Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

Denne protokollen gir forskere med et nytt verktøy for å overvåke gjengivelsen av transkripsjon i flere modell organismer.

Abstract

Nøyaktig transkripsjon kreves for trofast uttrykket av genetisk informasjon. Overraskende skjønt, lite er kjent om mekanismer som styrer gjengivelsen av transkripsjon. For å fylle dette hullet i vitenskapelig kunnskap, optimalisert vi nylig sirkel-sekvensering analysen å oppdage transkripsjon feil gjennom transcriptome av Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokollen gir forskere med et kraftig nytt verktøy for å kartlegge landskapet i transkripsjon feil i eukaryote celler slik at mekanismene som styrer gjengivelsen av transkripsjon kan bli belyst i enestående detaljer.

Introduction

Genomet gir en presis biologiske blåkopi av livet. For å implementere dette blåkopi riktig, er det viktig for genomet å bli transkribert med stor presisjon. Men er transkripsjon usannsynlig å være feilfri. For eksempel RNA polymerases har lenge vært kjent for å være utsatt for feil i vitro1,2, og nylig ble det vist at de begår feil i vivo samt3,5,6, spesielt når konfrontert med DNA skade7,8,9,10. Sammen indikerer disse observasjonene at transkripsjon feil oppstår kontinuerlig i alle levende celler, antyder at de kunne være en potent kilde til mutert proteiner.

Denne prosessen kalles transcriptional mutagenese, er forskjellig fra klassisk mutagenese på to måter. Først, i motsetning til genetiske mutasjoner, transkripsjon feil påvirke både mitotisk og post mitotisk celler, som de ikke avhengige av utryddelse. Studere mekanismer som påvirker gjengivelsen av transkripsjon vil derfor gi verdifull innsikt i mutasjon belastningen av både mitotisk og post mitotisk celler. Interessant, transkripsjon feil har nylig vært innblandet i markedsføringen av protein aggregering11,12,13 og har vært antatt bidra til både kreft10 og utvikling av antibiotikaresistens i bakterier14.

Andre, i motsetning til genetiske mutasjoner, transkripsjon feilene er forbigående i naturen. Deres midlertidig eksistens er spesielt utfordrende fordi det gjør transkripsjon feil meget vanskelig å oppdage. For eksempel, mens flere labs har utviklet verdifulle reporter analyser for studiet av transcriptional mutagenese, er disse analyser bare kjøpedyktig mål transkripsjon feil i noen sammenhenger og modell organismer4,15. For å overvinne disse begrensningene, har mange forskere slått til RNA sekvensering teknologi (RNA-seq), som tillater teoretisk transkripsjon feil skal registreres gjennom transcriptome av alle arter. Men er disse studiene lett forvirret av biblioteket bygging artefakter som omvendt transkripsjon feil, PCR forsterkning feil og feilutsatte natur sekvensering selv. For eksempel lagre omvendt transcriptases omtrent én feil hver ~ 20.000 baser, mens RNA polymerases (RNAPs) er forventet å gjøre bare én feil hver 300.000 baser5,6. Fordi feilrate omvendt transkripsjon alene dverger feilrate av RNA polymerases i cellene, er det praktisk talt umulig å skille ekte transkripsjon feil fra biblioteket forberedelse i tradisjonelle RNA-Seq data ( objekter Figur 1a).

For å løse dette problemet, utviklet vi en optimalisert versjon av den sirkel-sekvensering (Cirseq eller C-seq heretter) analysen5,16. Denne analysen kan brukeren finne transkripsjon feil og andre sjeldne varianter i RNA i transcriptome5. Rundskriv-sekvensering analysen bærer dette navnet fordi et viktig skritt i denne analysen dreier RNA circularization. Når RNA mål er circularized, er de omvendt transkribert i et bølgende sirkel mote, å produsere lineær cDNA molekyler som inneholder mange kopier av den samme RNA-malen. Hvis feilen var i en av disse malene, vil denne feilen også være til stede i hvert enkelt gjenta i cDNA molekylet. Derimot feilene som omvendt transkripsjon, PCR forsterkning eller sekvensering pleier å oppstår tilfeldig, og vil dermed være tilstede i bare én eller to ganger. Dermed generere en konsensus sekvens for hvert cDNA molekyl, og skille tilfeldige feil fra feil som forekommer i alle rapportene, kan bibliotek bygging gjenstander effektivt være adskilt fra sant transkripsjon feil (figur 1b).

Hvis brukt riktig, C-seq analysen kan brukes til nøyaktig oppdage frekvensen av base erstatninger, innsettinger og slettinger i RNA gjennom transcriptome av alle arter (for eksempel se traversering og Ochman17). For eksempel har vi brukt C-seq analysen gi genomet hele målinger av feilrate transkripsjon i Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans én base oppløsning5 (upublisert observasjoner). Opprinnelig brukt til å nøyaktig sekvens RNA-virus befolkninger, har denne optimalisert versjon av C-seq analysen blitt strømlinjeformet for å minimere værharde under bibliotek utarbeidelsen som bidrar til biblioteket bygging gjenstander. I tillegg bruker en rekke kommersielt tilgjengelige kits, er gjennomstrømningen av analysen kraftig forbedret, og dens brukervennlighet. Hvis brukt riktig, kan denne analysen nøyaktig oppdage tusenvis av transkripsjon feil per replikere, og dermed sterkt forbedre tidligere studier6. Total, denne metoden gir et kraftig verktøy for å studere transcriptional mutagenese og vil tillate brukeren å få ny innsikt i mekanismer som styrer gjengivelsen av transkripsjon i et bredt spekter av organismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse

  1. RNases er allestedsnærværende; Derfor, rense arbeidsområdet grundig ved å spraye den ned med en dekontaminering reagens (f.eks, RNase unna) og 70% etanol. Spray ned noen Pipetter, penner eller rør stativer fjerne potensielle kilder til RNase forurensning.
  2. For å forhindre RNases fra forurensende prøvene, bære en Laboratoriefrakk eller langermet trøye til ham under eksperimentering. Unngå kontakt mellom hansker og innsiden av alle rørene som skal brukes, spesielt når du henter dem fra eller vesken.
  3. Før den omvendte Transkripsjonen, endre hansker ofte.
    Merk: For optimale resultater, ikke pause eksperimentet før omvendt transkripsjon.

2. cellen og dyr kultur og samling

  1. Saccharomyces cerevisiae vekst og samling
    1. Hvis et C-seq-bibliotek fra gjær, først vaksinere en enkelt koloni av S. cerevisiae i 3 mL middels inneholder gjærekstrakt, adenine, pepton og druesukker (YAPD), og ruge det overnatting på 30 ° C i en rullende tromme.
    2. I morgen, å vaksinere kulturen i 50 mL av YAPD medium til en optisk tetthet (OD) 0,1 og vokse cellene til de når et OD på 0,5-0,7 (~ 7 x 106 celler/mL).
    3. Samle hele 50 mL kultur (ca 350 x 106 celler) i et 50 mL konisk rør og spinne celler ned for 3 min 2100 x g. Nøye fjerne YAPD mediet og vask pellet gang med 1 x PBS.
    4. Deretter resuspend pellet i 480 µL av lyseringsbuffer, 48 µL av 10% SDS og 480 µL av fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (25:24:1), pH 6.8. Vortex prøven med maksimal hastighet for 5 s og overføre den til skrukork 1,5 mL tube med 750 µL av iskalde zirconia perler (følger med kit). Gå videre til trinn 3 i denne protokollen for cellen lyse og totale RNA utvinning.
      Merk: Alle reagenser kreves for trinn 2.1.4 tilbys i anbefalt gjær RNA utvinning kit. Skal disse reagensene fungerer like godt for gjær, ormer, og flyr slik at etter samlingen av gjær (trinn 2.1), ormer (trinn 2.2) eller fluer (trinn 2.3), en enhetlig tilnærming kan brukes til å generere C-seq biblioteker (trinn 3-10).
  2. Caenorhabditis elegans kultur og samling
    1. Hvis et C-seq-bibliotek fra ormer, innskudd 30 voksne ormene på en frisk plate av agar oppdaget med OP50 bakterier.
      Merk: Fem platene er tilstrekkelig for 1 replikere.
    2. Kultur ormer i 4 dager og samle ormer ved å vaske forsiktig platene med 5 mL av M9 media, og basseng ormer i en enkelt 50 mL konisk rør.
    3. Spinne ormer ned 100 x g i 2 minutter å lage pellets. Avta sentrifuge på den laveste hastigheten mulig, for ikke å forstyrre pellet.
    4. Forsiktig flytte ormer i en 1,5 mL tube, vaske dem to ganger i 1,5 mL av M9 media og sentrifuge røret på 100 x g for 1 min å fjerne bakterier og generere ren 100 µL pellets ormer.
    5. Resuspend ormer i 480 µL av lyseringsbuffer, 48 µL av 10% SDS og 480 µL av fenol: kloroform: Isoamyl alkohol. Vortex prøven med maksimal hastighet for 5 s og overføre den til skrukork 1,5 mL tube med 750 µL av iskalde zirconia perler. Gå videre til trinn 3 i denne protokollen for lysis av ormer og den totale RNA utvinning.
  3. Drosophila melanogaster kultur og samling
    1. Hvis et C-seq-bibliotek fra fluer, kultur 20-25 fluer i ampuller som inneholder enten druesukker eller en sirup-baserte medium. Aliquot flyr over 3 ampuller, slik at hver ampullen inneholder ca 8 fluer.
    2. For å samle fluene, plasser ampullen i en isen bøtte til fluene er bedøvet. Deretter samle dem med en pensel i en 1,5 mL tube. Samle ikke fluene av CO2 behandling.
    3. La fluene varm til romtemperatur (RT), og raskt legge til en forhåndslagde blanding av 500 µL av lyseringsbuffer, 50 µL av 10% SDS og 500 µL av fenol: kloroform: Isoamyl alkohol i røret. Bruke en micropestle til å slipe opp fluer med ca 15 slag, ledsaget av et firma kronglete bevegelse når støter når bunnen av røret.
    4. Hell blandingen av fluer og lyse media skrukork 1,5 mL tube med 750 µL av iskalde zirconia perler og vortex det med maksimal hastighet for 5 s. Fortsett til trinn 3 i denne protokollen for lysis av fluer og den totale RNA utvinning.

3. total RNA rensing

Merk: på dette punktet alle tre protokoller sammen, og en enkelt, enhetlig tilnærming kan brukes til å generere C-seq biblioteker.

  1. Skru korken på tett og feste tuben til en vortexer med en kort eller selvklebende tape. Vortex tube med maksimal hastighet for 10 min å lyse prøvene. Deretter sentrifuge prøven 16,100 x g i 5 min å skille de organiske løsemidlene fra den vandige fasen.
  2. Nøye fjerne 400-500 µL av vandige fasen uten å forstyrre den hvite, skyet interphase og legge den til en 15 mL konisk rør som inneholder 1,9 mL bindende bufferen. Bland dem godt av vortexing.
  3. Legg 1,25 mL av 100% etanol og bland utvalget av vortexing. Overføre 700 µL av utvalget til et filterelement samlet i en samling rør og spinne prøven 14.500 x g for 30 s. Gjenta til alle prøven overføres via patronen.
    Merk: på dette punktet, prøven kan bli litt ugjennomsiktig. Hvis for mange celler, ormer eller fluer var lysed, precipitates kan vises som kan tette opp filteret.
  4. Filteren vaskes en gang 700 µL av vaskeløsning 1, og to ganger med 500 µL av vaskeløsning 2 eller 3. Fullfør vasker ved å spinne prøvene 14.500 x g i 2 minutter å fjerne alle overflødig etanol.
  5. Overføre filterelementet slik 1,5 mL delfin og legge 108 µL prewarmed elueringsrør løsning (65 ° C).
    Merk: Utsett aldri RNA prøver å temperaturer høyere enn 65 ° C før en omvendt transkripsjon, som så vil provosere cytosine uracil deamination hendelser som er umulig å skille fra transkripsjon feil.
  6. Fornedre DNA forurensning i isolerte RNA (se trinn 2.1-3.4) ved å legge til 11 µL av 10 x DNase jeg buffer, 2 µL av RNase hemmer og 4 µL av DNase jeg (8 U), og Inkuber dem på 37 ° C i 30 min.
  7. Etter fordøyelsen, Legg 11 µL av DNase inaktivering reagensen. Virvle blandingen og la det sitte på RT i 5 minutter. Deretter sentrifuge prøven på 15.000 x g for 3 min pellets inaktivering reagensen og samle 110 µL nedbryting av uten å forstyrre pellet. Overføre nedbryting til en 1,5 mL tube.
    Merk: DNase inaktivering reagensen kan være ganske vanskelig å Pipetter riktig, så visuelt inspisere pipette spissen etter hver pipettering handling. Hvis inaktivering reagensen blir for viskøse til Pipetter, legge 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) lik 1/5 av gjenværende volumet.
  8. (Kvalitetsjekk) Måle konsentrasjonen av den totale bruker et spektrofotometer. Deretter satt 1 µL av totalt og fortynne den til en konsentrasjon av 10 ng/µL i nuclease-fri (NF) vann. Kjøre RNA på et passende nukleotid analyse instrument med en høy følsomhet RNA Tape for å sikre at RNA ikke er forringes og har en eRIN verdi på minst 8.5 eller høyere (figur 2B).

4. mRNA berikelse

  1. Utføre mRNA anriking med en mRNA miniprep kit (se Tabell for materiale). Legge til 140 µL av NF vann til utvalget for et totalt volum på 250 µL. Legg deretter til 250 µL av 2 x bindende buffer, bland prøven godt av vortexing og legge 15 µL av oligo (dT) perler.
  2. Bland utvalget av pipettering det opp og ned og ruge det på 65 ° C i 2 minutter. Deretter plass prøven på RT i 10 min. Endelig sentrifuge prøven 16,100 x g i 2 minutter til pellets perle: mRNA komplekser.
  3. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 500 µL av vaskeløsning. Overføre løsningen til en spinn kolonne og spinn for 1 min 15.000 x g. Forkaste gjennomflytsenhet og vask prøven med en ekstra 500 µL av vaskeløsning. Deretter spinne prøven i 2 minutter på 15.000 x g fjerne alle overflødig etanol fra spinn filtrene.
  4. Overføre spinn filteret slik delfin og resuspend pellet i kolonnen med 80 µL prewarmed elueringsrør løsning (65 ° C). Inkuber utvalget for 1,5 min på 65 ° C og elute det ved å spinne det for 1 min 15.000 x g.
  5. Måle konsentrasjonen av renset med et spektrofotometer eller et lignende verktøy som gir mulighet for kvantifisering av RNA konsentrasjonen og kvaliteten.

5. RNase III fragmentering og RNA rydde opp

Merk: (Viktig) å forberede sirkulær RNA molekyler passende for generering av C-seq biblioteker, RNA må være fragmentert til omtrent 60 – 80 baser i lengde. Mens tidligere metoder har brukt en kjemisk fragmentering til fragment RNA, introduserer kjemiske fragmentering med tungmetaller skader til RNA prøvene som kan feiltolkes som transkripsjon feil under den endelige analysen. For å omgå dette problemet, stole i stedet på en fragmentering bruker RNase III for å generere små fragmenter. En ekstra fordel av denne enzymatisk tilnærmingen er at det skaper kompatibel ender kreves for hemorroider, obviating behovet for en slutt-reparasjon etter kjemiske fragmentering.

  1. Definere RNA fragmentering reaksjon med 1 µg av renset, 10 µL reaksjon bufferen, 5 µL RNase III og nok NF vann for å bringe volumet til 100 µL (se Tabell for materiale). Legg enzymet sist og Pipetter blanding opp og ned minst 10 ganger for å blande. Inkuber prøven på 37 ° C for 25 min, som pleier å produsere RNA fragmenter av ca 60-80 baser i lengden.
  2. Når den 25 min inkubering er fullført, rydde opp reaksjon umiddelbart med en oligo opprydding og konsentrator utstyr (se Tabell for materiale) for å forhindre alle fremme fordøyelsen. Legge til 200 µL oligo-bindende bufferen til prøven, bland det godt av vortexing, og Legg til 800 µL av 100% etanol. Bland utvalget av vortexing og overføre den til en gitt spinn kolonne i en samling rør.
  3. Sentrifuge prøven på 10.000 x g for 30 s og vask det med 750 µL av vaskebuffer fjerne RNase III. Sentrifuge prøven på 10.000 x g for 30 s, forkaste gjennomflytsenhet og vaskes prøven igjen med 750 µL av vaskebuffer som beskrevet ovenfor. Etter andre gjennomflytsenhet er forkastet, sentrifuge kolonnen 15.000 x g i 2 minutter å fjerne alle overflødig etanol.
  4. Overføre kolonnen til en frisk 1,5 mL tube og elute prøven i 24 µL av NF vann ved å spinne det 10.000 x g for 1 min.
  5. Kvalitetskontroll: Ta 2 µL av renset RNA fragmenter og fortynne den 2-fold ved 2 µL av NF vann. Kjøre den fragmentert RNA på en skjerm tape å sikre at den fragmentert RNA er i størrelsesorden 50 – 100 baser i lengde (figur 2 c).

6. RNA Circularization og rullende sirkel omvendt transkripsjon

  1. For å circularize RNA fragmenter, varme-denature 20 µL av prøven ved 65 ° C i 1 min og plasser den på is umiddelbart 2 min. Deretter legge til 4 µL av 10 x T4 RNA ligase buffer, 4 µL av 10 mM ATP, 1 µL av RNase hemmer, 1 µL av NF vann og 8 µL av 50% polyetylenglykol (PEG).
  2. Bland prøven godt av vortexing, deretter legger 2 µL av 10 U/µL av T4 RNA Ligase I. prøven igjen av pipettering det og ruge det ved 25 ° C for 2t i en thermocycler med temperaturen på lokket satt til 30 ° C.
  3. Etter 2 h, legge 10 µL av NF vann til prøven og rydde opp utvalget med en oligo opprydding og konsentrasjon kit i henhold til produsentens spesifikasjoner. Elute prøven i 20 µL av NF vann.
  4. Tilbakeføre transkribere sirkulær RNA molekyler, legge 4 µL av 10 mM dNTPs, 4 µL av 50 ng/µL tilfeldig hexamers og 9 µL av NF vann til 9 µL av. Bland alt godt av pipettering denature prøven ved 65 ° C i 1 min og plassere den på is 2 min. lager den gjenværende RNA som back-up.
  5. 8 µL 5 x første-strand syntese bufferen, 2 µL 0,1 mm DTT og 4 µL av 200 U/µL revers transkriptase og bland alt av pipettering. Inkuber prøven ved 25 ° C i 10 min, etterfulgt av en 20 min incubation på 42 ° C med lokk satt på 5 ° C høyere enn inkubasjon temperaturen.
    Merk: En revers transkriptase strand forskyvning evner må brukes på dette trinnet for å tillate en rullende sirkel omvendt transkripsjon.
  6. Legg til 10 µL av NF vann til prøven og rydde opp i oligo opprydding og konsentrasjon Kit i henhold til produsentens anbefalinger. Elute prøven i 42 µL elueringsrør løsning.
  7. Kvalitetskontroll: Fortynne 2 µL av enkelt-strandet cDNA i 2 µL av NF vann og kjøre dette eksemplet på et nukleotid analyse instrument med en høy følsomhet RNA Tape. Hvis den omvendte Transkripsjonen arbeidet riktig, et bibliotek med cDNA molekyler, skal fra omtrent 60-1500 baser i lengde, vises. Ideelt sett er de fleste cDNA i området 500-1000 baser (figur 2d).

7. andre Strand cDNA syntese og slutten reparasjon

  1. Bruk en andre strand syntese kit til å generere en double-strandet cDNA bibliotek. Sett prøvene på is og legge 30 µL av NF vann til 38 µL av prøve. Deretter legge 8 µL av 10 x andre Strand Buffer og 4 µL av andre Strand enzym og blande utvalget av mild pipettering før sin inkubasjon ved 16 ° C i 2,5 t.
  2. Rydde opp prøvene med oligo opprydding og konsentrasjon utstyr i henhold til produsentens anbefalinger for 100 µL reaksjoner og elute eksemplene i 38 µL av NF vann.
  3. Definere slutten-reparasjon reaksjonen ved å legge til 20 µL av NF vann 35,5 µL av double-strandet cDNA, 6,5 µL slutten reparere reaksjon bufferen og 3 µL slutten Prep enzym mix. Nøye sjekk reaksjon bufferen for hvit precipitates og oppløse dem av hånd-oppvarming hvis den finnes.
  4. Bland slutten-reparasjon reaksjonen av pipettering og ruge det ved 20 ° C i 30 min, etterfulgt av en andre 30 min incubation på 65 ° C. Angi temperaturen på thermocycler lokket på 5 ° C høyere enn inkubasjon temperaturen.

8. kort ligatur og størrelse utvalg av forberedt biblioteker

  1. Bruk en flertrinns biblioteket forberedelse modul for siste biblioteket forberedelsene (se Tabell for materiale). Først fortynne adaptere for neste generasjons sekvensering 10-fold i 10 mM Tris-HCl å en final konsentrasjon på 1,5 µM. Deretter legge til 2,5 µL utvannet adapter og 1 µL av hemorroider enhancer hvert utvalg og bland dem ved vortexing.
  2. Legge til 15 µL Blunt/TA Ligase Master mix, bland det av pipettering og ruge det ved 20 ° C i 15 min. Deretter legge 3 µL av uracil-spesifikke excision reagens enzym og ruge det på 37 ° C i 15 min. Når ligation er fullført, legge til 13,5 µL av NF vann til utvalget for et totalt volum på 100 µL og videre til størrelse utvalget.
    Merk: Det er best å-Velg for cDNA molekyler som er i området 600-800 baser i lengden. Hvis fragmentert RNA molekyler var ca 60 – 80 baser i lengde, velger for molekyler som er 600-800 baser i lengden vil sikre at de fleste av de valgte molekylene inneholde minst tre tandem gjentas, som er ideelt for nedstrøms behandling og analyse.
  3. For å velge for molekyler som er 600-800 bp i lengde, kan du legge til 30 µL av resuspended magnetiske perler (se Tabell for materiale), acclimated til RT, hver og blande av pipettering. Overføre prøven til en 1,5 mL tube og ruge det på RT i 5 min.
  4. Plass prøven på magnetiske standpunkt for 5 min å skille perler fra nedbryting. Overføre nedbryting (som inneholder ønsket cDNA molekylene) å en ny 1,5 mL tube og kast de magnetiske perlene (som er bundet til store cDNA molekyler).
  5. Legg en fersk aliquot av 15 µL av magnetiske perler til hver prøver, bland godt av pipettering, og ruge i 5 min på rett sted eksemplene på en magnetisk rack og ruge dem i 5 min på RT. Deretter forsiktig fjerne og kast supernatants, sørge for ikke å forstyrre perler.
    Merk: Ikke kast de magnetiske perlene, som nå inneholder ønsket mål cDNA.
  6. Legge til 200 µL av 80% nylagde etanol til hver av prøvene uten å forstyrre pelleted magnetiske perler og ruge for 30 s. kast etanol og vaske prøver igjen med 80% etanol. Deretter helt fjerne alle spor av etanol fra prøvene og air-dry perler i 5 min men vær forsiktig med å over tørr perler. Hvis perlene er overdried, vises sprekker i pellets.
  7. For å elute prøvene fra perler, fjerne rørene fra magnetiske stativet og legge til 19 µL av 10 mM Tris-HCl. Pipetter den opp og ned flere ganger til resuspended perler og ruge prøvene i 5 min på RT. Hvis perlene var overdried, ruge dem for > 10 min.
  8. Sett prøvene tilbake på magnetiske stand og ruge dem for 5 min å skille perler fra nedbryting. Nøye fjerne 15 µL av nedbryting som inneholder renset, størrelse-valgt cDNA bibliotekene fra rørene og overføre den til en frisk 1,5 mL tube.

9. PCR forsterkning og siste perle rensing

  1. Legge til 5 µL av universell primer og 5 µL av en unik indeks primer (se tabell of Materials) til hver renset cDNA bibliotek og bland dem godt av pipettering. Nøye sjekk polymerase master mix krystaller og andre precipitates og varme master mix for hånd til precipitates oppløse.
    1. Legge til 25 µL av polymerase master mix å prøven, bland dem av pipettering og følge sykling betingelsene nedenfor for PCR forsterkning. Kjøre den første rødsprit 98 ° C for 30 s, og deretter utføre en dobbel trinnvis PCR reaksjon denaturating prøvene på 98 ° C for 10 s og avspenning/filtypen PCR produktene 65 ° C for 75 s (12 x), etterfulgt av en siste utvidelse ved 65 ° C i 5 min og en ubestemt holder på 4 ° C.
  2. Rydde opp siste bibliotekene ved å legge til 45 µL av resuspended magnetiske perler direkte til PCR reaksjonen, bland dem av pipettering, og ruge på RT for 5 min. overføring prøve å en 1,5 mL tube og legg den i en magnetisk stand. Inkuber det etter 5 min, forkaste nedbryting og vaske det to ganger med nylagede 80% etanol for 30 s.
  3. Etter andre vask, fullt fjerne etanol fra utvalget, og air-dry perle pellet i 5 min og elute det i 35 µL av 0,1 x TE. Resuspend perler av pipettering dem og ruge dem på RT for 5 min. sted prøven på magnetiske stand, og etter 5 min, overføre 30 µL nedbryting av til en frisk 1,5 mL tube. Lagre bibliotekene på-80 ° C.
  4. Kvalitetskontroll: Fortynne 1 µL av siste biblioteket i 9 µL av NF vann og kjøre eksempelet på en dedikert DNA analyse instrument med høy følsomhet chip; fleste cDNA bør være i området 600-800 bp i lengde (figur 2e).
  5. Etter tilsettes, sende prøvene sekvensering på en massivt parallelle sekvenser plattform med 250 bp sammen-end leser eller 300 bp single-end leser.

10. bio-informatic analyse av sirkelen sekvensering Data

Merk: Analysere og tolke rådata fra C-seq analysen krever en egen bio-informatic rørledning. En skjematisk som ble brukt for våre analyser røret er avbildet i Figur 3. Last ned denne rørledningen på https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. Først trimme lest å fjerne kortet sekvenser og lav kvalitet base samtaler med cutadapt18, bruker en kvalitet score grense på 20.
  2. Deretter identifisere gjentakelser kodet av concatemerized RNA molekylet bruker en passende algoritme for å oppdage noen gjentar med en minimum størrelse på 30 nukleotider og maksimalt 2 uoverensstemmelser mellom gjentar18. Utlede en konsensus sekvens fra disse gjentar og holde oversikt over alle base samtaler og tilknyttede kvalitetspoeng på hver posisjon.
    Merk: Fordi omvendt transkripsjon kan starte på enhver posisjon på circularized RNA molekylet, starten av en gjenta ikke nødvendigvis tilsvarer 5 '-slutten av fragmentert RNA molekylet (heretter referert til som ligation). Følgelig tilordnes konsensus sekvensen ikke kontinuerlig mot den tilsvarende transcriptome, som nødvendiggjør identifikasjon av hemorroider poenget.
  3. For å identifisere ligation punktet, kan du tilordne en concatemer av konsensus sekvensen mot referanse transcriptome bruker BLAST-lignende justering verktøyet (BLAT)19.
    1. Sette sammen to forekomster av konsensus sekvensen slik at den tilordnede rekkefølgen inneholder minst én full uavbrutt forekomst av første RNA fragment sekvensen. Drei så konsensus sekvensen starte spådd ligation punkt der.
  4. Tilordne rotert konsensus sekvensene mot genomet bruker TopHat20 og bruke justeringer for å oppdage alle single nukleotid (SNPer) som kan forveksles med transkripsjon feil.
  5. Ringe transkripsjon feil fra tilordnede rotert konsensus sekvenser og teste om kandidaten feilene passere fire ytterligere tester.
    1. Forsikre deg om at en transkripsjon feil ikke overlapper med en SNP (et vanlig krav er at minst 20 leser må dekke en bestemt base og mer enn 5% av lest kan støtte en alternativ base samtale).
    2. Andre, sjekk at konsensus sekvensen er avledet fra minst 3 tandem gjentas, hver kaller samme base par; og for det tredje, sørg for at summen av kvalitetspoengene til den posisjonen må være over 100.
  6. For en fjerde og siste sjekk, rotere konsensus rekkefølgen alle mulige kombinasjoner (simulere alle mulige posisjoner av hemorroider punkt) og tilordne hver versjon mot referanse genomet bruker TopHat.
    Merk: Hvis en av rotert sekvensene finner en perfekt match i genomet, tilsvarende ligation poenget er nå behandlet riktig og transkripsjon feil samtalen bør være avvist.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som alle massivt parallelle sekvenser tilnærminger produserer hvert C-seq eksperiment et uhåndterlig, store datasett. For førstegangsbrukere, kan det være vanskelig å håndtere disse datasett; Det anbefales derfor at alle brukere kontakte en erfaren bio-informatiker før eksperimentering. Gjennomsnittlig er forventningen at brukere vil generere ca 55-70 Giga baser (Gbases) per kjørt på de fleste massivt parallelle sekvenser plattformer. For denne protokollen, vanligvis var 12-30 prøvene multiplekset per kjørt slik at for hver prøve ca 2-6 Gbases ble anskaffet. Etter trimming den adapter sekvenser og lav kvalitet base samtaler (< 20) fra dataset, forble ~ 70% av første datastørrelsen.

Disse baser deretter analysert videre for å undersøke effektiviteten av RNA fragmentering og circularization ved å bestemme størrelsen på gjentakelser som ble generert. De fleste gjentar pleier å være 45-80 baser i lengde (figur 4A) og ca 50% av baser som ble sekvensert er en del av disse gjentar (figur 4B). Siden de fleste av disse basene finnes i leser som inneholder er 3 ganger eller mer, antall unike baser som er i rekkefølge om lag en tredel av antall baser sekvensielt. Gjennomsnittlig > 75% av disse konsensus sekvenser kan spores tilbake til referanse genomet. Til slutt, ca 25% av disse basene omfattes av 20 leser eller mer, som til slutt betyr at ca 10% dataene kan brukes for feilsøking. Et eksempel på denne analysen er gitt i Figur 4, som representerer sekvensering informasjonen som ble kjøpt i løpet av denne protokollen for 1 gjenskape et enkelt C-seq-bibliotek som ble sekvensert relativt lav og representerer lavere begrensning på dataene som brukerne kan forvente å få.

Ca 5000-25,000 feil per kjørt pleier å bli identifisert, selv om disse tallene kan variere betydelig avhengig feil selv (jo høyere feilrate, mer feilene vil bli oppdaget), størrelsen på transcriptome (større den transcriptome, færre baser vil bli dekket av 20 leser, begrense sekvensering data som kan brukes til feilsøking), og dybden som har et sekvensielt (dypere sekvensering vil gjøre det mer sannsynlig at en gitt base vil bli dekket av 20 leser eller mer). Disse feilene har tendens til fordeles over hele genomet, slik at gjennomsnittlig ~ 47% av feilene ligger i mRNA molekyler generert av RNA polymerase II (RNAP II), ~ 49% ligger i rRNA molekyler generert av RNAP jeg, og de resterende ~ 3% ligger i RNAs generert av RNAP III og mitokondrie RNA polymerase. Men kan disse forholdene variere betydelig avhengig av celle type eller organisme under etterforskning (figur 4C). For eksempel inneholder celletyper som avhengige mitokondrie funksjon, for eksempel cardiomyocytes, betydelig mer mitokondrie RNA enn andre celletyper, sterkt økende antall mitokondrie RNA molekyler som er i rekkefølge, og dermed hvor feil funnet.

Når en liste over feil er utarbeidet, og deres steder i genomet er kjent, kan disse feilene brukes til å identifisere parametere som styrer feilrate transkripsjon i hver organisme. For eksempel kan plasseringen av feilene transkripsjon samsvares med en rekke funksjoner i genomet, slik som tilstedeværelsen av DNA gjentar, bestemt genetisk sammenhenger eller uttrykk ofte, å forstå hvordan disse funksjonene endre gjengivelsen av transkripsjon5. Forventningen er at i fremtiden, men brukere kan avgjøre hvor utallige tilleggsfunksjoner påvirker transcriptional gjengivelse, inkludert epigenetic markører, 3D organisasjonen av Genova, Nærings tilgjengelighet, alder eller eksponering for giftige forbindelser å belyse bidrag av genetiske og miljømessige faktorer til gjengivelsen av transkripsjon.

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av RNA-seq versus C-seq. (A) tradisjonelle RNA-seq eksperimenter isolere RNA fra et utvalg av interesse, fragmenter av RNA og revers transkribere før siste biblioteket forberedelse og sekvenser. Men introdusere disse forberedelse prosedyrer mange tekniske gjenstander inn i biblioteket i form av omvendt transkripsjon feil, PCR forsterkning feil og sekvensering feil. (B) denne optimalisert C-seq analysen gir korreksjon av disse tekniske gjenstander av circularizing fragmentert RNA molekyler før omvendt transkripsjon, som tillater dem å bli omvendt transkribert i en rullende sirkel måte å produsere lineær cDNA molekyler som inneholder flere kopier av den opprinnelige RNA malen i tandem gjenta. Disse tandem gjentar kan deretter brukes til å skille ekte transkripsjon feil fra gjenstander, som sanne transkripsjon feil (stjerne) vil være tilstede i alle rapportene på samme sted, mens gjenstander som reverse transkripsjon feil (torget) og PCR forsterkning feil (sirkel) finnes bare i én eller to ganger i et gitt cDNA molekyl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: representant resultater for biblioteket forberedelse. Disse panelene viser en electrophoretogram for (A) en høy følsomhet RNA skjermen båndet stigen (se Tabell for materiale), (B) totalen RNA renset fra Saccharomyces cerevisiae, (C) RNase III-fragmentert RNA og) D) rullende sirkel omvendt-transkribert cDNA. (E) endelige størrelse valgt cDNA biblioteket kjører på en høy følsomhet double-strandet DNA analyse brikke (se Tabell for materiale). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: skjematisk av bio-informatic rørledningen brukes til å analysere sirkel sekvensering data. Etter trimming den sekvensering lest, gjentar identifiseres, og en konsensus sekvens genereres ved hjelp av passende base kall på en gitt plassering. Deretter hemorroider utgangspunktet malen for første RNA identifiseres og konsensus sekvensen er justert til referanse genomet slik at potensielle transkripsjon feil kan identifiseres. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: eksempel på resultater for C-Seq rørledning. (A) dette panelet viser størrelsesDistribusjon av konsensus sekvensene innhentet fra et typisk C-Seq-eksperiment. (B) dette panelet viser antall baser, leser og prosentandel av sekvensert i hvert trinn av C-Seq bioinformatikk rørledningen. (C) dette panelet viser antall transkripsjon feil oppdaget og prosentandelen av feil tilskrevet RNA polymerase jeg, RNA polymerase II, RNA polymerase III og mitokondrie RNA polymerase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her beskriver vi en optimalisert protokoll for utarbeidelse av C-seq biblioteker for påvisning av transkripsjon feil i Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogasterog Caenorhabditis elegans. Denne protokollen har mange fordeler over eksisterende protokoller, samt alternative teknikker.

De siste 15 årene, har mange reporter systemer utviklet som bruker luciferase7,8 eller grobunn-Lox rekombinasjon3,4,15,21 å oppdage transkripsjon feil. Disse reporter systemene har vært uvurderlig for forskernes forståelse av transcriptional gjengivelse fordi de lov gener, alleler og molekylære mekanismer identifiseres som regulerer direkte gjengivelsen av transkripsjon. Men rapporterer de bare om feil kunstig skadet maler eller i svært spesifikke genetisk sammenhenger, som begrenser vitenskapelige spørsmålene de kan svare. En viktig fordel av C-seq-protokollen er at den overvåker gjengivelsen av transkripsjon gjennom hele transcriptome5, sterkt ekspanderende vitenskapelig kunnskap om nøyaktigheten som uttrykkes genetisk informasjon. Dernest fordi C-seq analysen benytter RNA som sin kildemateriale, er det sannsynlig at denne analysen kan tilpasses enhver organisme valgfrihet, obviating behovet for å generere komplisert reporter konstruksjoner for hver transgene modell. Denne protokollen har også fordelene over eksisterende massivt parallelle sekvenser tilnærminger17,22. Mest spesielt, de fleste av disse metodene gjør bruk av tungmetaller til fragment RNA biblioteker. Men innføre metodene fragmentering gjenstander i RNA som er utvisket fra sant transkripsjon feil5. For å oppklare denne problem, denne protokollen fragmenter RNA enzymatisk med RNase III, som har den ekstra fordelen at det går kompatibel ender for selv hemorroider, sterkt forenkle RNA circularization og øke sensitiviteten av analysen ~ 10 ganger.

Samtidig har C-seq analysen sin egen del av begrensninger. Først, selv om analysen måler transkripsjon feil gjennom hele genomet, en stor del av dataene til å være avledet fra gener som uttrykkes høyt, som utskrifter fra disse genene pleier å dominere de fleste RNA biblioteker. En annen faktor som forskjøvet analyse mot svært uttrykt gener er terskelen innebygd i bio-informatic rørledningen som hindrer genetiske mutasjoner og RNA redigere hendelser fra confounding endelige målene. Denne terskelen tilsier at bare baser som ble sekvensert 20 ganger eller mer kan brukes for den endelige analysen. En andre begrensning gjelder biblioteket mangfold. Som de fleste kits brukes for RNA utvinning, kit her ikke effektivt renser små RNA molekyler, som begrenser antall leseoperasjoner fra molekyler syntetisert av RNAP III. Mangfoldet av siste sekvensering biblioteket er ytterligere begrenset av mRNA rensing trinnet ansatt her. Selv om molekyler generert av RNAP jeg kan være effektivt sekvensert, de fleste av de gjenværende mitokondrie RNAs, tRNAs og ikke-koding RNAs går tapt under dette trinnet. Å ta disse molekylene mer ofte en annen kit som renser spesielt små RNA molekyler skal brukes, eller celletyper bør målrettes som er beriket for disse molekyler. Vær imidlertid oppmerksom på at de fleste av disse problemene kan løses av sekvensering dypere enn vanlig eller samtidig sekvensering DNA fra de samme cellene, selv om begge disse løsningene krever en større finansielle investeringer av etterforskerne.

I tillegg er fremtidige teknologiske utviklingen klar til å forbedre C-seq analysen på et grunnleggende nivå. For eksempel ved å utvide lese-lengden på eksisterende sekvensering teknologi, vil det være mulig å sekvens lengre molekyler, som betyr at flere gjentakelser kan brukes til å fastslå gjengivelsen av transkripsjon. Slike forbedringer vil automatisk resultere i en større sekvensering dybde og en økning i prosentandelen av lyder som kan brukes til nedstrøms. En lignende argument kan gjøres for noen sekvensering teknologi som tillater mer molekyler som ble sekvensert parallelt. I tillegg gjenstår mange komponenter til C-seq analysen å være optimalisert, inkludert effektiviteten av RNA circularization stringens av størrelse og tidkrevende natur analysen selv. Til slutt, det anbefales sterkt at alle brukere få tilgang til en dedikert, høy følsomhet verktøy for nukleinsyre analyse og potensielle feilsøking (se Tabell for materiale). Uten dette verktøyet, kan det være svært vanskelig å bestemme på hvilket punkt potensielle problemer oppstår, og dermed gjør dem umulig å løse.

Selv om hele protokollen er ganske ugjestmilde (liten feil pleier å ha betydelige konsekvenser), er det flere trinn som er helt avgjørende for suksessen til C-seq analysen. En av de viktigste kravene er at den isolerte RNA behandles så forsiktig som mulig. De fleste RNA utvinning metoder og nedstrøms behandling kits bryr lite om den kjemiske sammensetningen av RNA utover grunnleggende industristandarder, som er tilstrekkelig for de fleste molekylær analyser. C-seq analysen bør imidlertid identifisere en enkelt transkripsjon feil blant hundretusener av WT baser, sterkt økende behovet for å redusere molekylær stress. Med stress som påvirker bare 1 av 10.000 baser kan introdusere gjenstander som fullstendig opphever resultatene. For eksempel brukere må aldri unngå/grense utsette RNA noen temperatur over 65 ° C. Dernest må hver bruker nøye optimaliserer tiden som kreves for RNA fragmentering med RNase III. Det er helt avgjørende for suksessen til analysen at siste molekylene er ca 60 – 80 baser i lengden. Kortere molekyler kan være vanskelig å tilordne til genomet, og lengre molekyler tillater ikke for 3 uavhengige gjentakelser som ble sekvensert i 250 bp lese. Til slutt, det anbefales ikke å fryse og tine RNA flere ganger under hele protokollen. I stedet, isolere RNA og syntetisere cDNA på en enkelt dag. På grunn av tid og krefter involvert med denne forpliktelsen, kompleksiteten i protokollen, og antall utdrag som ofte behandlet samtidig, anbefales det at to etterforskere samarbeider for å generere disse bibliotekene.

Når vellykket, vil disse eksperimentene gjøre det mulig å nøyaktig oppdage transkripsjon feil i enhver organisme, under noen eksperimentelle tilstand. For eksempel ved å sammenligne kontroll og syke individer til hverandre, kan det være mulig å avgjøre om visse sykdommer er assosiert med transkripsjon feil, som kan avsløre en ny komponent i etiologien for mange menneskelige patologi. Andre parametere som kan bli undersøkt er organismebiologi aldring, ernæring, genotype og miljømessige faktorer som eksponering for giftige kjemikalier. Videre, fordi denne analysen oppdager transkripsjon feil gjennom transcriptome, det vil tillate forskere å analysere de forskjellige mekanismene som bidrar til gjengivelsen av RNA polymerase jeg, II og III, samt mitokondrie RNA polymerase. Følgelig, vi forventer at denne protokollen vil åpne opp et nytt felt av mutagenese til omfattende eksperimentering, preget av studiet av mutasjoner i RNA ikke i DNA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Denne publikasjonen ble gjort mulig med midler fra grant T32ES019851 (til C. Fritsch), gi R01AG054641 og AFAR unge etterforsker (til M. Vermulst).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kireeva, M. L., et al. Transient reversal of RNA polymerase II active site closing controls fidelity of transcription elongation. Molecular Cell. 30, 557-566 (2008).
  2. Walmacq, C., et al. Rpb9 subunit controls transcription fidelity by delaying NTP sequestration in RNA polymerase II. The Journal of Biological Chemistry. 284, 19601-19612 (2009).
  3. Strathern, J., et al. The fidelity of transcription: RPB1 (RPO21) mutations that increase transcriptional slippage in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2689-2699 (2013).
  4. Irvin, J. D., et al. A genetic assay for transcription errors reveals multilayer control of RNA polymerase II fidelity. PLoS Genetics. 10, e1004532 (2014).
  5. Gout, J. F., et al. The landscape of transcription errors in eukaryotic cells. Science Advances. 3, e1701484 (2017).
  6. Gout, J. F., Thomas, W. K., Smith, Z., Okamoto, K., Lynch, M. Large-scale detection of in vivo transcription errors. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 110, 18584-18589 (2013).
  7. Viswanathan, A., You, H. J., Doetsch, P. W. Phenotypic change caused by transcriptional bypass of uracil in nondividing cells. Science. 284, 159-162 (1999).
  8. Bregeon, D., Doddridge, Z. A., You, H. J., Weiss, B., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis induced by uracil and 8-oxoguanine in Escherichia coli. Molecular Cell. 12, 959-970 (2003).
  9. Saxowsky, T. T., Doetsch, P. W. RNA polymerase encounters with DNA damage: transcription-coupled repair or transcriptional mutagenesis. Chemical Reviews. 106, 474-488 (2006).
  10. Saxowsky, T. T., Meadows, K. L., Klungland, A., Doetsch, P. W. 8-Oxoguanine-mediated transcriptional mutagenesis causes Ras activation in mammalian cells. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 105, 18877-18882 (2008).
  11. Vermulst, M., et al. Transcription errors induce proteotoxic stress and shorten cellular lifespan. Nature Communications. 6, 8065 (2015).
  12. van Leeuwen, F. W., Burbach, J. P., Hol, E. M. Mutations in RNA: a first example of molecular misreading in Alzheimer's disease. Trends in Neurosciences. 21, 331-335 (1998).
  13. van Leeuwen, F. W., et al. Frameshift mutants of beta amyloid precursor protein and ubiquitin-B in Alzheimer's and Down patients. Science. 279, 242-247 (1998).
  14. Morreall, J. F., Petrova, L., Doetsch, P. W. Transcriptional mutagenesis and its potential roles in the etiology of cancer and bacterial antibiotic resistance. Journal of Cellular Physiology. 228, 2257-2261 (2013).
  15. Strathern, J. N., Jin, D. J., Court, D. L., Kashlev, M. Isolation and characterization of transcription fidelity mutants. Biochimica et Biophysica Acta. 1819, 694-699 (2012).
  16. Acevedo, A., Andino, R. Library preparation for highly accurate population sequencing of RNA viruses. Nature Protocols. 9, 1760-1769 (2014).
  17. Traverse, C. C., Ochman, H. Genome-Wide Spectra of Transcription Insertions and Deletions Reveal That Slippage Depends on RNA:DNA Hybrid Complementarity. mBio. 8, (2017).
  18. Martin, M. Cutadapt Removes Adapter Sequences From High-Throughput Sequencing Reads. EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).
  19. Kent, W. J. BLAT--the BLAST-like alignment tool. Genome Research. 12, 656-664 (2002).
  20. Kim, D., et al. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biology. 14, R36 (2013).
  21. Zhou, Y. N., et al. Isolation and characterization of RNA polymerase rpoB mutations that alter transcription slippage during elongation in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 288, 2700-2710 (2013).
  22. Reid-Bayliss, K. S., Loeb, L. A. Accurate RNA consensus sequencing for high-fidelity detection of transcriptional mutagenesis-induced epimutations. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 114, 9415-9420 (2017).

Tags

Genetikk problemet 139 genetisk prosesser genekspresjon transkripsjon genetiske omvendt transkripsjon Transcriptome mutagenese aminosyre substitusjon fenomener og prosesser genetisk fenomener mutagenese transkripsjon RNA-Seq S. cerevisiae C. elegans D. melanogaster sekvensering RNA polymerase feil
Genomet hele overvåking av transkripsjon feil i eukaryote organismer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fritsch, C., Gout, J. F. P.,… More

Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter