Procedure for bestemmelse af proteinkoncentration i Silica
- Indsæt et forudbestemt antal (stuetemperatur) Bradford reagens og prøve i hver tildelte kuvette (Se tabel 1 og tabel 2 for bestemte mængder). Bruge engangs pipette tips for hver kuvette at undgå volumen ændringer på grund af karakteren af reagenset og Gentag hvert punkt i tre eksemplarer.
- Bland hver kuvette af invertere 3 gange og lad for at udvikle i 10 min.
- Måling af absorbans ved 595 nm med ren supernatanten som tomme.
- Beregne den oprindelige absorbansen af hver kuvette ved at trække fra hver måling absorbansen fundet for kontrolprøve (kuvette nr. 0 i begge assays).
- Beregne proteinkoncentration ukendt prøve ved hjælp af en kalibreringskurve (figur 3). I tilfælde af en udvanding af den oprindelige prøve skal fortyndingsfaktoren regnskabsføres.
- Oprette en kalibreringskurve for hvert sæt af eksperimenter ved at plotte målte absorbans mod koncentration af BSA at undgå tilfældige udsving, som kan påvirke den assay følsomhed.
- Selvom dette protein assay er beregnet til at bruge BSA som standard til at kvantificere enhver form for protein, oprette en kalibreringskurve for hver specifik protein af interesse for forbedret nøjagtighed.
- Hvis proteinindholdet i den ukendte prøve forventes at være højere end det dækkede område af kalibreringskurven, fortyndes efter behov.
- Bestemme proteinindhold for hver prøve under resuspension at overvåge mulige protein tab.
Representative Results
De teknikker, der er beskrevet ovenfor er i stand til konsekvent og reproducerbar bundfald silica. Det er nemmest at finde ud af den hurtigt indsættende turbiditet i reaktion fartøj, som ved ophør af agitation udlignes spontant ind i en Tyk koagel udfældet silica (figur 2). Omfanget af reaktion og dermed udbytte kan bekræftes ved at måle massen af dette koagel efter adskillelse og er typisk 58 ± 6,5% (fig. 4, gul).
Yderligere indblik i reaktion progression kan oprettes ved at tilpasse molybdæn blå spektroskopisk metode til at registrere mængden af ureageret monomere silikat arter samt de arter, der har reageret på formen polysilicates eller 'oligomerer', men har ikke kunnet nå tilstrækkelig størrelse til at koagulere (figur 4, rød og blå henholdsvis).
Denne specifikke silica artsdannelse data er af særlig interesse, når man sammenligner forskellige titrering effektivitetsgevinster for nedbør reaktion - dvs hvordan den endelige reaktion pH og hastigheden, som denne er nået påvirker polymerisering af monomere silica til en 'oligomer' og dens efterfølgende koagulation til solid silica. Ved at ændre mængden af syre tilføjet i fase 2.4 lidt, under - eller slut - titration af reaktionsblandingen kan være udført (figur 5). Ved at måle silica artsdannelse igen for disse to tilfælde, ses en klar forskel i reaktionen er afsluttet (figur 4) trods kun mindre ændringer i profilen titrering af reaktion (figur 5).
Selv om ingen forskel er til stede mellem forbruget af monomere arter til de tre reaktion tilfælde (resterende mellem 29-33%), er der en klar forskel i mængden af oligomere silica arter, som udfældes i hvert enkelt tilfælde. Dette er i overensstemmelse med traditionel teori på sol-gel silicas - i sagen «eliminere» pH er holdt højere for længere, giver mulighed for individuelle partikler til at vokse og dermed medvirken effektiv koagulation; i 'overskridelse' tilfælde koagulation er induceret meget hurtigere på grund af den hurtige titrering, er dermed færre af silica arter vokset til en tilstrækkelig størrelse til at koagulere og blive fanget i den kolloide fase. 16
Betragtning af betydningen af titrering ved silica stiftelse, er en priori viden om passende titrering volumen afgørende. Selv om ikke kan ekstraheres fra reaktion støkiometrisk på grund af den komplekse protonation opførsel af amin tilsætningsstoffer og ændring af silica overflade syreindhold på koagulation, yderst pålidelig empiriske relationer mellem system indholdet, koncentrationer og titer diskenheder er let genereret (figur 1).
Når koagulation er afsluttet, kan materielle overflader let ændres ved hjælp af syre eluering, som er for nylig blevet rapporteret af forfatterne andetsteds. 13 dette giver mulighed for finjustering af materialeegenskaber såsom sammensætning, porøsitet og kemiske aktivitet af tilsætningsstoffet (figur 6a og b).
I denne undersøgelse, BSA blev brugt som et exemplar encapsulant enzym, men de teknikker, der beskrives her kan anvendes til flere enzymer17,18. Den procedure, der følges for protein opdagelse er Bradford assay protokol,19 bruger analysere gemt fra hver centrifugering cyklus. Mængden af protein i supernatanten beregnes ved hjælp af en kalibreringskurve, skabt af kendte mængder af BSA opløst i supernatanten af en prøve med nul proteinindhold (kontrolprøve). Mængden af protein indkapslet i silica beregnes ved subtraktion af den fundne protein i supernatanter fra den oprindelige mængde af protein tilføjet. Den eneste reagens nødvendige for analysen er Bradford reagens (enten indkøbt eller fremstillet efter standard opskrifter).
Der er tre typer af assay format, afhængigt af sample volumen, den forventede mængde af protein til at blive opdaget og målemetode anvendes. Heri, fulgte formatet er angivet for et spektrofotometer, kræver engangs kuvetter af makro og mikro størrelse og kan afsløre fra 10 µg/mL til 1,4 mg/mL af protein.
I figur 7 vises mængden af protein opdaget efter hver vask (trin 4.3) som en % af den oprindelige protein (som var 50 mg). Omkring blev ~ 50% af BSA opdaget i supernatanten efter den første centrifugering, som vedrører ~ 50% immobilisering effektivitet. Der var ingen BSA opdaget i de følgende vasker, BSA (eller nogen andre enzym) kunne være forsvarligt indkapslet under silica syntese med ingen udvaskning - er dette en væsentlig fordel ved denne metode. For at bekræfte tilstedeværelsen af BSA i silica produceret, blev Fourier Transform infrarød spektroskopi (FTIR) analyse udført. Tilstedeværelsen af de karakteristiske bands af akrylamid I og II i området i 1500/cm og 1650/cm (figur 8) i prøverne forberedt i nærværelse af BSA, men i kontrolelementet prøver (ingen BSA) bekræftet ikke tilstedeværelsen af BSA i faste stoffer.
Ud over metoden for enzym supplement beskrevet ovenfor (BSA tilføjet under neutralisering af reaktionsblandingen), er der andre mulige variationer fxBSA tilsætning i løbet af blanding af silikat og de additive løsninger, før neutralisering eller enzym føjes til silikat eller tilsætningsstof løsning før deres blanding og neutralisering. Nogle af disse muligheder blev undersøgt yderligere og immobilisering effektivitetsfordele (masse BSA immobiliseret som en procentdel af enzymet tilføjes reaktion system, beregnes baseret på Bradford assay) og mængden af BSA i den endelige silica blev målt) koncentration af BSA i silica som en procentdel af den samlede sammensatte vægt produceret, se figur 9). Det var klart, at når BSA blev føjet til de ureageret reagenser ( figur 9tilfælde A-C) der var nogen betydelige forskelle i immobilisering effektivitet eller mængden af BSA i den resulterende sammensat. Men når BSA er tilføjet under silica dannelse (tilfælde D i figur 9), immobilisering effektivitet og mængden af BSA i det endelige produkt blev både betydeligt lavere. Trods disse forskelle forblev den gennemsnitlige mængde af silica produceret uændret (mellem 85-90 mg). Disse observationer kan forklares på grundlag af ioniserende stråling (eller isoelektriske punkt) BSA, silikat/silica og tilsætningsstoffet. De forskellige metoder til tilføjelse giver mulighed for forskellige interaktioner mellem enzym og silica prækursorer. Som pH-værdien på tidspunktet for tilsætning af enzymet ændringer afgør ionisering af hver art intermolekylære vekselvirkninger, som igen vil kontrollere immobilisering effektivitet.
| Kuvette No | Koncentrationen af BSA (mg/mL) | Bradford reagens (mL) | Prøven (mL) |
| 0 | 0 (kontrol) | 1.5 | 0,05 |
| 1 | 0,1 | 1.5 | 0,05 |
| 2 | 0,25 | 1.5 | 0,05 |
| 3 | 0,5 | 1.5 | 0,05 |
| 4 | 0,75 | 1.5 | 0,05 |
| 5 | 1 | 1.5 | 0,05 |
| 6 | 1,25 | 1.5 | 0,05 |
| 7 | Ukendt prøve (X) | 1.5 | 0,05 |
Tabel 1: makro Bradford assay set-up og beregnede komponent diskenheder. Gyldig for bestemmelse vifte 0.1-1.4mg/mL (bind for 1 replikat)
| Kuvette No | Koncentrationen af BSA (ug/mL) | Bradford reagens (mL) | Prøven (mL) |
| 0 | 0 (kontrol) | 1 | 1 |
| 1 | 1 | 1 | 1 |
| 2 | 2.5 | 1 | 1 |
| 3 | 5 | 1 | 1 |
| 4 | 7.5 | 1 | 1 |
| 5 | 10 | 1 | 1 |
| 6 | Ukendt prøve (X) | 1 | 1 |
Tabel 2: Micro Bradford assay set-up og beregnede komponent diskenheder. Gyldig bestemmelse range 1-10 µg/mL (bind for 1 replikat)
Figur 1 : Kræves titer volumen mod silica koncentration for reaktion systemer ved hjælp af enten DETA eller PEHA som tilsætningsstoffet. Silica blev syntetiseret i varierende koncentrationer samtidig opretholde en [N]: [Si] forholdet 1 til to forskellige tilsætningsstof kemikalier. Fejllinjer er én standardafvigelse omkring middelværdien.
Figur 2 : Fotografier af silica koagel i reaktion fartøj (a) under og (b) efter agitation, demonstrerer løsning Turbiditet og afregning, der er vejledende for en optimal reaktion.
Figur 3 : Exemplar kalibreringskurven for Bradford makro assay. Supernatanten fra bioinspired silica syntese i mangel af BSA er blandet med en kendt mængde af protein, hvorefter Bradford analyse udføres som beskrevet i trin 9.1.
Figur 4 : Sidste polymerisering stater af silica arter for forskellige reaktionsbetingelser. Silica er syntetiseret ved hjælp af optimal (baseline) betingelser, såvel som med over- eller under titrering, hvorefter relative silica koncentration er kvantificeret til monomere eller dimerisk silicater (rød), polysilicat 'oligomerer' (blå) og ustabile koagulere silica (gul).
Figur 5 : Progression af pH gennem reaktion system som en funktion af indledende titer volumen. Syre er straks doseres efter ca. 38s blanding, forårsager pH til hurtigt falde til under 8. Bagefter, er yderligere mængder af syre automatisk doseret at pH var 7,0 ± 0,05 300s efter første tilføjelse. For over tilsætningen var dette ikke kan opnås, som den initiale dosis var tilstrækkelig til at droppe pH under 7, nå pH 6.65 efter 300s. Oprindelige HCl volumen tilføjet til 'underskridelse', 'baseline,' og 'overskridelse' var 6,90, 7,05 og 7,20 mL henholdsvis.
Figur 6 : Repræsentative egenskabsændringer efter forsuring af koaguleret silica materiale. a ændring af tilsætningsstoffet koncentration med hensyn til pH, og (b) ændring af silica porøsitet med hensyn til pH. Gengivet fra Manning et al. 13 under Creative Commons licens.
Figur 7 : BSA koncentration i bioinspired silica syntese analysere. Bradford assays blev udført på reaktion analysere efter centrifugering, hvorfra den relative mængde resterende (derfor tilstoppet fra den syntetiserede silica) blev fastsat.
Figur 8 : FTIR analyse på bioinspired silica med og uden aktive arter indkapsling. Spectra viste: sort linje: bioinspired silica, grå linje: ren BSA, blå streg: bioinspired silica fyldt med BSA. Lodrette stiplede linjer angiver karakteristiske akrylamid bands.
Figur 9 : Immobilisering effektivitet og mængden af BSA i komposit for silikatstøv fremstillet ved hjælp af PEHA. BSA blev tilføjet (A) i opløsningen PEHA før blanding med silikat, (B) i opløsningen silikat før blanding med PEHA, (C) efter indledende blanding af PEHA og silikat løsninger, og (D) efter blanding PEHA og silikat løsninger og neutralisere. Effektivitet er målt som % BSA indkapslet fra reaktionsmiljøet som en del af de samlede BSA tilføjet, mens BSA i silica betyder % koncentration af BSA i endelige silica sammensat af massen. Fejllinjer er én standardafvigelse omkring middelværdien.
Discussion
I den nuværende arbejde præsenterer vi en metode til hurtigt fældningen bioinspired silica materialer og indkapsling af biomolekyler deri. Vi demonstrere kritiske faser i proceduren, nemlig mængden reaktion-indlede syre tilføjes, og tidsplanen for tilføjelsen af biomolekyle encapsulant. Vi viser effekten af syre tilføjelse beløb på både reaktion progression og udbytte (figur 4 og figur 5, henholdsvis), og demonstrerede en metode for stram kontrol over syntese betingelser, giver mulighed for konsistens trods denne følsomhed. Vedrørende aktive arter indkapsling, selvom ligetil med hensyn til procedure, indkapsling er vist sig at være følsomme over for betingelserne for eksperimentet (rækkefølgen af tilsætning, pH af tilsætning, miljøforhold), men sammenhængen i materiale egenskaber er igen opnåelige.
Syntese betingelser kan ændres ved hjælp af forskellige tilsætningsstoffer, hvoraf mange har været offentliggjort andetsteds,15 giver en række morfologier og glasårer. Yderligere, efter syntetiske teknikker til at ændre og kemisk skræddersy bioinspired silica materialer er blevet rapporteret som mild rensning13 og overflade Amin dekoration. 20 endelig, på grund af den milde, vandige karakter af syntesen, i situ indkapsling er muligt for en bredere vifte af substrater end de viste her, lige fra enzymer17,18 til hele celler,21 metal salte,22 aktive farmaceutiske ingredienser,23 og quantum dots. 24
I modsætning til andre økologiske-medieret silica synteser (såsom MCM-41 eller SBA-15 familien af materialer) bestilt Polyfunktionelle arten af bioinspired tilsætningsstoffer ikke kan producere pore strukturer, eller meget monodisperse partikelstørrelse distributioner karakteristisk for Stöber-type silica. 25 dette er på grund af manglende veldefinerede micellization opførsel af bioinspired tilsætningsstoffer (uden for særlige tilfælde)26 kombineret med deres øgede katalytisk aktivitet over monofunctional Amin-holdige tilsætningsstoffer. 26
På den anden side, muliggør denne Polyfunktionelle additive natur brug af kortere reaktionstider og mildere temperatur og tryk i forhold til andre økologiske-medieret silica synteser. Dette fører også til muligheden for stuetemperatur tilsætningsstof eluering som beskrevet ovenfor, som endnu ikke opnås for disse andre silica familier på grund af detaljerne i deres overfladekemi. 27 , 28 , 29 derfor bioinspired silica materialer har vist sig at være både mere økonomisk og praktisk at producere på en større skala, fører til lettere kommercialisering og udvikling. 14
Sammenfattende repræsenterer bioinspired silica syntese en hurtig, facile metode til fremstilling af aktive arter understøtter eller gas sorptionsmiddel medier. Gennem streng kontrol af pH under og efter reaktionen, kan en bred vifte af silica-Amin kompositter syntetiseres med varierende egenskaber, som yderligere suppleres af muligheden for i situ indkapsling af en række forskellige organiske, uorganiske, eller bio-organiske materialer. Uafhængige post syntetiske modifikation af bioinspired tilsætningsstof og encapsulant koncentration har endnu skal opnås, repræsenterer metoderne et lovende skridt i retning af miljøvenlige kemiske processer.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansiel interesse.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke den finansielle støtte fra Institut kemiske og biologiske Engineering (universitetet i Sheffield) og EPSRC (EP/L017059/1 og P006892-EP-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silica synthesis | |||
| Sodium silicate pentahydrate | Fisher scientific | 10070470 | |
| Pentaethylene hexamine (PEHA) | Sigma-Aldrich | 292753 | |
| Diethylenetriamine (DETA) | Sigma-Aldrich | D93856 | Toxic |
| Triethylenetetraamine (TETA) | Sigma-Aldrich | 90460 | |
| Poly(ethyleneimine) (PEI) | Polysciences | 6088 | 1.2K MW |
| Poly(allylamine hydrochloride) (PAH) | Sigma-Aldrich | 283215 | 17.5k MW |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Hydrochloric acid (HCl) 1M | Fisher Scientific | 10487830 | |
| Silicomolybdic acid assay | |||
| Ammonium molybdate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | A7302 | Product replaced by M1019 |
| Hydrochloric acid (HCl) 37.0%wt | Fluka Analytical | 84436 | |
| Anhydrous oxalic acid | Sigma-Aldrich | 75688 | |
| Para-aminophenol sulphate | Fisher Scientific | 10446880 | |
| Sodium sulphite | Fisher Scientific | 10234400 | |
| Sulphuric acid | Sigma-Aldrich | 84727 | |
| Bradford assay | |||
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916 | |
| Equipment | |||
| Autotitrator Titrando 902 | Metrohm | 2.902.0010 | |
| 801 magnetic stirrer plate | Metrohm | 2.801.0040 | For use with above |
| 800 Dosino | Metrohm | 2.800.0010 | For use with above |
| Aquatrode Plus | Metrohm | 6.0253.100 | For use with above |
| Centrifuge Sorvall ST16 | Thermo Scientific | 11814243 | Code is for Fisher scientific |
| UV-Vis spectrophotometer Genesys 10A | Thermo scientific | 12104972 | Code is for Fisher scientific |
References
- Swaisgood, H. E. The use of immobilized enzymes to improve functionality. Proteins Food Process. , 607-630 (2004).
- Hartmann, M., Kostrov, X. Immobilization of enzymes on porous silicas - benefits and challenges. Chem Soc Rev. 42 (15), 6277 (2013).
- Hudson, S., Cooney, J., Magner, E. Proteins in Mesoporous Silicates. Angew Chemie Int Ed. 47 (45), 8582-8594 (2008).
- Hanefeld, U., Gardossi, L., Magner, E. Understanding enzyme immobilisation. Chem Soc Rev. 38 (2), 453-468 (2009).
- Magner, E. Immobilisation of enzymes on mesoporous silicate materials. Chem Soc Rev. 42 (15), 6213-6222 (2013).
- Rodrigues, R. C., Ortiz, C., Berenguer-Murcia, Á, Torres, R., Fernández-Lafuente, R. Modifying enzyme activity and selectivity by immobilization. Chem Soc Rev. 42 (15), 6290-6307 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Bio-Inspired Silicon-Based Materials. 5, Springer Netherlands. Dordrecht. (2014).
- Luckarift, H. R., Spain, J. C., Naik, R. R., Stone, M. O. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support. Nat Biotechnol. 22 (2), 211-213 (2004).
- Betancor, L., Luckarift, H. R. Bioinspired enzyme encapsulation for biocatalysis. Trends Biotechnol. 26 (10), 566-572 (2008).
- Livage, J., Coradin, T., Roux, C. Encapsulation of biomolecules in silica gels. J Phys Condens Matter. 13 (33), R673-R691 (2001).
- Hartmann, M., Jung, D. Biocatalysis with enzymes immobilized on mesoporous hosts: the status quo and future trends. J Mater Chem. 20 (5), 844 (2010).
- Carlsson, N., Gustafsson, H., Thörn, C., Olsson, L., Holmberg, K., Åkerman, B. Enzymes immobilized in mesoporous silica: A physical-chemical perspective. Adv Colloid Interface Sci. 205, 339-360 (2014).
- Manning, J. R. H., Yip, T. W. S., Centi, A., Jorge, M., Patwardhan, S. V. An Eco-Friendly, Tunable and Scalable Method for Producing Porous Functional Nanomaterials Designed Using Molecular Interactions. ChemSusChem. 10 (8), 1683-1691 (2017).
- Drummond, C., McCann, R., Patwardhan, S. V. A feasibility study of the biologically inspired green manufacturing of precipitated silica. Chem Eng J. 244, 483-492 (2014).
- Patwardhan, S. V. Biomimetic and bioinspired silica: recent developments and applications. Chem Commun. 47 (27), 7567-7582 (2011).
- Iler, R. K. The Chemistry of Silica: Solubility, Polymerization, Colloid and Surface Properties and Biochemistry of Silica. , Wiley. http://books.google.co.uk/books?id=Dc0RAQAAIAAJ (1979).
- Forsyth, C., Yip, T. W. S., Patwardhan, S. V. CO2 sequestration by enzyme immobilized onto bioinspired silica. Chem Commun (Camb). 49 (31), 3191-3193 (2013).
- Forsyth, C., Patwardhan, S. V. Controlling performance of lipase immobilised on bioinspired silica. J Mater Chem B. 1 (8), 1164 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72 (1-2), 248-254 (1976).
- Ewlad-Ahmed, A. M., Morris, M. A., Patwardhan, S. V., Gibson, L. T. Removal of formaldehyde from air using functionalized silica supports. Environ Sci Technol. 46, 13354-13360 (2012).
- Yang, S. H., Ko, E. H., Jung, Y. H., Choi, I. S. Bioinspired functionalization of silica-encapsulated yeast cells. Angew Chemie. 50 (27), 6239-6242 (2011).
- Alotaibi, K. M., et al. Iron supported on bioinspired green silica for water remediation. Chem Sci. 8 (1), 567-576 (2017).
- Davidson, S., Lamprou, D. A., Urquhart, A. J., Grant, M. H., Patwardhan, S. V. Bioinspired Silica Offers a Novel, Green, and Biocompatible Alternative to Traditional Drug Delivery Systems. ACS Biomater Sci Eng. 2 (9), 1493-1503 (2016).
- Patwardhan, S. V., Perry, C. C. Synthesis of enzyme and quantum dot in silica by combining continuous flow and bioinspired routes. Silicon. 2 (1), 33-39 (2010).
- Nozawa, K., et al. Smart control of monodisperse stöber silica particles: Effect of reactant addition rate on growth process. Langmuir. 21 (4), 1516-1523 (2005).
- Belton, D. J., Patwardhan, S. V., Annenkov, V. V., Danilovtseva, E. N., Perry, C. C. From biosilicification to tailored materials: optimizing hydrophobic domains and resistance to protonation of polyamines. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (16), 5963-5968 (2008).
- de Ávila, S. G., Silva, L. C. C., Matos, J. R. Optimisation of SBA-15 properties using Soxhlet solvent extraction for template removal. Microporous Mesoporous Mater. 234, 277-286 (2016).
- Cassiers, K., Van Der Voort, P., Vansant, E. F. Synthesis of stable and directly usable hexagonal mesoporous silica by efficient amine extraction in acidified water. Chem Commun. (24), 2489-2490 (2000).
- Tanev, P. T., Pinnavaia, T. J. Mesoporous Silica Molecular Sieves Prepared by Ionic and Neutral Surfactant Templating: A Comparison of Physical Properties. Chem Mater. 8 (8), 2068-2079 (1996).
