Summary
Dimostriamo di tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la visualizzazione di immunohistochemical di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.
Abstract
Periciti giocano un ruolo importante in molte malattie dell'occhio. Tecniche dei vasi retinici e microvascolare di macchiatura immunohistochemical periciti sono al centrali di ricerca oftalmologica. È fondamentale scegliere un metodo appropriato di visualizzare i pericytes microvascolari. Descriviamo retinica Pericita microvascolare immunoistochimica in cryo-sezioni, intero-monta e sistema vascolare isolato ipotonico usando gli anticorpi per β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l'antigene del nervo/glial 2 (NG2). Questo permette di evidenziare vantaggi e difetti di ciascuna delle preparazioni del tre tessuto per la visualizzazione dei periciti microvascolare. Cryo-sezioni forniscono transsectional visualizzazione di tutti gli strati retinici ma contengono solo qualche occasionale taglio trasversale del microvasculature. Intero-monta fornisce una panoramica dell'intero sistema vascolare retinico, ma la visualizzazione del microvasculature può essere fastidioso. Ipotonica isolamento fornisce un metodo per visualizzare l'intero sistema vascolare retinico tramite la rimozione delle cellule neuronali, ma questo rende il tessuto molto fragile.
Introduction
Periciti sono al centro di molti laboratori di ricerca come queste cellule svolgono un ruolo importante nell'integrità del sistema vascolare. Condizioni patologiche quali retinopatia diabetica1, ischemia2e glaucoma3 hanno caratteristiche vascolari che coinvolgono la funzione di periciti. I periciti sono trovati in plessi capillari retinici interni. Arteria retinica centrale che fornisce i rami retina interna in due strati dei plexuses capillari. Il letto vascolare interno è situato tra la cellula del ganglio e strati interni di nucleare. Lo strato più profondo è più denso e complesso ed è localizzato tra lo strato nucleare interno ed esterno4,5. Inoltre, alcune parti della retina contengono anche una terza rete definita i capillari parapapillary radiale. Questi sono lunghi, dritti capillari che si trovano tra le fibre nervose e raramente anastomotizzare con un l'altro o gli altri due plessi6. All'interno della parete capillare, i periciti sono incorporati nella membrana dello scantinato e linea lato abluminale delle cellule endoteliali vascolari.
A questa data, esiste un marker biologico unico di questi periciti che possibile distinguerle da altre cellule vascolari. Β del ricevitore di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGFRβ) e l'antigene del nervo/glial 2 (NG2) sono comunemente utilizzati marcatori che entrambi presentano il pericytes ma anche altre cellule vascolari. Identificazione dei pericytes è ulteriormente complicata dall'esistenza di sottoinsiemi di periciti che variano nell' espressione della proteina e morfologia7. Attualmente, la migliore identificazione si basa su una combinazione di proteine marker e il posizionamento caratteristico del Pericita nella parete vascolare. Dimostriamo qui tre tecniche di preparazione dei tessuti differenti per la macchiatura di immunohistochemical PDGFRβ/NG2 di periciti microvascolare del ratto, vale a dire, cryo-sezioni, intero-monta e ipotonico isolamento della rete vascolare.
Con cryo-sezioni, la retina e la sclera sono tagliate attraverso il nervo ottico. Ciò consente la visualizzazione di tutte le strutture a strati di neuroni. I dieci strati distinti della retina sono evidenti come lo scambio di strutture nucleari e assonale/dendritiche che possono essere visualizzate con macchie quali ematossilina/eosina o fluorescente nucleare 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)8. I requisiti metabolici differiscono tra i livelli9 e si fornisce un metodo per determinare lo spessore o la totale assenza di un livello specifico (ad esempio, la perdita delle cellule ganglionari retiniche è uno dei tratti distintivi di ischemia retinica10, 11). Il sistema vascolare è evidente come attraverso la retina, rendendo possibile studiare separatamente i plexuses capillari all'interno i rispettivi strati retinici12,13tagli trasversali.
Più tradizionalmente, le indagini della rete sistema vascolare retinico sono effettuate in intero-monta retinica. Con questa preparazione del tessuto, la retina è tagliata e appiattita come una struttura a forma di fiore. Il metodo è una tecnica di preparazione del tessuto relativamente veloce che permette di evidenziare il vasculature retinico di architettura globale e pertanto è spesso applicato nell'inchiesta della neovascolarizzazione della retina murino. Visualizzazione successo del microvasculature in retine montato tutto è segnalato anche nel sviluppo neonatale topo e nel ratto retina14,15,16,17,18, 19. questi studi rivelano una più definita attività pericitica con grandi aree senza capillare nell'adulto rispetto al retina neonatale14.
Un altro modo di visualizzare è il microcircolo retinico dopo isolamento ipotonica. Questa tecnica di preparazione del tessuto si traduce in vasi sanguigni retinici e capillari viene liberati delle cellule neuronali. Questo tipo di rappresentazione bidimensionale della rete vascolare retinica isolata è solitamente eseguito dopo retinica tripsina digestione20 e utilizzato per valutare le anomalie vascolari della retinopatia diabetica, compreso perdita di periciti e capillare degenerazione20,21,22. Il metodo di isolamento ipotonico offre le indagini del gene vascolare retinica e risposte normative proteina come è stato fatto con RT-PCR e western blotting23,24,25. Forniamo qui un protocollo per la macchiatura di immunohistochemical di flottante del vasculature retinico isolato ipotonico come alternativa alla digestione della tripsina per esaminare i pericytes microvascolari.
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Protocol
Il protocollo è stato ottimizzato e dimostrato su ratti adulti maschii dell'albino. In tutte le procedure sperimentali, gli animali sono stati trattati secondo la normativa l'ARVO istruzione per l'uso degli animali in oftalmica e Vision Research. Gli animali sono stati eutanasizzati di biossido di carbonio e successiva dislocazione cervicale.
1. ratto tessuto retinico preparazioni
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Cryo-sezione
- Rendere ~0.5 anteriori e posteriori fessure cm nella palpebra del ratto con un bisturi.
- Opzionale: Utilizza un bruciatore di diatermia, contrassegnare l'occhio l'angolo interno per orientare l'occhio in modo uniforme durante l'incorporamento e consentire per il sezionamento di criostato verticale tramite il nervo ottico.
- Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo.
Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina. - Mettere l'occhio brevemente in formaldeide 4% in tampone fosfato salino (PBS) per stabilizzare prima di effettuare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.
- Sotto un microscopio, tagliato lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe prima dell'immersione in formaldeide 4% in PBS per 2 – 4 h.
- Sciacquare in modo sequenziale in tampone fosfato di Sörensen con saccarosio di 10% e 25% di saccarosio.
- Incorporare nel mezzo di Yazulla preparato con 3% di gelatina da porcino pelle e 30% albumina da bianco d'uovo di pollo.
Nota: Il protocollo può essere sospesa qui con deposito di tessuto a-20 ° C.
- Rendere ~0.5 anteriori e posteriori fessure cm nella palpebra del ratto con un bisturi.
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Intero-monta
- Rendere ~0.5 posteriori ed anteriori cm fessure nella palpebra del ratto con un bisturi.
- Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo.
Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina. - Mettere l'occhio brevemente in formaldeide 4% in PBS per stabilizzare prima di effettuare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.
- Sotto un microscopio, tagliare lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe.
- Separare la retina dall'epitelio retinico del pigmento verso il nervo ottico con il forcipe con movimenti di piccola apertura per evitare di strappare principali.
- Gratis la retina al nervo ottico con forbici di dissezione e fare quattro fessure di pochi millimetri lunghezza dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico.
- Diffondere la retina su un vetrino e lasciare asciugare per 5 – 10 min.
- Difficoltà in formaldeide 4% per 20-30 min di sgocciolatura formaldeide sulla retina.
Attenzione: Non applicare direttamente sulla retina, come può staccare dal vetro. - Risciacquare con PBS. Per ottenere risultati ottimali, immuno-macchia direttamente dopo il risciacquo.
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Isolamento ipotonica
- Rendere ~0.5 posteriori ed anteriori cm fessure nella palpebra del ratto con un bisturi.
- Afferrare l'occhio con il forcipe e inclinare con attenzione al lato per esporre il tessuto circostante. Enucleare l'occhio facendo tagli con le forbici di dissezione nel tessuto muscolare e connettivo.
Attenzione: Non tirare troppo l'occhio come eccessiva pressione sul nervo ottico può causare il distacco della retina. - Fare un foro iniziale al limbus corneale applicando una leggera pressione con la punta di un bisturi.
- Sotto un microscopio, tagliare lungo il limbus cornea con le forbici di dissezione per rimuovere la cornea e la lente con il forcipe.
- Separare la retina dall'epitelio retinico del pigmento verso la testa del nervo ottico con il forcipe con movimenti di piccola apertura per evitare di strappare principali.
- Gratis la retina al nervo ottico con forbici di dissezione, collocare la retina in 1 mL di acqua deionizzata in una piastra a 24 pozzetti e agitare a 200 giri/min con un'orbita di vibrazione di 1,5 mm per 1 h a temperatura ambiente.
Nota: Qui di seguito, verrà visualizzato la retina che meno definiti ai bordi. - Aggiungere 200 U dnasi 1 per dissociare i detriti di lisato cellulare dal sistema vascolare retinico e agitare per un altro 30 min a temperatura ambiente.
Nota: Detriti potrebbero iniziare a forma nei pozzetti. - Sciacquare almeno 3 volte in acqua deionizzata per 5 minuti con agitazione a 150 – 300 giri/min per rimuovere i detriti di un neurone delle cellule. La retina dovrebbe diventare più trasparente con ogni risciacquo indicativo della rimozione di detriti cellulari neuronali.
- Utilizzare uno sfondo scuro per esaminare la piastra 24 pozzetti di vedere chiaramente il vasculature retinico isolato diafano.
- (Facoltativo): se il sistema vascolare non è gratis di un neurone strati (semi-trasparente) a questo punto o aggiungere ulteriori passaggi di risciacquo, aumentare la velocità di agitazione o utilizzare una pipetta per aspirare il liquido sul sistema vascolare.
Attenzione: I passaggi facoltativi possono danneggiare il sistema vascolare.
- Difficoltà 10 min in 1 mL di paraformaldeide al 4% in PBS a temperatura ambiente e risciacquo 3 volte in PBS.
Nota: Il protocollo può essere sospesa qui con deposito di tessuto a 4 ° C.
2. esame immuno-istochimico
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Macchiatura di cryo-sezioni
- Tagliare 10 µm cryo-sezioni della retina gelatina-incastonati come sezionamento verticale tramite il nervo ottico e la cryo-sezioni su un vetrino e lasciare asciugare (minimo 1 h).
- Immergere il vetrino in PBS con 0,25% Triton X-100 (PBS-T) per 15 min.
- 1: 100 PDGFRβ e gli anticorpi primari di 1: 500 NG2, diluiti in PBS-T + 1% BSA sulla cryo-sezione a goccia e incubare in camere di incubazione a 4 ° C durante la notte.
- Immergere il vetrino 2 volte in PBS-T per 15 min e 1: 100 anticorpi anti-topo Alexa Fluor 594-linked e 1: 100 anti-coniglio FITC-collegato secondari diluiti in PBS-T con 3% BSA su cryo-sezioni a goccia.
- Incubare il vetrino 1 h a temperatura ambiente al buio.
- Sciacquare il vetrino in PBS-T 2 x 15 min.
Nota: Facoltativo: per la macchiatura immunofluorescente doppie e triple, macchiatura sequenziale può essere eseguita ripetendo la procedura dal 2.1.3 a 2.1.6 due e tre volte, rispettivamente. - Montare il cryo-sezioni macchiate con anti-affievolimento montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti.
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Macchiatura del intero-supporto
- Coli di PBS-T sull'intero-monta e incubare a temperatura ambiente per 15 min.
- Versare fuori e gocciolamento 1: 100 PDGFRβ e gli anticorpi primari di 1: 500 NG2, diluiti in PBS-T + BSA 1% e incubare in camera umida a 4 ° C durante la notte.
- Versare fuori e gocciolare su PBS-T a sciacquare il vetrino in 2 x 15 min.
- Versare fuori e gocciolare su 1: 100 anti-coniglio Cy2 - e 1: 100 anti-Cy3-collegato secondario anticorpo diluito in PBS-T con 3% BSA per Incubare 1h in una camera umida a temperatura ambiente al buio.
- Versare fuori e gocciolare su PBS-T a sciacquare in 2 x 15 min al buio.
Nota: Facoltativo: per la macchiatura immunofluorescente doppie e triple, macchiatura sequenziale può essere eseguita ripetendo la procedura da 2.2.2 a 2.2.5 due e tre volte, rispettivamente. - Montare l'intero-monta macchiato con anti-affievolimento montaggio medio contenente DAPI e un vetrino coprioggetti.
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Macchiatura del vasculature isolato ipotonica
- Bloccare il vasculature isolato ipotonico 1h con agitazione a 100 rpm e temperatura con 500 µ l/pozzetto di 10% di siero di asino diluito in PBS.
- Incubare per una notte a temperatura ambiente e agitare a 100 rpm con 600 µ l/pozzetto di 1: 100 PDGFRβ e 1: 500 NG2 anticorpi primari diluiti in siero di 10% asino in PBS.
- Risciacquo retinico 3x in PBS per 5 min di rete ed incubare 1: 100 anticorpi anti-topo Alexa Fluor 594-linked e 1: 100 anti-coniglio FITC-collegato secondari diluiti con 10% siero di asino in PBS agitazione a 100 rpm e temperatura ambiente per 1 h al buio.
- Risciacquare in PBS-T per 5 min e incubare a 0,2 ng/mL DAPI in PBS-T seguita da risciacqui 3 x 5 min in PBS-T al buio per 15 min.
- Tagliare la punta di una pipetta di Pasteur plastica, inumidirlo con PBS-T e utilizzarlo per trasferire la rete retinica a una diapositiva di alloggiamento vetro 4 pozzetti.
Nota: Il passaggio d'inumidimento è importante evitare il vasculature retinico che attacca all'interno della pipetta Pasteur. - Aprire completamente il sistema vascolare retinico. Evitare di toccare il vasculature retinico con il forcipe come questo può causare il sistema vascolare a groviglio.
Nota: Svolgimento può essere fatto inclinando il vetrino camera avanti e indietro o aspirando le gocce di liquido sul sistema vascolare retinico. - Rimuovere il supporto dai pozzi. La tensione superficiale del liquido si appiattiscono il vasculature sulla parte inferiore della diapositiva.
- Garantire il corretto dispiegarsi sotto un microscopio prima di rimuovere la plastica pozzi dalla diapositiva camera.
- Montare il vasculature macchiato con mezzo di montaggio anti-sbiadimento e un vetrino coprioggetti.
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Representative Results
I protocolli di successo forniscono tre diverse preparazioni della retina per la visualizzazione di periciti microvascolari. Ciascuno di questi metodi utilizza la PDGFRβ e NG2 immunoreactivity co-localizzazione e la posizione unica dei pericytes che avvolgono l'endotelio capillare identifiicazione.
Con cryo-sezioni, gli strati di un neurone possono essere identificati dalla densità fluorescente dei nuclei DAPI-etichettati e interiore e profondo capillare plexuses contengono periciti che visualizzano il immunoreactivity PDGFRβ e NG2 (Figura 1). La posizione unica dei pericytes nella parete vascolare può essere visto come il immunoreactivity circolare o a ferro di cavallo nella periferia dei vasi (Figura 1, frecce) o occasionali tagliare longitudinalmente vasi (Figura 1, punta di freccia).
Visualizzazione successo dei pericytes microvascolare in intero-monta preparazione di ratto adulto può essere difficile14,20. Immunoreactivity PDGFRβ nella retina adulto intero-montato ha provocato solo un segnale molto debole (non mostrato). NG2 macchiatura delineato la rete vascolare interna con una colorazione intensa nei periciti abluminale (Figura 2).
Per ottenere una panoramica della rete vascolare della retina del ratto adulto, immunohistochemistry di rete vascolare retinica ipotonico isolati del ratto fornisce un metodo alternativo per intero-monta. Quando correttamente eseguita, questa tecnica di preparazione del tessuto fornisce una panoramica del microvasculature retinico intero compreso plexuses interiore e profondo capillare. Macchiatura immunohistochemical con gli indicatori pericitica risultati nell'intera rete microvascolare risultati NG2 immunoreactivity con una risposta intensa in specifiche cellule vascolari (Figura 3). Alcune di queste cellule inoltre visualizzare il immunoreactivity PDGFRβ (Figura 3).
Un accurato svolgimento del tessuto è importante ottenere una buona panoramica del vasculature retinico. Dispiegarsi insufficiente può provocare nel vasculature essendo disposto in strati multipli di messa a fuoco che rende fluorescente imaging difficile (Figura 4). Dispiegarsi può essere agevolato dall'agitazione delicata, inclinando il vetrino camera avanti e indietro o aspirando gocce di liquido sul sistema vascolare retinico. Si deve osservare che l'anatomia dei plexuses capillari retinici si tradurrà in qualche sovrapposizione dei letti vascolari. Quindi, è problematico per distinguere l'interno da plessi capillari più profondi quando appiattita su lastra di vetro.
Figura 1: Doppia macchiatura immunohistochemical Pericita di cryo-sezione della retina interna ratto. (A) NG2 (verde) immunoistochimica rivela positivi vasi all'interno la parte interna della retina. Le frecce indicano il immunoreactivity circolare e a forma di ferro di cavallo nei vasi. La punta della freccia indica una nave tagliata longitudinalmente. (B), PDGFRβ (rosso) immunohistochemistry mostrano reattività simile a NG2 immunoreactivity. Frecce e arrowhead punto presso le stesse strutture per quanto riguarda NG2 macchiatura. (C), l'immagine mostra un'Unione di NG2, PDGFRβ e DAPI (blu) sovrapponendo i tre filtri diversi. Viene rivelato che i due anticorpi sono co-localizzati (verde + rosso = giallo). NF: strato delle fibre nervose, GCL: strato di cellule del ganglio, IPL: strato plessiforme interno, INL: strato nucleare interno, OPL: strato plexiform esterno, ONL: strato nucleare esterno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: macchiatura Immunohistochemical periciti di retina del ratto montato tutto. Il immunoreactivity NG2 (rosso) è visibile lungo l'intervieni vascolare superficiale intensa colorazione in abluminale periciti. Le immagini mostrano Unite NG2 e DAPI (blu). Le cellule neuronali sono visibili come i nuclei di DAPI-blu tra microvasculature NG2-macchiato. PDGFRβ immunoreactivity nella retina adulto montato tutto solo ha provocato un segnale molto debole e non è pertanto incluso in questa figura. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Doppia macchiatura immunohistochemical Pericita del vasculature retinico ipotonico isolati del ratto. (A). l'immagine mostra ipotonico isolati del ratto rete vascolare retinica immunohistochemical macchiato con NG2 (verde) e PDGFRβ (rosso). La rete completa ha mostrato il immunoreactivity NG2. Tuttavia, PDGFRβ immunoreactivity è stato trovato in somas delle cellule. L'inserto della A è una panoramica della rete sistema vascolare retinico macchiato con DAPI (blu). (B), l'immagine mostra il campione stesso come (A) a un percorso diverso e più alto ingrandimento. È chiaro che PDGFRβ colorazione compare soltanto nei somas cella nella rete vascolare che indica Pericita immunoreactivity. L'inserto di B è l'immagine che mostra ad alto ingrandimento del vasculature macchiato con NG2 (verde), PDGFRβ (rosso) e fusa con DAPI. Compreso la macchiatura DAPI insieme NG2 e PDGFRβ rivela tre periciti (PDGFRβ-positivo) e due cellule della parete nave non identificata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: esempio di una distesa vasculature retinico isolato ipotonico inadeguata. Il dispiegarsi attenta di un sistema vascolare isolato ipotonica è importante in quanto sta svolgendo insufficiente può provocare nel vasculature essere impilato. Le immagini mostrano DAPI-macchiato vasculature retinico nello stesso luogo ma presi in strati di diversa attenzione. (A) il DAPI-macchiato le cellule nello strato uno dei focus Mostra un vaso sanguigno spessa circa 25 µm nel vasculature retinico. (B) The DAPI-macchiato le cellule in un secondo strato di messa a fuoco delucidano ramificazioni sottili capillari allo stesso luogo che ha stato impilati sul più grande vaso sanguigno visualizzato in (A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo tre tecniche di preparazione della retina che possono essere applicate nello studio dei periciti microvascolari. Qui di seguito, forniamo un confronto tra ciascuno dei metodi ed evidenziare passi critici nei protocolli.
Con cryo-sezionamento, la retina è tagliata in sezioni sagittali e quindi, è possibile ottenere numerosi esemplari dalla retina stessa. Le sezioni numerale derivanti da questo metodo lo rendono la scelta ideale per la specificità dell'anticorpo e titolazione test quanto impedisce inutili sacrifici di animali. Il lavoro preparatorio è decisivo per ottenere buoni risultati. È fondamentale durante la dissezione dell'occhio non per tirare l'occhio ma per tagliare tutti i muscoli intorno all'occhio. Se si usa la forza, esiste un rischio di distacco della retina. Poiché la vaschetta oculare è sottile, uno dovrebbe non fissare troppo a lungo. Immersione con paraformaldeide al 4% in PBS per 2 – 4 h risolverà il tessuto. Se fisso più, c'è un rischio di distruggere l'antigene di interesse. Al fine di generare la migliore immunostainings possibile, è fondamentale per ogni sezione essere il più piatto possibile contro il vetro. Poiché le sezioni contengono solo qualche occasionale taglio trasversale del microvasculature, questa tecnica di preparazione del tessuto offre solo intermittente visualizzazione del microvasculature. Pertanto, questo metodo non è adatto per gli studi di architettura nel complesso vascolare e misure quantificabili di periciti.
Il sistema vascolare globale può essere macchiato dopo tutto-montaggio a fornire una panoramica del sistema vascolare. Quando padroneggiare questa tecnica, può essere una procedura di preparazione del tessuto veloce che richiede relativamente poco carico di lavoro. Tuttavia, ci sono alcuni punti da tenere particolarmente presente. La retina è fragile ed è di fondamentale importanza per maneggiarli con cura ed evitare strappi e tagli. Inoltre, maneggiando con cura la retina, è di fondamentale importanza per evitare pieghe e altri crepacci durante il montaggio che possono interessare il immunohistochemical di imaging più tardi. La retina montata ha uno spessore di 250-300 µm e anticorpo penetrazione degli strati neuronali potrebbe essere problematico. Per quanto riguarda la visualizzazione Pericita, la macchiatura NG2 nel protocollo intero-monta solo potrebbe essere raggiunto con un anticorpo secondario Cy3-collegato e immunoreactivity PDGFRβ nella retina adulto intero-montato ha provocato una molto debole segnale che non è stato indicato in la figura. Quindi, l'utilità della tecnica di colorazione del intero-monta è fortemente ostacolata dal successo colorazione dipende principalmente lo specifici anticorpi primari e secondari utilizzati. Ulteriori suggerimenti per ottimizzare il protocollo per visualizzati plexuses microvascolare di una retina di ratto adulto è tramite l'incubazione in anticorpo primario per un lungo periodo di tempo e/o modificando la temperatura di incubazione26.
A causa dello spessore del intero-montato, è importante essere consapevoli della direzione della retina dopo aver apportato le quattro incisioni dalla periferia retinica verso la testa del nervo ottico per evitare accidentale montaggio con retina interna contenente i capillari verso il basso. Ancora, la visualizzazione dettagliata dei plessi microvascolari più profondi e i pericytes può essere fastidioso con questo metodo14,20. Come intero-monta la macchiatura della retina adulta è difficile nel plesso capillare più profondo, questo risultato nella retina che appaiono avascular in alcune parti. La macchiatura di immunohistochemical della retina adulto intero-montato fornisce solo una panoramica frammentata del vasculature con periciti fodera i vasi del plesso capillare superficiale e di conseguenza, questo metodo può portare a risultati falsi negativi nella Visualizzazione del vasculature retinico del ratto.
Digestione della tripsina è stato a lungo considerata la tecnica gold standard per l'isolamento e la visualizzazione del sistema vascolare retinico20. Isolamento ipotonica fornisce un metodo alternativo per la visualizzazione dell'intera rete vascolare tridimensionale complessa e affronta molte delle stesse sfide lavorando con tessuto molto fragile che è difficile da gestire. Per la somiglianza del prodotto vascolare retinica tra i due metodi, l'isolamento ipotonico affronta molte delle stesse sfide come tripsina digestione20 compreso la dissezione attenta per evitare grandi lacrime e gestione prudente da evitare pipettaggio e toccando con il forcipe. Un'importante differenza tra i metodi è la fissazione. Digestione della tripsina viene in genere eseguita dopo la fissazione e può essere applicata con successo su retine conservate che sono stati in fissativo per diversi anni20. Ipotonica isolamento viene eseguita prima della fissazione e consente quindi l'implementazione in vari altri saggi come precedentemente descritto nella letteratura23,24,25. La digestione della tripsina viene eseguita oltre due giorni20, mentre l'isolamento ipotonico può essere completato entro le ore. Inoltre, il protocollo di isolamento ipotonica non include il rischio di sovra-digestione e scissione enzimatica di marcatori di membrana previsti per il riconoscimento di Pericita, ad esempio PDGFRβ e NG2, rendendo questo metodo preferito per successive la macchiatura di Immunohistochemical microvascolare.
Infine, anche se fuori l'ambito immediato di questo manoscritto, c'è una tecnica meno conosciuta ma molto utile per isolare plexi microvascolare grande, intatta da roditore fuori la retina27. La retina è posizionata in un alloggiamento di vetro speciale e il vetrino coprioggetti. Dopo la rimozione del vetrino coprioggetti, i resti di microcircolo collegati il coprioggetto per creare una pienamente vivo (≈ 98% delle cellule) tessuto stampa. Il più grande vantaggio di questo metodo è che esso permette lo studio fisiologico dei vasi e successiva fissazione per immunostaining. Un'evidente limitazione del metodo è che non fornisce la visualizzazione/isolamento dell'intera rete microvascolare come Monte piatto retina e fanno preparazioni ipotoniche. Ancora, i periciti possono essere visualizzati dall'applicazione di questo metodo27.
Le tecniche di preparazione del tre tessuto qui descritte sono complementari nel senso che ogni metodo comprende vantaggi e difetti per la visualizzazione dei pericytes microvascolare. La valutazione di ogni potenzialità di metodi e di debolezza è importante selezionare il metodo ottimale per indagare i pericytes microvascolari in condizioni patologiche specifiche. I metodi hanno dimostrati possono essere ampliati a macchiatura non solo per gli indicatori Pericita, ma anche per la visualizzazione di strutture microvascolari in generale. Alla fine, è per il singolo ricercatore selezionare il metodo di visualizzazione appropriato basato sull'ipotesi di ricerca in questione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
La ricerca è stata finanziata dalla Fondazione Lundbeck, Danimarca.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Geletin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G2625-500G | |
| Albumin from chicken egg white | Sigma-Aldrich | A5253-500G | |
| Deoxyribonuclease (DNAse) I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025-15KU | Dissolved in 0.15 M NaCl |
| Bovine serum albumin (BSA) | VWR | 0332-100G | |
| Normal donkey serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121, lot 129348 | |
| Rabbit anti-PDGFRβ | Santa Cruz | sc-432 | 1:100 |
| Mouse anti-NG2 | Abcam | ab50009 | 1:500 |
| Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-585-152 | 1:100 |
| Fluorescein (FITC) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-151 | 1:100 |
| Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-225-152 | 1:100 |
| Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-165-150 | 1:100 |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Dissolved in DMSO |
| Anti-fading mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| Anti-fading mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Nunc Lab-Tek II 4-well chamber slide | Thermo Fisher Scientific | 154526 |
References
- Eshaq, R. S., Aldalati, A. M. Z., Alexander, J. S., Harris, N. R. Diabetic retinopathy: Breaking the barrier. Pathophysiology. , (2017).
- Cai, W., et al. Pericytes in Brain Injury and Repair After Ischemic Stroke. Translational Stroke Research. , (2016).
- Trost, A., et al. Brain and Retinal Pericytes: Origin, Function and Role. Frontiers in Cellular Neuroscience. 10, 20 (2016).
- Ramos, D., et al. The Use of Confocal Laser Microscopy to Analyze Mouse Retinal Blood Vessels. Confocal Laser Microscopy - Principles and Applications in Medicine, Biology, and the Food Sciences. Lagali, N. , InTech. (2013).
- Moran, E. P., et al. Neurovascular cross talk in diabetic retinopathy: Pathophysiological roles and therapeutic implications. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiolog. 311, H738-H749 (2016).
- Henkind, P. Microcirculation of the peripapillary retina. Transactions - American Academy of Ophthalmology and Otolaryngology. 73, 890-897 (1969).
- Attwell, D., Mishra, A., Hall, C. N., O'Farrell, F. M., Dalkara, T. What is a pericyte? Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36, 451-455 (2016).
- Fernandez-Bueno, I., et al. Histologic Characterization of Retina Neuroglia Modifications in Diabetic Zucker Diabetic Fatty Rats. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58, 4925-4933 (2017).
- Yu, D. -Y., Yu, P. K., Cringle, S. J., Kang, M. H., Su, E. -N. Functional and morphological characteristics of the retinal and choroidal vasculature. Progress in Retinal and Eye Research. 40, 53-93 (2014).
- Allen, R. S., et al. Severity of middle cerebral artery occlusion determines retinal deficits in rats. Experimental Neurology. 254, 206-215 (2014).
- Kyhn, M. V., et al. Acute retinal ischemia caused by controlled low ocular perfusion pressure in a porcine model. Electrophysiological and histological characterisation. Experimental Eye Research. 88, 1100-1106 (2009).
- Blixt, F. W., Radziwon-Balicka, A., Edvinsson, L., Warfvinge, K. Distribution of CGRP and its receptor components CLR and RAMP1 in the rat retina. Experimental Eye Research. 161, 124-131 (2017).
- Sarlos, S., Wilkinson-Berka, J. L. The renin-angiotensin system and the developing retinal vasculature. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46, 1069-1077 (2005).
- Wittig, D., Jaszai, J., Corbeil, D., Funk, R. H. W. Immunohistochemical localization and characterization of putative mesenchymal stem cell markers in the retinal capillary network of rodents. Cells Tissues Organs. 197, 344-359 (2013).
- Tual-Chalot, S., Allinson, K. R., Fruttiger, M., Arthur, H. M. Whole mount immunofluorescent staining of the neonatal mouse retina to investigate angiogenesis in vivo. Journal of Visualized Experiments. , e50546 (2013).
- Park, D. Y., et al. Plastic roles of pericytes in the blood-retinal barrier. Nature Communications. 8, 15296 (2017).
- Hughes, S., Chan-Ling, T. Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45, 2795-2806 (2004).
- Lange, C., et al. Intravitreal injection of the heparin analog 5-amino-2-naphthalenesulfonate reduces retinal neovascularization in mice. Experimental Eye Research. 85, 323-327 (2007).
- Higgins, R. D., et al. Diltiazem reduces retinal neovascularization in a mouse model of oxygen induced retinopathy. Current Eye Research. 18, 20-27 (1999).
- Chou, J. C., Rollins, S. D., Fawzi, A. A. Trypsin digest protocol to analyze the retinal vasculature of a mouse model. Journal of Visualized Experiments. , e50489 (2013).
- Hazra, S., et al. Liver X receptor modulates diabetic retinopathy outcome in a mouse model of streptozotocin-induced diabetes. Diabetes. 61, 3270-3279 (2012).
- Zhang, L., Xia, H., Han, Q., Chen, B. Effects of antioxidant gene therapy on the development of diabetic retinopathy and the metabolic memory phenomenon. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 253, 249-259 (2015).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Navaratna, D., McGuire, P. G., Menicucci, G., Das, A. Proteolytic degradation of VE-cadherin alters the blood-retinal barrier in diabetes. Diabetes. 56, 2380-2387 (2007).
- Gustavsson, C., et al. Vascular cellular adhesion molecule-1 (VCAM-1) expression in mice retinal vessels is affected by both hyperglycemia and hyperlipidemia. PLoS One. 5, e12699 (2010).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Regulation of blood flow in the retinal trilaminar vascular network. Journal of Neuroscience. 34, 11504-11513 (2014).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Progress in Retinal and Eye Research. 31, 258-270 (2012).
