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Genetics

Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas

Published: September 13, 2018 doi: 10.3791/57731
Automatic Translation
1,2, 3,4, 1
1Center for Mitochondrial and Epigenomic Medicine, Children's Hospital of Philadelphia, 2Department of Cellular and Molecular Biology, University of Pennsylvania, 3Department of Biological Sciences, Mississippi State University, 4Center for Mechanisms of Evolution, Biodesign Institute, Arizona State University

Summary

Este protocolo ofrece a los investigadores una nueva herramienta para controlar la fidelidad de la transcripción en organismos modelo múltiples.

Abstract

Transcripción exacta es necesaria para la expresión fiel de la información genética. Sorprendentemente sin embargo, poco se sabe sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción. Para llenar este vacío en los conocimientos científicos, hemos optimizado recientemente el análisis de secuenciación del círculo para detectar errores de transcripción en el transcriptoma de Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis de elegans de. Este protocolo proporcionará a los investigadores una poderosa nueva herramienta para el paisaje de errores de transcripción en las células eucariotas por lo que los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción pueden ser aclados en detalle sin precedentes.

Introduction

El genoma proporciona un preciso plan biológico de la vida. Para implementar correctamente este anteproyecto, es importante que el genoma se transcribe con gran precisión. Sin embargo, la transcripción es poco probable que sea libre de errores. Por ejemplo, ARN Polimerasas durante mucho tiempo se han sabido para ser propenso en vitro1,2, y fue demostrado recientemente que cometen errores en vivo 3,5,6, así particularmente cuando se enfrenta con ADN daños7,8,9,10. Tomados en conjunto, estas observaciones indican que errores de transcripción se producen continuamente en todas las células vivas, sugiriendo que podría ser una fuente potente de proteínas mutadas.

Este proceso, llamado mutagénesis transcripcional, difiere de la mutagénesis clásica de dos maneras. En primer lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción afectan las células mitotic y poste-mitotic, como no dependen de la replicación del ADN. Estudio de los mecanismos que afectan a la fidelidad de la transcripción, por lo tanto, proporcionará información valiosa sobre la carga de mutación de las células mitotic y poste-mitotic. Curiosamente, errores de transcripción recientemente han sido implicados en la promoción de la agregación de proteína11,12,13 y presumidos para contribuir a ambas de la carcinogénesis10 y el desarrollo de resistencia antibiótica en bacterias14.

En segundo lugar, en contraste con las mutaciones genéticas, errores de transcripción son transitorias en la naturaleza. Su existencia temporal es particularmente desafiante ya que hace sumamente difícil detectar errores de transcripción. Por ejemplo, mientras que varios laboratorios han ideado ensayos reportero valiosa para el estudio de mutagénesis transcripcional, estos ensayos sólo son capaces de medir los errores de transcripción en un número limitado de contextos y modelo organismos4,15. Para superar estas limitaciones, muchos investigadores han recurrido a la tecnología de la secuenciación del RNA (RNA-seq), que teóricamente permite errores de transcripción que se registrará en el transcriptoma de cualquier especie. Sin embargo, estos estudios son fácilmente confundidos por artefactos de construcción de biblioteca, tales como errores de transcripción inversa, PCR amplificación errores y lo errores de la secuencia sí mismo. Por ejemplo, reverso transcriptasas cometer un error de aproximadamente cada bases ~ 20.000, mientras que ARN Polimerasas (RNAPs) se esperan que sólo un error cada 300.000 bases5,6. Porque la tasa de error de transcripción reversa solo empequeñece la tasa de error de Polimerasas del RNA dentro de las células, es prácticamente imposible distinguir entre errores de transcripción verdadero artefactos causados por la preparación de la biblioteca en datos tradicionales de RNA-Seq ( Figura 1a).

Para resolver este problema, hemos desarrollado una versión optimizada de la secuenciación del círculo (Cirseq, o C-seq en adelante) ensayo5,16. Este ensayo permite detectar errores de transcripción y otras variantes raras en RNA en el transcriptoma5. El análisis de secuencia circular lleva este nombre porque un paso clave en este ensayo gira en torno a circularización de RNA. Una vez que los objetivos de RNA son circular, son revés transcrito de manera círculo rodante, para producir moléculas de cDNA lineal que contienen numerosas copias de la misma plantilla del RNA. Si un error estuvo presente en una de estas plantillas, este error también estaría presente en cada repetición única dentro de la molécula de cDNA. En cambio, errores introducidos por transcripción reversa y amplificación por PCR secuenciación tienden a surgir al azar y así estará presentes en sólo una o dos repeticiones. Por lo tanto, generando una secuencia de consenso para cada molécula de ADNc y distinguir errores aleatorios de los errores que se producen en todas las repeticiones, artefactos de construcción de biblioteca con eficacia pueden ser separados de los errores de transcripción verdadera (Figura 1b).

Si se utiliza correctamente, puede utilizarse el ensayo C-seq para detectar con precisión la tasa de base sustituciones, inserciones y eliminaciones en el ARN en el transcriptoma de cualquier especie (por ejemplo, véase travesía y Ochman17). Por ejemplo, hemos utilizado el ensayo C-seq para proporcionar mediciones de todo el genoma de la tasa de error de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans con una única resolución base5 (inéditas observaciones). Originalmente utilizado para exactamente la secuencia de las poblaciones de virus de ARN, esta versión optimizada del ensayo C-seq ha racionalizado para reducir al mínimo las agresiones durante la preparación de la biblioteca que contribuyen a los artefactos de construcción de biblioteca. Además, mediante el uso de un número de kits disponibles en el mercado, el rendimiento de la prueba se mejora, así como su facilidad de uso. Si se usa correctamente, este análisis pueden detectar con precisión miles de errores de transcripción por repetición, de tal modo grandemente mejorando en anteriores estudios6. En general, este método proporciona una poderosa herramienta para el estudio de mutagénesis transcripcional y permitirá al usuario obtener nuevos conocimientos sobre los mecanismos que controlan la fidelidad de la transcripción en una amplia gama de organismos.

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Protocol

1. preparación

  1. RNasas son omnipresentes; por lo tanto, limpie el área de trabajo bien por aspersión abajo con un reactivo de descontaminación (por ejemplo, ARNasa lejos) y etanol al 70%. Aerosol hacia abajo cualquier pipetas, plumas o gradillas para eliminar posibles fuentes de contaminación de Rnasa.
  2. Para evitar más RNasas contaminen las muestras, usar una bata o camiseta de manga larga durante la experimentación. Evite el contacto entre los guantes y el interior de cualquier tubo que se utilizará, sobre todo cuando de recuperar de una caja o bolsa.
  3. Antes de la transcripción inversa, cambiar guantes con frecuencia.
    Nota: Para obtener resultados óptimos, no hacer una pausa en el experimento antes de la transcripción inversa.

2. célula y cultura Animal y colección

  1. Colección y el crecimiento de saccharomyces cerevisiae
    1. Si se desea una biblioteca C-seq de la levadura, primero inocular una sola Colonia de S. cerevisiae en 3 mL de medio Extracto de levadura que contiene, adenina, peptona y dextrosa (YAPD) e incubar durante una noche a 30 ° C en un tambor rodante.
    2. En la mañana, volver a sembrar la cultura en 50 mL de medio YAPD a una densidad óptica (OD) de 0.1 y crecen las células hasta llegar a un OD de 0,5 – 0,7 (~ 7 x 106 células/mL).
    3. Recoger la cultura entera 50 mL (aproximadamente 350 x 106 células) en un tubo cónico de 50 mL y centrifugar las células abajo por 3 min a x 2.100 g. Cuidadosamente retire el medio YAPD y lavar el precipitado una vez con PBS 1 x.
    4. Entonces, Resuspender el precipitado en 480 μl de tampón de lisis, 48 μl de SDS 10% y 480 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol (25:24:1), pH 6,8. Vórtice de la muestra a velocidad máxima durante 5 s y la transferencia a un tapón de rosca de 1.5 mL tubo con 750 μl de granos del zirconia helada (suministrado con el kit). Proceda al paso 3 de este protocolo para la lisis celular y extracción de RNA total.
      Nota: Todos los reactivos necesarios para paso 2.1.4 se proporcionan en el kit de extracción de RNA la levadura recomendada. Estos reactivos funcionan igual para levaduras, gusanos y moscas para que después de la colección de la levadura (paso 2.1), gusanos (paso 2.2) o moscas (paso 2.3), un enfoque unificado permite generar bibliotecas de C-seq (pasos 3 – 10).
  2. Cultura de Caenorhabditis elegans y colección
    1. Si se desea una biblioteca C-seq de gusanos, depositar 30 lombrices adultas sobre una placa fresca de agar manchado con OP50 bacterias.
      Nota: Las placas de cinco son suficientes para 1 repetición.
    2. Cultura los gusanos durante 4 días y recoger los gusanos lavando suavemente las placas con 5 mL de medio M9 y los gusanos en un tubo cónico de 50 mL solo de la piscina.
    3. Girar los gusanos abajo a 100 x g durante 2 min crear una pelotilla. Desacelerar la centrifugadora a la menor velocidad posible, para no perturbar el sedimento.
    4. Suavemente mueva los gusanos en un tubo de 1,5 mL, lavar dos veces en 1,5 mL de medio M9 y centrifugar el tubo a 100 x g durante 1 min eliminar las bacterias y generar una limpieza 100 pellets μl de gusanos.
    5. Resuspender los gusanos en 480 μl de tampón de lisis, 48 μl de SDS 10% y 480 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol. Vórtice de la muestra a la máxima velocidad para 5 s y la transferencia a un tapón de rosca de 1.5 mL tubo conteniendo 750 μl de granos zirconia helada. Proceda al paso 3 de este protocolo para la lisis de los gusanos y la extracción de RNA total.
  3. Recolección y cultivo de drosophila melanogaster
    1. Si se desea una biblioteca C-seq de moscas, moscas de 20 – 25 en viales que contienen dextrosa o un medio basado en melaza de la cultura. Alícuota las moscas sobre los 3 frascos, para que cada frasco contiene aproximadamente 8 moscas.
    2. Para recoger las moscas, coloque el frasco en un cubo de hielo hasta que las moscas son sedadas. Entonces, les recogen con un cepillo en un tubo de 1,5 mL. No recoja las moscas por el tratamiento de CO2 .
    3. Deje que las moscas calientes a la temperatura ambiente (RT) y añadir rápidamente una mezcla premade de 500 μl de tampón de lisis 50 μl de SDS 10% y 500 μl de fenol: cloroformo: isoamílico alcohol al tubo. Utilice un micropestle para moler encima de las moscas con aproximadamente 15 golpes, acompañados por una firma de torsión movimiento cuando la mano alcanza la parte inferior del tubo.
    4. Vierta la mezcla de las moscas y medios de lisis en un tapón de rosca de 1.5 mL del tubo que contiene 750 μl de granos de zirconia helada y de vortex a máxima velocidad por 5 s. proceder al paso 3 de este protocolo para la lisis de las moscas y la extracción de RNA total.

3 purificación del ARN total

Nota: en este punto, todos los tres protocolos convergen, y un enfoque único y unificado permite generar bibliotecas de C-seq.

  1. Enrosque firmemente el tapón y conectar el tubo en un Vortex con un adaptador o cinta adhesiva. Vórtice el tubo a máxima velocidad por 10 min a lyse las muestras. Luego, centrifugar la muestra a 16.100 x g durante 5 min separar los solventes orgánicos de la fase acuosa.
  2. Cuidadosamente retire 400 – 500 μl de la fase acuosa sin alterar la interfase blanca, turbia y añadir a un tubo cónico de 15 mL 1,9 ml de tampón de Unión. Mezclar bien todo con un vórtex.
  3. Añadir 1,25 mL de etanol al 100% y mezclar la muestra con un vórtex. Transferencia de 700 μl de la muestra a un cartucho de filtro montado en un tubo de colección y girar la muestra a 14.500 x g por 30 s. repetición hasta que todos los de la muestra se pasa a través del cartucho.
    Nota: en este punto, la muestra puede resultar ligeramente opaca. Si muchas células, gusanos o moscas fueron sometidas a lisis, precipitados pueden aparecer que pueden obstruir el filtro.
  4. Lave el filtro una vez con 700 μl de solución de lavado 1 y dos veces con 500 μl de solución de lavado 2 o 3. Girar las muestras a 14.500 x g durante 2 min eliminar cualquier exceso etanol para finalizar los lavados.
  5. Transferir el cartucho del filtro a un tubo de 1,5 mL delfín y añadir μl de solución de elución precalentado (65 ° C) de 108.
    Nota: No exponga nunca las muestras de RNA a temperaturas superiores a 65 ° C antes de una transcripción inversa, ya que hacerlo provocará citosina a eventos uracilo desaminación son imposibles de distinguir de los errores de transcripción.
  6. Degradar la contaminación del ADN en el ARN aislado (vea los pasos 2.1-3.4) mediante la adición de 11 μl de 10 x DNasa buffer, 2 μl de inhibidor de la Rnasa y 4 μL de DNasa I (8 U) e incubar a 37 ° C durante 30 minutos.
  7. Después de la digestión, Añadir 11 μl de reactivo de inactivación de DNasa. Vórtice la mezcla y déjela reposar a temperatura ambiente 5 minutos. Luego, centrifugar la muestra a 15.000 x g durante 3 min para el reactivo de inactivación de la pelotilla y cobrar 110 μl del sobrenadante sin perturbar el pellet. Transfiera el sobrenadante a un tubo de 1,5 mL.
    Nota: El reactivo de inactivación de DNasa puede ser difícil de pipetear correctamente, así que visualmente la punta de la pipeta después de cada pipeteo acción. Si el reactivo de inactivación se vuelve demasiado viscoso para pipeta, añadir 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) igual a 1/5 del volumen restante.
  8. (Control de calidad) Medir la concentración del ARN total usando un espectrofotómetro. Luego reposar 1 μl de RNA total y diluir a una concentración de 10 ng/μl de agua libre de nucleasa de (NF). Ejecutar el RNA en un instrumento de análisis de nucleótido apropiado con un cinta de ARN de alta sensibilidad para asegurar que el RNA no se degrada y tiene un valor de eRIN de al menos 8.5 o más alto (figura 2B).

4. el mRNA enriquecimiento

  1. Realizar el enriquecimiento de mRNA con un miniprep de mRNA kit (véase Tabla de materiales). Añadir 140 μl de agua NF a la muestra para un volumen total de 250 μl. Luego, Añadir 250 μl de 2 x de tampón de Unión, homogeneizar la muestra con un vórtex y agregar 15 μl de oligo (dT) granos.
  2. Mezcle la muestra mediante pipeteo arriba y abajo e incubar a 65 ° C por 2 min. Luego, coloque la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos. Por último, centrifugar la muestra a 16.100 x g durante 2 minutos para que sedimenten los complejos de grano: mRNA.
  3. Deseche el sobrenadante y resuspender el precipitado en 500 μl de solución de lavado. Transferir la solución a una columna de vuelta y vuelta durante 1 min a x 15.000 g. Deseche el flujo a través y lavar la muestra con un adicional de 500 μl de solución de lavado. Luego, girar la muestra por 2 min a 15.000 x g para eliminar cualquier exceso etanol de los filtros de vuelta.
  4. Transferir el filtro spin a un tubo de delfín y resuspender el precipitado en la columna con 80 μl de solución de elución precalentado (65 ° C). Incubar la muestra durante 1,5 minutos a 65 ° C y eluir girando durante 1 min a 15.000 x g.
  5. Medir la concentración de RNA purificado con un espectrofotómetro o herramienta similar que permite la cuantificación de la concentración de RNA y de calidad.

5. ARN y ARNasa III fragmentación de limpieza

Nota: (Importante) para preparar las moléculas de ARN circular adecuadas para la generación de bibliotecas de C-seq, el ARN debe fragmentarse a aproximadamente 60 – 80 bases de longitud. Mientras que los métodos anteriores han utilizado una fragmentación química al fragmento de RNA, fragmentación químico con metales pesados presenta daños a las muestras de RNA que pueden ser malinterpretadas como errores de transcripción en el análisis final. Para evitar este problema, dependen en su lugar una fragmentación usando ARNasa III para generar pequeños fragmentos. Una ventaja adicional de este enfoque enzimática es que crea extremos compatibles requeridos para la ligadura, obviando la necesidad de una reparación final después de la fragmentación química.

  1. Configurar la reacción de la fragmentación del RNA con 1 μg de ARN purificado, 10 μl de tampón de reacción, 5 μl de ARNasa III y suficiente NF agua para llevar el volumen hasta 100 μl (véase Tabla de materiales). Agregue la enzima último y pipetear la mezcla hacia arriba y hacia abajo por lo menos 10 veces para mezclar. Incubar la muestra a 37 ° C durante 25 minutos, que tiende a producir fragmentos de ARN de aproximadamente 60-80 bases en longitud.
  2. Una vez finalizada la incubación de 25 minutos, limpiar la reacción inmediatamente con un oligo limpieza y concentrador kit (véase Tabla de materiales) para evitar cualquier digestión adicional. Añadir 200 μL de tampón de oligo-enlace a la muestra, mezclar completamente por Vortex y añadir 800 μl de etanol al 100%. Mezclar la muestra con un vórtex y transferir a una columna de giro proporcionado en un tubo de recogida.
  3. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 30 s y lavado con 750 μl de tampón de lavado para quitar ARNasa III. Centrifugar la muestra a 10.000 x g durante 30 s, deseche el flujo a través y lavar la muestra una vez más con 750 μl de tampón de lavado como se describió anteriormente. Después de la segunda a través de flujo ha sido descartado, centrifugar la columna a 15.000 x g durante 2 min eliminar cualquier exceso etanol.
  4. Transferencia a un nuevo tubo 1,5 mL de la columna y eluir la muestra en 24 μl de agua NF girando a 10.000 x g durante 1 minuto.
  5. Control de calidad: Tomar 2 μl de los fragmentos de RNA purificados y diluir 2 añadiendo 2 μl de agua NF. Ejecutar el ARN fragmentado en una cinta de pantalla para que el ARN fragmentado esté en el rango de 50 – 100 bases de longitud (figura 2 c).

6. ARN circularización y círculo del balanceo transcripción reversa

  1. Para circularize los fragmentos de ARN, calor-desnaturalizar 20 μl de la muestra a 65 ° C por 1 min y coloque en hielo inmediatamente durante 2 minutos. A continuación, añadir 4 μL de 10 x buffer ligasa de T4 RNA, 4 μL de 10 mM ATP, 1 μl de inhibidor de la Rnasa, 1 μl de agua NF y 8 μl de 50% polietileno glicol (PEG).
  2. Homogeneizar la muestra con un vórtex, luego añadir 2 μl de 10 U/μl de T4 RNA ligasa I. mezclar la muestra otra vez transfiriendo lo e incubar a 25 ° C por 2 h en un termociclador con la temperatura de la tapa a 30 ° C.
  3. Después de 2 h, añadir 10 μl de agua NF a la muestra y limpiar la muestra con un kit de limpieza y concentración de oligo según las especificaciones del fabricante. Eluir la muestra de 20 μl de agua NF.
  4. Revertir transcribe las moléculas de ARN circular, añadir 4 μL de 10 mM de dNTPs, 4 μL de 50 ng/μl random hexamers y 9 μl de agua NF a 9 μl de ARN. Mezclar todo bien mediante pipeteo, desnaturalizar la muestra a 65 ° C por 1 min y coloque en hielo durante 2 minutos tienda el ARN restante como respaldo.
  5. Añadir 8 μl de tampón de síntesis de la primera línea de 5 x, 2 μl de 0,1 mM DTT y 4 μL de 200 U/μl de la transcriptasa reversa y todo mezclar mediante pipeteo. Incubar la muestra a 25 ° C durante 10 min, seguido de una incubación de 20 min a 42 ° C con la tapa a 5 ° C superior a la temperatura de incubación.
    Nota: Debe usarse una transcriptasa inversa con capacidad de desplazamiento de hebra en este paso para permitir una transcripción reversa de círculo rodante.
  6. Añadir 10 μl de agua NF a la muestra y limpiar con el kit de limpieza y concentración de oligo según las recomendaciones del fabricante. Eluir la muestra 42 μl de solución de elución.
  7. Control de calidad: Diluya 2 μl de la ADNc monocatenario en 2 μl de agua NF y ejecutar este ejemplo en un instrumento de análisis de nucleótido con una cinta de ARN de alta sensibilidad. Si la transcripción inversa funcionara correctamente, una biblioteca de cDNA de moléculas, que van desde aproximadamente 60 – 1.500 bases de longitud, debe ser visible. Idealmente, la mayoría cDNA está en el rango de 500 – 1.000 bases (Figura 2d).

7. segundo Strand cDNA síntesis y reparación final

  1. Utilizar un segundo kit de síntesis de strand para generar una biblioteca de cDNA de doble hebra. Coloque las muestras en hielo y añadir 30 μl de agua NF a 38 μl de la muestra. Luego, añadir 8 μl de 10 x segundo Strand Buffer y 4 μL de la segunda enzima de la cadena y mezcle la muestra mediante pipeteo suave antes de su incubación a 16 ° C durante 2,5 horas.
  2. Limpiar las muestras con el oligo limpieza y concentración kit según las recomendaciones del fabricante para 100 reacciones μl y elución las muestras en 38 μl de agua NF.
  3. Configurar la reacción de reparación final añadiendo 20 μl de agua NF a 35,5 μl de cDNA de doble hebra, 6,5 μl de tampón de reacción de reparación final y 3 μl de mezcla de enzima de preparación final. Cuidadosamente Revise el buffer de reacción para precipitados blancos y disolver por calentamiento de mano si está presente.
  4. La mezcla de la reacción final de reparación mediante pipeteo e incubar a 20 ° C por 30 min, seguida de una segunda incubación de 30 min a 65 ° C. Ajuste la temperatura de la tapa del termociclador a 5 ° C más alta que la temperatura de incubación.

8. adaptador ligadura y selección del tamaño de bibliotecas preparadas

  1. Utilizar un módulo de preparación de biblioteca de varios pasos para la preparación final de la biblioteca (véase Tabla de materiales). En primer lugar, diluir los adaptadores para la nueva generación de la secuencia 10 veces en 10 mM Tris-HCl a una concentración final de 1,5 μm. Luego, añadir 2,5 μl de adaptador diluido y 1 μl de reforzador de la ligadura a cada muestra y mezclar con un vórtex.
  2. Agregar 15 μl de Blunt/TA ligasa Master Mix, mezclar mediante pipeteo e incubar a 20 ° C durante 15 minutos. Luego, agregar 3 μl de enzima de reactivo la supresión específica de uracilo e incubar a 37 ° C durante 15 minutos. Después de completar la ligadura, añadir 13,5 μl de agua NF a la muestra para un volumen total de 100 μl y proceder a la selección de tamaño.
    Nota: Es mejor seleccionar tamaño moléculas de cDNA que están en el rango de 600-800 bases en longitud. Si las moléculas de ARN fragmentadas eran aproximadamente 60 – 80 bases de longitud, seleccionar moléculas que son 600-800 bases en longitud se asegurará de que la mayoría de las moléculas seleccionadas contienen al menos tres repeticiones en tándem, que es ideal para el procesamiento de aguas abajo y Análisis.
  3. Para seleccionar moléculas que son 600-800 bp de longitud, Añadir 30 μl de granos magnéticos resuspendidos (véase Tabla de materiales), aclimatados a TA, cada uno de la muestra y mezclar mediante pipeteo. Transferir la muestra a un tubo de 1,5 mL e incube a temperatura ambiente durante 5 minutos.
  4. Coloque la muestra en un soporte magnético para 5 min separar el sobrenadante de los granos. Transferir el sobrenadante (que contiene las moléculas de cDNA deseada) para tubo un mL 1,5 nuevo y deshacerse de las bolas magnéticas (que están enlazadas a moléculas de cDNA grande).
  5. Añadir una nueva alícuota de 15 μl de granos magnéticos a cada muestras, homogeneizar mediante pipeteo e incube durante 5 minutos en lugar de RT. las muestras en una rejilla magnética e incubar por 5 min a TA. Entonces, retire con cuidado y deseche el sobrenadante, procurando no molestar a los granos.
    Nota: No deseche las bolas magnéticas, que ahora contienen el cDNA del objetivo deseado.
  6. Añadir 200 μL de 80% recién preparado etanol a cada una de las muestras sin perturbar las bolas magnéticas sedimentadas e incube durante 30 s. descartar el etanol y lavar las muestras con etanol al 80%. Luego, completamente quitar cualquier rastro de etanol de las muestras y deje secar al aire los granos para 5 min pero tenga cuidado de no secar demasiado las cuentas. Si los granos se secan, aparecerán grietas en las pelotillas.
  7. Para eluir las muestras de los granos, retirar los tubos del soporte magnético y agregar 19 μl de 10 mM Tris-HCl. Pipetear arriba y abajo varias veces a suspendidas las cuentas e incubar las muestras durante 5 min a TA. Si los granos se secan, para incubar > 10 minutos.
  8. Coloque las muestras en el soporte magnético e incubar por 5 min separar el sobrenadante de los granos. Cuidadosamente retire 15 μl del sobrenadante que contiene las bibliotecas de ADNc purificado, seleccionado por el tamaño de los tubos y transferirlo a un nuevo tubo 1,5 mL.

9. PCR amplificación y purificación Final del grano

  1. Añadir 5 μl de cebador universal y 5 μl de una cartilla de índice único (véase tabla de materiales) a cada uno purificado biblioteca del cDNA y homogeneizar mediante pipeteo. Cuidadosamente Compruebe la mezcla principal de polimerasa para cristales y otros precipitados y calentar la mezcla principal a mano hasta que los precipitados se disuelven.
    1. Añadir 25 μl de la mezcla principal de polimerasa a la muestra, mezclar mediante pipeteo y seguir las condiciones bicicleta a continuación para la amplificación por PCR. Ejecutar la desnaturalización inicial a 98 ° C por 30 s y llevar a cabo un paso doble reacción de PCR por denaturating las muestras a 98 ° C durante 10 s y recocido/extensión de los productos PCR a 65 º C por 75 s (x 12), seguido de una extensión final a 65 º C por 5 min y una espera indefinida a 4 º C.
  2. Limpiar las librerías finales añadiendo 45 μl de granos magnéticos resuspendidos directamente a la reacción de PCR, mezclar mediante pipeteo y ellos a temperatura ambiente por 5 min transferencia incubar la muestra a un tubo de 1,5 mL y colocarlo en un soporte magnético. Incubar por 5 min, descartar el sobrenadante y lavar dos veces con etanol de 80% recién preparada para 30 s.
  3. Después del segundo lavado, completamente eliminar el etanol de la muestra y secar el sedimento de grano durante 5 minutos y eluir en 35 μl de 0,1 x TE. Resuspender los granos mediante pipeteo les e incúbelos a RT por 5 min lugar la muestra sobre el soporte magnético y después de 5 min, transferir 30 μL del sobrenadante a un nuevo tubo 1,5 mL. Almacenar las bibliotecas a-80 ° C.
  4. Control de calidad: Diluya 1 μl de la biblioteca final en 9 μl de agua NF y ejecutar el ejemplo en un dedicado instrumento de análisis de ADN con un chip de alta sensibilidad; la mayoría de los ADNc debe estar en el rango de 600-800 bp de longitud (figura 2e).
  5. Después de la elución, enviar las muestras de secuencia en una plataforma de secuenciación masivamente paralela usando lecturas de extremo apareado de bp 250, o 300 lecturas del solo-fin de bp.

10. bio-informática análisis de secuenciación datos del círculo

Nota: Analizar e interpretar datos sin procesar desde el análisis de C-seq requieren una tubería bio-informático dedicadoa. Un esquema de la tubería que se utilizó para los análisis se muestra en la figura 3. Descargar este gasoducto en https://github.com/LynchLab/MAPGD.

  1. En primer lugar, recortar la Lee y quitar adaptador secuencias llamadas base de baja calidad con cutadapt18, utilizando un umbral de puntuación de calidad de 20.
  2. Luego, identificar las repeticiones codificadas por la molécula de RNA de concatemerized utilizando un algoritmo apropiado para detectar cualquier repeticiones con un mínimo de 30 nucleótidos y un máximo de 2 uniones mal hechas entre repeticiones18. De todas las llamadas de base y puntuaciones de calidad asociado en cada posición y obtener una secuencia consenso de estas repeticiones.
    Nota: Porque la reversa de la transcripción puede comenzar en cualquier posición en la molécula de RNA circular, el inicio de una repetición no necesariamente corresponden al extremo 5′ de la molécula de ARN fragmentado (en lo sucesivo, el punto de ligadura). Por consiguiente, la secuencia de consenso no mapa continuamente contra el transcriptoma correspondiente, que exige la identificación del punto de ligadura.
  3. Para identificar el punto de ligadura, mapa concatemer de la secuencia de consenso contra el transcriptoma de referencia mediante la alineación de la ráfaga-como herramienta (BLAT)19.
    1. Concatenar dos instancias de la secuencia de consenso para asegurar que la secuencia asignada contiene al menos una ocurrencia ininterrumpida completa de la secuencia inicial del fragmento de RNA. Entonces, gire la secuencia consenso para iniciar en la posición del punto de ligadura predicha.
  4. Mapa de las secuencias consenso girada contra el genoma usando TopHat20 y las alineaciones para detectar cualquier polimorfismos de nucleótido único (SNPs) que podrían confundirse con errores de transcripción.
  5. Llamar a los errores de transcripción de las secuencias consenso girado asignados y comprobar los errores del candidato pasan cuatro pruebas adicionales.
    1. En primer lugar, asegúrese de que un error de transcripción no se superpone con un SNP (un requisito típico es que al menos 20 lecturas necesitan cubrir una determinada base y no mayor de 5% de la lectura puede apoyar una alternativa llamada base).
    2. En segundo lugar, compruebe que la secuencia de consenso se deriva de al menos 3 repeticiones en tándem, cada uno de los cuales llama el mismo par de base; y en tercer lugar, asegúrese de que la suma de las puntuaciones de calidad de esa posición debe ser más de 100.
  6. Para una cuarta y última Compruebe, gire la secuencia consenso en todas las combinaciones posibles (simular todas las posibles posiciones del punto de ligadura) y mapa cada versión contra el genoma de referencia utilizando TopHat.
    Nota: Si una de las secuencias rotadas encuentra a una combinación perfecta en el genoma, el punto correspondiente de la ligadura se considera correcta y se debería rechazar la llamada de error de transcripción.

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Representative Results

Como todos los enfoques de secuenciación masivamente paralela, cada experimento C-seq produce un conjunto de datos grandes, difíciles de manejar. Para los usuarios de primera vez, puede ser difícil de manejar estos conjuntos de datos; por lo tanto, se recomienda que todos los usuarios en contacto con un bio-informático experimentado antes de la experimentación. En promedio, la expectativa es que los usuarios generen aproximadamente 55 – 70 Giga bases (Gbases) por ejecutar en más plataformas de secuenciación masivamente paralela. De este protocolo, por lo general, 12 – 30 muestras fueron multiplexadas por ejecutar por lo que para cada muestra fueron adquiridos aproximadamente 2 – 6 Gbases. Después de recortar las secuencias de adaptador y llamadas de base de baja calidad (< 20) de este conjunto de datos, seguía siendo ~ 70% del tamaño inicial de datos.

Estas bases se analizan entonces más para investigar la eficiencia de la fragmentación de la RNA y circularización determinando el tamaño de las repeticiones que se generaron. La mayoría repite tienden a ser de 45 – 80 bases de longitud (Figura 4A) y aproximadamente el 50% de las bases que fueron ordenados forman parte de estas repeticiones (Figura 4B). Puesto que la mayor parte de estas bases está presente en lecturas que contengan repeticiones de 3 o más, el número de bases únicas que son ordenados es un tercio del número total de bases secuenciadas. En promedio, > 75% de estas secuencias de consenso puede asignarse al genoma de referencia. Finalmente, aproximadamente el 25% de estas bases están cubierto por 20 lee o más, que en última instancia significa que alrededor del 10% de los datos puede utilizarse para detección de errores. Un ejemplo de este análisis se da en la figura 4, que representa la información de la secuencia que fue adquirida durante la configuración de este protocolo para 1 repetición de una única biblioteca de C-seq que se secuenció relativamente bajo y representa el más bajo límite de los datos que los usuarios pueden esperar a adquirir.

Aproximadamente 5.000 – 25.000 errores por funcionamiento tienden a identificarse, aunque estas cifras pueden variar significativamente dependiendo de la tasa de error sí mismo (cuanto mayor sea la tasa de error, se detectan más errores), el tamaño del transcriptoma (el más grande el transcriptoma, correrá las bases menos por 20 Lee, limitando los datos de la secuencia que pueden ser utilizados para detección de errores) y la profundidad a la que se ordena (la secuencia más profunda hará más probable que una dada base será cubierta por 20 lee o más). Estos errores tienden a ser distribuidos en todo el genoma, por lo que en promedio ~ 47% de los errores se encuentran en el mRNA las moléculas generadas por la ARN polimerasa II (ARNP II), ~ 49% se encuentran en las moléculas de rRNA generadas por ARNP I y el restante 3% estamos ubicados en RNAs generados por ARNP III y la polimerasa del RNA mitocondrial. Sin embargo, estas proporciones pueden variar significativamente dependiendo del tipo de la célula o del organismo bajo investigación (figura 4). Por ejemplo, tipos de células que se basan fuertemente en la función mitocondrial, como cardiomiocitos, contienen RNA mitocondrial significativamente más que otros tipos de células, aumentando considerablemente el número de moléculas de ARN mitocondriales que están secuenciadas y el número de errores detectados.

Una vez que se ha elaborado una lista de errores, y sus localizaciones en el genoma son conocidos, estos errores se pueden utilizar para identificar los parámetros que controlan la tasa de error de transcripción en cada organismo. Por ejemplo, la ubicación de estos errores de transcripción puede ser correlacionada con numerosas características del genoma, tales como la presencia de ADN se repite, contextos genéticos específicos o la tasa de expresión, para entender cómo estas funciones alteran la fidelidad de transcripción5. La expectativa es que en el futuro, sin embargo, los usuarios podrán determinar cómo innumerables características adicionales afectan fidelidad transcripcional, incluyendo marcadores epigenéticos, la 3-d organización del genoma, la disponibilidad de nutrientes, edad o exposición a tóxicos compuestos, para dilucidar la contribución de factores genéticos y ambientales a la fidelidad de la transcripción.

Figure 1
Figura 1: Representación esquemática de RNA-seq y siguientes del C (A) tradicional RNA-seq experimentos RNA aislado de una muestra de interés, fragmento del RNA, y atrás lo transcribir antes de la preparación final de la biblioteca y la secuencia. Sin embargo, estos procedimientos de preparación introducen numerosos artefactos técnicos en la biblioteca en forma de errores de transcripción reversa, PCR amplificación errores y errores de secuenciación. (B) esta optimizado C-seq ensayo permite la corrección de estos artefactos técnicos circularizing las moléculas de ARN fragmentadas antes de la transcripción inversa, que les permite ser revés transcrito en forma de círculo rodante para producir lineal repetición de moléculas de cDNA que contienen varias copias de la plantilla original de RNA en tándem. Estas repeticiones en tándem luego pueden utilizarse para distinguir errores de transcripción verdadero de artefactos, como errores de transcripción verdadero (estrella) estará presentes en todas las repeticiones en el mismo lugar, mientras que los artefactos tales como revertir errores de transcripción (cuadrados) y PCR errores de amplificación (círculo) sólo están presentes en una o dos repeticiones de cualquier molécula de cDNA dado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: resultados del representante para la preparación de la biblioteca. Estos muestran paneles un electrophoretogram para cinta de pantalla (A) una alta sensibilidad RNA escalera (véase Tabla de materiales), (B) total RNA purificado de Saccharomyces cerevisiae, RNA fragmentado por la Rnasa III (C) y) D) balanceo del círculo cADN transcripción inversa. (E) la biblioteca de cDNA de tamaño seleccionado final se ejecuta en un análisis de ADN de doble hebra de alta sensibilidad de la viruta (véase Tabla de materiales). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: esquema de la tubería bio-informático utilizada para analizar los datos de la secuencia del círculo. Después recorte lo lee de la secuencia, las repeticiones se identifican, y una secuencia del consenso se genera utilizando la llamada base más probable en cualquier posición dada. Luego, se identifica el punto de ligadura de la plantilla inicial de RNA y la secuencia de consenso se alinea con el genoma de referencia que pueden identificar posibles errores de transcripción. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: ejemplo de resultados para la tubería de C-Seq. (A) este panel muestra la distribución de tamaño de las secuencias consenso obtenida de un experimento típico de C-Seq. (B) este panel muestra el número de bases, Lee y el porcentaje de lecturas secuenciadas en cada paso de la tubería de Bioinformática C-Seq. (C) este panel muestra el número de errores de transcripción detectada y el porcentaje de errores atribuidos a ARN polimerasa I, ARN polimerasa II, RNA polimerasa III y polimerasa del RNA mitocondrial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Aquí, describimos un protocolo optimizado para la elaboración de bibliotecas de C-seq para la detección de errores de transcripción en Saccharomyces cerevisiae, Drosophila melanogastery Caenorhabditis elegans. Este protocolo tiene numerosas ventajas sobre los protocolos existentes, así como técnicas alternativas.

En los últimos 15 años, numerosos reportero han desarrollado sistemas que dependen de luciferase7,8 o Cre-Lox recombinación3,4,15,21 a detectar transcripción errores. Estos sistemas de reportero han sido inestimables para los investigadores entender de fidelidad transcripcional porque les mecanismos moleculares para identificar que directamente regulan la fidelidad de la transcripción, genes y alelos. Sin embargo, sólo reportan errores en plantillas artificialmente dañadas, o dentro de contextos genéticos muy específicos, que limita las preguntas científicas que se pueden contestar. Una ventaja importante del protocolo C-seq es que monitoriza la fidelidad de la transcripción en el transcriptoma completo5, grandemente ampliando el conocimiento científico de la exactitud con que se expresa la información genética. En segundo lugar, porque el ensayo C-seq utiliza RNA como su material de fuente, es probable que este análisis pueden ser adaptado a cualquier organismo de elección, obviando la necesidad de generar construcciones complicadas reportero para cada modelo de transgénico. Este protocolo también tiene ventajas sobre los actuales enfoques de secuenciación masivamente paralela17,22. En particular, la mayoría de estos métodos hace uso de los metales pesados a las bibliotecas de fragmento de RNA. Sin embargo, estos métodos de fragmentación introducen artefactos en el ARN, que son indistinguibles de la verdadera transcripción errores5. Para resolver este problema, este protocolo fragmentos de RNA enzimático con ARNasa III, que tiene la ventaja que deja extremos compatibles para uno mismo-ligadura, grandemente simplificando la circularización de RNA y aumentar la sensibilidad de la prueba de ~ 10 veces.

Al mismo tiempo, el ensayo C-seq tiene sus propias limitaciones. En primer lugar, a pesar de que el ensayo mide errores de transcripción a lo largo de todo el genoma, un componente importante de los datos tiende ser derivado de genes que se expresan altamente, como transcripción de estos genes tiende a dominar la mayoría de las bibliotecas de RNA. Otro factor que sesga el análisis hacia genes altamente expresados es el umbral en el gasoducto bio-informático que previene las mutaciones genéticas y ARN editar eventos de confundir las mediciones finales. Este umbral dicta que solamente las bases que fueron ordenadas 20 veces o más pueden utilizarse para el análisis final. Una segunda limitación refiere a diversidad de biblioteca. Como la mayoría de los kits utilizada para la extracción de RNA, el kit utilizado aquí no eficientemente purificar pequeñas moléculas de ARN, que limita el número de lecturas derivadas de moléculas sintetizadas por ARNP III. La diversidad de la biblioteca de la secuencia final está limitada más por el paso de la purificación de mRNA aquí. Aunque ordenados de moléculas generadas por RNAP puedo ser eficiente, la mayoría de los restantes RNAs mitocondriales, tRNAs y RNAs no codificantes desaparecen durante este paso. Para capturar estos más con frecuencia, debe utilizarse un kit diferente que purifica especialmente pequeñas moléculas de ARN, o tipos de la célula deben estar dirigidos de moléculas que están enriquecidas para estas moléculas. Tenga en cuenta, sin embargo, que la mayoría de estos problemas puede resolverse mediante secuenciación más profundo que el habitual, o al mismo tiempo secuenciar el ADN de las células del mismo, aunque ambas de estas soluciones requiere una mayor inversión financiera por los investigadores.

Además, futuros desarrollos tecnológicos están a punto de mejorar el análisis de C-seq en un nivel fundamental. Por ejemplo, ampliando la longitud de lectura de la actual tecnología de secuenciación, será posible moléculas más largo de la secuencia, lo que significa que más repeticiones pueden utilizarse para comprobar la fidelidad de la transcripción. Dichas mejoras resultará automáticamente en una mayor profundidad de la secuencia y un aumento en el porcentaje de lecturas que pueden utilizarse para análisis posteriores. Un argumento similar puede hacerse para cualquier tecnología de secuenciación que permite más moléculas ser ordenados en paralelo. Además, diversos componentes de la prueba de C-seq permanecen para ser optimizado, incluyendo la eficiencia de la circularización de ARN, el rigor de la selección del tamaño y la naturaleza desperdiciadora de tiempo de la prueba de sí mismo. Por último, se recomienda encarecidamente que todos los usuarios acceder a una herramienta dedicada, alta sensibilidad para el análisis de ácidos nucleicos y solución de problemas potenciales (véase Tabla de materiales). Sin esta herramienta, puede ser extremadamente difícil determinar en qué momento surgen problemas potenciales, lo que imposible fijar.

Aunque el conjunto del protocolo es bastante implacable (pequeños errores tienden a tener consecuencias significativas), hay varios pasos que son absolutamente fundamentales para el éxito de la prueba de C-seq. Uno de los requisitos más importantes es que el ARN aislado se trata lo más suavemente posible. Mayoría de los métodos de extracción de RNA y procesamiento aguas abajo kits cuidado poco sobre la composición química del RNA más allá de los estándares de la industria básica, que es suficiente para los análisis moleculares más. Sin embargo, el análisis de C-seq es tarea de identificar un error de transcripción solo entre cientos de miles de bases de la WT, aumentando considerablemente la necesidad de reducir la tensión molecular. Incluso el estrés que afecta a sólo 1 en 10.000 bases puede introducir artefactos que invalidan totalmente los resultados. Por ejemplo, los usuarios deben nunca evitar límite exponer el RNA a cualquier temperatura sobre 65 ° C. En segundo lugar, cada usuario debe optimizar cuidadosamente el tiempo necesario para la fragmentación de RNA con ARNasa III. Es absolutamente crucial para el éxito de la prueba de que las moléculas finales son aproximadamente 60 – 80 bases de longitud. Moléculas más cortas pueden ser difíciles mapear el genoma, y no permitirá que las moléculas más largas para que 3 repeticiones independientes a ser ordenados dentro de una lectura bp 250. Por último, se recomienda no congelar y descongelar más de una vez el ARN durante el conjunto del protocolo. En cambio, aislar el RNA y sintetizar el cDNA en un solo día. Debido al tiempo y esfuerzo con este compromiso, la complejidad del protocolo sí mismo y el número de muestras que con frecuencia se procesan a la vez, se recomienda que dos investigadores trabajan juntos para generar estas bibliotecas.

Cuando exitoso, estos experimentos hará posible detectar con precisión los errores de transcripción en cualquier organismo, bajo cualquier condición experimental. Por ejemplo, mediante la comparación de control y las personas enfermas entre sí, es posible determinar si ciertas enfermedades se asocian con errores de transcripción, que pueden revelar un nuevo componente de la etiología de numerosas patologías humanas. Otros parámetros que podrían ser probadas son la crianza, nutrición, genotipo y factores ambientales como la exposición a productos químicos tóxicos. Por otra parte, porque este análisis detecta errores de transcripción en el transcriptoma, permitirá a investigadores a diseccionar los diferentes mecanismos que contribuyen a la fidelidad de la ARN polimerasa I, II y III, así como la polimerasa del RNA mitocondrial. Por consiguiente, esperamos que este protocolo se abrirá un nuevo campo de la mutagénesis a la experimentación generalizada, caracterizada por el estudio de mutaciones en el ARN, en lugar de ADN.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Esta publicación fue hecha posible por el financiamiento del grant T32ES019851 (para C. Fritsch), R01AG054641 y un investigador joven AFAR conceden (a M. Vermulst).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RiboPure RNA purification kit ThermoFisher AM1926 Total RNA purification
Genelute mRNA purification kit Sigma-Aldrich MRN70-1KT mRNA purification
Nuclease-free Water Ambion AM9937 Elution and dilution
Ambion RNase III ThermoFisher AM2290 RNA fragmentation
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) New England Biolabs M0204S RNA circularization
Ribolock ThermoFisher EO0381 RNase inhibitor
SuperScript III Reverse Transcriptase ThermoFisher 18080044 Rolling circle reverse transcription
10 mM dNTP mix ThermoFisher 18427013 Rolling circle reverse transcription
Random hexamers (50 ng/µL) ThermoFisher N8080127 Rolling circle reverse transcription
NEB Second Strand Synthesis Module New England Biolabs E6111S Second Strand Synthesis
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England Biolabs E7370S cDNA library preparation
NEB Next index primers NEB E7335S Multiplex PCR primers
Oligo Clean & Concentrator Zymo Research D4061 Clean up of RNA and DNA samples
DynaMag-2 Magnet ThermoFisher 12321D Magnetic bead purification
AMPure XP beads Beckman Coulter A63881 Magnetic bead purification
Eppendorf 5424 Microcentrifuge FisherScientific 05-403-93 centrifugation
INCU-Shaker 10 L Benchmark Scientific H1010 Cell culture
T100 Thermal Cycler BIO RAD 1861096 Medium to High temperature cycling conditions
PTC-200 Thermal Cycler GMI 8252-30-0001  Low temperature cycling conditions
RNase Away Molecular Bioproducts 700S-11 Sterilization
50 mL Centrifuge Tube Corning 430290 Nuclease-free
15 mL Centrifuge Tube Corning 430052 Nuclease-free
Eppendorf tubes USA Scientific 1615-5500 Nuclease-free
4200 Tapestation System Agilent G2991AA Nucleotide analysis instrument for quality control of RNA and single stranded DNA samples
High Sensitivity RNA Screen Tape Agilent 5067-5579 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Sample Buffer Agilent 5067-5577 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
RNA ScreenTape Ladder Agilent 5067-5578 Quality control of RNA and single stranded DNA samples
2100 Bioanalyzer Instrument Agilent G2939BA Double stranded DNA quality control
High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626 Quality control for double stranded cDNA samples
Water Bath VWR 462-0244 Incubation
NanoDrop 2000/2000C Spectrophotometer ThermoFisher ND-2000C Determination of RNA concentration

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References

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Genética número 139 procesos genéticos genes transcripción genética transcripción inversa transcriptoma mutagénesis substitución del aminoácido fenómenos y procesos fenómenos de genética mutagénesis transcripción RNA-Seq S. cerevisiae C. elegans y D. melanogaster secuenciación ARN polimerasa errores
Vigilancia de todo el genoma de errores de transcripción en organismos eucariotas
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Fritsch, C., Gout, J. F. P., Vermulst, M. Genome-wide Surveillance of Transcription Errors in Eukaryotic Organisms. J. Vis. Exp. (139), e57731, doi:10.3791/57731 (2018).

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