Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

Denne protokol giver forskere et nyt værktøj til at overvåge troskab af transkription i flere modelorganismer.

Abstract

Nøjagtig transskription er nødvendig for den trofaste udtryk for genetisk information. Overraskende selv, lidt er kendt om de mekanismer, der styrer troskab i transskription. For at udfylde dette hul i den videnskabelige viden, optimeret vi for nylig cirkel-sekventering assay til påvisning transskription fejl i hele transkriptom af Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokol vil give forskere med en kraftfuld ny værktøj for at kortlægge landskabet af transskription fejl i eukaryote celler, således at de mekanismer, der styrer troskab i transskription kan blive belyst i hidtil uset detalje.

Introduction

Genomet giver en præcis biologiske blueprint af liv. For at gennemføre denne plan korrekt, er det vigtigt for genom til blive transskriberet med stor præcision. Transskription er imidlertid usandsynligt, at være fejlfri. For eksempel, RNA polymeraser har længe været kendt for at være fejlbehæftet in vitro-1,2, og for nylig blev det vist, at de begår fejl i vivo samt3,5,6, især når de konfronteres med DNA skader7,8,9,10. Taget sammen, tyder disse observationer på at transskription fejl ske løbende i alle levende celler, tyder på, at de kunne være en potent kilde af muterede proteiner.

Denne proces kaldes transkriptionel mutagenese, adskiller sig fra klassisk mutagenese på to måder. Først, i modsætning til genetiske mutationer, transskription fejl påvirker både mitotiske og post mitotiske celler, som de ikke afhænger af DNA-replikation. At studere de mekanismer, der påvirker troskab af transkription vil derfor give værdifuld indsigt i mutation belastningen af både mitotiske og post mitotiske celler. Interessant, transskription fejl har for nylig været involveret i fremme af protein sammenlægning11,12,13 , og har været en hypotese for at bidrage til både carcinogenese10 og den udvikling af antibiotikaresistens i bakterier14.

For det andet, i modsætning til genetiske mutationer, transskription fejlene er forbigående karakter. Deres midlertidige eksistens er særligt udfordrende, fordi det gør transskription fejl overordentlig svært at opdage. For eksempel, mens flere laboratorier har udtænkt værdifulde reporter assays til studiet af transcriptional mutagenese, er disse assays kun kunne måle transskription fejl i et begrænset antal sammenhænge og model organismer4,15. For at overvinde disse begrænsninger, mange forskere har henvendt sig til RNA sekventering teknologi (RNA-FF.), som teoretisk kan transskription fejl registreres i hele transkriptom af enhver art. Disse undersøgelser er dog let forvirret af bibliotek konstruktion artefakter, som reverse transkription fejl, PCR forstærkning fejl og fejlbehæftet art sekventering selv. For eksempel, begå reverse transcriptases cirka én fejl hver ~ 20.000 baser, mens RNA polymeraser (RNAPs) forventes at gøre kun én fejl hver 300.000 baser5,6. Fordi fejlrate på reverse transkription alene dværge fejlrate af RNA polymeraser inde i cellerne, er det næsten umuligt at skelne sande transskription fejl fra artefakter forårsaget af bibliotek forberedelse i traditionelle RNA-Seq data ( Figur 1a).

For at løse dette problem har udviklet vi en optimeret version af cirkel-sekventering (Cirseq, eller C-seq fremover) assay5,16. Denne analyse tillader bruger hen til opdager transskription fejl og andre sjældne varianter i RNA hele transkriptom5. Cirkulære-sekventering analysen bærer dette navn, fordi et vigtigt skridt i denne analyse kredser omkring RNA circularization. Når RNA mål er circularized, er de omvendt transskriberet i en rullende cirkel mode, til at producere lineær cDNA molekyler, der indeholder mange kopier af den samme RNA skabelon. Hvis en fejl var til stede i en af disse skabeloner, vil denne fejl også være til stede i hver enkelt gentagelse indeholdt i cDNA-molekyle. Derimod fejl indført ved reverse transkription, PCR-amplifikation eller sekventering tendens til at opstå tilfældigt, og dermed vil være til stede i kun én eller to gentagelser. Således, ved at generere en konsensus sekvens for hver cDNA molekyle, og skelne tilfældige fejl fra fejl, der opstår i alle gentagelser, bibliotek konstruktion artefakter kan effektivt adskilles fra sande transskription fejl (figur 1b).

Hvis de bruges rigtigt, C-seq analysen kan bruges til at præcist afsløre sats af basen erstatningsvarer, indsættelser og sletninger i RNA hele transkriptom af enhver art (for eksempel Se Traverse og Ochman17). For eksempel, har vi brugt C-seq analysen for at give genome-wide målinger af fejlprocenten af transkription i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans med en enkelt base opløsning5 (upublicerede observationer). Oprindeligt brugt til at præcist sekvens RNA-virus populationer, er denne optimeret version af C-seq assay blevet strømlinet for at minimere barske betingelser under udarbejdelsen, bibliotek, der bidrager til biblioteket konstruktion artefakter. Derudover ved hjælp af en række af kommercielt tilgængelige kits, er gennemløb af analysen væsentligt forbedret, samt dens brugervenlighed. Hvis de bruges rigtigt, kan dette assay præcist afsløre tusindvis af transskription fejl pr. replikat, derved høj grad forbedre på tidligere studier6. Samlet set denne metode giver en kraftfuld værktøj til at studere transcriptional mutagenese og vil tillade brugeren at få ny indsigt i de mekanismer, der styrer troskab af transkription i en bred vifte af organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse

  1. RNases er allestedsnærværende; Derfor, Rengør arbejdsområdet grundigt ved at sprøjte det ned med en dekontaminering reagens (fx, RNase væk) og 70% ethanol. Spray ned enhver pipetter, kuglepenne eller tube stativer til at fjerne potentielle forureningskilder RNase.
  2. For at forhindre yderligere RNases fra forurener prøverne, bære en laboratoriekittel eller langærmet T-shirt under eksperimenter. Undgå kontakt mellem handskerne og indersiden af et rør, der skal bruges, især når du henter dem fra en kasse eller pose.
  3. Før den omvendte transskription, ændre handsker hyppigt.
    Bemærk: Optimale resultater, sætter ikke pause eksperiment før reverse transkription.

2. celle og animalske kultur og samling

  1. Saccharomyces cerevisiae vækst og samling
    1. Hvis en C-seq biblioteket er ønsket fra gær, først podes en enkelt koloni af S. cerevisiae i 3 mL medium indeholdende gærekstrakt, adenin, pepton og dextrose (YAPD), og Inkuber det natten over ved 30 ° C i en rullende tromle.
    2. Om morgenen igen podes kultur i 50 mL af YAPD medium til et optisk densitet (OD) på 0,1 og vokse i cellerne, indtil de når en OD på 0,5-0,7 (~ 7 x 106 celler/mL).
    3. Saml hele 50 mL kultur (ca. 350 x 106 celler) i en 50 mL konisk slange og spin celler ned til 3 min på 2.100 x g. Forsigtigt fjerne YAPD medium og vaske pellet engang med 1 x PBS.
    4. Derefter resuspenderes i 480 µL af lysisbuffer, 48 µL af 10% SDS og 480 µL af Phenol: Chloroform: Isoamyl alkohol (25:24:1), pH 6,8. Vortex prøve ved maksimal hastighed for 5 s, og overføre det til en 1,5 mL skruelåg tube med 750 µL af iskold zirconia perler (leveres med kittet). Fortsæt til trin 3 i denne protokol for celle lysis og total RNA udvinding.
      Bemærk: Alle reagenser kræves for trin 2.1.4 leveres i den anbefalede gær RNA udvinding kit. Disse reagenser arbejde lige så godt for gær, orme, og flyver så at efter samlingen af gær (trin 2.1), orme (trin 2.2) eller fluer (trin 2.3), en samlet tilgang kan bruges til at generere C-seq biblioteker (trin 3-10).
  2. Caenorhabditis elegans kultur og samling
    1. Hvis en C-seq biblioteket er ønsket fra orme, indbetale 30 voksne orme på en frisk plade af agar spottet med OP50 bakterier.
      Bemærk: Fem plader er tilstrækkelig for 1 replikeres.
    2. Kultur orme i 4 dage og indsamle orme ved at forsigtigt vaske pladerne med 5 mL af M9 media pool orme i en enkelt 50 mL konisk slange.
    3. Spin orme ned på 100 x g for 2 min til at oprette en pellet. Aftage centrifuger på laveste hastighed muligt, for ikke at forstyrre pelleten.
    4. Forsigtigt flytte orme til en 1,5 mL tube, vaske dem to gange i 1,5 mL af M9 medier og centrifugeres rør ved 100 x g i 1 min til at fjerne bakterier og generere en ren 100 µL pellet af orme.
    5. Resuspend orme i 480 µL af lysisbuffer, 48 µL af 10% SDS og 480 µL af Phenol: Chloroform: Isoamyl alkohol. Vortex prøve ved maksimal hastighed for 5 s og overføre det til en 1,5 mL skruelåg tube indeholder 750 µL af iskold zirconia perler. Fortsæt til trin 3 i denne protokol for lysering af orme og total RNA udvinding.
  3. Drosophila melanogaster kultur og samling
    1. Hvis en C-seq biblioteket er ønsket fra fluer, kultur 20 – 25 fluer i hætteglas, som indeholder enten dextrose eller en melasse-baserede medium. Alikvot flyver over 3 hætteglas, således at hver hætteglas indeholder ca 8 fluer.
    2. For at indsamle fluerne, skal du placere hætteglasset i en isspand, indtil fluer er bedøvet. Derefter indsamle dem med en pensel i en 1,5 mL tube. Indsamle ikke fluer af CO2 behandling.
    3. Lad fluerne varm til stuetemperatur (RT), og hurtigt tilføje en premade blanding af 500 µL af lysisbuffer, 50 µL af 10% SDS og 500 µL af Phenol: Chloroform: Isoamyl alkohol til røret. Bruge en micropestle til at slibe op flyver med ca 15 slag, ledsaget af en virksomhed, vride motion når pistil når bunden af røret.
    4. Hæld blandingen af fluer og lysis medier til en 1,5 mL skruelåg tube indeholder 750 µL af iskold zirconia perler og vortex det ved maksimal hastighed for 5 s. Fortsæt til trin 3 i denne protokol for lysering af fluer og total RNA udvinding.

3. total RNA oprensning

Bemærk: på dette tidspunkt alle tre protokoller konvergerer, og en enkelt, samlet tilgang kan bruges til at generere C-seq biblioteker.

  1. Skrue hætten på stramt og tillægger en vortexer røret med en adapter eller selvklæbende tape. Vortex rør ved maksimal hastighed for 10 min til lyse prøverne. Derefter centrifugeres prøve på 16,100 x g i 5 min. til at adskille de organiske opløsningsmidler fra vandfasen.
  2. Forsigtigt fjerne 400 – 500 µL af den vandige fase uden at forstyrre den hvide, overskyet interfase, og føje den til en 15 mL konisk rør indeholdende 1,9 mL binding buffer. Bland dem grundigt af vortexing.
  3. Tilføje 1,25 mL 100% ethanol og proeven blandes ved vortexing. Overføre 700 µL af prøven til et samlet i en collection tube filterpatron og spin prøve på 14.500 x g for 30 s. Gentag, indtil alle prøven er bestået gennem patronen.
    Bemærk: på dette tidspunkt, prøven kan vise lidt uigennemsigtig. Hvis for mange celler, orme eller fluer var mængden, bundfald kunne vises der kan tilstoppe filteret.
  4. Vask filteret med 700 µL vaskeopløsning 1 og to gange med 500 µL vaskeopløsning 2 eller 3. Slutte vasker med spinning prøver på 14.500 x g for 2 min til at fjerne eventuelle overskydende ethanol.
  5. Overføre filter cartridge til en 1,5 mL dolphin tube og tilføje 108 µL forvarmet eluering løsning (65 ° C).
    Bemærk: Udsæt aldrig RNA prøver for temperaturer højere end 65 ° C før en reverse transkription, som så vil provokere cytosin uracil deamination begivenheder, der er umulig at skelne fra transskription fejl.
  6. Forringe DNA-kontaminering i den isolerede RNA (Se trin 2.1 – 3.4) ved at tilføje 11 µL af 10 x DNase jeg buffer, 2 µL af RNase hæmmer og 4 µL af DNase jeg (8 U), og dem der inkuberes ved 37 ° C i 30 min.
  7. Efter fordøjelse, tilføje 11 µL DNase inaktivering reagens. Vortex blandingen og lade det sidde på RT i 5 min. Derefter centrifugeres prøve ved 15.000 x g i 3 min pellet inaktivering reagens og indsamle 110 µL af supernatanten uden at forstyrre pelleten. Overføre supernatanten til en 1,5 mL tube.
    Bemærk: DNase inaktivering reagens kan være ganske vanskeligt at afpipetteres ordentligt, så visuelt inspicere pipette tip efter hver pipettering handling. Hvis inaktivering reagens bliver for tyktflydende til pipette, tilføje 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) svarende til 1/5 af den resterende mængde.
  8. (Kvalitetskontrol) Mål koncentrationen af total RNA bruger et spektrofotometer. Derefter afsætte 1 µL af total RNA og fortyndes til en koncentration af 10 ng/µL i nukleasen-fri (NF) vand. Køre RNA på et passende nukleotid analyse instrument med en høj følsomhed RNA Tape til at sikre, at RNA ikke nedbrydes og har en eRIN-værdi på mindst 8.5 eller højere (figur 2B).

4. mRNA berigelse

  1. Udføre mRNA berigelse med et mRNA miniprep kit (Se Tabel af materialer). Tilføje 140 µL af NF vand til prøve for en samlet maengde paa 250 µL. Derefter tilsættes 250 µL af 2 x binding buffer, proeven blandes grundigt ved vortexing og tilføje 15 µL af oligo (dT) perler.
  2. Proeven blandes ved pipettering det op og ned og der inkuberes ved 65 ° C i 2 min. Placer derefter, prøven på RT for 10 min. Endelig, centrifugeres prøve ved 16,100 x g i 2 min at sammenpresse perle: mRNA komplekser.
  3. Supernatanten og resuspenderes i 500 µL vaskeopløsning. Opløsningen overføres til en kolonne med spin og spin det til 1 min på 15.000 x g. Kassér gennemstrømnings- og vaske prøve med en ekstra 500 µL vaskeopløsning. Derefter, dreje prøven i 2 min på 15.000 x g at fjerne eventuelle overskydende ethanol fra spin filtre.
  4. Overføre spin filteret til en delfin tube og resuspenderes i kolonnen med 80 µL forvarmet eluering løsning (65 ° C). Inkuber prøve for 1,5 min. ved 65 ° C og elueres det ved at dreje det i 1 min på 15.000 x g.
  5. Mål koncentrationen af oprenset RNA bruger et spektrofotometer eller lignende værktøj, der giver mulighed for kvantificering af RNA koncentration og kvalitet.

5. RNase III fragmentering og RNA rydde op

Bemærk: (Vigtigt) at forberede cirkulært RNA molekyler passende til generering af C-seq biblioteker, RNA skal fragmenteres til omtrent 60 – 80 baser i længden. Mens tidligere metoder har brugt en kemisk fragmentering til fragment RNA, introducerer kemiske opsplitning med tungmetaller skader til RNA prøver, der kan mistolkes som transskription fejl under den endelige analyse. For at omgå dette problem, i stedet stole på en fragmentering ved hjælp af RNase III til at generere små fragmenter. En yderligere fordel ved denne enzymatiske tilgang er, at det skaber kompatibel ender kræves for ligatur, længere er behov for en ende-reparation efter den kemiske fragmentering.

  1. Oprettet RNA fragmentering reaktionen med 1 µg af oprenset RNA, 10 µL af reaktion buffer, 5 µL af RNase III og nok NF vand for at bringe volumen op til 100 µL (Se Tabel af materialer). Tilsættes enzymet sidst og afpipetteres blandingen op og ned på mindst 10 gange til at blande. Inkuber prøve ved 37 ° C i 25 min, som har tendens til at producere RNA fragmenter af ca 60-80 baser i længden.
  2. Når 25 min inkubation er færdig, rydde op reaktion straks med en oligo oprydning og koncentrator kit (Se Tabel af materialer) for at forhindre enhver yderligere fordøjelsen. Tilføje 200 µL af oligo-binding buffer til prøven, bland det grundigt af vortexing, og Tilføj 800 µL af 100% ethanol. Proeven blandes ved vortexing og overføre det til en medfølgende spin kolonne i en collection tube.
  3. Centrifugeres prøve på 10.000 x g for 30 s og vask det med 750 µL af wash buffer til at fjerne RNase III. Centrifugeres prøve på 10.000 x g for 30 s, kassere gennemstrømnings- og vaske prøve en gang mere med 750 µL af wash buffer som beskrevet ovenfor. Efter den anden gennemstrømnings er blevet kasseret, centrifugeres kolonnen på 15.000 x g for 2 min til at fjerne eventuelle overskydende ethanol.
  4. Overfør kolonnen til et frisk 1,5 mL rør og elueres prøven i 24 µL af NF vand ved at dreje det på 10.000 x g i 1 minut.
  5. Kvalitetskontrol: Tag 2 µL af de oprensede RNA-fragmenter og fortynd det 2-fold ved at lægge 2 µL af NF vand. Kør den fragmenterede RNA på en skærm tape til at sikre, at den fragmenterede RNA er i rækken af 50 – 100 baser i længde (fig. 2 c).

6. RNA Circularization og rullende cirkel Reverse transkription

  1. For at circularize RNA-fragmenter, varme-denaturere 20 µL af prøven ved 65 ° C i 1 min og placere den på is straks for 2 min. Derefter tilføje 4 µL af 10 x T4 RNA ligase buffer, 4 µL af 10 mM ATP, 1 µL af RNase inhibitor, 1 µL af NF vand og 8 µL af 50% polyethylenglycol (PEG).
  2. Proeven blandes grundigt ved vortexing, derefter tilføje 2 µL af 10 U/µL af T4 RNA Ligase I. Bland prøven igen af pipettering det og der inkuberes ved 25 ° C i 2 timer i en thermocycler med temperatur på låget angivet ved 30 ° C.
  3. Efter 2 h, tilføje 10 µL af NF vand til prøven og rydde op i eksemplet med en oligo oprydning og koncentration kit ifølge producentens specifikationer. Elueres prøven i 20 µL af NF vand.
  4. At vende transskribere cirkulært RNA molekyler, tilføje 4 µL af 10 mM dNTP'er, 4 µL af 50 ng/µL tilfældige hexamers og 9 µL af NF vand til 9 µL af RNA. Bland det hele grundigt af pipettering, denaturere prøve på 65 ° C i 1 min og placere den på køl i 2 min. butik den resterende RNA som back-up.
  5. Tilsæt 8 µL af 5 x first-strand syntese buffer, 2 µL af 0,1 mM DTT og 4 µL af 200 U/µL reverse transkriptase og bland det hele af pipettering. Inkuber prøve ved 25 ° C i 10 min, efterfulgt af en 20 min inkubation ved 42 ° C med låget på 5 ° C højere end inkubation temperatur.
    Bemærk: En reverse transkriptase med strand forskydning kapaciteter skal anvendes på dette trin til at tillade en rullende cirkel reverse transkription.
  6. Tilsæt 10 µL NF vand til prøven og rense det op med oligo oprydning og koncentration kit efter fabrikantens anvisninger. Elueres prøven i 42 µL af eluering løsning.
  7. Kvalitetskontrol: Fortyndes 2 µL af enkeltstrenget cDNA i 2 µL af NF vand og køre dette eksempel på et nukleotid analyse instrument med en høj følsomhed RNA Tape. Hvis en reverse transkription arbejdede ordentligt, et bibliotek af cDNA molekyler, skal spænder fra omkring 60-1.500 baser i længde, være synlig. Ideelt set, de fleste cDNA er i rækken af 500-1.000 baser (figur 2d).

7. anden streng cDNA syntese og slutningen reparation

  1. Brug en anden strand syntese kit til at generere en dobbelt-strenget cDNA bibliotek. Prøveemner på isen og tilføje 30 µL af NF vand til 38 µL af din prøve. Derefter tilsættes 8 µL af 10 x anden Strand Buffer og 4 µL af anden Strand enzym, og bland prøven af blid pipettering før dens inkubation ved 16 ° C for 2,5 h.
  2. Rydde op prøver med oligo oprydning og koncentration kit ifølge producentens anbefalinger for 100 µL reaktioner og elueres prøver i 38 µL af NF vand.
  3. Oprettet den ende-reparation reaktion ved at tilføje 20 µL af NF vand til 35,5 µL af dobbelt-strenget cDNA, 6,5 µL af slutningen reparere reaktion Buffer og 3 µL af slutningen Prep enzym Mix. Omhyggeligt kontrollere reaktion buffer for hvidt bundfald og opløse dem af hånd-opvarmning hvis til stede.
  4. Bland reaktion ved udgangen-reparation af pipettering og inkuberes ved 20 ° C i 30 min, efterfulgt af en anden 30 min inkubation ved 65 ° C. Indstil temperaturen af thermocycler låg ved 5 ° C højere end inkubation temperatur.

8. adapter ligatur og størrelse udvælgelse af rede biblioteker

  1. Bruge en multi-step bibliotek forberedelse modul til de endelige bibliotek præparater (Se Tabel af materialer). Først, fortyndes adaptere til næste generation sequencing 10-fold i 10 mM Tris-HCl til en endelig koncentration på 1,5 µM. Derefter tilsættes 2,5 µL fortyndede adapter og 1 µL af ligatur forstærker til hver prøve og bland dem ved vortexing.
  2. Tilføj 15 µL af stump/TA Ligase Master Mix, bland det af pipettering og inkuberes ved 20 ° C i 15 min. Derefter tilsættes 3 µL af uracil-specifikke excision reagens enzym og der inkuberes ved 37 ° C i 15 min. Når ligation er fuldført, tilføje 13,5 µL af NF vand til prøve for en samlet maengde paa 100 µL og fortsætte udvælgelsen af størrelse.
    Bemærk: Det er bedst at størrelsen-Vælg for cDNA molekyler, der er i området fra 600-800 baser i længden. Hvis de fragmenterede RNA molekyler var ca 60 – 80 baser i længden, at vælge for molekyler, der er 600-800 baser i længden vil sikre at de fleste af de valgte molekyler indeholder mindst tre tandem gentagelser, som er ideel til den downstream behandling og analyse.
  3. Du kan vælge for molekyler, der er 600-800 bp i længde, tilføje 30 µL af resuspenderede magnetiske perler (Se Tabel af materialer), akklimatiseret til RT, til hver prøve indsamles og mix af pipettering. Overføre prøven til et 1,5 mL rør og inkuberes ved RT i 5 min.
  4. Prøven anbringes på en magnetisk stå i 5 min at skille perlerne fra supernatanten. Overføre supernatanten (som indeholder de ønskede cDNA molekyler) for at en ny 1,5 mL tube og bortskaffe de magnetiske perler, (som er bundet til store cDNA molekyler).
  5. Tilføje en frisk alikvot af 15 µL af magnetiske perler til hver prøver, blandes grundigt af pipettering, og Inkuber i 5 min på RT. sted prøver på en magnetisk rack og Inkuber dem i 5 min på RT. Derefter forsigtigt fjerne og bortskaffe analysere, og sørg for ikke at forstyrre perlerne.
    Bemærk: Smid ikke de magnetiske perler, der nu indeholder de ønskede mål cDNA.
  6. Tilføje 200 µL 80% frisklavet ethanol til hver af prøverne uden at forstyrre de pelleted magnetiske perler og Inkuber i 30 s. udsmid ethanol og vaske prøver en gang mere med 80% ethanol. Derefter, helt fjerne ethvert spor af ethanol fra prøverne og lufttørre perler i 5 min men vær omhyggelig med ikke at over tørre perlerne. Hvis perlerne er overdried, vises revner i pellets.
  7. For at eluere prøver fra glasperler, fjerne rør fra den magnetiske stå og tilføje 19 µL af 10 mM Tris-HCl. afpipetteres det op og ned flere gange til genopslemmes perler og inkuberes prøver i 5 min på RT. Hvis perlerne var overdried, inkuberes dem til > 10 min.
  8. Prøveemner tilbage på den magnetiske stå og inkuberes dem i 5 min at skille perlerne fra supernatanten. Forsigtigt fjerne 15 µL af supernatanten indeholder renset, størrelse-udvalgte cDNA-biblioteker fra rør og overføre det til en frisk 1,5 mL tube.

9. PCR-amplifikation og endelige perle rensning

  1. Tilsæt 5 µL af universal primer og 5 µL af et entydigt indeks primer (se tabel af materialer) til hver renset cDNA bibliotek og bland dem grundigt af pipettering. Omhyggeligt kontrollere polymerase master mix for krystaller og andre bundfald, og varm den master mix i hånden, indtil bundfald opløses.
    1. Tilføj 25 µL af polymerase master mix til prøven, bland dem af pipettering, og følg cykling betingelserne nedenfor for PCR-amplifikation. Kør den oprindelige denaturering på 98 ° C i 30 s, og derefter udføre en dobbelt step PCR reaktion ved denaturating eksempler på 98 ° C til 10 s og udglødning/forlængelse af PCR-produkter på 65 ° C i 75 s (12 x), efterfulgt af en sidste udvidelse ved 65 ° C i 5 min og en ubestemt hold ved 4 ° C.
  2. Rydde op de endelige biblioteker ved at tilføje 45 µL af resuspenderede magnetiske perler direkte til PCR reaktion, bland dem af pipettering, og Inkuber dem på RT for 5 min. overføre prøven til et 1,5 mL rør og placere det i en magnetisk stand. Inkuber det i 5 min, supernatanten og vaske det to gange med frisklavede 80% ethanol til 30 s.
  3. Efter den anden vask, fuldt fjerne ethanol fra prøven og lufttørre perle pellet i 5 min og elueres det i 35 µL af 0,1 x TE. Resuspend perlerne af pipettering dem og Inkuber dem på RT i 5 min. sted stikprøven på den magnetiske stå og efter 5 min, overføre 30 µL af supernatanten til en frisk 1,5 mL tube. Gemme biblioteker ved-80 ° C.
  4. Kvalitetskontrol: Fortyndes 1 µL af den endelige bibliotek i 9 µL af NF vand og Kør prøven på en dedikeret DNA analyse instrument med en høj følsomhed chip; fleste af cDNA bør i rækken af 600-800 bp i længde (figur 2e).
  5. Efter eluering, sende prøverne ud til sekvensering på et massivt parallel sekventering platform ved hjælp af 250 bp parret ende læser eller 300 bp single-ende læser.

10. bio-it analyse af cirkel Sequencing Data

Bemærk: Analysere og fortolke raw data fra C-seq analysen kræver en dedikeret bio-it rørledning. En skematisk af rørledningen, der blev brugt til vores analyser er afbildet i figur 3. Download denne rørledning på https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Først, trim læser til fjern adapter sekvenser og lav kvalitet base opkald med cutadapt18, ved hjælp af en kvalitet score tærskel på 20.
  2. Derefter identificere det gentager kodet af concatemerized RNA-molekyle ved hjælp af en passende algoritme til at opdage eventuelle gentagelser med et mindstemål af 30 nukleotider og højst 2 uoverensstemmelser mellem gentager18. Udlede en konsensus sekvens fra disse gentagelser og holde styr på alle de base opkald og tilhørende kvalitetsresultater hver position.
    Bemærk: Fordi reverse transkription kan starte på enhver placering på det circularized RNA-molekyle, starten på en gentagelse ikke nødvendigvis svarer til 5 '-enden af den fragmenterede RNA-molekyle (herefter benævnt ligatur punkt). I overensstemmelse hermed, konsensus sekvens ikke tilknytter løbende mod den tilsvarende transkriptom, hvilket nødvendiggør identifikation af ligatur punkt.
  3. For at identificere punktet ligatur, tilknytte en concatemer af konsensus sekvens mod reference transkriptom ved hjælp af BLAST-lignende justering værktøj (BLAT)19.
    1. Sammenkæde to forekomster af konsensus sekvens til at sikre, at de tilknyttede sekvensen indeholder mindst én fuld uafbrudt forekomsten af den oprindelige RNA fragment sekvens. Derefter, dreje konsensus sekvens til at starte på den forudsagte ligatur punkt holdning.
  4. Kort roteret konsensus sekvenser mod genom ved hjælp af TopHat20 og bruge tilpasninger til at opdage enhver enkelt nucleotid polymorfier (SNPs) der kunne forveksles med transskription fejl.
  5. Kalder transskription fejl fra de tilknyttede roterede konsensus sekvenser og teste, om kandidat fejl passere fire yderligere tests.
    1. Kontroller først, at en transskription fejl ikke overlapper med en SNP (en typisk krav er, at mindst 20 læser skal dække en bestemt base og ikke mere end 5% af læst kan støtte en alternativ base opkald).
    2. For det andet, tjek at konsensus sekvens er afledt af mindst 3 tandem gentagelser, der kalder den samme basepar; og for det tredje, Sørg for, at summen af kvalitetsresultater i denne stilling skal være over 100.
  6. For en fjerde og sidste check, rotere konsensus sekvens i alle mulige kombinationer (simulerer alle mulige positioner ligatur punkt) og tilknytte hver version mod den reference genom ved hjælp af TopHat.
    Bemærk: Hvis et perfekt match finder man de roterede sekvenser i genomet, den tilsvarende ligatur punkt er nu betragtes som den berigtige sig og transskription fejl opkald skal afvises.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ligesom alle massivt parallel sekventering strategier producerer hver C-seq eksperiment en uhåndterlig, store datasæt. For første gang brugere, kan det være vanskeligt at håndtere disse datasæt; Det anbefales således, at alle brugere skal du kontakte en erfaren bio-Informatikassistent før eksperimenter. I gennemsnit er forventningen, at brugerne vil generere ca 55-70 Giga baser (Gbases) pr. køre på de fleste massivt parallel sekventering platforme. For denne protokol, typisk var 12-30 prøver multipleksede pr. Kør så at for hver prøve ca 2 – 6 Gbases blev anskaffet. Efter trimning adapter sekvenser og lav kvalitet base opkald (< 20) fra dette datasæt, forblev ~ 70% af den oprindelige datastørrelse.

Disse baser er derefter analyseret yderligere for at undersøge effektiviteten af RNA fragmentering og circularization ved at bestemme størrelsen af de gentagelser, der blev genereret. De fleste gentager tendens til at være 45-80 baser i længde (figur 4A) og ca. 50% af de baser, der blev sekventeret er en del af disse gentagelser (figur 4B). Da de fleste af disse baser er til stede i læser, der indeholder 3 gentagelser eller mere, antallet af unikke baser, der er sekventeret er omkring en tredjedel af det samlede antal baser sekventeret. I gennemsnit > 75% af disse konsensus sekvenser kan tilknyttes tilbage til reference genom. Endelig, ca. 25% af disse baser er omfattet af 20 læser eller mere, hvilket i sidste ende betyder, at omkring 10% af data kan bruges til fejlfinding. Et eksempel på denne analyse er givet i fig. 4, som repræsenterer de sekventering oplysninger, der var erhvervet under Opsætning af denne protokol for 1 replikat af en enkelt C-seq bibliotek, der blev sekventeret relativt grundt og repræsenterer nederst grænse for de data, som brugere kan forvente at erhverve.

Ca 5.000-25.000 fejl pr. run tendens til at være identificeret, selv om disse tal kan variere betydeligt afhængig af fejlprocenten, selv (jo højere fejlprocent, flere fejl vil blive detekteret), størrelsen af transkriptom (jo større den transkriptom, færre baser vil være omfattet af 20 læser, begrænse sequencing data, der kan bruges til fejlregistrering af), og den dybde, hvormed det er sekventeret (dybere sekventering vil gøre det mere sandsynligt, at en given base vil være omfattet af 20 læser eller mere). Disse fejl tendens til at være fordelt over det hele genom, således at gennemsnitligt ~ 47% af fejlene, der er placeret i mRNA molekyler genereret af RNA polymerase II (RNAP II), ~ 49% er placeret i rRNA molekyler genereret af RNAP jeg, og de resterende ~ 3% er placeret i RNA'er genereret af RNAP III og den mitokondrier RNA polymerase. Disse nøgletal kan imidlertid variere betydeligt afhængig af den celle eller organisme under undersøgelse (figur 4 c). For eksempel indeholde celletyper, der er stærkt afhængige mitokondrie-funktion, som cardiomyocytes, betydeligt mere mitokondrier RNA end andre celletyper, hvilket øger antallet af mitokondrier RNA-molekyler, der er sekventeret, og dermed antallet fejl opdaget.

Når en liste over fejl er blevet kompileret, og deres placeringer på tværs af genomet er kendt, kan disse fejl bruges til at identificere de parametre, der styrer fejlrate af transkription i hver organisme. For eksempel, kan placeringen af disse transskription fejl være korreleret med talrige funktioner af genomet, såsom tilstedeværelsen af DNA gentager, specifikke genetiske sammenhænge eller udtryk sats, at forstå, hvordan disse funktioner alter troskab af transskription5. Forventningen er, at i fremtiden, dog brugere vil være i stand til at afgøre, hvordan utallige ekstrafunktioner påvirke transcriptional troskab, herunder epigenetiske markører, 3D-organisationen af genomet, næringsstoftilgængelighed, alder eller udsættelse for giftige forbindelser, at belyse bidrag af genetiske og miljømæssige faktorer til troskab i transskription.

Figure 1
Figur 1: Skematisk fremstilling af RNA-seq versus C-FF. (A) traditionelle RNA-seq eksperimenter isoleres RNA fra en prøve af interesse, fragment RNA, og omvendt omskrive det før den endelige bibliotek forberedelse og sekventering. Men disse forberedelse procedurer indføre talrige tekniske artefakter i biblioteket i form af reverse transkription fejl, PCR forstærkning fejl og sekventering fejl. (B) denne optimeret C-seq assay giver mulighed for korrektion af disse tekniske artefakter af circularizing fragmenterede RNA molekyler før reverse transkription, der tillader dem at blive omvendt, transskriberede i en rullende cirkel mode til at producere lineær cDNA molekyler, der indeholder flere eksemplarer af den oprindelige RNA skabelon i tandem gentage. Disse tandem gentagelser kan derefter bruges til at skelne sande transskription fejl fra artefakter, som sande transskription fejl (star) vil være til stede i alle gentagelser på samme sted, boer artefakter såsom reverse transkription fejl (firkantet) og PCR forstærkning fejl (cirkel) er kun til stede i en eller to gentagelser af enhver given cDNA molekyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentant resultater af bibliotek forberedelse. Disse paneler viser en electrophoretogram til (A) en høj følsomhed RNA skærmen tape stigen (Se Tabel af materialer), (B) samlet RNA renset fra Saccharomyces cerevisiae, (C) RNase III-fragmenteret RNA og) D) rullende cirkel reverse-transskriberet cDNA. (E) den endelige størrelse-udvalgte cDNA bibliotek kører på en høj følsomhed dobbelt-strenget DNA analyse chip (Se Tabel af materialer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: skematisk af bio-it rørledningen bruges til at analysere cirkel sequencing data. Efter trimning sekventering læser, gentagelser er identificeret, og en konsensus sekvens er genereret ved hjælp af den mest sandsynlige base opkald ved enhver given position. Derefter punktet ligatur af den oprindelige RNA skabelon er identificeret og konsensus sekvens er justeret til reference genom, således at potentielle transskription fejl kan identificeres. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: eksempel på resultaterne for C-Seq pipeline. (A) dette panel viser opnås størrelse fordeling af konsensus sekvenser fra et typisk C-Seq eksperiment. (B) dette panel viser antallet af baser, læser og procentdel af lyder sekventeret i hvert trin af C-Seq Bioinformatik pipeline. (C) dette panel viser antallet af transskription fejlbehæftet og procentdelen af fejl tilskrives RNA polymerase jeg, RNA polymerase II, RNA polymerase III og mitokondrier RNA polymerase. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her, beskriver vi en optimeret protokol for forberedelse af C-seq biblioteker til påvisning af transskription fejl i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokol har mange fordele i forhold til eksisterende protokoller, såvel som alternative teknikker.

I de sidste 15 år, er der blevet udviklet talrige reporter systemer, der er afhængige af luciferase7,8 eller Cre-Lox rekombination3,4,15,21 at opdage transskription fejl. Disse reporter systemer har været uvurderlig for forskernes forståelse af transcriptional troskab fordi de gav gener, alleler og molekylære mekanismer kan identificeres, der direkte regulerer troskab i transskription. Men, de kun rapport om fejl i kunstigt beskadigede skabeloner, eller inden for meget specifikke genetiske sammenhænge, som begrænser de videnskabelige spørgsmål, de kan besvare. En vigtig fordel af C-seq-protokollen er, at den overvåger troskab af transkription i hele den hele transkriptom5, kraftigt udvide den videnskabelige viden om den nøjagtighed hvormed genetiske oplysninger udtrykkes. For det andet, fordi C-seq assay udnytter RNA som sin kildemateriale, det er sandsynligt, at denne analyse kan tilpasses enhver organisme valg, længere er behov at generere kompliceret reporter konstruktioner for hver transgene model. Denne protokol har også fordele i forhold til eksisterende massivt parallel sekventering strategier17,22. Mest bemærkelsesværdigt, de fleste af disse strategier gøre brug af tungmetaller til fragment RNA biblioteker. Imidlertid indføre metoderne fragmentering artefakter i RNA, der er umulig at skelne fra sande transskription fejl5. For at løse dette problem, denne protokol fragmenter RNA enzymatisk med RNase III, som har den fordel, at det efterlader kompatibel ender for selvstændig ligatur, i høj grad forenkle RNA circularization og øge følsomheden af analysen ~ 10-fold.

På samme tid har C-seq analysen sin egen andel af begrænsninger. Først, selvom analysen måler transskription fejl i hele den hele genom, en stor del af dataene, der har tendens til at være afledt af gener, der er stærkt udtrykt, som udskrifter fra disse gener har tendens til at dominere de fleste RNA biblioteker. En anden faktor, der forvrænger analyse mod stærkt udtrykte gener er den tærskel, der er indbygget i den bio-it rørledning, der forhindrer genetiske mutationer og RNA redigering begivenheder fra confounding de endelige målinger. Denne tærskel dikterer, at kun baser, der blev sekventeret 20 gange eller mere kan bruges til den endelige analyse. En anden begrænsning vedrører bibliotek mangfoldighed. Ligesom de fleste kits til RNA udvinding, kit bruges her ikke effektivt rense små RNA molekyler, der begrænser antallet læsninger stammer fra molekyler syntetiseret af RNAP III. Mangfoldigheden af de endelige sekventering bibliotek er yderligere begrænset af trinnet mRNA rensning ansat her. Selvom molekyler genereret af RNAP jeg kan være effektivt sekventeret, de fleste af de resterende mitokondrie RNA'er, går tRNAer og ikke-kodende RNA'er tabt under dette trin. At fange disse molekyler mere hyppigt, en anden kit, som specifikt renser små RNA molekyler skal bruges, eller celletyper bør være målrettet, der er beriget til disse molekyler. Bemærk dog, at de fleste af disse problemer kan løses ved sekventering dybere end normalt, eller samtidig sekventering af DNA fra de samme celler, selv om begge disse løsninger vil kræve en større finansiel investering af efterforskerne.

Derudover er fremtidige teknologiske udviklinger klar til at forbedre C-seq analysen på et grundlæggende niveau. For eksempel ved at udvide eksisterende sequencing technology Læs-længde, vil det være muligt at sekvens længere molekyler, hvilket betyder at flere gentagelser kan bruges til at fastslå troskab i transskription. Sådanne forbedringer vil automatisk resultere i en større sekventering dybde og en stigning i procentdelen af læser, der kan bruges til efterfølgende analyse. Et lignende argument kan gøres for enhver sekventering teknologi, der giver mulighed for flere molekyler til at blive sekventeret parallelt. Derudover fortsat adskillige komponenter af C-seq assay skal optimeres, herunder effektiviteten af RNA circularization, stramhed i valg af størrelse og tidskrævende arten af analysens selv. Endelig anbefales det, at alle brugere får adgang til en dedikeret, Højfølsom værktøj for nukleinsyre analyse og potentielle fejlfinding (Se Tabel af materialer). Uden dette værktøj, kan det være meget vanskeligt at afgøre, på hvilket tidspunkt potentielle problemer opstår, dermed gøre dem umuligt at fastsætte.

Selv om den hele protokol er temmelig nådesløs (små fejl tendens til at have betydelige konsekvenser), der er flere trin, som er helt afgørende for succes af C-seq assay. En af de vigtigste krav er, at den isolerede RNA er behandlet så skånsomt som muligt. De fleste RNA udvindingsmetoder og downstream behandling kits pleje lidt om den kemiske sammensætning af RNA ud over grundlæggende branchestandarder, som er tilstrækkelig for de fleste molekylære analyser. C-seq assay er imidlertid til opgave med at identificere en enkelt transskription fejl blandt hundreder af tusinder af WT baser, hvilket øger behovet for at reducere molekylære stress. Endda stress, der påvirker kun 1 i 10.000 baser kan indføre artefakter, der helt omstøde resultaterne. For eksempel, brugernes skal aldrig undgå/grænse eksponere RNA til enhver temperatur over 65 ° C. For det andet, skal hver bruger omhyggeligt optimere den nødvendige tid til RNA opsplitning med RNase III. Det er helt afgørende for succes i analysen at de endelige molekyler er ca 60 – 80 baser i længden. Kortere molekyler kan være vanskeligt at knytte til genomet, og længere molekyler vil ikke muliggøre 3 uafhængige gentagelser at blive sekventeret inden for 250 bp læse. Endelig, det anbefales ikke at fryse og tø RNA mere end én gang under den hele protokol. I stedet, isolere RNA og syntetisere cDNA i en enkelt dag. På grund af den tid og kræfter involveret med denne forpligtelse, kompleksiteten af selve protokollen, og antallet af prøver, der hyppigt behandles på én gang, anbefales det, at to efterforskere arbejder sammen for at generere disse biblioteker.

Når det lykkes, vil disse eksperimenter gøre det muligt at præcist afsløre transskription fejl i enhver organisme, under enhver eksperimentelle tilstand. For eksempel ved at sammenligne kontrol og syge personer til hinanden, kan det være muligt at afgøre, om visse sygdomme er forbundet med transskription fejl, som kan afsløre en ny komponent i ætiologien af talrige menneskelige patologier. Andre parametre, der kunne blive aftestede er kropsligt aldring, ernæring, genotype og miljømæssige faktorer som udsættelse for giftige kemikalier. Endvidere fordi denne analyse registrerer transskription fejl i hele transkriptom, giver det forskere til at dissekere de forskellige mekanismer, der bidrager til troskab af RNA polymerase jeg, II, og III, samt den mitokondrier RNA polymerase. Vi forventer derfor, at denne protokol vil åbne et nyt felt af mutagenese til udbredt eksperimenter, karakteriseret ved studiet af mutationer i RNA ikke i DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Denne publikation blev muliggjort af finansiering fra grant T32ES019851 (til C. Fritsch), give R01AG054641 og efterforsker AFAR unge (M. Vermulst).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Tags

Genetik sag 139 genetiske processer Gen-ekspression transskription genetiske Reverse transkription transkriptom mutagenese aminosyre Substitution fænomener og processer genetiske fænomener mutagenese transskription RNA-FF. S. cerevisiae C. elegans D. melanogaster sekventering RNA polymerase fejl
Genom-dækkende overvågning af transskription fejl i Eukaryote organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, C., Gout, J. F. P.,… More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter