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Genetics

Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731

Summary

Le présent protocole aux chercheurs un nouvel outil pour surveiller la fidélité de la transcription dans plusieurs organismes modèles.

Abstract

Transcription précise est nécessaire pour l’expression fidèle de l’information génétique. Étonnamment bien, on en sait peu sur les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription. Pour combler cette lacune dans les connaissances scientifiques, nous avons récemment optimisé le dosage de cercle-à-pas pour détecter les erreurs de transcription dans le transcriptome de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole sera aux chercheurs un nouvel outil puissant pour cartographier le paysage des erreurs de transcription dans des cellules eucaryotes afin que les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription peuvent être élucidés en détail sans précédent.

Introduction

Le génome fournit un plan biologique précis de la vie. Pour mettre en oeuvre ce plan correctement, il est important pour le génome à transcrire avec une grande précision. Cependant, la transcription est peu susceptible d’être sans erreur. Par exemple, les ARN polymérases ont longtemps été connus pour être sujette à vitro1,2, et récemment il a été démontré qu’ils commettent erreurs en vivo ainsi3,5,6, en particulier lorsqu’ils sont confrontés avec l’ADN des dommages7,8,9,10. Pris ensemble, ces observations indiquent que transcription des erreurs se produisent en permanence dans toutes les cellules vivantes, ce qui suggère qu’ils pourraient être une puissante source de protéines mutées.

Ce processus, appelé transcriptional mutagénèse, diffère de la mutagenèse classique de deux façons. Tout d’abord, contrairement aux mutations génétiques, erreurs de transcription affectent les cellules mitotiques et post-mitotiques, car ils ne dépendent pas de la réplication de l’ADN. Étudie les mécanismes qui influent sur la fidélité de la transcription fournira, par conséquent, un aperçu précieux dans la charge de la mutation des cellules mitotiques et post-mitotiques. Fait intéressant, les erreurs de transcription ont été récemment impliqués dans la promotion de l’agrégation de protéines11,12,13 et ont émis l’hypothèse pour contribuer à tant de carcinogenèse10 et la développement de résistance aux antibiotique chez les bactéries,14.

Deuxièmement, contrairement aux mutations génétiques, les erreurs de transcription sont transitoires dans la nature. Leur existence temporaire est particulièrement difficile car il fait des erreurs de transcription extrêmement difficiles à détecter. Par exemple, alors que plusieurs laboratoires ont conçu des dosages de journaliste précieux pour l’étude de la mutagénèse transcriptionnel, ces tests ne sont capables de mesurer les erreurs de transcription dans un nombre limité de contextes et modèle organismes4,15. Pour surmonter ces limites, de nombreux chercheurs sont tournent vers la technologie de séquençage de RNA (RNA-seq), qui permet en théorie des erreurs de transcription à enregistrer tout au long du transcriptome de toute espèce. Toutefois, ces études sont facilement confondus par les artefacts de construction de bibliothèque, tels que les erreurs de transcription inverse, erreurs d’amplification PCR et la nature sujette de séquencer lui-même. Par exemple, reverse transcriptases commis environ une erreur chaque bases de ~ 20 000, tandis que les ARN polymérases (RNAPs) devraient ne faire qu’une seule erreur tous les 300 000 bases5,6. Parce que le taux d’erreur de transcription inverse seul éclipse le taux d’erreur des ARN polymérases à l’intérieur des cellules, il est pratiquement impossible de distinguer les erreurs de transcription exacte des artefacts causés par la préparation de la bibliothèque de données traditionnelles de RNA-Seq ( Figure 1 a).

Pour résoudre ce problème, nous avons développé une version optimisée du cercle-séquençage (Cirseq ou C-seq désormais) dosage5,16. Ce test permet à l’utilisateur détecter les erreurs de transcription et autres variantes rares dans l’ARN dans tout le transcriptome5. L’essai circulaire-séquençage porte ce nom parce qu’il est une étape clé dans cet essai s’articule autour de circularization RNA. Une fois que les objectifs de RNA sont prospectés, ils sont inverses transcrit de façon cercle roulant, pour produire des molécules de cDNA linéaire qui contiennent de nombreuses copies du même modèle RNA. Si une erreur était présente dans un de ces modèles, cette erreur serait également présente dans chaque répétition unique contenue dans la molécule de cDNA. En revanche, les erreurs introduites par transcription inverse l’amplification par PCR et séquençage ont tendance à survenir au hasard et seront donc présents dans seulement une ou deux répétitions. Ainsi, en générant une séquence consensus pour chaque molécule de cAdn et distinguer les erreurs aléatoires des erreurs qui se produisent dans toutes les répétitions, artefacts construction bibliothèque efficacement se distingues des erreurs de transcription exacte (Figure 1 b).

Si utilisé correctement, le dosage de la C-seq peut servir à détecter avec précision le taux de substitutions de base, les insertions et suppressions dans l’ARN dans le transcriptome de toutes les espèces (par exemple, voir levé et Ochman17). Par exemple, nous avons utilisé le test C-seq pour fournir des mesures de Génome-large de la marge d’erreur de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans avec une résolution de base unique5 (observations inédites). Initialement utilisé pour séquencer avec précision les populations de virus à ARN, cette version optimisée de l’essai C-seq a été simplifiée pour réduire au minimum des conditions difficiles lors de la préparation de la bibliothèque qui contribuent aux artefacts de construction de bibliothèque. En outre, en utilisant un certain nombre de kits disponibles dans le commerce, le débit du dosage est grandement amélioré, ainsi que sa facilité d’utilisation. Si utilisé correctement, ce test peut détecter avec précision les milliers d’erreurs de transcription par réplicat, améliorant ainsi considérablement les précédentes études6. Dans l’ensemble, cette méthode fournit un outil puissant pour étudier la mutagénèse transcriptionnelle et permettra à l’utilisateur de mieux comprendre les mécanismes qui contrôlent la fidélité de la transcription dans un large éventail d’organismes nouveaux.

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Protocol

1. préparation

  1. Ribonucléases sont omniprésents ; par conséquent, nettoyer l’espace de travail par pulvérisation il vers le bas avec un réactif de décontamination (par exemple, RNase AWAY) et 70 % d’éthanol. Jet vers le bas des pipettes, stylos ou supports de tube pour éliminer les sources potentielles de contamination de la RNase.
  2. Pour mieux prévenir les ribonucléases de contaminer les échantillons, porter une blouse ou un T-shirt manches longues pendant l’expérimentation. Éviter tout contact entre les gants et l’intérieur de tous les tubes qui seront utilisés, en particulier lorsque les récupérer à partir d’une boîte ou un sac.
  3. Avant la transcriptase inverse, les changer fréquemment.
    Remarque : Pour des résultats optimaux, ne pas interrompre l’expérience avant la transcriptase inverse.

2. cellules et Culture animale et Collection

  1. Collection et croissance de saccharomyces cerevisiae
    1. Si une bibliothèque C-seq est souhaitée à partir de levure, tout d’abord ensemencer une seule colonie de S. cerevisiae dans 3 mL de milieu contenant extrait de levure, adénine, peptone et dextrose (YAPD) et du jour au lendemain il incuber à 30 ° C dans un roulement de tambour.
    2. Dans la matinée, ré-ensemencer la culture dans 50 mL de milieu YAPD à une densité optique (do) de 0,1 et cultiver les cellules jusqu'à ce qu’ils atteignent une OD de 0,5 à 0,7 (~ 7 x 106 cellules/mL).
    3. Percevoir la culture entière 50 mL (environ 350 x 106 cellules) dans un tube conique de 50 mL et faire tourner les cellules vers le bas pendant 3 min à 2 100 x g. Retirez le support YAPD doucement et laver le culot une fois avec du PBS 1 x.
    4. Puis, resuspendre le culot dans 480 µL de tampon de lyse, 48 µL du SDS de 10 % et 480 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool (25:24:1), pH 6,8. Vortex de l’échantillon à vitesse maximale pendant 5 s et le transfert d’un bouchon à vis 1,5 mL tube 750 µl de perles glacées zircone (fourni avec le kit). Passez à l’étape 3 du présent protocole pour la lyse des cellules et l’extraction de l’ARN totale.
      NOTE : Tous les réactifs nécessaires pour l’étape 2.1.4 sont fournis dans la levure recommandée kit d’extraction d’ARN. Ces réactifs fonctionnent aussi bien pour la levure, worms et vole donc qu’après la collecte de la levure (étape 2.1), vers (étape 2.2) ou des mouches (étape 2.3), une approche unifiée peut être utilisée pour générer des bibliothèques C-seq (étapes 3 à 10).
  2. Culture de Caenorhabditis elegans et collection
    1. Si une bibliothèque C-seq est souhaitée à partir de worms, déposer 30 vers adultes sur une assiette fraîche d’agar parsemée de bactéries OP50.
      NOTE : Cinq plaques suffisent pour la 1 réplique.
    2. Les vers la culture pendant 4 jours et recueille les vers en lavant délicatement les plaques avec 5 mL de M9 médias et mettre en commun les vers dans un tube conique unique 50 mL.
    3. Faites tourner les vers le bas à 100 x g pendant 2 min créer une boulette. Ralentir la centrifugeuse à la vitesse la plus basse possible, de manière à ne pas déranger le culot.
    4. Doucement déplacer les vers dans un tube de 1,5 mL, laver deux fois dans 1,5 mL de médias M9 et centrifuger le tube à 100 x g pendant 1 min éliminer les bactéries et générer une pastille de nettoyage 100 µL de worms.
    5. Remettre en suspension les vers en 480 µL de tampon de lyse et 480 µL de phénol : chloroforme : isoamylique Alcool 48 µL du SDS de 10 %. Vortex de l’échantillon à vitesse maximale pendant 5 s et le transfert d’un bouchon à vis 1,5 mL tube contenant 750 µL de perles glacées zircone. Passez à l’étape 3 du présent protocole pour provoquer la lyse les vers et l’extraction de l’ARN totale.
  3. Collection et la culture de drosophila melanogaster
    1. Si une bibliothèque C-seq est souhaitée à partir de mouches, culture 20 – 25 mouches dans des flacons contenant dextrose ou un milieu à base de mélasse. Aliquote les mouches plus 3 flacons, ainsi que chaque flacon contient environ 8 mouches.
    2. Pour collecter les mouches, placez le flacon dans un seau à glace jusqu'à ce que les mouches sont sous sédation. Ensuite, les recueillir avec une brosse dans un tube de 1,5 mL. Ne pas prélever les mouches par le CO2 traitement.
    3. Laissez les mouches chaudes à la température ambiante (RT) et rapidement ajouter 500 µL de phénol : chloroforme : isoamylique alcool un mélange premade de 500 µL de tampon de lyse et 50 µL de SDS de 10 % dans le tube. Utiliser un micropestle pour broyer les mouches avec environ 15 coups, accompagnés d’une firme de mouvement de torsion lorsque le pilon atteint le fond du tube.
    4. Verser le mélange de mouches et de médias de lyse dans un bouchon à vis 1,5 mL tube contenant 750 µL de billes de zircone glacée et vortex il à vitesse maximale pendant 5 s. continuer à l’étape 3 du présent protocole pour la lyse de l’oiseau et l’extraction de l’ARN totale.

3. le montant total RNA Purification

Remarque : À ce stade, tous les trois protocoles convergent, et une approche unifiée peut être utilisée pour générer des bibliothèques C-seq.

  1. Revisser le bouchon fermement et fixer le tube à un vortexer avec un adaptateur ou un ruban adhésif. Vortex le tube à vitesse maximale pendant 10 min à lyser les échantillons. Puis, centrifuger l’échantillon à 16 100 x g pendant 5 min séparer les solvants organiques de la phase aqueuse.
  2. Soigneusement retirer 400 – 500 µL de la phase aqueuse sans déranger l’interphase blanc, nuageux et ajoutez-le à un tube conique 15 mL contenant 1,9 mL de tampon de liaison. Les homogénéiser au vortex.
  3. Ajouter 1,25 mL d’éthanol à 100 % et mélanger l’échantillon au vortex. Transfert de 700 µL de l’échantillon à une cartouche de filtre Assemblée dans un tube de prélèvement et tournez l’échantillon à 14 500 x g pendant 30 s. répéter jusqu'à ce que la totalité de l’échantillon est passé au travers de la cartouche.
    Remarque : À ce stade, l’échantillon peut tourner légèrement opaque. Si trop de cellules, les vers ou les mouches ont été lysées, précipités pourraient apparaître qui peuvent obstruer le filtre.
  4. Laver le filtre une fois avec 700 µL de solution de lavage 1 et deux fois avec 500 µL de solution de lavage 2 ou 3. Fini les lavages en faisant tourner les échantillons à 14 500 g pendant 2 min enlever tout excès d’éthanol.
  5. Transférer la cartouche de filtre dans un tube de Dauphin de 1,5 mL et ajouter 108 µL de solution d’élution préchauffée (65 ° C).
    NOTE : Ne jamais exposer échantillons d’ARN à des températures supérieures à 65 ° C avant d’être une transcription inverse, que faire alors provoquera une cytosine aux événements de désamination uracile qui sont impossibles à distinguer des erreurs de transcription.
  6. Dégrader l’ADN contaminant dans l’ARN isolé (voir étapes 2.1 – 3,4) en ajoutant 11 µL de 10 x la DNase I mettre en mémoire tampon, 2 µL d’inhibiteur de RNase et 4 µL de DNase I (8 U) et les incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  7. Après digestion, ajouter 11 µL de réactif de l’inactivation de DNase. Vortex du mélange et laisser reposer à ta pendant 5 min. Puis, centrifuger l’échantillon à 15 000 x g pendant 3 min pour le réactif de l’inactivation de granule et collecter 110 µL du liquide surnageant sans déranger le culot. Transférer le surnageant dans un tube de 1,5 mL.
    NOTE : Le réactif d’inactivation de DNase peut être assez difficile à pipeter correctement, donc vérifiez visuellement la pipette après chaque action de pipetage. Si le réactif d’inactivation devient trop visqueux à la pipette, ajouter 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) égal à 1/5 du volume restant.
  8. (Contrôle qualité) Mesurer la concentration de l’ARN total à l’aide d’un spectrophotomètre. Puis mettre de côté 1 µL d’ARN total et le diluer à une concentration de 10 ng/µL dans l’eau sans nucléase (NF). Exécutez l’ARN sur un instrument d’analyse appropriée de nucléotides avec une bande d’ARN haute sensibilité pour s’assurer que l’ARN n’est pas dégradée et a une valeur d’eRIN d’au moins 8,5 ou supérieur (Figure 2 b).

4. ARNm enrichissement

  1. Effectuer l’enrichissement de l’ARNm avec un miniprep ARNm nécessaire (voir la Table des matières). Ajouter 140 µL d’eau NF à l’échantillon pour un volume total de 250 µL. Puis, ajouter 250 µL de 2 x tampon de liaison, bien mélanger l’échantillon au vortex et ajouter 15 µL de billes oligo (dT).
  2. Mélanger l’échantillon en pipettant également, il monte et descend et il incuber à 65 ° C pendant 2 min. Ensuite, placer l’échantillon à la droite pendant 10 min. Enfin, centrifuger l’échantillon à 16 100 x g pendant 2 min granuler les complexes de perle : ARNm.
  3. Jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de solution de lavage. Transvaser la solution dans une colonne et le tourner pendant 1 min à 15 000 x g. Jeter le cheminement et laver l’échantillon avec un supplémentaire 500 µL de solution de lavage. Ensuite, tourner l’échantillon pendant 2 min à 15 000 g pour enlever tout excès d’éthanol des filtres spin.
  4. Transférer le filtre essorage dans un tube de Dauphin et Resuspendre le culot dans la colonne 80 µl de solution d’élution préchauffée (65 ° C). Incuber l’échantillon pendant 1,5 min à 65 ° C et il éluer par il tourne pendant 1 min à 15 000 x g.
  5. Mesurer la concentration de l’ARN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre ou un outil similaire qui permet la quantification de la concentration d’ARN et de la qualité.

5. nettoyer les ARN et la Fragmentation de RNase III

NOTE : (Important) pour préparer des molécules d’ARN circulaires appropriées pour générer des bibliothèques C-seq, l’ARN doit être fragmenté pour environ 60 à 80 bases de longueur. Tandis que les méthodes précédentes ont utilisé une fragmentation chimique au fragment RNA, fragmentation chimique avec des métaux lourds introduit des dommages pour les échantillons d’ARN qui peuvent être mal interprétés comme des erreurs de transcription au cours de la dernière analyse. Pour contourner ce problème, s’appuient plutôt sur une fragmentation à l’aide de RNase III pour générer de petits fragments. Un autre avantage de cette approche enzymatique est qu’il crée des extrémités compatibles requises pour la ligature, il ne soit pas la nécessité d’une réparation de fin après la fragmentation chimique.

  1. Mettre en place la réaction de fragmentation du RNA avec 1 µg d’ARN purifié, 10 µL de tampon de réaction, 5 µL de RNase III et assez NF water pour porter le volume jusqu'à 100 µL (voir Table des matières). Ajoutez l’enzyme dernière et Pipeter le mélange monte et descend au moins 10 fois pour mélanger. Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 25 min, ce qui tend à produire des fragments d’ARN d’environ 60-80 bases de longueur.
  2. Une fois terminée l’incubation de 25 min, nettoyer la réaction immédiatement avec un oligo nettoyage et concentrateur kit (voir Table des matières) pour empêcher toute digestion supplémentaire. Ajouter 200 µL de tampon de l’oligo-liaison à l’échantillon, homogénéiser au vortex et ajouter 800 µL d’éthanol à 100 %. Mélanger l’échantillon au vortex et transférez-la sur une colonne dans un tube de prélèvement fourni.
  3. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 s et lavage avec 750 µL de tampon de lavage pour éliminer la RNase III. Centrifuger l’échantillon à 10 000 x g pendant 30 s, jetez le cheminement et laver l’échantillon une fois de plus avec 750 µL de tampon de lavage tel que décrit ci-dessus. Après le deuxième intermédiaire a été écarté, centrifuger la colonne à 15 000 x g pendant 2 min enlever tout excès d’éthanol.
  4. Transférer la colonne à un tube frais de 1,5 mL et éluer l’échantillon dans 24 µL d’eau NF en il tourne à 10 000 x g pendant 1 min.
  5. Contrôle de qualité : Prendre 2 µL des fragments d’ARN purifiés et 2 fois le diluer en ajoutant 2 µL d’eau NF. Exécutez l’ARN fragmenté sur une bande d’écran pour s’assurer que l’ARN fragmenté est de l’ordre de 50 – 100 bases de longueur (Figure 2c).

6. RNA Circularization et cercle roulant Transcription inverse

  1. Pour circularize les fragments d’ARN, chaleur-dénaturer 20 µL de l’échantillon à 65 ° C pendant 1 min et placez-le sur la glace immédiatement pendant 2 min. Ensuite, ajoutez 4 µL de 10 x T4 ARN ligase buffer, 4 µL d’ATP 10 mM, 1 µL d’inhibiteur de RNase, 1 µL d’eau NF et 8 µL de 50 % de polyéthylène glycol (PEG).
  2. Bien mélanger l’échantillon au Vortex, puis rajouter 2 µL de 10 U/µL de T4 ARN Ligase I. mélanger l’échantillon en pipettant également, il et elle incuber à 25 ° C pendant 2 h dans un thermocycleur avec la température du couvercle fixé à 30 ° C.
  3. Après 2 h, ajouter 10 µL d’eau NF dans l’échantillon et nettoyer l’échantillon avec un kit de nettoyage et de la concentration d’oligo selon les spécifications du fabricant. Éluer l’échantillon dans 20 µL d’eau NF.
  4. Pour inverser transcrire les molécules d’ARN circulaires, ajouter 4 µL des dNTPs 10 mM, 4 µL de 50 ng/µL hexamères aléatoire et 9 µL d’eau NF à 9 µL d’ARN. Mélanger le tout soigneusement en pipettant également, dénaturer l’échantillon à 65 ° C pendant 1 min et placez-le sur la glace pendant 2 min. magasin l’ARN restant comme back-up.
  5. Ajouter 8 µL de tampon de synthèse du premier-brin x 5 et 2 µL de 0,1 mM TNT 4 µL de 200 U/µL de la transcriptase inverse et mélanger le tout par pipetage. Incuber les échantillons à 25 ° C pendant 10 min, suivie d’une incubation de 20 min à 42 ° C avec le couvercle fixé à 5 ° C supérieure à la température d’incubation.
    Remarque : Une transcriptase inverse avec des capacités de déplacement brin doit être utilisé à cette étape afin de permettre une transcription inverse de cercle roulant.
  6. Ajouter 10 µL d’eau NF dans l’échantillon et le nettoyer avec le kit de nettoyage et de la concentration d’oligo selon les recommandations du fabricant. Éluer l’échantillon dans 42 µL de solution d’élution.
  7. Contrôle de qualité : Diluer 2 µL de l’ADNc simple brin dans 2 µL d’eau NF et exécutez cet exemple sur un instrument d’analyse de nucléotides avec une bande d’ARN haute sensibilité. Si la transcription inverse a fonctionné correctement, une bibliothèque de molécules de cDNA, allant approximativement de 60 – 1 500 bases de longueur, doit être visible. Idéalement, la plupart ADNc est de l’ordre de 500 – 1 000 bases (Figure 2d).

7. deuxième synthèse de cDNA de brin et réparation fin

  1. Utiliser un kit de synthèse deuxième brin pour générer une bibliothèque d’ADNc double brin. Placer les échantillons sur la glace et ajouter 30 µL d’eau NF à 38 µL de votre échantillon. Ensuite, ajoutez 8 µL du deuxième brin mémoire tampon 10 x et 4 µL de deuxième brin Enzyme et mélanger l’échantillon en douce de pipetage avant son incubation à 16 ° C, pendant 2,5 heures.
  2. Nettoyer les échantillons avec les oligo purification et concentration kit selon les recommandations du fabricant pour les 100 réactions µL et éluer les échantillons dans 38 µL d’eau NF.
  3. Mettre en place la réaction de fin-réparation en ajoutant 20 µL d’eau NF à 35,5 µL de l’ADNc double brin, 6,5 µL de tampon de réaction réparer fin et 3 µL de fin mélange de préparation enzymatique. Soigneusement vérifier le tampon de réaction des précipités blanches et les dissoudre en main-le réchauffement s’il est présent.
  4. La réaction de fin-réparation de la composition de pipetage et il incuber à 20 ° C pendant 30 min, suivie d’une deuxième période d’incubation de 30 min à 65 ° C. Régler la température du couvercle thermocycleur à 5 ° C supérieure à la température d’incubation.

8. adaptateur ligature et sélection de la taille des bibliothèques de prêts

  1. Utiliser un module de préparation bibliothèque plusieurs étapes pour la préparation finale de bibliothèque (voir Table des matières). Tout d’abord, diluer les adaptateurs pour les génération séquençage 10 fois dans 10 mM Tris-HCl à une concentration finale de 1,5 µM. Puis, ajouter 2,5 µL d’adaptateur dilué et 1 µL de renforceur de ligature à chaque échantillon et les mélanger au vortex.
  2. Ajouter 15 µL du mélange réactionnel Ligase Blunt/TA, mélangez-le en pipettant également et il incuber à 20 ° C pendant 15 minutes. Puis, ajouter 3 µL d’enzyme réactif spécifique uracile excision et elle incuber à 37 ° C pendant 15 min. Après que la ligature est terminée, ajouter 13,5 µL d’eau NF à l’échantillon pour un volume total de 100 µL et procéder à la sélection de la taille.
    Remarque : Il est préférable de taille-choisir pour des molécules de cDNA qui sont de l’ordre de 600 à 800 bases de longueur. Si les molécules d’ARN fragmentés étaient approximativement de 60 à 80 bases de longueur, sélection de molécules qui sont 600 – 800 bases de longueur veillera à ce que la plupart des molécules sélectionnées contiennent au moins trois séquences répétées en tandem, ce qui est idéal pour la transformation en aval et analyse.
  3. Pour sélectionner des molécules qui sont bp 600 – 800 de longueur, ajouter 30 µL de suspension billes magnétiques (voir Table des matières), acclimatés à RT, pour chaque échantillon et mélanger en pipettant également. Transférer l’échantillon dans un tube de 1,5 mL et laisser incuber à ta 5 min.
  4. Placer l’échantillon sur un support magnétique pendant 5 min séparer les billes du surnageant. Transférer le surnageant (qui contient les molécules de cDNA désiré) pour un nouveau 1,5 mL de tube et éliminer des billes magnétiques (qui sont liés à des molécules de cDNA grand).
  5. Ajouter une portion de frais de 15 µL de billes magnétiques pour chacun des échantillons, bien mélanger en pipettant également et incuber pendant 5 min à la Place de la RT. les échantillons sur un support magnétique et les incuber pendant 5 min à température ambiante. Puis, délicatement, enlever et jeter les surnageants, veillant à ne pas déranger les perles.
    Remarque : Ne pas jeter les billes magnétiques, qui contiennent maintenant l’ADNc cible souhaitée.
  6. Ajouter 200 µL de 80 % fraîchement préparés chacun des échantillons d’éthanol sans déranger les billes magnétiques granulés et incuber pendant 30 s. jeter l’éthanol et laver les échantillons une fois de plus avec l’éthanol à 80 %. Puis, complètement éliminer toute trace d’éthanol à partir des échantillons et sécher les perles pendant 5 min mais veillez à ne pas trop sécher les perles. Si les perles sont overdried, fissures apparaîtront dans les boulettes.
  7. Pour éluer les échantillons provenant des perles, retirer les tubes du support magnétique et ajouter 19 µL de 10 mM Tris-HCl. pipette il vers le haut et vers le bas plusieurs fois à remis en suspension les perles et incuber les échantillons pendant 5 min à température ambiante. Si les billes étaient overdried, incuber à > 10 min.
  8. Replacez les échantillons sur le support magnétique et incuber les pendant 5 min séparer les billes du surnageant. Soigneusement retirer 15 µL de surnageant contenant les banques d’ADNc purifiée, sélectionné à la taille des tubes et le transférer dans un tube frais 1,5 mL.

9. PCR Amplification et Purification finale perle

  1. Ajouter 5 µL de l’amorce universelle et 5 µL d’une amorce de l’index unique (voir la Table des matières) à chaque purifiée d’ADNc et mélangez-les soigneusement par pipetage. Soigneusement vérifier le mélange maître polymérase de cristaux et autres précipités et chauffer le mélange maître à la main jusqu'à ce que les précipités se dissolvent.
    1. Ajouter 25 µL du mélange maître polymérase de l’échantillon, mélangez-les en pipettant également et suivre les conditions cyclisme ci-dessous pour l’amplification PCR. Exécutez la dénaturation initiale à 98 ° C pendant 30 s, puis effectuez une étape double réaction PCR par tous les échantillons à 98 ° C pendant 10 s et une recuit/extension des produits PCR à 65 ° C pendant 75 s (x 12), suivi d’une extension finale à 65 ° C pendant 5 min et une attente indéfinie à 4 ° C.
  2. Nettoyer les bibliothèques final en ajoutant 45 µL de suspension perles magnétiques directement à la réaction de PCR, mélangez-les en pipettant également et eux à ta pendant 5 min. transfert Incuber l’échantillon dans un tube de 1,5 mL et placez-le sur un support magnétique. Il incuber pendant 5 min, jeter le surnageant et le laver deux fois avec fraîchement préparée éthanol à 80 % pendant 30 s.
  3. Après le deuxième lavage, complètement éliminer l’éthanol de l’échantillon et sécher le culot de perle pendant 5 min et il éluer dans 35 µL de 0,1 x TE. Resuspendre les perles en pipettant également, eux et incuber entre eux RT pendant 5 min Place l’échantillon sur le support magnétique et après 5 min, transfert 30 µL du liquide surnageant dans un tube frais de 1,5 mL. Stocker les bibliothèques à-80 ° C.
  4. Contrôle de qualité : Diluer 1 µL de la bibliothèque finale à 9 µL d’eau NF et exécuter l’exemple sur un instrument d’analyse ADN dédié avec une puce haute sensibilité ; la majorité des ADNc devrait être de l’ordre de 600 à 800 bp de longueur (Figure 2e).
  5. Après l’élution, envoyer les échantillons pour le séquençage sur une plate-forme de séquençage massivement parallèle à l’aide de 250 lectures jumelé-fin de bp, ou les 300 bp single-end lectures.

10. bio-informatique analyse du cercle données de séquençage

NOTE : Analyser et interpréter les données brutes tirées de l’essai C-seq nécessitent un pipeline de bio-informatique dédié. Une représentation schématique du pipeline qui a été utilisée pour nos analyses est représentée à la Figure 3. Télécharger ce gazoduc à https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Tout d’abord, coupez les lectures à supprimer adaptateur séquences et de faible qualité base appelle cutadapt18, en utilisant un seuil de score de qualité de 20.
  2. Ensuite, identifier les répétitions codées par la molécule d’ARN de concatemerized en utilisant un algorithme approprié pour détecter toute répète avec une taille minimale de 30 nucléotides et un maximum de 2 incompatibilités entre reprend18. Dérivez une séquence consensus de ces répétitions et garder une trace de tous les appels de base et les scores de qualité associé à chaque position.
    Remarque : Étant donné que la transcription inverse peut commencer à n’importe quelle position sur la molécule d’ARN ΦH1, le début d’une répétition ne correspond pas nécessairement à l’extrémité 5′ de la molécule d’ARN fragmentée (ci-après dénommée le point de ligature). Par conséquent, la séquence consensus ne mappera pas continuellement contre le transcriptome correspondant, qui nécessite l’identification de la borne de la ligature.
  3. Pour identifier le point de la ligature, mapper un concatemer de la séquence consensus contre le transcriptome de référence en utilisant l’alignement BLAST-comme outil (BLAT)19.
    1. Concaténer deux instances de la séquence consensus pour s’assurer que la séquence mappée contienne au moins une occurrence sans interruption complète de la séquence de fragment d’ARN initiale. Puis, faites tourner la séquence consensus à commencer par la position du point prédit la ligature.
  4. Carte les séquences consensus tourné contre le génome en utilisant TopHat20 et utiliser les alignements pour détecter toute polymorphismes mononucléotidiques (SNP) qui pourraient être confondu avec erreurs de transcription.
  5. Appelez les erreurs de transcription des séquences consensus pivoté mappé et vérifier si les erreurs de candidats passent quatre essais supplémentaires.
    1. Tout d’abord, veiller à ce qu’une erreur de transcription ne se chevauche pas avec un SNP (une exigence typique, c’est qu’au moins 20 lectures devront couvrir un particulier base et pas plus de 5 % de la lecture peut prendre en charge un autre appel de base).
    2. Ensuite, vérifiez que la séquence consensus est dérivée d’au moins 3 séquences répétées en tandem, chacune d’elles appelle la même paire de base ; et Troisièmement, assurez-vous que la somme des scores de qualité de ce poste doit être supérieur à 100.
  6. Pour une quatrième et dernière vérifier, faire pivoter la séquence consensus dans toutes les combinaisons possibles (simulant toutes les positions possibles du point de ligature) et carte de chaque version contre le génome de référence en utilisant TopHat.
    Remarque : Si une des séquences tournées trouve une correspondance parfaite dans le génome, le point correspondant de la ligature est maintenant considérée comme correcte et l’appel d’erreur de transcription doit être rejeté.

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Representative Results

Comme toutes les approches de séquençage massivement parallèle, chaque expérience de C-seq produit un ensemble de données difficiles à manier, grand. Pour les nouveaux utilisateurs, il peut être difficile à gérer ces ensembles de données ; ainsi, il est recommandé que tous les utilisateurs une expérience bio-disponible avant l’expérimentation. En moyenne, l’espoir est que les utilisateurs vont générer environ 55 – 70 Giga bases (Gbases) par course sur la plupart des plateformes de séquençage massivement parallèle. Pour ce protocole, en général, 12 – 30 échantillons étaient multiplexés par course afin que pour chaque échantillon environ 2 – 6 Gbases ont été acquis. Après coupe les séquences de l’adaptateur et les appels de base faible qualité (< 20) de cet ensemble de données, environ 70 % de la taille des données initiales sont restées.

Ces bases sont ensuite analysées plus loin pour étudier l’efficacité de la fragmentation de la RNA et circularization en déterminant la taille des séquences répétées qui ont été générés. La plupart se répète tendent à être de 45 à 80 bases de longueur (Figure 4 a) et environ 50 % des bases qui ont été séquencés font partie de ces répétitions (Figure 4 b). Puisque la plupart de ces bases sont présente dans les lectures qui contiennent 3 répétitions ou plus, le nombre de bases uniques qui sont séquencés est environ le tiers du nombre total des bases séquencées. En moyenne, > 75 % de ces séquences consensus peut être mappé vers le génome de référence. Enfin, environ 25 % de ces bases sont couverts par 20 lectures ou plus, ce qui signifie qu’environ 10 % des données peut être utilisé pour la détection d’erreurs. Un exemple de cette analyse est donné dans la Figure 4, qui représente les informations de séquençage qui a été acquis au cours de la mise en place du présent protocole pour la 1 réplique d’une bibliothèque C-seq unique qui a été séquencée relativement faible et représente le plus bas limite des données que les utilisateurs peuvent s’attendre à acquérir.

Environ 5 000 – 25 000 erreurs par course ont tendance à être identifié, même si ces chiffres peuvent varier considérablement selon le taux d’erreur lui-même (plus le taux d’erreur, les plus d’erreurs seront détectées), la taille de la transcriptome (plus le transcriptome, les bases moins seront couverts par 20 lectures, limitant les données de séquençage qui peuvent être utilisées pour la détection d’erreurs) et la profondeur à laquelle il est séquencé (séquençage plus profond rendra plus probable qu’une base de donnée sera couvert par les lectures de 20 ou plus). Ces erreurs ont tendance à être réparties sur l’ensemble du génome, afin qu’en moyenne ~ 47 % des erreurs se trouvent dans l’ARNm molécules générées par l’ARN polymérase II (RNAP II), ~ 49 % sont trouvent dans les molécules d’ARNr générés par RNAP I et les ~ 3 % restants sommes situés à ARN généré par RNAP III et de l’ARN polymérase mitochondriale. Toutefois, ces ratios peuvent varier considérablement selon le type de cellule ou l’organisme incriminé (Figure 4). Par exemple, les types de cellules qui dépendent fortement de la fonction mitochondriale, tels que les cardiomyocytes, contiennent des ARN significativement plus mitochondrial que d’autres types de cellules, qui augmente considérablement le nombre de molécules d’ARN mitochondriales qui sont séquencés et donc le nombre des erreurs détectées.

Une fois une liste des erreurs a été compilée, et leur emplacement au sein du génome est connues, ces erreurs peuvent être utilisés pour identifier les paramètres qui contrôlent le taux d’erreur de transcription dans chaque organisme. Par exemple, l’emplacement de ces erreurs de transcription peut être corrélée avec de nombreuses fonctionnalités du génome, comme la présence d’ADN se répète, des contextes génétiques spécifiques, ou le taux d’expression, de comprendre comment ces fonctionnalités altérer la fidélité de 5de transcription. L’espoir est que dans l’avenir, cependant, utilisateurs seront en mesure de déterminer combien d’innombrables fonctionnalités supplémentaires affectent transcriptionnelle fidélité, y compris les marqueurs épigénétiques, l’organisation 3D du génome, la disponibilité des nutriments, âge ou exposition à des toxiques composés, pour élucider la contribution des facteurs génétiques et environnementaux de la fidélité de la transcription.

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la RNA-seq versus C-suiv. (A) traditionnel RNA-seq RNA isolat d’expériences auprès d’un échantillon d’intérêt, l’ARN des fragments, et le revers transcrire avant la préparation finale de bibliothèque et de séquençage. Toutefois, ces procédures de préparation introduisent nombreux artefacts techniques dans la bibliothèque sous la forme d’erreurs de transcription inverse, PCR amplification et séquençage erreurs. (B), ce C-seq optimisé dosage permet la correction de ces artefacts techniques par circularisation les molécules d’ARN fragmentés avant transcription inverse, ce qui leur permet d’être inverse transcrit de façon cercle roulant pour produire linéaire Répétez les molécules de cDNA qui contiennent plusieurs exemplaires du modèle original de RNA en tandem. Ces séquences répétées en tandem peuvent alors servir à distinguer les erreurs de transcription exacte des artefacts, comme les erreurs de transcription exacte (star) sera présents dans toutes les séquences répétées au même endroit, alors que les artefacts tels que renverser les erreurs de transcription (carrés) et la PCR Erreurs d’amplification (cercle) sont présents dans une ou deux répétitions de n’importe quelle molécule de cAdn donné uniquement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : représentant des résultats pour la préparation de la bibliothèque. Ces panneaux montrent une electrophoretogram pour ruban de (A), une haute sensibilité RNA écran ladder (voir Table des matières), (B) le total ARN purifié de Saccharomyces cerevisiae, RNA de RNase III-fragmenté (C) et) ADNc d’inverse-transcrits cercle roulant D). (E), la finale-la taille sélectionnée d’ADNc fonctionne sur une analyse d’ADN double-brin haute sensibilité puce (voir Table des matières). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : schématique de la canalisation de bio-informatique utilisée pour analyser les données de séquençage cercle. Après la coupe des lectures de séquençage, les répétitions sont identifiées, et une séquence consensus est générée à l’aide de l’appel de base très probablement à une position donnée. Ensuite, le point de la ligature du modèle initial de RNA est identifié et la séquence consensus est alignée sur le génome de référence afin que les éventuelles erreurs de transcription peuvent être identifiées. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : exemple de résultats pour C-Seq pipeline. (A), ce panneau montre la distribution de la taille des séquences consensus issue d’une expérience typique de C-Seq. (B) ce panneau indique le nombre de bases, lectures et le pourcentage de lectures séquencé dans chaque étape de l’oléoduc de bioinformatique C-Seq. (C) ce panneau indique le nombre d’erreurs de transcription détecté et le pourcentage d’erreurs attribué aux ARN polymérase I, l’ARN polymérase II, l’ARN polymérase III et ARN polymérase mitochondriale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous décrivons ici un protocole optimisé pour la préparation des bibliothèques C-seq pour la détection des erreurs de transcription dans Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteret Caenorhabditis elegans. Ce protocole a de nombreux avantages par rapport aux protocoles existants, ainsi que des techniques alternatives.

Au cours des 15 dernières années, nombreux journaliste ont élaboré des systèmes qui dépendent de la luciférase7,8 ou Cre-Lox recombinaison3,4,15,21 pour détecter la transcription erreurs. Ces systèmes de journaliste ont été inestimables à la compréhension de chercheurs de fidélité transcriptionnelle parce qu’ils ont permis gènes, allèles et mécanismes moléculaires d’identifier directement régulant la fidélité de la transcription. Cependant, ils ne signalent que sur les erreurs dans les modèles artificiellement endommagés, ou dans des contextes très spécifiques génétiques, qui limite les questions scientifiques, qu'ils peuvent répondre. Un avantage important du protocole C-seq, c’est qu’il surveille la fidélité de la transcription dans tout le transcriptome ensemble5, élargissant considérablement les connaissances scientifiques de la précision avec laquelle l’information génétique est exprimée. Deuxièmement, parce que le C-seq est RNA comme son matériel de base, il est probable que ce dosage peut être adapté à n’importe quel organisme de choix, il ne soit pas le besoin de générer des constructions compliquées journaliste pour chaque modèle transgénique. Ce protocole a également des avantages par rapport aux existants séquençage massivement parallèle approches17,22. Plus particulièrement, la plupart de ces approches font usage de métaux lourds à des bibliothèques de fragment RNA. Cependant, ces méthodes de fragmentation introduisent des artefacts dans l’ARN qui sont indistinguibles des erreurs de transcription exacte5. Pour résoudre ce problème, ce protocole fragments d’ARN enzymatiquement avec la RNase III, qui a l’avantage supplémentaire qu’il laisse les extrémités compatibles pour l’individu-ligature, grandement simplifier circularization RNA et accroître la sensibilité du dosage ~ 10 fois.

Dans le même temps, le dosage de la C-seq a sa propre part de limitations. Tout d’abord, même si l’essai mesure les erreurs de transcription dans tout le génome entier, une grande partie des données a tendance à provenir de gènes qui sont exprimés fortement, comme la transcription de ces gènes ont tendance à dominer la plupart des bibliothèques de RNA. Un autre facteur qui biaise l’analyse vers gènes fortement exprimés est le seuil construit dans le pipeline de bio-informatique qui empêche les mutations génétiques et l’ARN édition des événements depuis les mesures finales de confusion. Ce seuil dicte que seulement les bases qui ont été séquencés 20 fois ou plus peuvent être utilisés pour l’analyse finale. Une autre limite concerne la diversité de la bibliothèque. Comme la plupart des kits utilisés pour l’extraction de l’ARN, le kit utilisé ici efficacement purifie pas petites molécules d’ARN, qui limite le nombre de lectures de dérivés de molécules synthétisées par RNAP III. La diversité de la bibliothèque de séquençage final est limitée par la purification de l’ARNm employée ici. Même si les molécules générées par RNAP je peux être efficacement séquencé, la plupart du RNAs mitochondrial restant, ARNt et ARN non codants est perdus au cours de cette étape. Pour capturer ces molécules plus fréquemment, un kit différent qui purifie spécifiquement les petites molécules d’ARN devrait être utilisé, ou types cellulaires devraient être ciblées qui sont enrichis de ces molécules. Veuillez noter, cependant, que la plupart de ces problèmes peut être résolue par séquençage plus profond que d’habitude, ou simultanément séquençage de l’ADN des cellules mêmes, bien que les deux de ces solutions nécessiteront un investissement financier plus important par les enquêteurs.

En outre, les futurs développements technologiques sont prêts à améliorer l’essai C-seq à un niveau fondamental. Par exemple, en étendant la lecture-longueur de la technologie existante de séquençage, il sera possible aux molécules plus longues séquence, ce qui signifie que plus de répétitions peuvent être utilisées pour s’assurer la fidélité de la transcription. Ces améliorations entraîneront automatiquement une plus grande profondeur de séquençage et une augmentation du pourcentage des lectures qui peut être utilisé pour l’analyse en aval. Un argument similaire est possible pour n’importe quelle technologie de séquençage qui permet plus de molécules à séquencer en parallèle. En outre, de nombreuses composantes de l’essai C-seq restent à être optimisé, y compris l’efficacité du RNA circularization, la rigueur de la sélection de la taille et la nature de temps de l’essai lui-même. Enfin, il est fortement recommandé que tous les utilisateurs accéder à un outil dédié, haute sensibilité pour l’analyse des acides nucléiques et de dépannage possibles (voir Table des matières). Sans cet outil, il peut être extrêmement difficile de déterminer à quel moment surviennent les problèmes potentiels, ce qui les rend impossible de fixer.

Bien que l’ensemble du protocole est assez impitoyable (petites erreurs ont tendance à avoir des conséquences importantes), il y a plusieurs étapes qui sont absolument essentiels à la réussite de l’essai C-seq. Une des exigences plus importantes est que l’ARN est traitée aussi doucement que possible. Plupart des méthodes d’extraction d’ARN et des kits de transformation en aval soucient peu la composition chimique de l’ARN au-delà des normes de l’industrie de base, qui est suffisant pour des analyses moléculaires plus. Toutefois, le dosage de la C-seq est chargé indiquant une erreur de transcription unique parmi des centaines de milliers de bases WT, qui augmente considérablement la nécessité de réduire le stress moléculaire. Même stress qui affecte uniquement les bases de 1 à 10 000 peuvent introduire des artefacts qui invalident complètement les résultats. Par exemple, les utilisateurs doivent jamais éviter/limite exposer l’ARN à n’importe quelle température supérieure à 65 ° C. Deuxièmement, chaque utilisateur doit optimiser soigneusement le temps nécessaire à la fragmentation de RNA avec RNase III. Il est absolument crucial pour le succès de la série que les molécules finales sont environ 60 – 80 bases de longueur. Molécules plus courtes peuvent être difficiles à mapper sur le génome, et plus longues molécules ne permettront pas pour 3 répétitions indépendantes à séquencer dans une lecture bp 250. Enfin, il est recommandé de ne pas congeler et décongeler l’ARN de plus d’une fois au cours de l’ensemble du protocole. Au contraire, isoler l’ARN et de synthétiser l’ADNc en une seule journée. En raison de l’heure et l’effort impliqué dans cet engagement, la complexité du Protocole lui-même et le nombre d’échantillons qui sont fréquemment traitées en même temps, il est recommandé que les deux enquêteurs travaillent ensemble pour générer ces bibliothèques.

Lorsque réussie, ces expériences permettra de détecter avec précision des erreurs de transcription dans n’importe quel organisme, sous toute condition expérimentale. Par exemple, en comparant les contrôle et les personnes malades les uns aux autres, il serait possible de déterminer si certaines maladies sont associées à des erreurs de transcription, qui peuvent révéler une nouvelle composante de l’étiologie de nombreuses pathologies humaines. D’autres paramètres qui pourraient être sondées sont vieillissement organismique, nutrition, génotype et des facteurs environnementaux tels que l’exposition aux produits chimiques toxiques. En outre, parce que ce test détecte les erreurs de transcription dans le transcriptome, il permettra aux chercheurs de disséquer les différents mécanismes qui contribuent à la fidélité de l’ARN polymérase I, II et III, ainsi la polymérase ARN mitochondriale. Par conséquent, nous espérons que ce protocole va ouvrir un nouveau champ de mutagénèse d’expérimentation très répandue, caractérisée par l’étude des mutations dans l’ARN, plutôt que dans l’ADN.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Cette publication a été rendue possible par le financement de subventions T32ES019851 (de C. Fritsch), R01AG054641 et un jeune chercheur AFAR accordent (à M. Vermulst).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

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References

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Génétique numéro 139 processus génétiques Expression génique Transcription génétique Transcription inverse Transcriptome mutagenèse Substitution d’acide aminé phénomènes et processus phénomène génétique mutagenèse transcription RNA-Seq S. cerevisiae c. elegans d. melanogaster séquençage l’ARN polymérase Erreurs
Surveillance de Génome-large d’erreurs de Transcription dans les organismes eucaryotes
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Fritsch, C., Gout, J. F. P.,More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

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