Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

Dit protocol biedt onderzoekers met een nieuw instrument voor het controleren van de betrouwbaarheid van transcriptie in meerdere modelorganismen.

Abstract

Nauwkeurige transcriptie is vereist voor de trouwe uitdrukking van genetische informatie. Verrassend genoeg echter is weinig bekend over de mechanismen waarmee de betrouwbaarheid van de transcriptie. Om te vullen deze kloof van de wetenschappelijke kennis, we onlangs de cirkel-sequencing assay voor het detecteren van transcriptie fouten in de gehele transcriptome van Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogasteren Caenorhabditis geoptimaliseerd elegans. Dit protocol zorgt voor onderzoekers met een krachtige nieuwe tool om het landschap van transcriptie fouten in eukaryote cellen toewijzen zodat de mechanismen waarmee de trouw van transcriptie kunnen worden opgehelderd in ongekend detail.

Introduction

Het genoom biedt een nauwkeurige biologische blauwdruk van het leven. Ter uitvoering van deze blauwdruk correct, is het belangrijk dat het genoom te worden overgezet met grote precisie. Transcriptie is echter onwaarschijnlijk dat vrij is van fouten. Bijvoorbeeld, RNA polymerase zijn al lang bekend bij vergissing-geneigd in vitro1,2, en onlangs werd aangetoond dat ze fouten begaan in vivo evenals3,5,6, met name wanneer geconfronteerd met DNA schade7,8,9,10. Samen genomen, deze opmerkingen aangeven dat transcriptie voortdurend in alle levende cellen fouten, suggereren dat ze een potente bron van gemuteerde eiwitten zou kunnen zijn.

Dit proces wordt genoemd transcriptionele mutagenese, verschilt van de klassieke mutagenese op twee manieren. Eerst, in tegenstelling tot genetische mutaties, transcriptie fouten invloed op zowel mitotische en post mitotische cellen, aangezien ze niet afhankelijk van DNA-replicatie. Bestuderen van de mechanismen die van invloed zijn de trouw van transcriptie, daarom krijgt waardevol inzicht geven in de belasting van de mutatie van de mitotische zowel post mitotische cellen. Interessant, transcriptie fouten zijn onlangs betrokken bij de bevordering van eiwit aggregatie11,12,13 en hypothetische hebben is om bij te dragen aan beide carcinogenese10 en de ontwikkeling van resistentie tegen antibiotica in bacteriën14.

Ten tweede, in tegenstelling tot genetische mutaties, transcriptie fouten zijn in de natuur van voorbijgaande aard. Hun tijdelijke bestaan vormt een bijzondere uitdaging omdat het maakt transcriptie fouten buitengewoon moeilijk op te sporen. Bijvoorbeeld, terwijl verschillende labs hebben bedacht waardevolle verslaggever testen voor de studie van transcriptionele mutagenese, kunnen deze testen alleen voor het meten van de transcriptie fouten in een beperkt aantal contexten en model organismen4,15. Om deze beperkingen te overwinnen, hebben vele onderzoekers aan RNA sequencing-technologie (RNA-seq), waarmee theoretisch transcriptie fouten worden geregistreerd in de gehele transcriptome van elke soort gedraaid. Deze studies zijn echter gemakkelijk verward door bibliotheek bouw artefacten, zoals omgekeerde transcriptie fouten, PCR versterking fouten en de feilbare aard van sequencing zelf. Bijvoorbeeld, omgekeerde transcriptases ongeveer één fout begaan elke ~ 20.000 basen, terwijl RNA polymerase (RNAPs) worden verwacht om te maken maar van één fout elke 300.000 honken5,6. Omdat de foutmarge van omgekeerde transcriptie alleen de foutmarge van RNA polymerase binnen cellen dwergen, is het vrijwel onmogelijk om te onderscheiden waar transcriptie fouten van artefacten, veroorzaakt door de voorbereiding van de bibliotheek in traditionele RNA-Seq-gegevens ( Figuur 1a).

U kunt dit probleem oplossen, ontwikkelden we een geoptimaliseerde versie van de cirkel-Sequencing (Cirseq, of C-seq voortaan) bepaling5,16. Deze bepaling kan de gebruiker voor het opsporen van transcriptie fouten en andere zeldzame varianten in RNA gedurende de transcriptome5. De circulaire-sequencing assay draagt deze naam omdat een belangrijke stap in deze test rond RNA circularization draait. Zodra de RNA-doelstellingen zijn circularized, zijn ze omgekeerde overgezet in een rollende cirkel mode, voor de productie van lineaire cDNA moleculen die vele kopieën van dezelfde RNA sjabloon bevatten. Als een fout aanwezig in een van deze sjablonen was, zou deze fout ook aanwezig zijn in elke één herhaling deel uitmaakt van het cDNA molecuul. In tegenstelling, fouten geïntroduceerd door omgekeerde transcriptie, PCR versterking of sequencing neiging om willekeurig ontstaan, en zullen dus aanwezig zijn in slechts één of twee herhalingen. Dus, door het genereren van een consensus volgorde voor elke cDNA molecuul en willekeurige fouten van fouten die in alle herhalingen optreden te onderscheiden, bibliotheek bouw artefacten kunnen effectief worden gescheiden van ware transcriptie fouten (Figuur 1b).

Indien goed gebruikt, de C-seq-bepaling kan worden gebruikt voor het nauwkeurig detecteren het tempo van de base vervangingen, invoegingen en verwijderingen in RNA hele transcriptome van elke soort (bijvoorbeeld Zie Traverse en Ochman17). Bijvoorbeeld, zijn wij gewend de C-seq-assay genoom-brede metingen van de foutmarge van transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegans en Drosophila melanogastervoorzien van een enkele basis resolutie5 (niet-gepubliceerde opmerkingen). Oorspronkelijk gebruikt voor het nauwkeurig volgnummer RNA-virus populaties, is deze geoptimaliseerde versie van de C-seq-bepaling gestroomlijnd om te minimaliseren van de barre omstandigheden tijdens de voorbereiding van de bibliotheek die aan de bibliotheek bouw artefacten bijdragen. Bovendien, met behulp van een aantal commercieel beschikbare kits, is de doorvoer van de bepaling sterk verbeterd, evenals de gebruiksvriendelijkheid. Indien goed gebruikt, kan deze test duizenden transcriptie fouten per repliceren, daardoor sterk verbeteren op eerdere studies6nauwkeurig detecteren. Globaal, is deze methode biedt een krachtig instrument om te studeren transcriptionele mutagenese en toestaat de gebruiker toegang krijgt tot nieuwe inzichten in de mechanismen waarmee de trouw van transcriptie in een breed scala van organismen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. voorbereiding

  1. RNases zijn alomtegenwoordig; de werkruimte daarom grondig te reinigen door het naar beneden te spuiten met een decontaminatie-reagens (b.v., RNase weg) en 70% ethanol. Spray onderaan elke pipetten, pennen, of buis rekken potentiële bronnen van RNase besmetting uit te schakelen.
  2. Voorkom verdere RNases van de verontreiniging van de monsters en draag een laboratoriumjas of lange mouwen T-shirt tijdens de experimenten. Vermijd contact tussen de handschoenen en de binnenkant van elke buizen die zal worden gebruikt, vooral als ze worden opgehaald uit een doos of tas.
  3. Voorafgaand aan het omgekeerde transcriptie, handschoenen vaak worden gewijzigd.
    Opmerking: Voor een optimaal resultaat worden niet onderbroken het experiment vóór de omgekeerde transcriptie.

2. cel en dierlijke cultuur en collectie

  1. Saccharomyces cerevisiae groei en collectie
    1. Desgewenst een C-seq-bibliotheek is uit gist eerst enten een één kolonie van S. cerevisiae in 3 mL middellange bevatten gistextract, adenine, pepton en dextrose (YAPD), en na een het nacht bebroeden bij 30 ° C in een rollende trommel.
    2. In de ochtend, opnieuw het enten van de cultuur in 50 mL YAPD middellange tot een optische dichtheid (OD) van 0,1 en de cellen groeien totdat ze een OD van 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 cellen/mL).
    3. Verzamelen van de gehele 50 mL cultuur (ongeveer 350 x 106 cellen) in een conische tube van 50 mL en draaien de cellen naar beneden voor 3 min bij 2100 x g. Verwijder het medium van de YAPD voorzichtig en wassen van de pellet een keer met 1 x PBS.
    4. Vervolgens resuspendeer de pellet in 480 µL van lysis buffer, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1), pH 6.8. Vortex het monster bij maximumsnelheid voor 5 s, en overdracht aan een schroefdop 1,5 mL tube met 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen (meegeleverd met de kit). Ga naar stap 3 van dit protocol voor de lysis van de cel en totaal RNA extractie.
      Opmerking: Alle van de reagentia die nodig zijn voor stap 2.1.4 vindt u in de aanbevolen gist RNA extractie kit. Deze reagentia werken even goed voor gist, wormen, en vliegt zodat na de inzameling van de gist (stap 2.1), wormen (stap 2.2) of vliegen (stap 2.3), een uniforme aanpak kan worden gebruikt voor het genereren van C-seq bibliotheken (stap 3 – 10).
  2. Caenorhabditis elegans cultuur en collectie
    1. Als u wilt een C-seq-bibliotheek van wormen, Kluisje 30 volwassen wormen op een verse plaat agar gespot met OP50 bacteriën.
      Opmerking: Vijf platen zijn voldoende voor 1 repliceren.
    2. Cultuur van de wormen voor 4 dagen en de wormen door voorzichtig wassen de platen met 5 mL M9 media verzamelen en bundelen van de wormen in een conische buis van één 50 mL.
    3. Draai de wormen naar beneden bij 100 x g gedurende 2 min maken een pellet. Vertragen de centrifuge op de laagste snelheid mogelijk, dus niet te verstoren de pellet.
    4. Zachtjes de wormen gaan met een 1.5 mL-buis, was ze twee keer in 1,5 mL M9 media en centrifugeer de buis bij 100 x g gedurende 1 minuut te verwijderen van bacteriën en het genereren van een schoon 100 µL pellet van wormen.
    5. Resuspendeer de wormen in 480 µL van lysis buffer, 48 µL van 10% SDS en 480 µL van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol. Vortex het monster bij maximumsnelheid voor 5 s en overdracht aan een schroefdop 1,5 mL tube met 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen. Ga naar stap 3 van dit protocol voor de lysis van de wormen en de totale extractie van RNA.
  3. Drosophila melanogaster cultuur en collectie
    1. Desgewenst een C-seq-bibliotheek is vanaf vliegen, cultuur 20 – 25 vliegen in flesjes die dextrose of een medium van melasse gebaseerde bevatten. Aliquot de vliegen meer dan 3 flesjes, zo dat elke ampul bevat ongeveer 8 vliegen.
    2. Het verzamelen van de vliegen, plaatst u de ampul in een ijsemmer totdat de vliegen zijn gedrogeerd. Vervolgens, om ze met een penseel in een tube van 1,5 mL te verzamelen. Verzamelen de vliegen niet door CO2 behandeling.
    3. Laat de warme vliegt naar kamertemperatuur (RT), en snel een premade mengsel van 500 µL van lysis buffer, 50 µL van 10% SDS en 500 µL van fenol: Chloroform: Isoamylalcohol toevoegen aan de buis. Gebruik een micropestle om te slijpen van het vliegen met ongeveer 15 lijnen, vergezeld van een onderneming draaiende beweging wanneer de stamper de onderkant van de buis bereikt.
    4. Giet het mengsel van vliegen en lysis van de media in een schroefdop 1,5 mL tube met 750 µL van ijskoude Zirkonia kralen en vortex het bij maximumsnelheid voor 5 s. doorgaan naar stap 3 van dit protocol voor de lysis van de vliegen en de totale extractie van RNA.

3. totaal RNA zuivering

Opmerking: op dit moment alle drie protocollen convergeren, en een enkele, uniforme aanpak kan worden gebruikt voor het genereren van C-seq bibliotheken.

  1. Schroef de dop op strak en bevestig de buis aan een vortexer met een adapter of plakband. Vortex de buis bij maximumsnelheid voor 10 min lyse van de monsters. Vervolgens Centrifugeer het monster bij 16.100 x g gedurende 5 min te scheiden van de organische oplosmiddelen van de waterige fase.
  2. Verwijder voorzichtig 400-500 µL van de waterige fase zonder verstoring van de interfase wit, bewolkt, en het toe te voegen aan een conische tube van 15 mL met 1.9 mL bindende buffer. Meng ze door vortexing.
  3. Voeg 1,25 mL ethanol 100% en meng het monster door vortexing. 700 µL van het monster overbrengen in een filterpatroon geassembleerd in een collectie buis en het monster bij 14.500 x g draaien voor 30 s. herhalen totdat alle van het monster wordt doorgegeven door de cartridge.
    Opmerking: op dit punt, het monster kan zetten iets ondoorzichtig. Als te veel cellen, wormen of vliegen werden lysed, precipitaten kunnen blijken dat het filter kan verstoppen.
  4. Was het filter eenmaal met 700 µL van wassen oplossing 1 en tweemaal met 500 µL van wassen oplossing 2 of 3. Beëindig de wasbeurten door het draaien van de monsters bij 14.500 x g gedurende 2 min voor het verwijderen van eventuele overtollige ethanol.
  5. Het filterelement overbrengen in een tube van de dolfijn 1,5 mL en voeg 108 µL voorverwarmde elutie oplossing (65 ° C).
    Opmerking: Nooit bloot RNA monsters aan temperaturen hoger dan 65 ° C vóór een omgekeerde transcriptie, zoals doen dus cytosine uracil deamination gebeurtenissen die onmogelijk zijn provoceren zal te onderscheiden van transcriptie fouten.
  6. Degraderen van de DNA-besmetting in de geïsoleerde RNA (Zie stappen 2.1-3.4) door toevoeging van 11 µL van 10 x DNase ik buffer, 2 µL van RNase remmer en 4 µL van DNase ik (8 U), en laat hen bij 37 ° C gedurende 30 minuten inwerken.
  7. Voeg na vertering, 11 µL van DNase inactivatie reagens. Vortex het mengsel en laat het zitten op RT gedurende 5 minuten. Vervolgens Centrifugeer het monster bij 15.000 x g gedurende 3 minuten de inactivatie-reagens pellet en 110 µL van het supernatans dat verzamelen zonder de pellet te verstoren. Het supernatant overbrengen in een 1,5 mL-buis.
    Opmerking: De DNase inactivatie reagens kan heel moeilijk om Pipetteer goed, zo visueel inspecteren de pipet tip na elke pipetting actie. Als de inactivatie-reagens al te visceus aan Pipetteer wordt, toevoegen 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) gelijk is aan 1/5 van het resterende volume.
  8. (Kwaliteitscontrole) Het meten van de concentratie van de totale RNA met behulp van een spectrofotometer. Vervolgens 1 µL van totale RNA gereserveerd en Verdun het tot een concentratie van 10 ng/µL in nuclease-gratis (NF) water. Het RNA worden uitgevoerd op een passende nucleotide analyse-instrument met een hoge gevoeligheid RNA-Tape om ervoor te zorgen dat de RNA is niet gedegradeerd en een eRIN-waarde van ten minste 8,5 of hoger (figuur 2B heeft).

4. mRNA verrijking

  1. Uitvoeren van de mRNA verrijking met een mRNA-miniprep kit (Zie Tabel van materialen). 140 µL van NF water Voeg aan het monster voor een totaal volume van 250 µL. Dan, voeg 250 µL van 2 x bindende buffer, het monster Meng door vortexing en voeg 15 µL van oligo (dT) kralen.
  2. Meng het monster door pipetteren het op en neer en na het bebroeden bij 65 ° C gedurende 2 min. Leg vervolgens het monster op RT gedurende 10 minuten. Ten slotte, Centrifugeer het monster bij 16.100 x g gedurende 2 min naar de kraal: mRNA complexen pellet.
  3. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 500 µL van wassen oplossing. Breng de oplossing over in een kolom spin en draai het voor 1 min bij 15.000 x g. Negeren de doorstroming en wassen van het monster met een extra 500 µL van wassen oplossing. Draai vervolgens, aan het monster gedurende 2 minuten bij 15.000 x g eventuele overtollige ethanol uit de spin filters verwijderen.
  4. De spin filter overbrengen in een dolfijn buis en resuspendeer de pellet in de kolom met 80 µL voorverwarmde elutie oplossing (65 ° C). Incubeer het monster gedurende 1,5 minuten bij 65 ° C en elueer het door het draaien van het voor 1 min bij 15.000 x g.
  5. Het meten van de concentratie van gezuiverde RNA met een spectrofotometer of gelijkaardig hulpmiddel waarmee voor de kwantificering van de concentratie van RNA en kwaliteit.

5. RNase III fragmentatie en RNA schoon te maken

Opmerking: (Belangrijk) ter voorbereiding van de circulaire RNA-moleculen die geschikt is voor het genereren van C-seq Bibliotheken, RNA naar ongeveer 60 – 80 bases in lengte moet worden gefragmenteerd. Terwijl de voorgaande methoden hebt gebruikt een chemische fragmentatie naar fragment RNA, introduceert chemische fragmentatie met zware metalen schade aan het RNA samples die kunnen worden geïnterpreteerd als transcriptie fouten tijdens de laatste analyse. Om dit probleem te omzeilen, in plaats daarvan vertrouwen op een versnippering RNase III met kleine fragmenten te genereren. Een bijkomend voordeel van deze enzymatische aanpak is dat het creëert compatibel uiteinden vereist voor afbinding, het wegnemen van de noodzaak van een einde-reparatie na de chemische versnippering.

  1. De reactie van de RNA-fragmentatie met 1 microgram van gezuiverde RNA ingesteld, 10 µL van reactie buffer, 5 µL van RNase III, en genoeg NF water om het volume tot 100 µL (Zie Tabel van materialen). Voeg het enzym laatst en Pipetteer het mengsel op en neer ten minste 10 keer te mengen. Incubeer het monster bij 37 ° C gedurende 25 minuten, die de neiging om het produceren van RNA fragmenten van ongeveer 60-80 bases in lengte.
  2. Zodra de incubatie 25 min voltooid is, het opruimen van de reactie onmiddellijk met een oligo-opschonen en concentrator kit (Zie Tabel van materialen) om te voorkomen dat eventuele verdere vertering. 200 µL van oligo-bindende buffer aan het monster, meng het door vortexing en voeg 800 µL van 100% ethanol toevoegen. Meng het monster door vortexing en het overbrengen van een meegeleverde spin-kolom in een collectie buis.
  3. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 s en wassen met 750 µL van was buffer te verwijderen RNase III. Centrifugeer het monster bij 10.000 x g gedurende 30 s, negeren de doorstroming, en wassen van het monster nogmaals met 750 µL van was buffer zoals hierboven beschreven. Na de tweede doorstroming heeft verworpen, centrifugeren van de kolom bij 15.000 x g gedurende 2 min voor het verwijderen van eventuele overtollige ethanol.
  4. De kolom overbrengen in een tube van verse 1,5 mL en elueer van het monster in 24 µL van NF water door het draaien van het bij 10.000 x g gedurende 1 minuut.
  5. QUALITY CHECK: Neem 2 µL van het gezuiverde fragmenten van RNA en Verdun het 2-fold door 2 µL van NF water toe te voegen. De gefragmenteerde RNA worden uitgevoerd op een scherm-tape om ervoor te zorgen dat de gefragmenteerde RNA in het bereik van 50-100 bases in lengte (Figuur 2 c).

6. RNA Circularization en glooiende cirkel omgekeerde transcriptie

  1. Om het circularize van de fragmenten van RNA, warmte-denatureren 20 µL van het monster bij 65 ° C gedurende 1 minuut en plaats deze op ijs onmiddellijk gedurende 2 minuten. Dan, Voeg 4 µL van 10 x T4 RNA ligase buffer, 4 µL van 10 mM ATP, 1 µL van RNase remmer, 1 µL van NF water en 8 µL van 50% polyethyleenglycol (PEG).
  2. Meng van het monster door vortexing, voeg vervolgens 2 µL van 10 U/µL van T4 RNA Ligase I. Mix het monster opnieuw door het pipetteren en na het bebroeden bij 25 ° C gedurende 2 uur in een thermocycler met de temperatuur van het deksel ingesteld bij 30 ° C.
  3. Na 2 uur, 10 µL van NF water Voeg aan het monster en opruimen van het monster met een oligo-opschonen en concentratie kit volgens specificaties van de fabrikant. Elueer het monster in 20 µL van NF water.
  4. Om te keren transcriberen de circulaire molecules van RNA, 4 µL van 10 mM dNTPs, 4 µL van 50 ng/µL willekeurige hexamers en 9 µL van NF water toevoegen aan 9 µL van RNA. Meng alles grondig door pipetteren, denatureren van het monster bij 65 ° C gedurende 1 minuut, en plaats deze op het ijs voor 2 min. winkel de resterende RNA als back-up.
  5. 8 µL van 5 x eerste-onderdeel synthese buffer, 2 µL van 0.1 mM DTT en 4 µL van 200 U/µL reverse-transcriptase toevoegen en meng alles door pipetteren. Incubeer het monster bij 25 ° C gedurende 10 minuten, gevolgd door een 20 min incubatie bij 42 ° C met het deksel ingesteld op 5 ° C hoger is dan de incubatietemperatuur.
    Opmerking: Een reverse-transcriptase met strand verplaatsing mogelijkheden moeten worden gebruikt bij deze stap te voorzien in een rollende omgekeerde transcriptie van de cirkel.
  6. 10 µL van NF water Voeg aan het monster en het schoon te maken met de oligo sanering en concentratie kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Elueer het monster in 42 µL van elutie oplossing.
  7. QUALITY CHECK: Verdun 2 µL van het single-stranded cDNA in 2 µL van NF water en uitvoeren van dit voorbeeld op een nucleotide analyse-instrument met een hoge gevoeligheid RNA Tape. Als de omgekeerde transcriptie goed, een bibliotheek van cDNA moleculen werkte, moeten variërend van ongeveer 60 – 1.500 bases in lengte, zichtbaar zijn. Idealiter is de meeste cDNA in het bereik van 500 – 1000 bases (figuur 2d).

7. tweede onderdeel cDNA synthese en einde reparatie

  1. Een tweede onderdeel synthese kit gebruiken voor het genereren van een double-stranded cDNA Bibliotheek. Leg de monsters op ijs en 30 µL van NF water toevoegen aan 38 µL van uw monster. Dan, voeg 8 µL van 10 x tweede onderdeel Buffer en 4 µL van tweede Strand enzym, en meng het monster door het zachte pipetteren voordat de incubatie bij 16 ° C gedurende 2,5 uur.
  2. Opruimen van de monsters met de oligo sanering en concentratie kit volgens de aanbevelingen van de fabrikant voor 100 µL reacties en elueer de monsters in 38 µL van NF water.
  3. De reactie van de einde-reparatie door 20 µL van NF water toe te voegen aan 35.5 µL van double-stranded cDNA, 6.5 µL van einde herstellen reactie Buffer en 3 µL van einde Prep enzym Mix opgericht. Zorgvuldig controleren de reactie buffer voor witte precipitaten en ontbinden hen door hand-warming indien aanwezig.
  4. Meng de einde-reparatie reactie door pipetteren en Incubeer het bij 20 ° C gedurende 30 minuten, gevolgd door een tweede 30 min incubatieperiode bij 65 ° C. Stel de temperatuur van het deksel thermocycler bij 5 ° C hoger is dan de incubatietemperatuur.

8. adapter afbinding en grootte selectie van bereid bibliotheken

  1. Een scriptingregel bibliotheek voorbereiding-module gebruiken voor de voorbereiding van de definitieve bibliotheek (Zie Tabel van materialen). Eerst, Verdun de adapters voor volgende-generatie 10-fold sequencing in 10 mM Tris-HCl tot een eindconcentratie van 1,5 µM. Vervolgens 2.5 µL van verdunde adapter en 1 µL van afbinding enhancer toevoegen aan elk monster en meng ze door vortexing.
  2. Voeg 15 µL van Blunt/TA Ligase Master Mix, meng het door pipetteren en Incubeer het bij 20 ° C gedurende 15 minuten. Vervolgens Voeg 3 µL van uracil-specifieke excisie reagens enzym en het incuberen bij 37 ° C gedurende 15 minuten. Nadat de afbinding voltooid is, 13,5 µL van NF water Voeg aan het monster voor een totaal volume van 100 µL en overgaan tot de selectie van de grootte.
    Opmerking: Het is best om grootte-select voor cDNA moleculen die in het bereik van 600-800 bases in lengte. Mochten de gefragmenteerde RNA-moleculen ongeveer 60 – 80 basissen in lengte, selecteren voor moleculen die 600-800 basis in lengte zal zorgen dat de meeste van de geselecteerde moleculen ten minste drie tandem wordt herhaald bevatten, ideaal voor de downstream processing en analyse.
  3. Toevoegen om te selecteren voor moleculen die 600-800 bp in lengte, 30 µL van de geresuspendeerde magnetische kralen (Zie Tabel of Materials), acclimated aan RT, aan elk monster en meng door pipetteren. Overdracht van het monster tot een 1,5 mL koker en Incubeer het bij RT gedurende 5 min.
  4. Leg het monster op een magnetische stand gedurende 5 minuten om te scheiden van de parels van de bovendrijvende substantie. Breng het supernatant (waarin de gewenste cDNA-moleculen) een nieuwe 1,5 mL tube te vervreemden van de magnetische kralen (die zijn gebonden aan grote cDNA moleculen).
  5. Een verse hoeveelheid 15 µL van magnetische kralen toevoegen aan elk samples, Meng door pipetteren, Incubeer gedurende 5 min op RT. plaats de monsters op een magnetische rek en hen Incubeer gedurende 5 min op RT. Vervolgens zorgvuldig verwijderen en verwijdering van het supernatant, om ervoor te zorgen niet te verstoren, de kralen.
    Let op: Gooi niet het magnetische kralen, die nu de gewenste doelgroep cDNA bevatten.
  6. Voeg 200 µL van 80% vers bereid ethanol aan elk van de monsters zonder verstoring van de Ingehuld magnetische kralen en incubeer 30 s. negeren de ethanol en wassen van de monsters nogmaals met 80% ethanol. Vervolgens volledig verwijderen van elk spoor van ethanol uit de monsters en drogen van de kralen voor 5 min maar wees voorzichtig niet te overdreven drogen de kralen. Als de kralen zijn overdried, verschijnt er scheuren in de pellets.
  7. Om elueer de monsters van de kralen, verwijder de buizen uit de magnetische stand en voeg 19 µL van 10 mM Tris-HCl. Pipet omhoog en omlaag meerdere keren te resuspended de kralen en Incubeer de monsters gedurende 5 minuten op RT. Als de parels werden overdried, incubeer hen voor > 10 min.
  8. Leg de monsters terug op de magnetische standaard en hen gedurende 5 minuten om te scheiden van de parels van de bovendrijvende substantie uit te broeden. Verwijder 15 µL van het supernatans dat met de zuivere, grootte-geselecteerd cDNA bibliotheken van de buizen voorzichtig en overbrengen naar een verse 1,5 mL-buis.

9. PCR versterking en reiniging van de laatste kraal

  1. Voeg 5 µL van universele primer en 5 µL van een unieke index primer (zie tabel van materialen) aan elk gezuiverd cDNA Bibliotheek en meng ze door pipetteren. Zorgvuldig controleren van de polymerase master mix voor kristallen en andere precipitaten en warm de master mix met de hand totdat de precipitaten ontbinden.
    1. Voeg 25 µL van de polymerase master mix aan het monster, meng ze door pipetteren, en volg de fietsen voorwaarden hieronder voor de PCR versterking. Uitvoeren van de eerste denaturatie bij 98 ° C gedurende 30 s, en voer een dubbele stap PCR reactie door denaturating de monsters bij 98 ° C voor 10 s en gloeien/extensie van de PCR producten bij 65 ° C gedurende 75 s (12 x), gevolgd door een laatste extensie bij 65 ° C gedurende 5 minuten en een onbepaalde hold bij 4 ° C.
  2. Reinigen van de definitieve bibliotheken door 45 µL van de geresuspendeerde magnetische kralen rechtstreeks naar de PCR reactie toe te voegen, meng ze door pipetteren, en hen op RT voor 5 min. overdracht Incubeer het monster tot een 1,5 mL koker en plaats deze in een magnetische stand. Incubeer het gedurende 5 minuten, verwijder het supernatant en wassen tweemaal met vers bereide 80% ethanol voor 30 s.
  3. Na de tweede wash, volledig verwijderen van de ethanol uit het monster, en drogen van de kraal pellet voor 5 min en elueer het in 35 µL van 0.1 x TE. Resuspendeer de kralen door hen pipetteren en incubeer hen bij RT gedurende 5 min. plaats het monster op de magnetische stand en na 5 min, 30 µL van het supernatans overbrengen in een verse 1,5 mL-buis. Opslaan van de bibliotheken van-80 ° C.
  4. QUALITY CHECK: 1 µL van de definitieve bibliotheek in 9 µL van NF water verdunnen en uitvoeren van het monster op een speciaal DNA-analyse-instrument met een hoog-gevoeligheids-chip; de meerderheid van cDNA moeten in het bereik van 600-800 bp in lengte (figuur 2e).
  5. Na de elutie, verstuur de monsters voor het rangschikken op een platform van massaal parallelle sequencing met behulp van 250 bp gekoppeld-einde leest, of 300 bp single-end leest.

10. bio-informatica analyse van cirkel rangschikking van gegevens

Opmerking: Analyseren en interpreteren van de ruwe gegevens van de C-seq-test vereist een speciale bio-informatica pijpleiding. Een schematische voorstelling van de pijpleiding die werd gebruikt voor onze analyses is afgebeeld in Figuur 3. Download deze pijpleiding op https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Eerst, trim de leest verwijderen adapter sequenties en lage kwaliteit basis gesprekken met cutadapt18, met behulp van een kwaliteit score drempel van 20.
  2. Vervolgens identificeren de herhalingen gecodeerd door de concatemerized RNA molecuul gebruikmakend van een passende algoritme te detecteren herhalingen met een minimale grootte van 30 nucleotiden en een maximum van 2 incongruenties tussen herhaalt18. Een reeks van consensus ontlenen deze herhalingen en bijhouden van alle basis oproepen en bijbehorende kwaliteitsscores op elke positie.
    Opmerking: Omdat omgekeerde transcriptie op elke positie op het circularized RNA-molecuul beginnen kan, het begin van een herhaling niet noodzakelijkerwijs overeenkomt met het 5 '-eind van de gefragmenteerde RNA molecuul (hierna te noemen de afbinding punt). Dienovereenkomstig, zal de volgorde van de consensus niet continu kaart tegen de overeenkomstige transcriptome, die de identificatie van het punt van de afbinding vergt.
  3. Kaart ter identificatie van de afbinding punt, een concatemer van de reeks van de consensus tegen de verwijzing transcriptome met behulp van de uitlijning van de BLAST-achtige tool (BLAT)19.
    1. Samenvoegen van twee exemplaren van de volgorde van de consensus om ervoor te zorgen dat de toegewezen reeks ten minste één volledige ononderbroken exemplaar van het eerste fragment opeenvolging van RNA bevat. Vervolgens, draaien de volgorde van de consensus om te beginnen op de plaats van de voorspelde afbinding-punt.
  4. De sequenties van de gedraaide consensus tegen het genoom met behulp van TopHat20 in kaart en gebruiken de uitlijning voor het detecteren van enkele nucleotidepolymorfisme (SNPs) die kunnen worden verward met transcriptie fouten.
  5. Bel de transcriptie fouten uit de toegewezen gedraaide consensus sequenties en testen of de fouten van de kandidaat-vier extra tests doorstaan.
    1. Controleer eerst dat een fout transcriptie niet met een SNP overlapt (een typische vereiste is dat ten minste 20 leest nodig ter dekking van een bepaalde basis en niet meer dan 5% van de leest kan een alternatieve basis oproep steunen).
    2. Ten tweede, Controleer dat de volgorde van de consensus is afgeleid van ten minste 3 tandem wordt herhaald, elk waarvan de dezelfde basenpaar roept; en ten derde, zorg ervoor dat de som van de kwaliteitsscores van die positie meer dan 100 moet.
  6. Voor een vierde en laatste controleren, draaien de volgorde van de consensus in alle mogelijke combinaties (simuleren van alle mogelijke standen van de afbinding punt) en elke versie tegen het genoom van de verwijzing met behulp van TopHat kaart.
    Opmerking: Als een perfecte match men van de gedraaide sequenties in het genoom vindt, de overeenkomstige afbinding punt wordt nu beschouwd als de juiste is en de transcriptie fout oproep moet worden afgewezen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals alle benaderingen van massaal parallelle sequencing produceert elk C-seq-experiment een logge, grote dataset. Voor first-time gebruikers is het moeilijk te behandelen deze datasets; Dus, is het aanbevolen dat alle gebruikers contact met een ervaren bio-informaticus voorafgaand aan het experimenteren. Gemiddeld, is de verwachting dat gebruikers zal het genereren van ongeveer 55 – 70 Giga basen (Gbases) per run op de meeste platformen van massaal parallelle sequencing. Voor dit protocol, meestal werden 12 – 30 monsters multiplexed per run zodat voor elk monster ongeveer 2 – 6 Gbases werden verworven. Na het bijsnijden de adapter sequenties en lage kwaliteit basis oproepen (< 20) van deze dataset, bleef ~ 70% van de grootte van de oorspronkelijke gegevens.

Deze grondslagen worden vervolgens verder geanalyseerd om te onderzoeken van de efficiëntie van het RNA versnippering en circularization door het bepalen van de grootte van de herhalingen die werden gegenereerd. De meeste herhaalt neigen 45 – 80 bases in lengte (figuur 4A) en ongeveer 50% van de grondslagen die waren sequenced deel uitmaken van deze herhalingen (figuur 4B). Aangezien de meeste van deze bases aanwezig in leest die bevatten is 3 herhalingen of meer, het aantal unieke bases die zijn sequenced ongeveer eenderde van het totale aantal basissen gesequentieerd. Gemiddeld > 75% van deze consensus sequenties terug aan het genoom van de verwijzing kunnen worden toegewezen. Ten slotte, ongeveer 25% van deze rechtsgrondslagen vallen 20 leest of meer, wat uiteindelijk betekent dat ongeveer 10% van de gegevens kan worden gebruikt voor foutopsporing. Een voorbeeld van deze analyse wordt gegeven in Figuur 4, waarmee de sequencing-informatie die werd verkregen tijdens de opbouw van dit protocol voor 1 repliceren van één C-seq bibliotheek die relatief ondiep was sequenced en vertegenwoordigt de laagste limiet van de gegevens die gebruikers verwachten kunnen om te verwerven.

Ongeveer 5.000-25.000 fouten per run de neiging te worden geïdentificeerd, hoewel deze getallen aanzienlijk afhankelijk van het foutenpercentage zelf variëren kan (hoe hoger het foutenpercentage, de meer fouten worden gedetecteerd), de grootte van de transcriptome (hoe groter de transcriptome, de minder honken zullen worden gedekt door 20 leest, beperken de sequencing-gegevens die kan worden gebruikt voor foutopsporing), en de diepte waarop het is sequenced (dieper sequencing maakt het waarschijnlijker dat een bepaalde base zullen worden gedekt door 20 leest of meer). Deze fouten de neiging om te worden verdeeld over het hele genoom, zodat gemiddeld ~ 47% van de onregelmatigheden bevinden zich in mRNA moleculen gegenereerd door RNA polymerase II (RNAP II), ~ 49% bevinden zich in de rRNA molecules gegenereerd door RNAP ik, en de resterende ~ 3% bevinden zich in de RNAs gegenereerd door RNAP III en de mitochondriale RNA-polymerase. Deze verhoudingen kunnen echter aanzienlijk verschillen afhankelijk van het celtype of organisme onder onderzoek (figuur 4C). Celtypes die sterk afhankelijk zijn van mitochondriale functie, zoals cardiomyocytes, bevatten bijvoorbeeld aanzienlijk meer mitochondriale RNA dan andere celtypes, het aantal mitochondriale RNA-moleculen die gesequentieerd zijn, en dus het aantal sterk te verhogen. van fouten gedetecteerd.

Zodra een lijst van fouten is samengesteld, en hun locaties in het genoom zijn bekend, kunnen deze fouten worden gebruikt voor identificatie van de parameters waarmee de foutmarge van transcriptie in elk organisme. Bijvoorbeeld, kan de locatie van deze transcriptie fouten worden gecorreleerd met talrijke eigenschappen van het genoom, zoals de aanwezigheid van DNA wordt herhaald, specifieke genetische contexten, of de rente expressie te begrijpen hoe deze functies veranderen de getrouwheid van transcriptie5. De verwachting is dat in de toekomst, maar gebruikers kunnen om te bepalen hoe talloze extra functies beïnvloeden transcriptionele trouw, met inbegrip van epigenetische markeringen, de 3D-organisatie van het genoom, de beschikbaarheid van nutriënten, leeftijd of blootstelling aan giftige verbindingen, de bijdrage van genetische en omgevingsfactoren factoren aan de trouw van transcriptie ophelderen.

Figure 1
Figuur 1: Schematische weergave van RNA-seq versus C-seq. (A) traditionele RNA-seq experimenten isoleren RNA van een steekproef van belang, fragment RNA en reverse transcriberen het voorafgaand aan de definitieve bibliotheek voorbereiding en sequentiebepaling. Deze voorbereiding procedures voeren echter talrijke technische artefacten in de bibliotheek in de vorm van omgekeerde transcriptie fouten, PCR versterking fouten en volgorde fouten. (B) deze geoptimaliseerde C-seq assay zorgt voor de correctie van deze technische artefacten door de gefragmenteerde molecules van RNA vóór omgekeerde transcriptie, waarmee ze als omgekeerde overgezet in een rollende cirkel mode tot lineaire circularizing cDNA-moleculen die meerdere kopieën van de oorspronkelijke sjabloon van het RNA in tandem bevatten herhalen. Deze tandem herhalingen kunnen vervolgens worden gebruikt om te onderscheiden waar transcriptie fouten van artefacten, zoals echte transcriptie fouten (ster) aanwezig zijn in alle herhalingen op dezelfde locatie, zullen overwegende dat artefacten, zoals reverse transcriptie fouten (vierkante) en PCR versterking fouten (cirkel) zijn alleen in één of twee herhalingen van een bepaalde cDNA molecuul aanwezig. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten voor bibliotheek voorbereiding. Deze panelen Toon een electrophoretogram voor (A) een hoge gevoeligheid RNA scherm tape ladder (Zie Tabel of Materials), (B) het totaal RNA gezuiverd van Saccharomyces cerevisiae, RNase III gefragmenteerde RNA van (C) en) D) rollende cirkel omgekeerde-getranscribeerd cDNA. (E) de definitieve grootte geselecteerde cDNA Bibliotheek runs op een hoge gevoeligheid double-stranded DNA-analyse chip (Zie Tabel van materialen). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: schematische van de bio-informatica pijpleiding gebruikt voor het analyseren van de gegevens van de sequencing omcirkelen. Nadat trimmen de volgorde leest, herhalingen worden geïdentificeerd en een consensus-reeks wordt gegenereerd met behulp van de meest waarschijnlijke basis oproep op een bepaalde positie. Dan het punt van de afbinding van de initiële RNA-sjabloon wordt geïdentificeerd en de volgorde van de consensus wordt uitgelijnd met de referentie-genoom zodat potentiële transcriptie fouten kunnen worden geïdentificeerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: voorbeeld van resultaten voor C-Seq pijpleiding. (A) dit paneel toont de grootteverdeling van de sequenties van de consensus is verkregen van een typische C-Seq-experiment. (B) dit paneel toont het aantal bases, leest, en percentage van luidt sequenced in elke stap van de C-Seq bioinformatics pijpleiding. (C) dit paneel toont het aantal geconstateerde fouten van de transcriptie en het percentage van de fouten toegeschreven aan RNA polymerase I, RNA polymerase II, RNA polymerase III en mitochondriale RNA-polymerase. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol voor de bereiding van C-seq bibliotheken voor het opsporen van fouten van de transcriptie in Saccharomyces cerevisiae, Caenorhabditis elegansen Drosophila melanogaster. Dit protocol heeft vele voordelen ten opzichte van de bestaande protocollen, evenals alternatieve technieken.

In de afgelopen 15 jaar, zijn talrijke verslaggever systemen ontwikkeld die afhankelijk zijn van luciferase7,8 of Cre-Lox recombinatie3,4,15,21 te detecteren transcriptie fouten. Deze verslaggever systemen zijn onschatbare waarde geweest voor onderzoekers begrip van transcriptionele trouw, omdat ze toegestaan moleculaire mechanismen worden geïdentificeerd die direct de trouw van transcriptie regelen, genen en allelen. Echter, zij alleen verslag over fouten in kunstmatig beschadigde sjablonen, of binnen zeer specifieke genetische contexten die beperkt de wetenschappelijke vragen die ze kunnen beantwoorden. Een belangrijk voordeel van het C-seq-protocol is dat het controleert de trouw van transcriptie gedurende de gehele transcriptome5, de wetenschappelijke kennis van de nauwkeurigheid waarmee de genetische informatie wordt uitgedrukt sterk uit te breiden. Ten tweede, omdat de C-seq-bepaling maakt gebruik van RNA als haar bronmateriaal, is het waarschijnlijk dat deze bepaling kan worden aangepast aan elk organisme van keuze, het wegnemen van de noodzaak voor het genereren van ingewikkelde verslaggever constructies voor elk transgene model. Dit protocol heeft ook voordelen ten opzichte van bestaande massaal parallelle sequencing benaderingen17,22. Meest in het bijzonder, de meeste van deze benaderingen maken gebruik van zware metalen aan fragment RNA bibliotheken. Echter leiden deze versnippering methoden tot artefacten in het RNA die zijn niet te onderscheiden van echte transcriptie fouten5. U kunt dit probleem oplossen, dit protocol fragmenten RNA enzymatisch met RNase III, die het voordeel heeft dat het compatibel uiteinden voor zelf-Afbinding verlaat, aanzienlijk vereenvoudigen RNA circularization en verhogen van de gevoeligheid van de test ~ 10-fold.

Op hetzelfde moment heeft de C-seq-bepaling zijn eigen aandeel van beperkingen. Eerst, hoewel de bepaling transcriptie fouten tijdens het gehele genoom maatregelen, een groot onderdeel van de gegevens neigt te worden afgeleid van genen die zeer worden uitgedrukt, zoals afschriften van deze genen hebben de neiging te domineren de meeste RNA bibliotheken. Een andere factor die de analyse naar zeer uitgesproken genen scheef is de drempel die is ingebouwd in de bio-informatica pijpleiding die voorkomt dat genetische mutaties en bewerken van gebeurtenissen uit de laatste metingen verstorende RNA. Deze drempel dicteert dat alleen bases die waren sequenced 20 keer of meer kunnen worden gebruikt voor de uiteindelijke analyse. Een tweede beperking betreft de diversiteit van de bibliotheek. Zoals de meeste kits gebruikt voor RNA extractie, is de kit die hier wordt gebruikt niet efficiënt zuiveren kleine molecules van RNA, die beperkt het aantal leest afgeleid van moleculen gesynthetiseerd door RNAP III. De diversiteit van de definitieve volgorde bibliotheek wordt verder beperkt door de mRNA zuivering stap hier in dienst. Hoewel moleculen gegenereerd door RNAP ik kan efficiënt zijn sequenced, de meeste van de resterende mitochondriale RNAs, tRNAs, en niet-coderende RNAs gaan verloren tijdens deze stap. Te vangen deze moleculen meer vaak, een verschillende kit die specifiek kleine molecules van RNA zuivert moet worden gebruikt, of celtypen moeten worden gericht die voor deze moleculen zijn verrijkt. Houd er rekening mee, echter dat de meeste van deze problemen kunnen worden opgelost door sequentiebepaling dieper dan normaal, of gelijktijdig sequencing het DNA van dezelfde cellen, hoewel beide oplossingen een grotere financiële investering door de onderzoekers vergt.

Bovendien, zijn toekomstige technologische ontwikkelingen klaar om de bepaling van de C-seq op een fundamenteel niveau verbeteren. Bijvoorbeeld door de uitbreiding van het Lees-lengte van de bestaande volgorde technologie, zullen het kunnen reeks langer moleculen, wat betekent dat meer herhalingen kunnen worden gebruikt om na te gaan van de betrouwbaarheid van de transcriptie. Dergelijke verbeteringen zal automatisch leiden tot een grotere diepte sequencing en een toename van het percentage van luidt dat kan worden gebruikt voor downstream analyse. Een soortgelijk argument kan worden gemaakt voor elke sequencing-technologie die voor meer moleculen zorgt te worden sequenced in parallel. Bovendien talrijke componenten van de C-seq bepaling moeten nog worden geoptimaliseerd, met inbegrip van de efficiëntie van RNA circularization de striktheid van selectie van de grootte en de tijdrovende aard van de bepaling zelf. Tot slot, is het sterk aanbevolen dat alle gebruikers toegang krijgen tot een toegewijde, ultragevoelige hulpmiddel voor nucleïnezuur analyse en probleemoplossing van de potentiële (Zie Tabel van materialen). Zonder dit hulpmiddel kan het uiterst moeilijk om te bepalen op welk punt potentiële problemen, waardoor ze onmogelijk om vast te stellen.

Hoewel het gehele protocol vrij onverzoenlijk is (kleine fouten neiging om aanzienlijke gevolgen hebben), zijn er verschillende stappen die absoluut essentieel voor het succes van de C-seq-bepaling zijn. Een van de belangrijkste eisen is dat de geïsoleerde RNA zo voorzichtig mogelijk wordt behandeld. Meeste RNA extractiemethoden en downstream processing kits schelen weinig over de chemische samenstelling van het RNA dan basisindustrie normen, die is voldoende voor meest moleculair analyses. De C-seq-bepaling is echter belast met het identificeren van een fout van één transcriptie onder honderdduizenden WT grondslagen, de noodzaak om moleculaire stress te verminderen sterk te verhogen. Zelfs stress die van invloed is slechts 1 in 10000 basissen kan leiden tot artefacten die volledig de resultaten vervalt. Bijvoorbeeld, gebruikers moeten nooit voorkomen/beperken bloot het RNA tot een temperatuur van meer dan 65 ° C. Ten tweede, moet elke gebruiker zorgvuldig de tijd die nodig is voor de versnippering van de RNA met RNase III optimaliseren. Het is absoluut cruciaal voor het welslagen van de bepaling dat de definitieve moleculen ongeveer 60 – 80 bases in lengte zijn. Kortere moleculen wellicht moeilijk om toe te wijzen aan het genoom, en langere moleculen zal niet toestaan voor 3 onafhankelijke herhalingen te worden sequenced binnen een 250 bp te lezen. Ten slotte, is het raadzaam niet te bevriezen en ontdooien van het RNA meerdere keren tijdens het gehele protocol. In plaats daarvan, isoleren van RNA en cDNA synthetiseren in een enkele dag. Vanwege de tijd en moeite die betrokken zijn bij dit engagement, de complexiteit van het protocol zelf, en het aantal monsters dat vaak tegelijk worden verwerkt, is het aanbevolen dat twee onderzoekers samen werken voor het genereren van deze bibliotheken.

Wanneer succesvol, zal deze experimenten het mogelijk maken te nauwkeurig transcriptie fouten worden opgespoord in elk organisme, onder geen enkele voorwaarde experimentele. Bijvoorbeeld door controle en zieke personen met elkaar te vergelijken, het mogelijk om te bepalen of bepaalde ziekten worden geassocieerd met transcriptie fouten, die een nieuw onderdeel van de etiologie van talrijke menselijke pathologie kunnen onthullen. Er zijn andere parameters die kunnen worden gesondeerd organisch veroudering, voeding, genotype en milieufactoren zoals blootstelling aan giftige chemische stoffen. Bovendien, omdat deze test transcriptie fouten in de gehele transcriptome detecteert, het zal toestaan onderzoekers te ontleden van de verschillende mechanismen die bijdragen aan de trouw van RNA-polymerase I, II, III, alsmede de mitochondriale RNA-polymerase. We verwachten daarom dat dit protocol van een nieuw veld van mutagenese voor grootschalige experimenten openstellen zal, gekenmerkt door de studie van mutaties in RNA in plaats van DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Deze publicatie werd mogelijk gemaakt door financiering verlenen T32ES019851 (C. Fritsch), toekennen R01AG054641, en een jonge onderzoeker van AFAR (M. Vermulst).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Tags

Genetica kwestie 139 genetische processen genexpressie transcriptie genetische Reverse transcriptie transcriptoom mutagenese aminozuur vervanging verschijnselen en processen genetische verschijnselen mutagenese transcriptie RNA-Seq S. D. melanogaster sequencing RNA polymerase fouten cerevisiae C. elegans
Genoom-brede Surveillance van transcriptie fouten in eukaryote organismen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, C., Gout, J. F. P.,… More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter