Summary
Detta protokoll ger forskare med ett nytt verktyg för att övervaka trohet transkriptionen i flera modellorganismer.
Abstract
För ett troget uttryck för genetisk information krävs korrekt transkription. Överraskande men lite är känt om de mekanismer som styr trohet transkriptionen. För att fylla denna lucka i vetenskaplig kunskap, optimerad vi nyligen cirkel-sekvensering analysen för att upptäcka transkription fel i hela transkriptom av Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans. Detta protokoll kommer att ge forskare med ett kraftfullt nya verktyg för att kartlägga landskap av transkription fel i eukaryota celler så att de mekanismer som styr trohet transkriptionen kan belysas i oöverträffad detaljrikedom.
Introduction
Genomet ger en exakt biologiska blåkopia av liv. För att genomföra denna blåkopia korrekt, är det viktigt för genomet att transkriberas med stor precision. Transkription är dock osannolikt att vara felfri. Till exempel RNA polymeraser har länge varit känt att vara felbenägen in vitro-1,2, och nyligen det visades att de begår fel i vivo samt3,5,6, särskilt när de konfronteras med DNA skada7,8,9,10. Sammantaget tyder dessa observationer på att transkriptionen fel uppkomma kontinuerligt i alla levande celler, vilket tyder på att de kunde vara en potent källa av muterade proteiner.
Denna process kallas transkriptionell mutagenes, skiljer sig från klassisk mutagenes på två sätt. Först, i motsats till genetiska mutationer, transkription fel påverkar både mitotiska och efter mitotiska celler, som de inte beror på DNA-replikation. Studera de mekanismer som påverkar trohet transkriptionen kommer därför att ge värdefulla insikter om mutationen belastningen av både mitotiska och efter mitotiska celler. Intressant, transkription fel har nyligen varit inblandade i främjandet av protein sammanläggning11,12,13 och har varit en hypotes om för att bidra till både carcinogenes10 och utveckling av antibiotikaresistens hos bakterier14.
Andra, till skillnad från genetiska mutationer, transkription fel är övergående. Deras tillfälliga existens är särskilt utmanande eftersom det gör transkription fel ytterst svår att upptäcka. Till exempel, medan flera labs har utarbetat värdefulla reporter analyser för studiet av transkriptionell mutagenes, finns dessa analyser endast kunna mäta transkription fel i ett begränsat antal sammanhang och modell4,15. För att övervinna dessa begränsningar, har många forskare vänt sig till RNA-sekvensering teknik (RNA-seq), som teoretiskt kan transkription fel registreras i hela transkriptom av alla arter. Dessa studier är dock enkelt ihop av bibliotek konstruktion artefakter, såsom omvänd Transkription fel, PCR-amplifiering fel och felbenägna beskaffenhet sekvensering själv. Till exempel begår omvänd transcriptases ungefärligt ett fel varje ~ 20.000 baser, medan RNA polymeraser (RNAPs) förväntas göra enda fel var 300.000 baser5,6. Eftersom felprocenten för omvänd Transkription ensam dvärgar felprocenten av RNA polymeraser inuti cellerna, är det nästan omöjligt att skilja sant transkription fel från artefakter som orsakas av bibliotek preparatet i traditionella RNA-Seq data ( Figur 1a).
För att lösa problemet, utvecklat vi en optimerad version av den cirkel-sekvenseringen (Cirseq eller C-seq hädanefter) analys5,16. Denna analys tillåter användaren att upptäcka transkription fel och andra sällsynta varianter i RNA under hela den transkriptom5. Cirkulär-sekvensering analysen bär detta namn eftersom ett viktigt steg i denna analys kretsar kring RNA circularization. När RNA målen är circularized, är de omvänd transkriberas i en rullande mode cirkel, att producera linjär cDNA molekyler som innehåller många kopior av samma RNA mall. Om ett fel var närvarande i en av dessa mallar, skulle detta fel också vara närvarande i varje enskild upprepning som finns inom cDNA molekylen. Däremot fel införs genom omvänd Transkription, PCR-amplifiering eller sekvensering tenderar att uppkomma slumpmässigt, och således finnas i endast en eller två repetitioner. Genom att generera en konsensus sekvens för varje cDNA molekyl, och särskilja slumpmässiga fel från fel som uppstår i alla repetitioner, kan således bibliotek konstruktion artefakter effektivt separeras från Sant transkription fel (figur 1b).
Om det används korrekt, C-seq analysen kan användas för att korrekt identifiera andelen bas substitutioner, infogningar och borttagningar i RNA under hela transkriptom av alla arter (exempelvis se Traverse och Ochman17). Till exempel har vi använt C-seq analysen för att förse genome-wide mätningar av felprocenten av transkription i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans med en enda bas resolution5 (opublicerade observationer). Ursprungligen användes korrekt sekvensera RNA-virus populationer, har detta optimerade versionen av C-seq analysen effektiviserats för att minimera hårda förhållanden under bibliotek förberedelsen som bidrar till biblioteket konstruktion artefakter. Dessutom, med hjälp av ett antal kommersiellt tillgängliga kit, förbättrad genomströmning av analysen väsentligt, samt dess användarvänlighet. Om det används korrekt, kan denna analys upptäcka tusentals transkription fel per replikat, därmed kraftigt förbättra på tidigare studier6. Sammantaget denna metod ger ett kraftfullt verktyg för att studera transkriptionell mutagenes och tillåter att användaren att få nya insikter i de mekanismer som styr trohet transkriptionen i ett brett utbud av organismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. beredning
- RNaser finns överallt; Därför rengöra arbetsytan ordentligt genom besprutning ner med en sanering reagens (e.g., RNase bort) och 70% etanol. Spraya ner alla pipetter, pennor eller tube rack för att ta bort potentiella föroreningskällor RNase.
- För att ytterligare förhindra RNaser från att förorena proverna, bära en labbrock eller Långärmad T-shirt under experimenterandet. Undvik kontakt mellan handskar och insidan av eventuella tuber som kommer att användas, särskilt när du hämtar dem från en låda eller påse.
- Före den omvänd transkriptionen, Byt handskar ofta.
Obs: För optimalt resultat, pausa inte experimentet innan den omvänd transkriptionen.
2. cellen och djur kultur och samling
-
Saccharomyces cerevisiae tillväxt och samling
- Om ett C-seq bibliotek önskas från jäst, först Inokulera en enda koloni av S. cerevisiae 3 ml medium innehållande jästextrakt, adenin, pepton och glukos (YAPD), och inkubera det över natten vid 30 ° C i en rullande trumma.
- På morgonen åter Inokulera kulturen i 50 mL YAPD medium till en optisk densitet (OD) 0,1 och odla cellerna tills de når en OD av 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 celler/mL).
- Samla hela 50 mL kulturen (cirka 350 x 106 celler) i en 50 mL konisk tub och snurra cellerna ner för 3 min vid 2100 x g. Ta försiktigt bort det YAPD mediet och tvätta pelleten en gång med 1 x PBS.
- Sedan återsuspendera pelleten i 480 μl lyseringsbuffert, 48 µL 10% SDS och 480 µL av fenol: kloroform: isopentanol (25:24:1), pH 6,8. Vortex provet vid maxhastighet för 5 s, och överföra det till skruvlock 1,5 mL rör med 750 µL av iskall zirkonia pärlor (medföljer i kitet). Fortsätt till steg 3 i detta protokoll för cell lysis och totalt RNA-extraktion.
Obs: Alla reagenser som krävs för steg 2.1.4 finns i rekommenderade jästen RNA extraktion kit. Dessa reagenser fungerar lika bra för jästen, maskar och flugor så att efter insamlingen av jäst (steg 2.1), maskar (steg 2.2) eller flugor (steg 2,3), ett enhetligt tillvägagångssätt kan användas för att generera C-seq bibliotek (steg 3 – 10).
-
Caenorhabditis elegans kultur och samlingen
- Om ett C-seq bibliotek önskas från maskar, insättning 30 vuxna maskar på en färsk platta av agar fläckig med OP50 bakterier.
Obs: Fem plattor är tillräckliga för 1 replikera. - Kultur maskar i 4 dagar och samla maskar genom att försiktigt tvätta plattorna med 5 mL av M9 media och pool maskar i ett enda 50 mL koniska rör.
- Snurra maskarna ner vid 100 x g i 2 min till skapa en pellet. Avta centrifugen vid den lägsta hastigheten som möjligt, så att inte störa pelleten.
- Försiktigt flytta maskar i en 1,5 mL tub, tvätta dem två gånger i 1,5 mL M9 media och centrifugera röret på 100 x g för 1 min att ta bort bakterier och generera en ren 100 µL pellet av maskar.
- Återsuspendera maskar i 480 μl lyseringsbuffert, 48 µL 10% SDS och 480 µL av fenol: kloroform: isopentanol. Vortex provet vid maxhastighet för 5 s och överföra det till ett 1,5 mL skruvlock tube innehåller 750 µL av iskall zirkonia pärlor. Fortsätt till steg 3 i detta protokoll för lys av maskar och den totala RNA-extraktionen.
- Om ett C-seq bibliotek önskas från maskar, insättning 30 vuxna maskar på en färsk platta av agar fläckig med OP50 bakterier.
-
Drosophila melanogaster kultur och samling
- Om ett C-seq bibliotek önskas från flugor, kultur 20 – 25 flugor i injektionsflaskor som innehåller dextros eller melass-baserade medium. Alikvotens flugor över 3 injektionsflaskor, så att varje injektionsflaska innehåller cirka 8 flugor.
- Samla in flugor, Placera injektionsflaskan i en ishink tills flugorna är drogad. Sedan samla dem med en borste i en 1,5 mL tub. Samla inte flugorna av CO2 behandling.
- Låt flugorna varm rumstemperatur (RT) och snabbt lägga till en premade blandning av 500 μl lyseringsbuffert, 50 µL 10% SDS och 500 µL av fenol: kloroform: isopentanol till röret. Använd en micropestle för att slipa upp flugor med cirka 15 stroke, åtföljs av en firma som vrida motion när mortelstöten når botten av röret.
- Häll blandningen av flugor och lysis media i ett 1,5 mL skruvlock tube innehåller 750 µL av iskall zirkonia pärlor och vortex det med maximal hastighet för 5 s. Fortsätt till steg 3 i detta protokoll för lys av flugor och den totala RNA-extraktionen.
3. total-RNA rening
Obs: vid denna punkt, alla tre protokoll konvergerar, och en enhetlig strategi kan användas för att generera C-seq bibliotek.
- Skruva på korken ordentligt och fäst röret till en vortexer med en adapter eller tejp. Vortex röret med maximal hastighet i ca 10 min att lysera proverna. Sedan Centrifugera provet vid 16,100 x g i 5 min att separera de organiska lösningsmedel från vattenfasen.
- Försiktigt bort 400 – 500 µL av vätskefasen utan att störa vit, grumlig interphasen, och lägga till den i en 15 mL koniska rör som innehåller 1,9 mL bindande buffert. Blanda dem genom vortexa.
- Lägg till 1,25 mL 100% etanol och blanda provet genom vortexa. Över 700 µL av provet till en filterpatron som monteras i en samling tube och snurra provet vid 14.500 x g för 30 s. Upprepa tills alla provet leds genom patronen.
Obs: vid denna punkt, provet kan vända svagt ogenomskinlig. Om alltför många celler, maskar och flugor var lyserat, fällningar kunde visas som kan täppa upp filtret. - Tvätta filtret en gång med 700 µL tvättlösning 1 och två gånger med 500 µL tvättlösning 2 eller 3. Avsluta tvättarna med spinning proverna vid 14.500 x g i 2 min att ta bort någon överflödig etanol.
- Överför filterpatronen till ett 1,5 mL dolphin rör och tillsätt 108 µL förvärmd eluering lösning (65 ° C).
Obs: Utsätt aldrig RNA prover för temperaturer som är högre än 65 ° C före en omvänd Transkription, som gör så kommer att provocera cytosin uracil deaminering händelser som är omöjliga att skilja från transkription fel. - Försämra DNA kontaminering i den isolerade RNA (se steg 2.1-3,4) genom att lägga till 11 µL 10 x DNAS jag buffert, 2 µL av RNase inhibitor och 4 µL av DNAS jag (8 U), och inkubera dem vid 37 ° C i 30 min.
- Efter matsmältningen, tillsätt 11 µL av DNAS inaktivering reagens. Vortex blandningen och låt det sitta på RT i 5 min. Sedan Centrifugera provet vid 15 000 x g i 3 min pellet inaktivering reagens och samla in 110 µL av supernatanten utan att störa pelleten. Överför supernatanten till en 1,5 mL tub.
Obs: DNAS inaktivering reagens kan vara ganska svårt att Pipettera ordentligt, så okulärbesiktiga pipettspetsen efter varje pipettering åtgärd. Om inaktivering reagensen blir för trögflytande att Pipettera, lägga till 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) lika med 1/5 av den återstående volymen. - (Kvalitetskontroll) Mätning av koncentrationen av den total-RNA med en spektrofotometer. Sedan avsätta 1 µL av total-RNA och späda ut det till en koncentration på 10 ng/µL i nuclease-fri (NF) vatten. Kör RNA på ett lämpligt nukleotid analysinstrument med en hög känslighet RNA tejp så att RNA inte försämras och har ett eRIN värde på minst 8,5 eller högre (figur 2B).
4. mRNA anrikning
- Utföra mRNA berikning med en mRNA-miniprep kit (se Tabell för material). Lägga till 140 µL NF vatten i provet för en total volym på 250 µL. Lägg sedan till 250 µL av 2 x bindande buffert, blanda provet grundligt genom vortexa och tillsätt 15 µL av oligo (dT) pärlor.
- Blanda provet genom pipettering det upp och ner och inkubera det vid 65 ° C i 2 min. Sedan placera provet på RT i 10 min. Slutligen, Centrifugera provet vid 16,100 x g i 2 min till pellet pärla: mRNA komplexen.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera pelleten i 500 µL tvättlösning. Överför lösningen till en spin kolumn och spinna för 1 min vid 15 000 x g. Kassera genomströmmande och tvätta provet med en ytterligare 500 µL tvättlösning. Sedan, snurra provet för 2 min vid 15 000 x g ta bort någon överflödig etanol från spin filtren.
- Överföra spin filtret till en dolphin tube och återsuspendera pelleten i kolumnen med 80 µL förvärmd eluering lösning (65 ° C). Inkubera provet för 1,5 min vid 65 ° C och eluera det genom att snurra det för 1 min vid 15 000 x g.
- Mätning av koncentrationen av renat RNA med en spektrofotometer eller liknande verktyg som möjliggör kvantifiering av RNA-koncentrationen och kvalitet.
5. RNase III fragmentering och RNA städa upp
Obs: (Viktigt) att förbereda cirkulär RNA-molekyler som är lämpliga för att generera C-seq bibliotek, RNA måste fragmenteras till ungefär 60 – 80 baser i längd. Medan tidigare metoder har använt en kemisk fragmentering att fragmentet RNA, introducerar kemiska fragmentering med tungmetaller skadestånd till de RNA-prover som kan misstolkas som transkription fel under den slutliga analysen. För att kringgå problemet, lita istället på en splittring med RNase III för att generera små fragment. En ytterligare fördel med denna enzymatisk metod är att det skapar kompatibel ändar krävs för ligering, undanröja behovet av en slut-reparation efter kemiska splittringen.
- Ställa in RNA fragmentering reaktion med 1 µg renat RNA, 10 µL reaktion buffert, 5 µL RNase III och tillräckligt NF vatten för att få volymen upp till 100 µL (se Tabell för material). Lägg till enzymet senast och Pipettera blandningen upp och ner minst 10 gånger för att blanda. Inkubera provet vid 37 ° C i 25 min, som tenderar att framkalla RNA fragment av cirka 60-80 baser i längd.
- När 25 min ruvning är klar, städa upp reaktionen omedelbart med en oligo sanering och koncentrator kit (se Tabell för material) för att förhindra eventuella ytterligare matsmältningen. Tillsätt 200 µL oligo-bindande buffert till provet, blanda det av vortexa och tillsätt 800 µL av 100% etanol. Blanda provet genom vortexa och överför det till en medföljande spin kolumn i en samling tube.
- Centrifugera provet vid 10 000 x g för 30 s och tvätta det med 750 µL tvättlösning ta bort RNase III. Centrifugera provet vid 10 000 x g för 30 s, kasta genomströmmande och tvätta provet en gång till med 750 µL tvättlösning enligt ovan. Efter andra genomströmning har förkastats, Centrifugera kolumnen vid 15 000 x g i 2 min att ta bort någon överflödig etanol.
- Flytta kolumnen till en fräsch 1,5 mL tub och eluera provet i 24 µL NF vatten genom att snurra det vid 10 000 x g i 1 min.
- Kvalitetskontroll: Ta 2 µL av renat RNA fragment och späd den 2gånger genom ett tillägg 2 µL NF vatten. Kör den fragmenterade RNA på skärmen band för att fragmenterade RNA är i intervallet 50 – 100 baser i längd (figur 2 c).
6. RNA Circularization och rullande cirkel omvänd Transkription
- För att circularize RNA fragment, värme-denaturera 20 µL av provet vid 65 ° C i 1 min och placera den på is omedelbart i 2 min. Lägg sedan till 4 µL 10 x T4 RNA ligase buffert, 4 µL 10 mM ATP, 1 µL RNase inhibitor, 1 µL NF vatten och 8 µL av 50% polyetylenglykol (PEG).
- Blanda provet grundligt genom vortexa, sedan lägga till 2 µL 10 U/µL T4 RNA Ligase I. Blanda provet igen genom pipettering det och inkubera det vid 25 ° C under 2 h i en termocykler med temperaturen av locket vid 30 ° C.
- Efter 2 h, tillsätt 10 µL av NF vatten och rensa upp provet med ett kit för sanering och koncentration av oligo enligt tillverkarens specifikationer. Eluera provet i 20 µL av NF vatten.
- Att vända transkribera de cirkulära RNA-molekylerna, lägga till 4 µL 10 mM dNTP, 4 µL av 50 ng/µL slumpmässiga hexamers och 9 µL NF vatten 9 µL av RNA. Blanda allt noggrant genom pipettering, denaturera provet vid 65 ° C i 1 min och placera den på is för 2 min. Store återstående RNA som back-up.
- Tillsätt 8 µL av 5 x första-strand syntes buffert, 2 µL 0,1 mM DTT och 4 µL av 200 U/µL omvänt transkriptas och blanda allt genom pipettering. Inkubera provet vid 25 ° C i 10 min, följt av en 20 min inkubation vid 42 ° C med locket vid 5 ° C högre än inkubation temperaturen.
Obs: Ett omvänt transkriptas med strand deplacement kapacitet måste användas i det här steget för en rullande cirkel omvänd Transkription. - Tillsätt 10 µL av NF vatten och rensa upp med oligo sanering och koncentration kit enligt tillverkarens rekommendationer. Eluera provet i 42 µL eluering lösning.
- Kvalitetskontroll: Späd 2 µL av den enkelsträngade cDNA i 2 µL NF vatten och köra exemplet på en nukleotid analysinstrument med hög känslighet RNA Tape. Om omvänd Transkription arbetat riktig, ett bibliotek av cDNA molekyler, bör alltifrån ungefär 60 – 1.500 baser i längd, vara synliga. Helst är de flesta cDNA i storleksordningen 500 – 1000 baser (figur 2d).
7. andra Strand cDNA syntes och slutet reparation
- Använda ett andra strand syntes kit för att generera ett dubbelsträngat cDNA-bibliotek. Placera proverna på isen och Lägg till 30 µL NF vatten 38 µL av ditt prov. Sedan lägga till 8 µL 10 x andra Strand buffert och 4 µL av andra Strand enzym och blanda provet genom skonsam pipettering före dess inkubation vid 16 ° C för 2,5 h.
- Städa upp av prov med oligo sanering och koncentration kit enligt tillverkarens rekommendationer för 100 µL reaktioner och eluera proverna i 38 µL NF vatten.
- Ställa in slutet-reparation reaktionen genom att lägga till 20 µL av NF vatten 35,5 µL av dubbelsträngat cDNA, 6,5 µL slutet reparera reaktion buffert och 3 µL av slutet Prep enzym Mix. Noggrant kontrollera reaktion bufferten för vita fällningar och lös upp dem genom handvärmande om närvarande.
- Blanda slutet-reparation reaktionen genom pipettering och inkubera det vid 20 ° C under 30 min, följt av en andra 30 min inkubation vid 65 ° C. Ställa in temperaturen av termocyklern locket vid 5 ° C högre än inkubation temperaturen.
8. adapter ligering och storlek urval av beredda bibliotek
- Modulen en flerstegs bibliotek förberedelse för de slutliga bibliotek preparat (se Tabell för material). Först, späd adaptrar för nästa generations sekvensering 10 gånger i 10 mM Tris-HCl till en slutlig koncentration av 1,5 µM. Sedan lägga till 2,5 µL utspädda adapter och 1 µL ligering enhancer i varje prov och blanda dem genom vortexa.
- Tillsätt 15 µL av Blunt/TA Ligase Master Mix, blanda det genom pipettering och inkubera det vid 20 ° C under 15 minuter. Lägg 3 µL av uracil-specifika excision reagens enzym sedan och inkubera det vid 37 ° C i 15 min. Efter ligation är klar, tillsätt 13,5 µL NF vatten i provet för en total volym av 100 µL och vidare till storlek markeringen.
Obs: Det är bäst att storlek-Välj för cDNA molekyler som är i spänna av 600 – 800 baser i längd. Om de fragmenterade RNA-molekylerna var cirka 60 – 80 baser i längd, att välja för molekyler som är 600 – 800 baser i längden kommer att säkerställa att de flesta av de valda molekylerna innehåller minst tre tandemupprepningar, vilket är idealiskt för efterföljande bearbetning och analys. - Markera för molekyler som är 600 – 800 bp i längd, lägga till 30 µL återsuspenderad magnetiska pärlor (se Tabell för material), acklimatiserad till RT, för varje provtagning och blanda genom pipettering. Överför provet till en 1,5 mL tub och inkubera det vid RT i 5 min.
- Placera provet på en magnetisk stå för 5 min att separera pärlorna från supernatanten. Överför supernatanten (som innehåller önskad cDNA molekylerna) för att en ny 1,5 mL tub och avyttra de magnetiska pärlor (som är bundna till stora cDNA molekyler).
- Lägga till en fräsch delmängd av 15 µL av magnetiska pärlor i varje prov, blanda omsorgsfullt genom pipettering, och inkubera i 5 min på RT. Place proverna på en magnetisk rack och inkubera dem i 5 min på RT. Sedan försiktigt bort och kassera supernatanterna, att se till att inte störa pärlorna.
Obs: Släng inte de magnetiska pärlor, som nu innehåller cDNA som önskat mål. - Tillsätt 200 µL av 80% nylagade etanol till varje prov utan att störa pelleterat magnetiska pärlor och inkubera i 30 s. kasta etanolen och tvätta av prov gång med 80% etanol. Då helt bort alla spår av etanol från proverna och lufttorka pärlorna för 5 min men var noga med att inte alltför torr pärlorna. Om pärlorna är overdried, visas sprickor i pellets.
- För att eluera proverna från pärlorna, ta bort rören från magnetiska stativet och tillsätt 19 µL 10 mm Tris-HCl. Pipettera upp och ner flera gånger till resuspended pärlorna och inkubera proverna för 5 min vid RT. Om pärlorna var overdried, inkubera dem för > 10 min.
- Placera proverna på magnetiska stativet och inkubera dem för 5 min att separera pärlorna från supernatanten. Försiktigt bort 15 µL av supernatanten innehållande renat, storlek är markerade cDNA biblioteken från rören och överföra den till en fräsch 1,5 mL tub.
9. PCR-amplifiering och Final pärla rening
-
Tillsätt 5 µL universal primer och 5 µL av en unikt index primer (se tabell för material) till varje renat cDNA bibliotek och blanda dem genom pipettering. Noggrant kontrollera polymeras huvudmixen för kristaller och andra fällningar och värma huvudmixen för hand tills fällningar lös.
- Lägg till 25 µL av polymeras huvudmixen till provet, blanda dem genom pipettering och följ cykling villkoren nedan för den PCR-amplifieringen. Kör den inledande denaturering vid 98 ° C i 30 s, och sedan utföra en dubbel steg PCR-reaktionen av denaturating proverna vid 98 ° C för 10 s och en glödgning/förlängning av PCR produkter vid 65 ° C för 75 s (12 x), följt av en sista förlängning vid 65 ° C i 5 min och en obestämd håll vid 4 ° C.
- Städa upp de sista bibliotek genom att lägga till 45 µL återsuspenderad magnetiska pärlor direkt till PCR-reaktionen, blanda dem genom pipettering, och inkubera dem på RT för 5 min. överför provet till en 1,5 mL tub och placera den i en magnetisk stå. Inkubera det i 5 min, avlägsna supernatanten och tvätta två gånger med nylagade 80% etanol för 30 s.
- Efter den andra tvätten, helt bort etanolen från stickprovet, och lufttorka pelleten pärla för 5 min och eluera det i 35 µL 0,1 x TE. Återsuspendera pärlorna genom att dem med och odla dem i RT i 5 min. plats provet på magnetiska stativet och efter 5 min, överföra 30 µL av supernatanten till en fräsch 1,5 mL tub. Lagra biblioteken vid-80 ° C.
- Kvalitetskontroll: Späd 1 µL slutliga biblioteket i 9 µL NF vatten och kör provet på en dedikerad DNA analysinstrument med en hög känslighet chip; majoriteten av cDNA bör i spänna av 600 – 800 bp i längd (figur 2e).
- Efter elueringen, skicka proverna för sekvensering på ett massivt parallella sekvensering plattform med 250 bp Parade-end läsningar eller 300 bp single-end läsningar.
10. bioinformatiska analyser av cirkla sekvensering Data
Obs: Analysera och tolka rådata från C-seq-analysen kräver en dedikerad bioinformatiska pipeline. En schematisk bild av den rörledning som användes för våra analyser avbildas i figur 3. Ladda ner denna rörledning på https://github.com/LynchLab/MAPGD.
- Först, trimma läser att ta bort adaptern sekvenser och låg kvalitet bas samtal med cutadapt18, med en kvalitet Poäng tröskel av 20.
- Sedan, identifiera de repetitioner som kodas av concatemerized RNA molekylen med en lämplig algoritm för att upptäcka eventuella repetitioner med en minsta storlek på 30 nukleotider och högst 2 missmatchningar mellan upprepas18. Härleda en konsensus-sekvens från dessa repetitioner och hålla koll på alla bas samtal och associerade kvalitetsresultat på varje position.
Obs: Eftersom omvänd Transkription kan starta på valfri plats på den circularized RNA-molekylen, början av en upprepning inte nödvändigtvis motsvarar 5′-slutet av den fragmenterade RNA-molekyl (hädanefter benämnd ligering punkten). Därför kartlägger sekvensen konsensus inte kontinuerligt mot de motsvarande transkriptom, vilket kräver identifiering av ligering poängen. -
För att identifiera den ligering punkten, mappa en concatemer av samförstånd sekvensen mot referens transkriptom använder BLAST-liknande justering verktyg (BLAT)19.
- Sammanfoga två instanser av sekvensen konsensus att säkerställa att den mappade sekvensen innehåller minst en full oavbruten förekomst av inledande RNA fragment sekvensen. Sedan rotera sekvensen konsensus att starta på den förutspådda ligering punkt positionen.
- Mappa den rotera samförstånd sekvenser mot genomet med TopHat20 och använda anpassningar för att upptäcka någon enda nukleotid polymorfismer (SNP) som skulle kunna misstas för transkription fel.
-
Ring transkription felen från de mappade rotera samförstånd sekvenserna och testa om kandidaten felen passera fyra ytterligare tester.
- Först, se till att en transkription fel inte överlappar med en SNP (en typisk krav är att minst 20 läser behöver täcka en viss bas och inte mer än 5% av läser kan stödja ett alternativa bas samtal).
- För det andra, kontrollera att sekvensen konsensus härstammar från minst 3 tandemupprepningar, som alla kräver samma bas par; och för det tredje, se till att summan av kvalitetsresultat för den positionen måste vara över 100.
- För en fjärde och sista kontrollera, rotera sekvensen samförstånd i alla möjliga kombinationer (simulera alla möjliga positioner för ligering punkten) och karta varje version mot referens genomet använder TopHat.
Obs: Om en av de rotera sekvenserna hittar en perfekt match i genomet, ligatur punkt anses nu vara rätta och transkription fel samtalet bör avvisas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som alla massivt parallella sekvensering metoder producerar varje C-seq experiment en otymplig, stor datamängd. För första gången användare, kan det vara svårt att hantera dessa datamängder; Det rekommenderas således att alla användare kontakta en erfaren bio-informatiker före experimenterandet. I genomsnitt är förväntningen att användarna kommer att generera cirka 55 – 70 Giga baser (Gbases) per körning på de flesta massivt parallella sekvensering plattformar. För detta protokoll, vanligtvis var 12 – 30 prover multiplexed per körning så att för varje prov cirka 2 – 6 Gbases förvärvades. Efter putsning på adapter sekvenser och låg kvalitet bas samtal (< 20) från denna datamängd, återstod ~ 70% av den ursprungliga datastorleken.
Dessa baser sedan analyseras ytterligare för att undersöka effektiviteten av RNA fragmentering och circularization genom att bestämma storleken på de repetitioner som genererades. De flesta upprepar tenderar att vara 45 – 80 baser i längd (figur 4A) och cirka 50% av de grunder som var sekvenserade är en del av dessa repetitioner (figur 4B). Eftersom de flesta av dessa baser finns i läser som innehåller är 3 repetitioner eller mer, antalet unika baser som är sekvenserade ungefär en tredjedel av det totala antalet baser sekvenserade. I genomsnitt, > 75% av dessa samförstånd sekvenser kan mappas tillbaka till referens genomet. Slutligen omfattas cirka 25% av dessa baser av 20 läsningar eller mer, vilket i slutändan innebär att cirka 10% av data kan användas för felavkänning. Ett exempel på denna analys ges i figur 4, som representerar den sekvensering information som förvärvades under installationen av detta protokoll för 1 kopia av ett enda C-seq-bibliotek som sekvenserades relativt grunt och representerar nedre gränsen för de data som användarna kan förvänta sig att förvärva.
Cirka 5 000 – 25 000 fel per körning tenderar att identifieras, men dessa siffror kan variera avsevärt beroende på felprocenten själv (ju högre felprocenten, mer felen upptäcks), storleken på transkriptom (den större de transkriptom, färre baserna kommer att omfattas av 20 läsningar, begränsa sekvensering data som kan användas för felavkänning), och djup där det är sekvenserade (djupare sekvensering kommer att göra det mer sannolikt att en viss bas kommer att omfattas av 20 läsningar eller mer). Dessa fel tenderar att fördelas över hela genomet, så att i genomsnitt ~ 47% av felen finns i mRNA molekyler genereras av RNA-polymeras II (RNAP II), ~ 49% ligger i rRNA molekyler genereras av RNAP som jag, och de resterande ~ 3% ligger i RNAs genereras av RNAP III och den RNA-polymerasen. Dessa nyckeltal kan dock variera betydligt beroende på celltyp eller organismen under utredning (figur 4 c). Till exempel innehålla celltyper att förlita sig tungt på mitokondriell funktion, till exempel hjärtmuskelceller, betydligt mer mitokondriell RNA än andra celltyper, vilket kraftigt ökar antalet mitokondriell RNA-molekyler som är sekvenserade, och därmed antalet fel har upptäckts.
När en lista över fel har sammanställts, och deras platser över genomet är kända, kan dessa fel användas för att identifiera de parametrar som styr felprocenten av transkription i varje organism. Till exempel kan placeringen av felen transkription korreleras med många funktioner i genomet, såsom förekomst av DNA upprepas, specifika genetiska sammanhang eller uttryck pris, att förstå hur dessa funktioner ändra trohet transkription5. Förväntningen är att i framtiden, men användare kommer att kunna avgöra hur otaliga ytterligare funktioner påverkar transkriptionell trohet, inklusive epigenetiska markörer, 3D-organisationen av genomet, näringsämne tillgänglighet, ålder eller exponering för giftiga föreningar, att belysa bidraget av genetiska och miljömässiga faktorer till trohet transkriptionen.
Figur 1: Schematisk bild av RNA-seq kontra C-följande punkter (A) traditionell RNA-seq experiment isolera RNA från ett urval av intresse, Fragmentera RNA, och omvänd transkribera det före den slutliga bibliotek förberedelse och sekvensering. Dock att många tekniska artefakter i biblioteket i form av omvänd Transkription fel, PCR-amplifiering fel och sekvensering fel införa i procedurerna förberedelse. (B) denna optimerad C-seq assay möjliggör korrigering av dessa tekniska artefakter genom circularizing de fragmenterade RNA-molekylerna före omvänd Transkription, vilken tillåt dem till vara omvänd transkriberas i en rullande cirkel sätt att producera linjär cDNA molekyler som innehåller flera kopior av den ursprungliga RNA-mallen i tandem upprepa. Dessa tandemupprepningar kan sedan användas att skilja sant transkription fel från artefakter, som sann transkription fel (star) kommer att vara närvarande i alla repetitioner på samma plats, medan artefakter såsom omvänd Transkription fel (torg) och PCR Det finns bara förstärkning fel (cirkel) i en eller två repetitioner av någon viss cDNA-molekylen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa resultat för bibliotek förberedelse. Dessa paneler visar en electrophoretogram för (A), en hög känslighet RNA skärmen tape stege (se Tabell för material), (B) totalen RNA renats från Saccharomyces cerevisiae, (C) RNase III-fragmenterad RNA och) D) rullande cirkel omvänd-transkriberas cDNA. (E), slutliga stoleken cDNA biblioteket körs på en hög känslighet dubbelsträngat DNA analys chip (se Tabell för material). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Schematisk av rörledningen bioinformatiska används för att analysera cirkel sekvensering data. Efter putsning den sekvensering läser, repetitioner identifieras och en konsensus sekvens skapas med troligen bas samtalet på någon given position. Sedan ligering peka av den inledande RNA-mallen identifieras och samförstånd sekvensen är anpassad till referens arvsmassan så att potentiella transkription fel kan identifieras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: exempel på resultat för C-Seq pipeline. (A) denna panel visar fördelningen av storlek av samförstånd sekvenser erhålls från en typisk C-Seq-experiment. (B) i denna panel visas antalet baser, läsningar och andelen läsningar sekvenserade i varje steg av rörledningen C-Seq bioinformatik. (C) i denna panel visas antalet transkription fel upptäcks och procentandelen fel i tillskrivas RNA-polymeras I, RNA-polymeras II, RNA-polymeras III och RNA-polymeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi ett optimerat protokoll för beredning av C-seq bibliotek för detektion av transkription fel i Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteroch Caenorhabditis elegans. Detta protokoll har många fördelar jämfört med befintliga protokoll, liksom alternativa tekniker.
Under de senaste 15 åren, många reporter system har utvecklats som förlitar sig på Cre-Lox rekombination3,4,15,21 att upptäcka transkription eller luciferas7,8 fel. Dessa reporter system har varit ovärderlig för forskarnas förståelse av transkriptionell trohet eftersom de tillåtna gener, alleler och molekylära mekanismer kan identifieras som direkt reglerar trohet transkriptionen. Men rapporterar de bara om fel i artificiellt skadade mallar, eller inom mycket specifika genetiska sammanhang, vilket begränsar de vetenskapliga frågor som de kan svara på. En viktig fördel med C-seq protokollet är att det övervakar trohet transkriptionen i hela den hela transkriptom5, kraftigt expanderande den vetenskapliga kunskapen om noggrannheten med vilken genetisk information uttrycks. För det andra, eftersom C-seq analysen använder RNA som dess källmaterial, det är troligt att denna analys kan anpassas till någon organism val, undanröja behovet av att skapa komplicerade reporter konstruktioner för varje transgena modell. Detta protokoll har också fördelar över befintliga massivt parallella sekvensering metoder17,22. Framför allt, de flesta av dessa synsätt göra använda av tungmetaller till fragment RNA bibliotek. Dock införa metoderna fragmentering artefakter i RNA som är omöjlig att skilja från Sant transkription fel5. Lös problemet genom detta protokoll fragment RNA enzymatiskt med RNase III, som har fördelen att det lämnar kompatibel ändar för egen ligatur, kraftigt förenkla RNA circularization och öka känsligheten i analysen ~ 10-faldig.
Samtidigt har C-seq analysen sin egen andel av begränsningar. Först, även om analysen mäter transkription fel i hela hela genomet, en stor del av data tenderar att härledas gener som uttrycks mycket, avskrifter från dessa gener tenderar att dominera de flesta RNA bibliotek. En annan faktor som förvränger analysen mot starkt uttryckt gener är tröskeln för inbyggd i bioinformatiska rörledningen som förhindrar genetiska mutationer och RNA redigera händelser från confounding sista mätningarna. Detta tröskelvärde dikterar att endast baser som var sekvenserade 20 gånger eller mer kan användas för den slutliga analysen. En andra begränsning gäller bibliotek mångfald. Som de flesta kit används för RNA-extraktion, kit används här inte effektivt rena små RNA-molekyler, som begränsar antalet läsningar från molekyler syntetiseras av RNAP III. Mångfalden av slutliga sekvensering biblioteket begränsas ytterligare av mRNA rening steget anställd här. Även om molekyler genereras av RNAP jag kan vara effektivt sekvenserade, de flesta av de återstående mitokondriell RNAs, tRNAs och icke-kodande RNAs förloras under detta steg. Att fånga dessa molekyler mer ofta, ett olika kit som specifikt renar små RNA-molekyler kan användas, eller celltyper bör riktas som är berikad för dessa molekyler. Observera dock att de flesta av dessa problem kan lösas genom sekvensering djupare än vanligt, eller samtidigt sekvensering DNA från samma celler, även om båda dessa lösningar kommer att kräva en större finansiell investering av utredarna.
Framtida tekniska utvecklingen är dessutom redo för att förbättra C-seq analysen på en grundläggande nivå. Exempelvis genom att utvidga befintliga sekvenseringsteknologi Läs-längd, kommer det vara möjligt att sekvensen längre molekyler, vilket innebär att fler repetitioner kan användas för att fastställa trohet transkriptionen. Sådana förbättringar kommer automatiskt resultera i en större sekvensering djup och en ökning av andelen läsningar som kan användas för efterföljande analys. Ett liknande argument kan göras för sekvensering teknik som möjliggör fler molekyler till sekvenseras parallellt. Dessutom återstår ett flertal komponenter C-seq analysens optimeras, inklusive effektiviteten i RNA circularization, striktheten hos storlek urval och tidskrävande beskaffenhet analysen själv. Slutligen, det rekommenderas starkt att alla användare får tillgång till en dedikerad, hög känslighet för nukleinsyra analys och felsökning av potentiella (se Tabell för material). Utan detta verktyg, kan det vara extremt svårt att bestämma vid vilken punkt potentiella problem uppstår, vilket gör dem omöjligt att fixa.
Även om hela protokollet är ganska oförlåtande (små misstag tenderar att få betydande konsekvenser), finns det flera steg som är absolut avgörande för framgången för C-seq analysen. En av de viktigaste kraven är att den isolerade RNA behandlas så varsamt som möjligt. De flesta RNA extraktionsmetoder och nedströms behandling kit bryr sig föga om den kemiska sammansättningen av RNA utöver grundläggande industristandarder, vilket är tillräckligt för de flesta molekylära analyser. Dock C-seq analysens uppgift är att identifiera en enda transkription fel bland hundratusentals WT baser, vilket kraftigt ökar behovet av att minska molekylär stress. Även stress som påverkar endast 1 av 10 000 baser kan införa artefakter som helt ogiltigförklarar resultatet. Exempelvis användare måste aldrig undvika eller begränsar exponera RNA till alla temperaturer över 65 ° C. För det andra måste varje användare noggrant optimera den tid som krävs för RNA fragmentering med RNase III. Det är helt avgörande för framgången av analysen att de slutliga molekylerna är cirka 60 – 80 baser i längd. Kortare molekyler kan vara svårt att mappa till genomet och längre molekyler kommer inte att tillåta för 3 oberoende repetitioner till sekvenseras inom en 250 bp-läsa. Slutligen, det rekommenderas inte att frysa och Tina RNA mer än en gång under hela protokollet. Istället isolera RNA och syntetisera cDNA på en enda dag. På grund av tid och arbetsinsats som med detta åtagande, komplexiteten i själva protokollet och antalet prover som ofta bearbetas på en gång, rekommenderas det att två utredare arbetar tillsammans för att generera dessa bibliotek.
När framgångsrika, gör dessa experiment det möjligt att korrekt upptäcka transkription fel i någon organism, några experimentella villkor. Till exempel genom att jämföra kontroll och sjuka individer till varandra, kan det möjligt att avgöra huruvida vissa sjukdomar är associerade med transkription fel, som kan avslöja en ny komponent i etiologin av talrika mänskliga sjukdomar. Andra parametrar som kunde bli utforskad är organismers åldrande, kost, genotyp och miljöfaktorer såsom exponering för giftiga kemikalier. Dessutom, eftersom denna analys upptäcker transkription fel i hela transkriptom, det gör att forskare att dissekera de olika mekanismer som bidrar till trohet av RNA-polymeras I, II och III, samt den RNA-polymerasen. Därför förväntar vi oss att detta protokoll kommer att öppna upp ett nytt fält av mutagenes att omfattande experiment, kännetecknas av studier av mutationer i RNA istället för DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna publikation har möjliggjorts genom finansiering från grant T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641, och en AFAR unga utredare bevilja (M. Vermulst).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RiboPure RNA purification kit | ThermoFisher | AM1926 | Total RNA purification |
| Genelute mRNA purification kit | Sigma-Aldrich | MRN70-1KT | mRNA purification |
| Nuclease-free Water | Ambion | AM9937 | Elution and dilution |
| Ambion RNase III | ThermoFisher | AM2290 | RNA fragmentation |
| T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) | New England Biolabs | M0204S | RNA circularization |
| Ribolock | ThermoFisher | EO0381 | RNase inhibitor |
| SuperScript III Reverse Transcriptase | ThermoFisher | 18080044 | Rolling circle reverse transcription |
| 10 mM dNTP mix | ThermoFisher | 18427013 | Rolling circle reverse transcription |
| Random hexamers (50 ng/µL) | ThermoFisher | N8080127 | Rolling circle reverse transcription |
| NEB Second Strand Synthesis Module | New England Biolabs | E6111S | Second Strand Synthesis |
| NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina | New England Biolabs | E7370S | cDNA library preparation |
| NEB Next index primers | NEB | E7335S | Multiplex PCR primers |
| Oligo Clean & Concentrator | Zymo Research | D4061 | Clean up of RNA and DNA samples |
| DynaMag-2 Magnet | ThermoFisher | 12321D | Magnetic bead purification |
| AMPure XP beads | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic bead purification |
| Eppendorf 5424 Microcentrifuge | FisherScientific | 05-403-93 | centrifugation |
| INCU-Shaker 10 L | Benchmark Scientific | H1010 | Cell culture |
| T100 Thermal Cycler | BIO RAD | 1861096 | Medium to High temperature cycling conditions |
| PTC-200 Thermal Cycler | GMI | 8252-30-0001 | Low temperature cycling conditions |
| RNase Away | Molecular Bioproducts | 700S-11 | Sterilization |
| 50 mL Centrifuge Tube | Corning | 430290 | Nuclease-free |
| 15 mL Centrifuge Tube | Corning | 430052 | Nuclease-free |
| Eppendorf tubes | USA Scientific | 1615-5500 | Nuclease-free |
| 4200 Tapestation System | Agilent | G2991AA | Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| High Sensitivity RNA Screen Tape | Agilent | 5067-5579 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Sample Buffer | Agilent | 5067-5577 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| RNA ScreenTape Ladder | Agilent | 5067-5578 | Quality control of RNA and single stranded DNA samples |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | Double stranded DNA quality control |
| High Sensitivity DNA Kit | Agilent | 5067-4626 | Quality control for double stranded cDNA samples |
| Water Bath | VWR | 462-0244 | Incubation |
| NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer | ThermoFisher | ND-2000C | Determination of RNA concentration |
References
- Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
- Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
- Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
- Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
- Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
- Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
- Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
- Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
- Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
- Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
- Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
- van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
- van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
- Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
- Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
- Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
- Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
- Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
- Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
- Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
- Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
- Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).
