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JoVE Journal Genetics
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Genetics

Vigilância de todo o genoma de erros de transcrição em organismos eucarióticos

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

Este protocolo fornece aos pesquisadores uma nova ferramenta para monitorar a fidelidade da transcrição em vários organismos modelo.

Abstract

Transcrição exata é necessária para a expressão fiel da informação genética. Surpreendentemente, porém, pouco é conhecido sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição. Para preencher esta lacuna no conhecimento científico, nós aperfeiçoamos recentemente o ensaio de círculo-sequenciamento para detectar erros de transcrição durante o transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis de elegans. Este protocolo irá fornecer aos pesquisadores uma nova ferramenta poderosa para mapear a paisagem de erros de transcrição em células eucarióticas para que os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição podem ser elucidados em detalhes sem precedentes.

Introduction

O genoma fornece um modelo biológico preciso de vida. Para implementar esta planta corretamente, é importante para o genoma para ser transcrito com grande precisão. No entanto, a transcrição é improvável que seja livre de erros. Por exemplo, a ARN-polimerase tem sido conhecido para ser propenso em vitro1,2, e recentemente foi demonstrado que cometem erros na vivo assim3,5,6, particularmente quando confrontado com DNA danos7,8,9,10. Tomados em conjunto, estas observações indicam que os erros de transcrição ocorrem continuamente em todas as células vivas, sugerindo que poderia ser uma potente fonte de proteínas mutantes.

Este processo, denominado transcriptional mutagênese, difere de mutagénese clássica de duas maneiras. Em primeiro lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição afetam células mitóticas e pós mitóticas, como eles não dependem de replicação do DNA. Estudar os mecanismos que a fidelidade da transcrição de impacto, portanto, proporcionará insights valiosos sobre a carga de mutação das células mitóticas e pós mitóticas. Curiosamente, erros de transcrição recentemente têm sido implicados na promoção da agregação de proteínas11,12,13 e tem sido a hipótese para contribuir para ambos de carcinogênese10 e o desenvolvimento da resistência aos antibióticos em bactérias14.

Em segundo lugar, em contraste com as mutações genéticas, erros de transcrição são transitórios na natureza. Sua existência temporária é particularmente desafiadora porque erros de transcrição torna extremamente difícil de detectar. Por exemplo, enquanto vários laboratórios desenvolveram ensaios repórter valioso para o estudo de mutagénese transcriptional, estes ensaios só são capazes de medir erros de transcrição em um número limitado de contextos e de4,de organismos modelo15. Para superar essas limitações, muitos pesquisadores se voltaram para a tecnologia de sequenciamento de RNA (RNA-seq), que teoricamente permite erros de transcrição que gravassem em todo a transcriptoma de qualquer espécie. No entanto, estes estudos são facilmente confundidos por artefatos de construção de biblioteca, tais como erros de transcrição reversa, erros de amplificação da PCR e a natureza propensa de sequenciamento em si. Por exemplo, reversa transcriptases cometer um erro de aproximadamente todas as bases de ~ 20.000, enquanto ARN-polimerase (RNAPs) é esperado para fazer apenas um erro cada 300.000 bases5,6. Porque a taxa de erro de transcrição reversa sozinha anões a taxa de erro de polymerases do RNA no interior das células, é virtualmente impossível de distinguir os erros de transcrição verdadeira de artefatos causados pela preparação biblioteca em dados de RNA-Seq tradicional ( Figura 1a).

Para resolver este problema, desenvolvemos uma versão otimizada do círculo-sequenciamento (Cirseq, ou C-seq doravante) ensaio5,16. Este ensaio permite ao usuário detectar erros de transcrição e outras variantes raras no ARN em todo o transcriptoma5. O ensaio da circular-sequenciamento leva este nome porque uma etapa chave neste ensaio gira em torno de circularização de RNA. Uma vez que as metas de RNA são circularizou, são reversos transcrito em uma forma de círculo rolante, para produzir moléculas de cDNA linear que contêm várias cópias do mesmo modelo do RNA. Se um erro estava presente em um desses modelos, esse erro também estaria presente em cada repetição única contida dentro da molécula de cDNA. Em contraste, os erros introduzidos por transcrição reversa, amplificação por PCR ou sequenciamento tendem a surgir aleatoriamente e assim estará presentes em apenas uma ou duas repetições. Assim, gerando uma sequência de consenso para cada molécula de cDNA, e distinção entre erros aleatórios de erros que ocorrem em todas as repetições, artefatos de construção de biblioteca podem efetivamente ser separados de erros de transcrição de verdade (Figura 1b).

Se usado corretamente, o ensaio de seq-C pode ser usado para detectar com precisão a taxa de base substituições, inserções e exclusões no RNA ao longo da transcriptoma de qualquer espécie (por exemplo, ver Traverse e Ochman17). Por exemplo, nós usamos o ensaio C-seq para fornecer medidas de todo o genoma da taxa de erro de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans com uma única resolução base5 (inédita observações). Originalmente usado para sequenciar com precisão as populações de vírus de RNA, esta versão otimizada do ensaio C-seq foi racionalizado para minimizar as condições adversas durante a preparação da biblioteca que contribuem para os artefatos de construção de biblioteca. Além disso, usando um número de kits comercialmente disponíveis, a taxa de transferência do ensaio é muito melhorada, além de sua facilidade de utilização. Se usado corretamente, este teste pode detectar com precisão a milhares de erros de transcrição por replicar, melhorando desse modo extremamente em anteriores estudos6. Em geral, este método fornece uma ferramenta poderosa para estudar transcriptional mutagênese e permitirá ao usuário a ganhar novos insights sobre os mecanismos que controlam a fidelidade da transcrição em uma ampla gama de organismos.

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Protocol

1. preparação

  1. RNases são onipresentes; Portanto, limpe a área de trabalho completamente pulverizando-o para baixo com um reagente de descontaminação (por exemplo,, RNase afastado) e 70% de etanol. Pulverizador para baixo qualquer pipetas, canetas ou tubo racks para remover as possíveis fontes de contaminação de RNase.
  2. Para aumentar a prevenção de RNases contamine as amostras, vestir uma bata ou camiseta de manga longa durante a experimentação. Evite o contacto entre as luvas e o interior dos tubos de que será usado, especialmente quando recuperá-los a partir de uma caixa ou saco.
  3. Antes a transcrição reversa, mude frequentemente as luvas.
    Nota: Para obter melhores resultados, não pause o experimento antes a transcrição reversa.

2. célula e cultura Animal e coleção

  1. Coleção e o crescimento de saccharomyces cerevisiae
    1. Se uma biblioteca C-seq é desejada do fermento, primeiro inocular uma única colônia de S. cerevisiae em 3 mL de extrato de levedura contendo médio, adenina, peptona e dextrose (YAPD) e incube-lo durante a noite a 30 ° C, em um tambor de rolamento.
    2. Pela manhã, repicar a cultura em 50 mL de meio YAPD para uma densidade óptica (OD) de 0,1 e crescer as células até atingirem uma overdose de 0,5-0,7 (~ 7 x 106 células/mL).
    3. Recolher a cultura inteira 50 mL (aproximadamente 350 x 106 células) em um tubo cónico de 50 mL e girar as células para baixo por 3 min a 2.100 x g. Retire o meio YAPD cuidadosamente e lavar o sedimento de uma vez com PBS 1x.
    4. Em seguida, resuspenda o pellet em 480 µ l de tampão de Lise, 48 µ l de SDS 10% e 480 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio (25:24:1), pH 6,8. Vórtice da amostra em velocidade maxima por 5 s e a transferência para uma tampa de rosca de 1,5 mL do tubo com 750 µ l de grânulos de zircônia gelada (fornecido com o kit). Prossiga para a etapa 3 deste protocolo para a lise celular e a extração de RNA total.
      Nota: Todos os reagentes necessários para passo 2.1.4 constam o fermento recomendado kit de extração de RNA. Estes reagentes funcionam igualmente bem para leveduras, vermes e voa para que após a coleta do fermento (passo 2.1), vermes (passo 2.2) ou moscas (passo 2.3), uma abordagem unificada pode ser usada para gerar bibliotecas C-seq (passos 3 – 10).
  2. Cultura de Caenorhabditis elegans e coleção
    1. Se uma biblioteca C-seq é desejada de vermes, deposite 30 vermes adultos num prato fresco do ágar manchado com bactérias OP50.
      Nota: Cinco chapas são suficientes para 1 replicar.
    2. Cultura os vermes por 4 dias e recolher os vermes delicadamente lavando os pratos com 5 mL de mídia M9 e os vermes em um tubo cônico único 50ml da piscina.
    3. Gire os vermes para baixo a 100 x g por 2 min criar uma pelota. Desacelere a centrífuga na menor velocidade possível, para não perturbar a pelota.
    4. Suavemente move os vermes em um tubo de 1,5 mL, lavá-los duas vezes em 1,5 mL de mídia M9 e centrifugar o tubo a 100 x g por 1 min remover as bactérias e gerar pellets limpo 100 µ l de vermes.
    5. Resuspenda as minhocas em 480 µ l de tampão de Lise, 48 µ l de SDS 10% e 480 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio. A amostra em velocidade maxima por 5 s e transferência para uma tampa de rosca de 1,5 mL contendo µ l 750 de grânulos de zircônia gelada de tubo de vórtice. Prossiga para a etapa 3 deste protocolo para a lise dos vermes e a extração de RNA total.
  3. Coleção e cultura de drosophila melanogaster
    1. Se uma biblioteca C-seq é desejada de moscas, moscas de 20 – 25 em frascos que contêm glicose ou uma mídia baseada em melaço da cultura. Alíquota as moscas mais de 3 frascos, então, que cada frasco contém aproximadamente 8 moscas.
    2. Para coletar as moscas, coloque o frasco em um balde de gelo até as moscas são sedadas. Em seguida, recolhê-los com um pincel em um tubo de 1,5 mL. Não recolhem as moscas por tratamento de CO2 .
    3. Deixe as moscas quentes à temperatura ambiente (RT) e adicionar rapidamente uma mistura do premade de 500 µ l de tampão de Lise, 50 µ l de SDS 10% e 500 µ l de álcool isoamílico: fenol: clorofórmio ao tubo. Use um micropestle para moer até as moscas com aproximadamente de 15 cursos, acompanhados por uma firma de torção de movimento quando o pilão atinge o fundo do tubo.
    4. Despeje a mistura de moscas e mídia de Lise em uma tampa de rosca de 1,5 mL tubo contendo µ l 750 de grânulos de zircônia gelada e o vórtice que na velocidade máxima por 5 s. prosseguir para a etapa 3 deste protocolo para a Lise das moscas e a extração de RNA total.

3. purificação de RNA total

Nota: neste momento, todos os três protocolos convergem, e uma abordagem unificada pode ser usada para gerar bibliotecas C-seq.

  1. Aperte firmemente a tampa e fixe o tubo um reaccional com um adaptador ou fita adesiva. O tubo na velocidade máxima por 10 min lisar as amostras de vórtice. Em seguida, centrifugar a amostra a 16.100 x g por 5 min separar os solventes orgânicos da fase aquosa.
  2. Cuidadosamente remova 400 – 500 µ l da fase aquosa sem perturbar a interfase branca, nublada e adicioná-lo para um tubo cônico de 15 mL contendo 1,9 mL de tampão de ligação. Misturá-los vortexing.
  3. Adicionar 1,25 mL de etanol 100% e misturar a amostra vortexing. Transferência de 700 µ l da amostra para um cartucho de filtro montado em um tubo de coleta e girar a amostra a 14.500 x g por 30 s. Repita até que todos da amostra é passado através do cartucho.
    Nota: neste momento, a amostra pode rodar ligeiramente opaca. Se muitas células, worms ou moscas foram lysed, precipitados poderiam aparecer que pode entupir o filtro.
  4. Lave o filtro uma vez com 700 µ l da solução de lavagem 1 e duas vezes com 500 µ l de solução de lavagem 2 ou 3. Termine as lavagens girando as amostras a 14.500 x g por 2 min remover qualquer excesso etanol.
  5. Transfira o refil do filtro para um tubo de golfinho de 1,5 mL e adicionar 108 µ l de solução de eluição escaldadas (65 ° C).
    Nota: Nunca expor amostras do RNA para temperaturas superiores a 65 ° C, antes de uma transcrição reversa, como fazer então vai provocar citosina para eventos de desaminação uracil que são impossíveis de distinguir de erros de transcrição.
  6. Degradar a contaminação de DNA em RNA isolado (ver passos 2.1 – 3.4) adicionando 11 µ l de 10 x 4 µ l de DNase, 2 µ l de inibidor de RNase e DNase eu de buffer que 8 U e incube-os a 37 ° C por 30 min.
  7. Depois da digestão, adicione 11 µ l de reagente de inactivação de DNase. Vórtice a mistura e deixe descansar na RT por 5 min. Em seguida, centrifugar a amostra a 15.000 x g durante 3 min para o reagente de inactivação de pelotas e coletar 110 µ l do sobrenadante sem perturbar o sedimento. Transferi o sobrenadante para um tubo de 1,5 mL.
    Nota: O reagente de inactivação de DNase pode ser bastante difícil para pipeta corretamente, então visualmente inspecionar a ponta da pipeta após cada ação pipetagem. Se o reagente de inactivação torna-se demasiado viscoso para pipeta, adicione 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) igual a 1/5 do volume restante.
  8. (Verificação de qualidade) Medir a concentração do RNA total usando um espectrofotômetro. Então Reserve 1 µ l de RNA total e diluí-la a uma concentração de 10 ng / µ l em água (NF) livre de nuclease. Execute o RNA em um instrumento de análise de nucleotídeo apropriada com uma fita de RNA sensibilidade elevada para garantir que o RNA não é degradado e tem um valor de eRIN de pelo menos 8.5 ou superior (Figura 2B).

4. o mRNA enriquecimento

  1. Realizar o enriquecimento de mRNA com um miniprep mRNA kit (veja a Tabela de materiais). Adicione 140 µ l de água de NF para a amostra para um volume total de 250 µ l. Em seguida, adicionar 250 µ l de 2x do tampão de ligação, homogeneizar a amostra vortexing e adicionar 15 µ l de grânulos de oligo (dT).
  2. Misturar a amostra pipetando-lo acima e para baixo e incube-a 65 ° C por 2 min. Em seguida, coloque a amostra no RT por 10 min. Finalmente, centrifugar a amostra a 16.100 x g por 2 min para os complexos do grânulo: mRNA de Pelotas.
  3. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado em 500 µ l de solução de lavagem. Transferir a solução para uma coluna de rotação e girá-lo para 1 min a 15.000 x g. Descartar o escoamento e lavar a amostra com um adicional 500 µ l de solução de lavagem. Em seguida, gire a amostra por 2 min a 15.000 x g para remover qualquer excesso etanol de filtros a rotação.
  4. Transfira o filtro de rotação para um tubo de golfinho e resuspenda o pellet em coluna com 80 µ l de solução de eluição escaldadas (65 ° C). Incubar a amostra por 1,5 min 65 ° c e Elui-lo girando-o por 1 min a 15.000 x g.
  5. Medir a concentração de RNA purified usando um espectrofotômetro ou ferramenta semelhante que permite a quantificação da concentração de RNA e de qualidade.

5. RNase III fragmentação e RNA limpar

Nota: (Importante) para preparar a moléculas de RNA circulares apropriadas para a geração de bibliotecas C-seq, o RNA deve ser fragmentado para cerca de 60 – 80 bases de comprimento. Enquanto os métodos anteriores usaram uma fragmentação química de fragmento de RNA, fragmentação química com os metais pesados apresenta danos para as amostras de RNA que podem ser interpretadas como erros de transcrição durante a análise final. Para contornar este problema, refugiam-se na fragmentação usando RNase III para gerar pequenos fragmentos. Uma vantagem adicional desta abordagem enzimática é que ele cria extremidades compatíveis necessárias para ligadura, obviating a necessidade para um fim-reparo após a fragmentação química.

  1. Configurar a reação de fragmentação de RNA com 1 µ g de RNA purificado, 10 µ l de tampão de reação, 5 µ l de RNase III e NF suficiente água para trazer o volume até 100 µ l (veja a Tabela de materiais). Adicionar a enzima última e pipetar a mistura acima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar. Incube a amostra a 37 ° C por 25 min, o que tende a produzir fragmentos de RNA de aproximadamente 60-80 bases de comprimento.
  2. Uma vez concluída a incubação de 25 min, limpar a reação imediatamente com um oligo limpar e concentrador kit (veja a Tabela de materiais) para evitar qualquer digestão mais. Adicione 200 µ l de tampão de oligo-vinculação à amostra, homogeneiza-vortexing e adicionar 800 µ l de etanol 100%. Misturar a amostra vortexing e transferi-lo para uma coluna de rotação fornecida em um tubo de coleta.
  3. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 30 s e lave-o com 750 µ l de tampão de lavagem para remover RNase III. Centrifugar a amostra a 10.000 x g durante 30 s, descartar o escoamento e lavar a amostra mais uma vez com 750 µ l de tampão de lavagem como descrito acima. Após a segunda passagem tem sido descartada, centrifugar a coluna a 15.000 x g por 2 min remover qualquer excesso etanol.
  4. Transferir a coluna para um tubo 1,5 mL e eluir a amostra em 24 µ l de água NF girando-a 10.000 x g por 1 min.
  5. Seleção de qualidade: Tomar 2 µ l dos fragmentos de RNA purificados e diluí-la 2 dobras adicionando 2 µ l de água NF a ela. Execute o RNA fragmentado em uma fita de tela para garantir que o RNA fragmentado é na faixa de 50 – 100 bases de comprimento (Figura 2C).

6. RNA circularização e rolamento círculo de transcrição reversa

  1. Para circularizar os fragmentos de RNA, calor-desnaturar 20 µ l da amostra a 65 ° C por 1 min e coloque-o no gelo imediatamente por 2 min. Em seguida, adicione 4 µ l de RNA T4 ligase buffer, 4 µ l de ATP de 10 mM, 1 µ l de inibidor de RNase, 1 µ l de água NF de 10x e 8 µ l de 50% polietileno glicol (PEG).
  2. Homogeneizar a amostra vortexing, em seguida adicionar 2 µ l de 10 U / µ l de RNA de T4 Ligase I. Mix a amostra novamente pipetando- e incube a 25 ° C, durante 2 h em um thermocycler com a temperatura da tampa fixada em 30 ° C.
  3. Após 2 h, adicionar 10 µ l de água de NF para a amostra e limpar a amostra com um kit de limpeza e concentração de oligo de acordo com as especificações do fabricante. Eluir a amostra em 20 µ l de água de NF.
  4. Para reverter a transcrever as moléculas de RNA circulares, adicionar 4 µ l de dNTPs 10 mM, 4 µ l de hexâmeros aleatória de 50 ng / µ l e 9 µ l de água NF a 9 µ l de RNA. Misture tudo bem pipetando, desnaturar a amostra a 65 ° C por 1 min e coloque-o no gelo por 2 min. loja o RNA restante como back-up.
  5. Adicionar 8 µ l de tampão de síntese primeiro-costa x 5, 2 µ l de 0,1 mM DTT e 4 µ l de 200 U / µ l reverse transcriptase e misture tudo por pipetagem. Incube a amostra a 25 ° C por 10 min, seguido de uma incubação de 20 min a 42 ° C com a tampa fixada em 5 ° C superior à temperatura de incubação.
    Nota: Um transcriptase reversa com capacidade de deslocamento do fio deve ser usado nesta etapa para permitir uma transcrição reversa do círculo rolante.
  6. Adicionar 10 µ l de água de NF para a amostra e limpar com o kit de limpeza e concentração de oligo de acordo com as recomendações do fabricante. Eluir a amostra em 42 µ l de solução de eluição.
  7. Seleção de qualidade: Diluir 2 µ l do cDNA single-stranded em 2 µ l de água NF e executar este exemplo em um instrumento de análise de nucleotídeo com uma fita de RNA de sensibilidade elevada. Se a transcrição reversa funcionou corretamente, uma biblioteca de moléculas de cDNA, que variam de cerca de 60 – 1.500 bases de comprimento, deve ser visível. Idealmente, a maioria dos cDNA é na faixa de 500-1.000 bases (Figura 2d).

7. segunda vertente cDNA síntese e reparo do fim

  1. Use um kit de síntese segundo vertente para gerar uma biblioteca de cDNA double-stranded. Colocar as amostras no gelo e adicionar 30 µ l de água de NF para 38 µ l de sua amostra. Em seguida, adicione 8 µ l de 10 x segundo Strand Buffer e 4 µ l da segunda enzima Strand e misturar a amostra pipetando suave antes de sua incubação a 16 ° C para 2,5 h.
  2. Limpar as amostras com o oligo limpar concentração kit e acordo com as recomendações do fabricante para reações de 100 µ l e eluir as amostras em 38 µ l de água de NF.
  3. Configurar a reação final-reparação adicionando 20 µ l de água de NF para 35,5 μL de cDNA double-stranded, 6,5 µ l de tampão de reação final reparar e 3 µ l do Mix de enzima de preparação final. Verifique o amortecedor da reação para precipitados brancos e dissolvê-los pela mão-aquecimento se estiver presente.
  4. Misture a reação final-reparação pipetando e incube-lo a 20 ° C por 30 min, seguido por uma segunda incubação 30 min a 65 ° C. Regule a temperatura da tampa thermocycler a 5 ° C superior à temperatura de incubação.

8. adaptador ligadura e seleção de tamanho de bibliotecas preparadas

  1. Use um módulo de preparação de várias etapas de biblioteca para os preparativos finais da biblioteca (ver Tabela de materiais). Em primeiro lugar, diluir os adaptadores para geração 10-fold de sequenciamento em 10 mM Tris-HCl a uma concentração final de 1,5 µM. Em seguida, adicione 2,5 µ l de adaptador diluído e 1 µ l de potenciador de ligadura para cada amostra e misturá-los vortexing.
  2. Adicionar 15 µ l de Blunt/TA Ligase Master Mix, misturá-lo pipetando e incube-a 20 ° C por 15 min. Em seguida, adicione 3 µ l da enzima do reagente específico uracil excisão e -incubar a 37 ° C por 15 min. Após a ligadura é completa, adicionar 13,5 µ l de água de NF para a amostra para um volume total de 100 µ l e prossiga para a seleção de tamanho.
    Nota: É melhor selecionar tamanho de moléculas de cDNA que estão na faixa de 600-800 bases de comprimento. Se as moléculas de RNA fragmentadas foram aproximadamente 60-80 bases de comprimento, selecionando para moléculas que são 600 e 800 bases de comprimento irá garantir que a maioria das moléculas selecionadas contém pelo menos três repetições em tandem, que é ideal para o processamento a jusante e análise.
  3. Para selecionar por moléculas que são 600 e 800 bp em comprimento, adicione 30 µ l de ressuspensão grânulos magnéticos (ver Tabela de materiais), aclimatados ao RT, para cada amostra e misture por pipetagem. Transferir a amostra para um tubo de 1,5 mL e incubar RT por 5 min.
  4. Coloca a amostra num suporte magnético por 5 min separar os grânulos do sobrenadante. Transferi o sobrenadante (que contém as moléculas de cDNA desejado) para um novo 1,5 mL tubo e alienar os grânulos magnéticos (que estão ligados a moléculas de cDNA grande).
  5. Adicionar uma alíquota fresca de 15 µ l de grânulos magnéticos para cada amostras, homogeneiza pipetando e incubar durante 5 min no lugar do RT. as amostras em um rack magnético e incube-os por 5 min à RT Em seguida, Retire cuidadosamente e alienar os sobrenadantes, certificando-se para não perturbar os grânulos.
    Nota: Não elimine os grânulos magnéticos, que agora contém o cDNA de destino desejado.
  6. Adicionar 200 µ l de 80% etanol para cada uma das amostras preparadas sem perturbar os grânulos magnéticos peletizados e incube por 30 s. descartar o etanol e lavar as amostras mais uma vez com 80% de etanol. Então, totalmente remover qualquer vestígio de etanol das amostras de e secar os grânulos por 5 min, mas tenha cuidado para não secar demasiado as contas. Se os grânulos são superaquecimento, rachaduras aparecerão em Pelotas.
  7. Para eluir as amostras de grânulos, retirar os tubos do suporte magnético e adicionar 19 µ l de 10 mM Tris-HCl. Pipetar acima e para baixo várias vezes para resuspended os grânulos e incubar as amostras durante 5 min à RT Se os grânulos eram superaquecimento, incube-los para > 10 min.
  8. Coloque o suporte magnético as amostras e incube-os por 5 min separar os grânulos do sobrenadante. Cuidadosamente remova 15 µ l do sobrenadante contendo as bibliotecas de cDNA purificado, selecionados por tamanho dos tubos e transferi-lo para um tubo 1,5 mL.

9. PCR amplificação e purificação Final do grânulo

  1. Adicionar 5 µ l de primer universal e 5 µ l de uma cartilha de índice exclusivo (consulte tabela de materiais) para cada um purificado biblioteca de cDNA e misture-os bem pipetando. Verifique o mix de mestre do polymerase para cristais e outros precipitados e aquecer a mistura de mestre com a mão até dissolver o precipitado.
    1. Adicione 25 µ l do mix mestre polimerase para a amostra, misturá-los por pipetagem e siga as ciclismo condições abaixo para a amplificação por PCR. Executar a desnaturação inicial a 98 ° C por 30 s e em seguida, executar uma etapa dupla reação de PCR por denaturating as amostras a 98 ° C por 10 s e recozimento/prorrogação dos produtos do PCR a 65 ° C para 75 s (x 12), seguido por uma extensão final a 65 ° C por 5 min e uma espera indefinida a 4 ° C.
  2. Limpe as bibliotecas final adicionando 45 µ l de ressuspensão grânulos magnéticos diretamente para a reação de PCR, misturá-los por pipetagem e incube-os em RT 5 min. transferência da amostra para um tubo de 1,5 mL e colocá-lo em um suporte magnético. -Incubar durante 5 min, desprezar o sobrenadante e lavá-lo duas vezes com etanol a 80% recentemente preparada por 30 s.
  3. Após a segunda lavagem, totalmente remover o etanol da amostra e secar o sedimento de grânulo por 5 min e Elui-lo em 35 µ l de 0.1 x et. Resuspenda os grânulos pipetando-los e incubar os RT 5 min. lugar da amostra sobre o suporte magnético e depois de 5 min, transferir 30 µ l do sobrenadante para um tubo 1,5 mL. Armazenar as bibliotecas a-80 ° C.
  4. Seleção de qualidade: Diluir 1 µ l da biblioteca final em 9 µ l de água NF e executar a amostra em um instrumento de análise de DNA específico com um chip de alta sensibilidade; a maioria de cDNA deverá estar na faixa de 600-800 bp de comprimento (Figura 2e).
  5. Após a eluição, envie as amostras para sequenciamento em uma plataforma de sequenciamento em paralelo usando 250 leituras de emparelhado-fim de bp, ou 300 leituras de único-extremidade de bp.

10. bio-informática análise de dados de sequenciamento de círculo

Nota: Análise e interpretação de dados brutos da C-seq ensaio requerem um pipeline de bio-informática dedicado. Um esquema do gasoduto que foi usado para nossas análises é retratado na Figura 3. Baixe esse pipeline no https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Primeiro, apare o lê para remover sequências de adaptador e chamadas de base de baixa qualidade com cutadapt18, usando um limite de Pontuação de qualidade de 20.
  2. Em seguida, identificar as repetições codificadas pela molécula de RNA do concatemerized usando um algoritmo apropriado para detectar qualquer repetições com um tamanho mínimo de 30 nucleotídeos e um máximo de 2 incompatibilidades entre repete18. Derivam estas repetições de uma sequência de consenso e acompanhar todas as chamadas base e escores de qualidade de associado em cada posição.
    Nota: Porque a transcrição reversa pode começar em qualquer posição sobre a molécula de RNA circular, o início de uma repetição não necessariamente corresponde a extremidade 5 ' da molécula de RNA fragmentada (doravante referida como o ponto de ligadura). Nesse sentido, a sequência de consenso não irá mapear continuamente contra a transcriptoma correspondente, o que exige a identificação do ponto de ligadura.
  3. Para identificar o ponto de ligadura, mapear um concatemer da sequência de consenso contra a transcriptoma de referência usando o alinhamento de explosão, como ferramenta (BLAT)19.
    1. Concatene duas instâncias da sequência de consenso para garantir que a sequência mapeada contém pelo menos uma ocorrência ininterrupta completa da sequência inicial de RNA fragmento. Em seguida, gire a sequência de consenso para iniciar na posição de ponto previsto da ligadura.
  4. Mapear as sequências de consenso girado contra o genoma usando TopHat20 e usar os alinhamentos para detectar qualquer polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) que poderiam ser confundidos com os erros de transcrição.
  5. Chamar os erros de transcrição de sequências de consenso girado mapeada e testar se os erros do candidato passam quatro testes adicionais.
    1. Primeiro, certifique-se que um erro de transcrição não sobreposição com um SNP (um requisito típico é que pelo menos 20 leituras precisam cobrir uma determinada base e não mais do que 5% do lê pode apoiar uma alternativa chamada de base).
    2. Em segundo lugar, verificar que a sequência de consenso é derivada de pelo menos 3 repetições em tandem, cada qual chama o mesmo par de base; e em terceiro lugar, certifique-se que a soma das pontuações qualidade dessa posição deve ser mais de 100.
  6. Para uma quarta e última verificar, rodar a sequência de consenso em todas as combinações possíveis (simulando todas as posições possíveis do ponto de ligadura) e mapear cada versão contra o genoma de referência usando TopHat.
    Nota: Se uma das sequências giradas encontrar uma correspondência perfeita no genoma, o ponto correspondente da ligadura é agora considerado uma correta e a chamada de erro de transcrição deve ser rejeitada.

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Representative Results

Como todas as aproximações de sequenciamento em paralelo, cada experimento C-seq produz um conjunto de dados grande, difícil de manejar. Para usuários de primeira viagem, pode ser difícil lidar com esses conjuntos de dados; assim, é recomendável que todos os usuários entre em contato com um experiente bio-informático antes da experimentação. Em média, a expectativa é que os usuários irão gerar aproximadamente 55 – 70 Giga bases (Gbases) por execução na maioria das plataformas de sequenciamento em paralelo. Para este protocolo, normalmente, 12 – 30 amostras foram multiplexadas por executar para que para cada amostra foram adquiridos cerca de 2-6 Gbases. Depois de aparelhar o adaptador sequências e chamadas de base de baixa qualidade (< 20) este conjunto de dados, manteve-se ~ 70% do tamanho inicial de dados.

Essas bases são então analisadas ainda mais para investigar a eficiência da fragmentação de RNA e circulares, determinando o tamanho das repetições que foram gerados. A maioria repete tendem a ser 45 – 80 bases de comprimento (Figura 4A) e aproximadamente 50% das bases que foram sequenciadas são parte destas repetições (Figura 4B). Desde que a maioria destas bases está presente em leituras que contêm 3 repetições ou mais, o número de bases únicas sequenciados é cerca de um terço do número total de bases sequenciado. Em média, > 75% dessas sequências de consenso pode ser mapeado para o genoma de referência. Finalmente, cerca de 25% destas bases são cobertos por 20 leituras, ou mais, que em última análise, significa que cerca de 10% dos dados pode ser usado para detecção de erros. Um exemplo desta análise é dado na Figura 4, que representa as informações de sequenciamento que foi adquiridas durante a configuração do presente protocolo para 1 replicar de uma única biblioteca de C-seq que foi sequenciada relativamente rasa e representa o mais baixo limite de dados que os usuários podem esperar adquirir.

Aproximadamente 5.000 – 25.000 erros por execução tendem a ser identificados, embora estes números podem variar significativamente, dependendo da taxa de erro em si (quanto maior a taxa de erro, os erros mais serão detectados), o tamanho do transcriptoma (o maior o transcriptoma, as bases menos serão cobertas por 20 leituras, limitando os dados de sequenciamento que podem ser usados para detecção de erros) e a profundidade na qual ele é sequenciado (sequenciamento mais profundo tornará mais provável que uma determinada base será coberta por 20 leituras ou mais). Esses erros tendem a ser distribuído entre o genoma inteiro, para que em média ~ 47% dos erros estão localizados no mRNA moléculas geradas pela RNA polimerase II (RNAP II), ~ 49% situam-se em moléculas de RNA ribossomal, geradas pela RNAP I e o ~ 3% restantes estão localizados em RNAs gerados pela RNAP III e o RNA polimerase mitocondrial. No entanto, estas relações podem variar significativamente dependendo do tipo de célula ou organismo sob investigação (Figura 4). Por exemplo, tipos de células que dependem fortemente de função mitocondrial, como cardiomyocytes, contêm RNA significativamente mais mitocondrial do que outros tipos de células, aumentando o número de moléculas de RNA mitocondriais sequenciados e, portanto, o número dos erros detectados.

Uma vez que foi compilada uma lista de erros, e suas localizações em todo o genoma são conhecidas, esses erros podem ser usados para identificar os parâmetros que controlam a taxa de erro de transcrição em cada organismo. Por exemplo, a localização desses erros de transcrição pode ser correlacionada com inúmeras funcionalidades do genoma, tais como a presença de DNA se repete, contextos genéticos específicos, ou a taxa de expressão, para entender como esses recursos alteram a fidelidade de transcrição de5. A expectativa é que no futuro, porém, os usuários serão capazes de determinar características adicionais como incontáveis afetam fidelidade transcriptional, incluindo marcadores epigenéticas, a organização em 3-d do genoma, disponibilidade de nutrientes, idade ou exposição a tóxicos compostos, para elucidar a contribuição de fatores genéticos e ambientais para a fidelidade da transcrição.

Figure 1
Figura 1: Representação esquemática do RNA-seq versus C-Seq. (A) tradicional RNA-seq experimentos RNA isolado de uma amostra de interesse, fragmentar o RNA, e reverso transcrevê-lo antes da preparação final da biblioteca e sequenciamento. No entanto, estes procedimentos de preparação apresentar inúmeros artefatos técnicos para a biblioteca em forma de erros de transcrição reversa, erros de amplificação da PCR e sequenciamento de erros. (B) Esta otimizado C-seq ensaio permite a correção desses artefatos técnicos por circularizing as moléculas de RNA fragmentadas antes da transcrição reversa, que permite que eles sejam reverso transcrito em forma de círculo rolante para produzir linear Repita as moléculas de cDNA que contêm várias cópias do modelo original do RNA em tandem. Estas repetições em tandem podem ser usadas para distinguir os erros de transcrição verdadeira de artefatos, como erros de transcrição de verdade (estrela) estará presentes em todas as repetições no mesmo local, Considerando que artefatos tais como reverter erros de transcrição (quadrados) e PCR erros de amplificação (círculo) só estão presentes em uma ou duas repetições de qualquer molécula de cDNA determinado. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: representante resultados para preparação de biblioteca. Estes painéis mostram uma electrophoretogram para a fita de tela (A), uma alta sensibilidade do RNA da escada (ver Tabela de materiais), (B) o total do RNA purificado de Saccharomyces cerevisiae, RNA de RNase III-fragmentado (C) e ( D) rolamento círculo reverso-transcrito cDNA. (E), a biblioteca de cDNA de tamanho selecionado final é executado em uma análise de DNA de dupla-hélice de alta sensibilidade da microplaqueta (ver Tabela de materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: esquemático do bio-informática encanamento usado para analisar dados de sequenciamento de círculo. Depois de aparar as leituras de sequenciamento, repetições são identificadas, e uma sequência de consenso é gerada usando a chamada base mais provável em qualquer determinada posição. Então, o ponto de ligadura do modelo inicial do RNA é identificado e a sequência de consenso está alinhada para o genoma de referência para que possam ser identificados potenciais erros de transcrição. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: exemplo de resultados para o encanamento de C-Seq. (A), este painel mostra a distribuição de tamanho das sequências consenso obtida a partir de uma experiência típica de C-Seq. (B) este painel mostra o número de bases, leituras e percentagem de leituras sequenciadas em cada passo do pipeline de bioinformática do C-Seq. (C) este painel mostra o número de erros de transcrição detectado e a porcentagem de erros atribuída a RNA polimerase I, RNA polimerase II, RNA polimerase III e mitocondrial RNA polimerase. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Aqui, descrevemos um protocolo otimizado para a preparação das bibliotecas C-seq para a detecção de erros de transcrição em Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastere Caenorhabditis elegans. Este protocolo tem numerosas vantagens sobre os protocolos existentes, bem como técnicas alternativas.

Nos últimos 15 anos, numerosos repórter foram desenvolvidos sistemas que dependem do luciferase7,8 ou Cre-Lox recombinação3,4,15,21 para detectar transcrição erros. Estes sistemas de repórter tem sido inestimáveis para dos investigadores compreensão do transcriptional fidelidade porque eles permitiram genes alelos e mecanismos moleculares para ser identificado que regulam diretamente a fidelidade da transcrição. No entanto, eles só relatam sobre erros em modelos artificialmente danificados, ou dentro de contextos altamente específicos de genéticos, que limita as questões científicas, que eles podem responder. Uma vantagem importante do protocolo C-seq é que ele monitora a fidelidade da transcrição durante todo o inteiro transcriptome5, expandindo consideravelmente o conhecimento científico da precisão com que a informação genética é expressa. Em segundo lugar, porque o ensaio C-seq utiliza do RNA como seu material de origem, é provável que este ensaio pode ser adaptado a qualquer organismo de escolha, obviating a necessidade de gerar construções complicadas repórter para cada modelo de transgénico. Este protocolo também tem vantagens sobre sequenciamento maciçamente paralelo existente abordagens17,22. Mais notavelmente, a maioria dessas abordagens fazem uso de metais pesados para bibliotecas de fragmento de RNA. No entanto, estes métodos de fragmentação introduzir artefatos no RNA que são indistinguíveis de erros de transcrição de verdade5. Para resolver este problema, este protocolo fragmentos de RNA enzimaticamente com RNase-III, que tem a vantagem que deixa extremidades compatíveis para auto ligadura, simplifica a circularização de RNA e de aumentar a sensibilidade do ensaio consideravelmente ~ 10 vezes.

Ao mesmo tempo, o ensaio de C-seq tem sua própria parte de limitações. Em primeiro lugar, mesmo que o ensaio mede erros de transcrição durante todo o genoma inteiro, uma grande componente de dados tende a ser derivado de genes que são altamente expressos, como transcrições destes genes tendem a dominar a maioria das bibliotecas de RNA. Outro fator que distorce a análise no sentido de genes altamente expressos é o limiar construído no pipeline do bio-informática que impede a mutações genéticas e o RNA eventos de confundir as medições finais de edição. Esse limite determina que apenas as bases que foram sequenciadas 20 vezes ou mais podem ser usadas para a análise final. Uma segunda limitação diz respeito à diversidade de biblioteca. Como a maioria dos kits usados para extração de RNA, o kit usado aqui não eficientemente purificar pequenas moléculas de RNA, que limita o número de leituras, derivado de moléculas sintetizadas por RNAP III. A diversidade da biblioteca de sequenciamento final é ainda mais limitada pela etapa de purificação de mRNA empregada aqui. Apesar de moléculas geradas pela RNAP, que pode ser eficientemente sequenciado, a maioria dos RNAs mitocondriais restantes, os tRNAs e RNAs não codificantes são perdidos durante esta etapa. Para capturar esses mais frequentemente, deve ser usado um kit diferente que purifica especificamente pequenas moléculas de RNA, ou tipos de células devem ser alvo de moléculas que são enriquecidas por estas moléculas. Por favor note, porém, que a maioria destes problemas pode ser resolvida por sequenciamento mais profundo do que o habitual, ou simultaneamente, sequenciamento do DNA de células do mesmos, embora ambas as soluções exigirá um maior investimento financeiro pelos investigadores.

Além disso, os futuros desenvolvimentos tecnológicos estão preparados para melhorar o ensaio C-seq em um nível fundamental. Por exemplo, estendendo o comprimento de leitura da tecnologia de sequenciamento existente, será possível às moléculas mais longos sequência, o que significa que mais repetições podem ser usadas para verificar a fidelidade da transcrição. Tais melhorias automaticamente irão resultar em uma maior profundidade de sequenciamento e um aumento da percentagem de leituras que podem ser usados para análise a jusante. Um argumento semelhante pode ser feito para qualquer tecnologia de sequenciamento que permite mais moléculas a ser sequenciado em paralelo. Além disso, vários componentes do ensaio C-seq permanecem para ser otimizado, incluindo a eficiência de RNA circularização, o rigor da seleção de tamanho e a natureza demorada do ensaio em si. Finalmente, é altamente recomendável que todos os usuários tenham acesso a uma ferramenta dedicada, alta sensibilidade para análise de ácidos nucleicos e solução de problemas potenciais (ver Tabela de materiais). Sem esta ferramenta, pode ser extremamente difícil de determinar em que momento surgem problemas potenciais, tornando-os assim impossível de corrigir.

Embora o protocolo inteiro é bastante implacável (pequenos erros tendem a ter consequências significativas), há várias etapas que são absolutamente essenciais para o sucesso do ensaio C-seq. Um dos requisitos mais importantes é que o RNA isolado é tratado mais suavemente possível. A maioria dos métodos de extração de RNA e kits de processamento a jusante pouco se preocupam com a composição química do RNA para além de padrões da indústria básica, que é suficiente para análises moleculares mais. No entanto, o ensaio de C-seq é encarregado de identificar um erro de transcrição único entre centenas de milhares de bases WT, aumentando grandemente a necessidade de reduzir o estresse molecular. Até mesmo estresse que afeta somente 1 em 10.000 bases pode introduzir artefatos que completamente invalidar os resultados. Por exemplo, os usuários devem nunca evitar/limite de expor o RNA para qualquer temperatura acima de 65 ° C. Em segundo lugar, cada usuário deve cuidadosamente otimizar o tempo necessário para a fragmentação de RNA com RNase III. É absolutamente crucial para o sucesso do ensaio que as moléculas finais são aproximadamente 60-80 bases de comprimento. Moléculas menores podem ser difíceis de mapear o genoma, e mais moléculas não permitirá para 3 repetições independentes a ser sequenciado dentro de uma leitura de bp 250. Finalmente, é recomendado para não congelar e descongelar o RNA mais de uma vez durante o protocolo inteiro. Em vez disso, isolar o RNA e sintetizar o cDNA em um único dia. Por causa do tempo e o esforço envolvidos com este compromisso, a complexidade do protocolo em si e o número de amostras que frequentemente são processadas de uma vez, recomenda-se que dois investigadores trabalham juntos para gerar essas bibliotecas.

Quando bem sucedido, estas experiências tornará possível detectar com precisão os erros de transcrição em qualquer organismo, sob qualquer condição experimental. Por exemplo, comparando o controle e indivíduos doentes para o outro, é possível determinar se certas doenças são associadas com erros de transcrição, que podem revelar um novo componente da etiologia de diversas patologias humanas. Outros parâmetros que podem ser analisados são a envelhecimento, nutrição, genótipo e fatores ambientais como a exposição aos produtos químicos tóxicos. Além disso, porque este teste detecta erros de transcrição durante o transcriptoma, permitirá que pesquisadores dissecar os diferentes mecanismos que contribuem para a fidelidade da ARN polimerase eu, II e III, bem como a RNA polimerase mitocondrial. Nesse sentido, esperamos que este protocolo vai abrir um novo campo de mutagénese à experimentação generalizada, caracterizada pelo estudo de mutações no RNA em vez de DNA.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Esta publicação foi viabilizada pelo financiamento do grant T32ES019851 (C. Fritsch), R01AG054641 e um jovem investigador do AFAR concedem (para M. Vermulst).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

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References

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Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

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