Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Bronchoalveolar Lavage Exosomes i LPS-induceret septisk lunge skade

Published: May 21, 2018 doi: 10.3791/57737

Summary

Mus udsættes for intraperitoneal LP'ER udskiller exosomes i bronchopneumoni-alveolære lavage (BAL) væske, som er pakket med miRNAs. Ved hjælp af en fælles kultur system, viser vi, at exosomes udgivet i BAL væske forstyrre udtryk for tight junction proteiner i bronchiale epitel celler og øge udtryk af pro-inflammatoriske cytokiner, at fremhæver lunge skade.

Abstract

Akut lunge skade (ALI) og Akut respiratorisk distress syndrom (ARDS) repræsenterer en heterogen gruppe af lungesygdomme, som fortsat har en høj sygelighed og dødelighed. Den molekylære patogenese af ALI bliver bedre defineret; men på grund af den komplekse karakter af sygdommen molekylære behandlingsformer har endnu skal udvikles. Her bruger vi en LPS (LPS) induceret musemodel af akut septisk lunge skade for at afgrænse rollen som exosomes i det inflammatoriske respons. Bruger denne model, har vi kunnet vise, at mus, der er udsat for intraperitoneal LP'ER udskiller exosomes i bronchopneumoni-alveolære lavage (BAL) væske fra lungerne, som er pakket med miRNA og cytokiner, der regulerer inflammatorisk respons. Yderligere ved hjælp af en fælles kultur modelsystem, viser vi, at exosomes frigivet fra makrofager forstyrrer udtryk for tight junction proteiner i bronchiale epitel celler. Disse resultater tyder på, at 1) krydstale mellem medfødte immun og strukturelle celler gennem exosomal shuttling bidrage til det inflammatoriske respons og afbrydelse af den strukturelle barriere og 2) rettet mod disse miRNAs kan give en ny platform til at behandle ALI og ARDS.

Introduction

ALI og ARDS er de livstruende former for respiratorisk svigt med svær hypoxæmi forårsaget af ikke-kardiogent lungeødem, som påvirker omkring 1 million mennesker verden over hvert år1. Ætiologien af ARDS omfatter direkte skade på lungerne fra infektioner eller aspiration og en række indirekte fornærmelser. I det seneste årti har der været en øget forståelse for de molekylære patogenese af ARDS, specifikke målrettede behandlinger for ARDS er dog endnu at være udviklet2,3.

Flere dyremodeller for akut lunge skade er blevet udviklet som giver en bro til at oversætte eksperimentelle behandlinger til humane undersøgelser4,5. Almindeligt anvendte modeller omfatter lokale installation af oliesyre, bakterier, LP'ER og bleomycin. Andre metoder omfatter iskæmi-reperfusion, cecal ligatur punktering, mekanisk ventilation-induceret stretch skade, Iltforgiftning eller systemisk administration af bakterier og LP'ER5. Disse modeller giver en nyttig biologiske system for at teste kliniske hypoteser og for udvikling af mulige behandlinger. For at simulere menneskelig ARDS, bør dyremodeller reproducere inflammation og akut skade de epitel og endothelial celler med defekter i barriere funktion i lungerne.

Exosomes er membran vesikler med 20-200 nm i diameter, hvis molekylære indhold indeholder proteiner, DNA, RNA og lipider, og lette inter cellular meddelelser i væv mikromiljø via molekylære sammensætning overførsel. Exosomes udskilles af flere typer af celler, såsom endotelceller, epitelceller, glatte muskelceller og tumorceller, og findes i menneskelige legeme væske. Undersøgelser tyder på, at exosomes regulere cross-talk mellem immunceller og stromale celler under smitsom og sterile inflammatoriske sygdomme, og deres unormale udgivelse ser ud til at være underlagt forskellige naturlige og eksperimenterende stimuli under fysiologiske og patologiske processer6. Sådanne kommunikationsnet kan spille en vigtig rolle i patogenesen af lungesygdomme og kan påvirke patofysiologiske progression7,8. Som 18-22 nukleotid ikke-kodende RNA'er, miRNAs findes i både væv og legemsvæsker, plasma, sera og modulere mRNA udtryk på posttranslationel niveau9,10.

Emballerede miRNAs i exosomes påvirke differentiering og funktion af flere typer af celler, og overdreven niveauer er forbundet med en lang række sygdomme, herunder kræft, lungesygdomme, fedme, diabetes og hjerte-kar-sygdom11, 12,13,14,15,16. Indrejse i de modtagende celler og shuttling af exosomal miRNAs lette intercellulær kommunikation modificerer hæmostase mikromiljø17,18. Akut lunge-skade er en komplekse processer, der involverer flere celletyper med omfattende intercellulær kommunikation via exosomes8. miR-155 og miR-146 deler den fælles transcriptional regulerende mekanisme og bidrage til det inflammatoriske respons og immuntolerance19,20. Nylige undersøgelser tyder på at både modulere inflammatoriske respons via exosomal miRNAs shuttling mellem immunceller21. Men de molekylære mekanismer bag modulerende virkningerne af exosomal miRNAs på alveolær svar på endotoxin forbliver uklart, utvivlsomt potentielle klinisk relevans og translationel Implikationen merit yderligere undersøgelse.

Fælles kultur modeller er ansat til at definere interaktionen mellem de specifikke celletyper i det komplekse miljø, såsom betændelse og cancer22,23. Disse platforme giver en alternativ strategi for at afhøre krydstale mellem celletyper især for immun og strukturelle celler.

Intra-luftrør, aerosolmaterialer, intraperitoneal eller systemisk administration af LP'ER er almindeligt anvendt til at fremkalde eksperimentelle lunge skade24,25,26, og har vist sig for at fremkalde epitel og endotel permeabilitet defekter. Her bruger vi intraperitoneal LP'ER til at fremkalde en septisk model af akut lunge skade i mus. Inden for 24 timer af intraperitoneal indgift af LP'ER, er permeabilitet defekter induceret i lungerne med rekruttering af inflammatoriske celler. Vi viser yderligere, at exosomes fra BAL indeholder miRNA-155 og miR-146, og exosomes fra BAL væske fremkalde pro-inflammatoriske cytokiner udtryk i modtagerens epitelceller, herunder IL-6 og TNF-α. Disse data er de første til at vise at exosomal miRNAs udskilles i BAL i denne model af akut septisk lunge skade.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den samlede protokollen kræver 2 dage, herunder den første dag af sepsis induktion og isolation af BAL væske fra dyret, og den anden dag for exosomes isolation fra mus BALF. Alle procedurer er gennemgået og godkendt af institutionelle Animal Care og brug Udvalget på Atlanta VA medical center.

1. Mouse akut septisk lunge skade Model

  1. Brug 6-8 uger - gamle mandlige vildtype C57BL/6J mus (vægt 20-22 g) for dyret model, og udføre alle procedurer ved hjælp af aseptisk teknikker og instrumenter. Autoklave alle kirurgiske instrumenter, herunder pincet og saks i 20 min ved 121 ° C.
  2. Tilfældigt distribuere mus i eksperimentelle og kontrolgruppen. Dy mus på en kirurgisk bord. Behandling af musene med Escherichia coli LPS (LP'ER, 15 mg/kg) ved intraperitoneal rute. Ifølge den enkelte kropsvægt, fortyndes passende LP'ER doser til 0,1 mL PBS pr. mus, derefter indsprøjtes LP'ER løsning ved hjælp af en 1 mL sprøjte med 27 G kanyle og indsprøjtes et tilsvarende volumen af PBS kontrol dyr.
  3. Holde mus i den animalske BSL2 anlæg, der består af ren bure på passende rumtemperatur.
  4. 24 timer senere, aflive mus med CO2 indånding.
  5. Vælg den kirurgisk område i midten af musen hals. Gør et lille snit (ca. 5 mm), og forsigtigt adskille musklerne for adgang til luftrøret ved hjælp af stump pincet, indtil luftrøret er eksponeret.
  6. Trække musen BAL væske med 10 mL steril sprøjte med en 27 G kanyle. Først, forsigtigt, indsætte nålen ind i luftrøret og indsprøjte 1 mL steril PBS langsomt i luftrøret, og derefter trække BALF ind i en 3 mL engangs sprøjte med en 27 G kanyle. Efter afslutningen af proceduren, bortskaffe sprøjter og nåle i biohazard skarpe container.
  7. Behandle kirurgiske instrumenter med chlordioxid, som tidligere beskrevet af Chauret et al. 27, og derefter sterilisere alle kirurgiske instrumenter ved autoklavering i 20 min ved 121 ° C.

2. Exosomes Isolation-serie Ultra-centrifugering og karakterisering

  1. Indsamle mus BAL væske i 15 mL konisk rør. At høste alveolær celler, centrifuge prøver i 10 min på 1.000 g på 4 ° C.
  2. Overføre supernatanten til nye 15 mL koniske rør og derefter centrifugeres prøver for 30 min på 4.000 x g ved 4 ° C til at fjerne celle debris.
  3. Indsamle supernatanten i ultracentrifuge rør og centrifugeres prøver i 60 min på 10.000 x g ved 4 ° C til at fjerne større cellulære partikler.
  4. Overføre supernatanten til nye koniske rør og derefter filtrere prøverne gennem 0,2 µm sprøjte-filter til at fjerne resterende større partikler.
  5. Indsamle prøver i ultracentrifuge rør, og balance rør. Der centrifugeres prøver for 2 h på 140.000 x g ved 4° C at sammenpresse exosomes.
    Bemærk: Størrelsen af exosomes varierer 20-200 nm. 0,2 µm filter bruges til at fjerne større partikler, der er mere end 200 nm i størrelse.
  6. Kassér analysere forsigtigt. Opløse pellet med 100 µL PBS eller lysis løsning og overførsel exosomes prøver at 1,5 mL rør, og opbevares ved-80 ° C indtil brug.
    Bemærk: Transmissions-elektronmikroskop anbefales at kontrollere isoleret exosomes.
  7. Følg standardprøven TEM behandling protokol28. Analysere exosomes prøver ved hjælp af transmissions elektronmikroskopi og tage billeder, skala bar 200 nm.

3. forberedelse af miRNA og Performing miRNA-q-RT-PCR

Bemærk: miRNA-q-RT-PCR anbefales at analysere udtryk niveau af miRNAs.

  1. Følg standard miRNAs isolation protokol og sørg for at bruge et tilsvarende beløb af renset RNA'er i enkelt-strenget reverse transkription24.
  2. Følg den standard real-time PCR-protokol for at opdage exosomal mikroRNA niveau i BAL væske. Brug specifikke real-time PCR primere mod miR-155, miR-146 og U6 SnRNA. Køre PCR reaktion med kvantitativ PCR apparatet og normalisere udtryk værdier til intern kontrol U6 snRNA.
    Bemærk: Hver gruppe består af tredobbelt prøver24.

4. Exosomes mærkning og rensning

  1. Suspendere exosomes pellet med 100 µL suspension løsning i en 1,5 mL polypropylen tube, derefter tilføje 0,4 µL af exosomes farvestoffet ind i andre rør med 100 µL af opløsningen suspension.
  2. Hurtigt tilføje exosomes i opløsningen til farvestof løsning og bland det grundigt af pipettering. Holde prøver for 5 min ved stuetemperatur, beskytte mod lys.
  3. Sætte en exosome spin kolonne i 1,5 mL eluering rør. Overføre løsning blandingen til midten af kolonnen exosome spin.
  4. Spin kolonnen for 2 min på 800 x g ved stuetemperatur.
  5. Kassér kolonnen og gemme den eluted prøve ved-20 ° C indtil brug.

5. validering af Exosomes op taget af modtagerens celler

  1. Frø 1 x 104 MLE 12 /cell i en 8-godt kammer dias og kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2.
  2. Tilføje 10 µL fluorescerende-mærket exosomes til cellerne. Inkuber i 1 time ved 37 ° C.
  3. Fjerne dyrkningsmedier og vaske cellerne med PBS, så fix celler med 1% PARAFORMALDEHYD i 10 minutter ved stuetemperatur.
  4. Mount diaset i mount medium med DAPI.
  5. Analysere prøver gennem et fluorescens mikroskop og tage billeder, 40 X forstørrelse.

6. kontrol af samspillet mellem Exosomes og modtagende celler

  1. Frø 2 x 105 MLE12/brønd i en 12-godt kultur plade der indeholder passende næringssubstratet og kultur celler ved 37 ° C, 5% CO2.
  2. Tilføje 20 µg exosomes fra mus BAL væske til MLE12 celler og konfigurere replikater pr. eksperimentelle gruppe.
  3. 24 timer senere, vaske cellerne med PBS og tilføje 600 µL lysisbuffer i brønd. Forsigtigt ryste pladen og indsamle lysis prøver i 1,5 mL rør med en pipette.
  4. Følg standard total RNA isolering- og cDNA reverse transkription protokollen, komplet single-streng cDNA reverse transkription29.
  5. Følg den standard real-time PCR-protokol til påvisning af mRNA udtryk niveau i modtagerens celler29. Brug specifikke real-time PCR primere mod TNF-α, IL-6 og ZO-1. Køre PCR reaktioner med kvantitativ PCR apparatet og normalisere udtryk værdier til den interne kontrol GAPDH.
    Bemærk: Hver gruppe består af tredobbelt prøver.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at fremkalde septisk lunge skade, blev mus behandlet med intraperitoneal LP'ER (15 mg/kg). Inden for 24 timer af LP'ER administration, blev neutrophilic tilstrømningen set i lungerne, som vist i figur 1A. Musen BAL væske var udarbejdet, efterfulgt af isolering og oprensning af exosomes. Morfologi af BALF exosomes blev bekræftet af elektron transmission mikroskopi (figur 1B).

Udtrykket selektiv pro-inflammatoriske miRNAs miRNA-155 og miR-146 blev opdaget af q-RT-PCR fra den renset exosomes. Udtrykket niveauer af miR-155 og miR-146 var steget betydeligt i BAL væske exosomes fra mus, der blev behandlet med LP'ER, sammenlignet med kontrol mus behandlet med PBS (miR-155, 1 ± 0,16 vs 11.6 ± 0,6, miR-146, 1 ± 0,12 vs 13,5 ± 1.186) (figur 2).

For at definere de funktionelle virkninger af exosomes, blev mus bronchiale epitel celler (MLE12 celler) behandlet med renset exosomes udvundet af BAL væske i mus behandlet med LP'ER eller PBS, henholdsvis. Først, vi beviste indtastning af BALF exosomes i modtagerens epitelceller. BALF exosomes blev mærket med PKH-67, og co kulturperler med MLE12 celler, og derefter fluorescens mikroskop billeder viser udbredelsen af exosomes af epitelceller (figur 3A). Udtryk af pro-inflammatoriske mediator, TNF-α og IL-6 var steget betydeligt i epitelceller, der var Co kulturperler med exosomes fra LPS behandlede mus, sammenlignet med kontrolgruppen (TNF-α, 1 ± 0,13 vs 5.01 ± 0,22; Il-6, 1 ± 0,02 vs 1,72 ± 0,17) (figur 3B). Vi bestemt også udtryk for tight junction protein ZO-1 som et surrogat for epitelial integritet. Celler, der blev behandlet med exosomes fra LPS behandlede mus viste en markant svækket udtryk af ZO-1, sammenlignet med LPS behandlede kontrol mus (ZO-1, 1 ± 0,12 vs 0.66 ± 0,13) (figur 3 c).

Figure 1
Figur 1: karakterisering af exosomes isoleret fra BAL væske af LPS-behandlede mus. C57BL/6J mus blev behandlet med intraperitoneal injektion af LP'ER (15mg/kg) (N = 5), PBS blev brugt som kontrol (N = 5). 24 timer senere, mus blev aflivet, og BAL væske blev udført. Repræsentative billeder af musen lungevæv behandlet med LP'ER og PBS viser akut lunge skade, skalalinjen, 50 µm, A). Exosomes blev udvundet fra BAL væske. Transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) analyse viser exosomes, skalere bar, 200 nm, B). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Exosomal miRNAs udtryk i BAL væske isoleret fra LP'ER-behandlede mus. C57BL/6J mus blev udfordret med intraperitoneal LP'ER. Udtryk for selektiv MicroRNA blev analyseret gennem q-RT-PCR og normaliseret til U6 udtryk. A) miR-155; B) miR-146. n = 5 mus pr. gruppe. Student's test, * P < 0,05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: udtryk af inflammatoriske cytokiner og tight junction protein i mus epitelceller behandlet med exosomes. BAL væske-afledte exosomes var mærket med PKH-67, og fluorescens mikroskop viser PKH67 mærket exosomes (grøn), DAPI(Blue) og flettede billeder af Vis optagelsen af exosomes i MLE12 celler, skalalinjen, 50 µm, som vist i A). Musen epitelceller MLE12 var Co kulturperler med exosomes isoleret fra BAL væske fra mus behandlet med LP'ER eller PBS. 24 timer senere, celler er høstet, og total RNA blev isoleret. Udtryk af TNF-α og IL-6 blev målt med q-RT-PCR, normaliseret til GAPDH intern kontrol. (B) TNF-α og c IL6; (D) ZO-1 mRNA udtryk blev målt med q-RT-PCR. * P < 0,05, Student's test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Musemodeller af sygdomme er almindeligt anvendt til at evaluere den fysiologiske funktion af specifikke gener og reducere omkostningerne ved eksperimenter2. Den akutte septiktanke lunge skade beskrevet her efterligner inflammatorisk reaktion ses hos mennesker med ARDS. Denne model er relevante at undersøge den molekylære patogenese, udvikling af biomarkører og teste potentielle nye behandlingsformer5.

Fælles kultur systemer er relevante for i vivo undersøgelser i forbindelse med at undersøge potentielle mekanismer for overførsel af biologiske molekyler som RNA, DNA, lipider og proteiner i et in vitro system23,30. Nogle af disse platforme har stor nytte i vurderingen af mekanistisk forståelse og udvikling af terapier for komplekse sygdomme22,23. Som vist her exosomes fra lavage celler (makrofager, neutrofiler) kan påvirke integriteten af strukturelle epitelceller gennem overførsel af exosomes.

De pathobiological virkninger af exosomes fremstår som kritisk aspekt i menneskelige sygdomme både fra diagnostiske og den terapeutiske synsvinkel og forstå sygdom patogenese31,32. For at isolere exosomes fra biologiske væsker, omfatter de mest almindeligt anvendte teknik differential centrifugering kombineret med ultracentrifugering som beskrevet her33,34. Denne teknik har flere styrker, men er begrænset af, at det kan være tidskrævende og risikoen for forurening med ikke-exosomal proteiner. Nye strategier er blevet foreslået til at overvinde disse begrænsninger, som exosome isolationen af tæthed farveforløb eller immun-affinitet eller størrelse-afhængige metode35. Exosomes er ved at blive undersøgt i kliniske studier som biomarkører for diagnose og prognose, og udvikling af målrettede behandlinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbejde blev støttet af VA Merit Review 2I01BX001786-06A1 midler til RS.

Acknowledgments

Forfatterne har erklæret nogen interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
lipopolysaccharide Sigma-Aldrich Escherichia coli 055:B5
PBS pH7.2(1X) Life technologies 20012-027
mirVana miRNA isolation kit Thermo Fisher 449774
TaqMan Gene Expression Master Mix Thermo Fisher 4369016
mmu-miR-155 (002571) primer Thermo Fisher 4427975
has-miR-146a (000468) primer Thermo Fisher 4427975
U6snRNA primer Thermo Fisher 4427975
TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer Thermo Fisher 4331182
IL-6 (Mm00446190_m1   )primer Thermo Fisher 4331182
ZO-1 (Mm00493699_m1  )primer Thermo Fisher 4331182
minimal essential medium (MEM) Thermo Fisher 11095-072
Trysin-EDTA solution(0.05%) Thermo Fisher 25300054
Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit  Sigma-Aldrich MINI67-1KT
Exosome Spin Columns (MW3000) Thermo Fisher 4484449
Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge  Beckman Coulter L-100XP
Ultra-clear centrifuge tubes Beckman Coulter 344058
Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System Thermo Fisher
transmission electron microscopes (TEM) JEOL Ltd 120 kV TEM
Olympus BX41 microscope Olympus BX41

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubenfeld, G. D., Herridge, M. S. Epidemiology and outcomes of acute lung injury. Chest. 131, 554-562 (2007).
  2. Baron, R. M., Choi, A. J., Owen, C. A., Choi, A. M. Genetically manipulated mouse models of lung disease: potential and pitfalls. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L485-L497 (2012).
  3. Han, S., Mallampalli, R. K. The acute respiratory distress syndrome: from mechanism to translation. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 855-860 (1950).
  4. Aeffner, F., Bolon, B., Davis, I. C. Mouse Models of Acute Respiratory Distress Syndrome: A Review of Analytical Approaches, Pathologic Features, and Common Measurements. Toxicologic pathology. 43, 1074-1092 (2015).
  5. Matute-Bello, G., Frevert, C. W., Martin, T. R. Animal models of acute lung injury. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L379-L399 (2008).
  6. Terrasini, N., Lionetti, V. Exosomes in Critical Illness. Critical care medicine. , (2017).
  7. Fujita, Y., Kadota, T., Araya, J., Ochiya, T., Kuwano, K. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. , (2017).
  8. Kubo, H. Extracellular Vesicles in Lung Disease. Chest. 153, 210-216 (2018).
  9. Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nature reviews. Genetics. 11, 597-610 (2010).
  10. Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136, 215-233 (2009).
  11. Fanini, F., Fabbri, M. CANCER-DERIVED EXOSOMIC microRNAs SHAPE THE IMMUNE SYSTEM WITHIN THE TUMOR MICROENVIRONMENT: STATE OF THE ART. Seminars in cell & developmental biology. , (2016).
  12. Agarwal, U., et al. Experimental, Systems, and Computational Approaches to Understanding the MicroRNA-Mediated Reparative Potential of Cardiac Progenitor Cell-Derived Exosomes From Pediatric Patients. Circulation research. 120, 701-712 (2017).
  13. Prattichizzo, F., et al. Extracellular microRNAs and endothelial hyperglycaemic memory: a therapeutic opportunity? Diabetes, obesity & metabolism. 18, 855-867 (2016).
  14. Huang-Doran, I., Zhang, C. Y., Vidal-Puig, A. Extracellular Vesicles: Novel Mediators of Cell Communication In Metabolic Disease. Trends in endocrinology and metabolism: TEM. 28, 3-18 (2017).
  15. Khalyfa, A., et al. Circulating Plasma Extracellular Microvesicle MicroRNA Cargo and Endothelial Dysfunction in Children with Obstructive Sleep Apnea. American journal of respiratory and critical care medicine. 194, 1116-1126 (2016).
  16. Thomou, T., et al. Adipose-derived circulating miRNAs regulate gene expression in other tissues. Nature. 542, 450-455 (2017).
  17. Gregson, A. L., et al. Altered Exosomal RNA Profiles in Bronchoalveolar Lavage from Lung Transplants with Acute Rejection. American journal of respiratory and critical care medicine. 192, 1490-1503 (2015).
  18. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature cell biology. 9, 654-659 (2007).
  19. Doxaki, C., Kampranis, S. C., Eliopoulos, A. G., Spilianakis, C., Tsatsanis, C. Coordinated Regulation of miR-155 and miR-146a Genes during Induction of Endotoxin Tolerance in Macrophages. Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5750-5761 (2015).
  20. Schulte, L. N., Westermann, A. J., Vogel, J. Differential activation and functional specialization of miR-146 and miR-155 in innate immune sensing. Nucleic acids research. 41, 542-553 (2013).
  21. Alexander, M., et al. Exosome-delivered microRNAs modulate the inflammatory response to endotoxin. Nature communications. 6, 7321 (2015).
  22. Yuan, Z., et al. TREM-1 is induced in tumor associated macrophages by cyclo-oxygenase pathway in human non-small cell lung cancer. PloS one. 9, e94241 (2014).
  23. Xu, R., Richards, F. M. Development of In Vitro Co-Culture Model in Anti-Cancer Drug Development Cascade. Combinatorial chemistry & high throughput screening. 20, 451-457 (2017).
  24. Yuan, Z., et al. TREM-1-accentuated lung injury via miR-155 is inhibited by LP17 nanomedicine. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. , L426-L438 (2016).
  25. Sadikot, R. T., et al. High-dose dexamethasone accentuates nuclear factor-kappa b activation in endotoxin-treated mice. American journal of respiratory and critical care medicine. 164, 873-878 (2001).
  26. Yuan, Z., et al. Curcumin mediated epigenetic modulation inhibits TREM-1 expression in response to lipopolysaccharide. The international journal of biochemistry & cell biology. 44, 2032-2043 (2012).
  27. Chauret, C. P., et al. Chlorine dioxide inactivation of Cryptosporidium parvum oocysts and bacterial spore indicators. Applied and environmental microbiology. 67, 2993-3001 (2001).
  28. Cizmar, P., Yuana, Y. Detection and Characterization of Extracellular Vesicles by Transmission and Cryo-Transmission Electron Microscopy. Methods in molecular biology. , Clifton, N.J. 221-232 (2017).
  29. Yuan, Z., et al. HIV-related proteins prolong macrophage survival through induction of Triggering receptor expressed on myeloid cells-1. Scientific reports. 7, 42028 (2017).
  30. Jackson, M. V., et al. Analysis of Mitochondrial Transfer in Direct Co-cultures of Human Monocyte-derived Macrophages (MDM) and Mesenchymal Stem Cells (MSC). Bio-protocol. 7, (2017).
  31. Fujita, Y., et al. Extracellular Vesicles: New Players in Lung Immunity. American journal of respiratory cell and molecular biology. 17, 474-484 (2017).
  32. Gunasekaran, M., et al. Donor-Derived Exosomes With Lung Self-Antigens in Human Lung Allograft Rejection. American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, 474-484 (2017).
  33. Kalra, H., et al. Comparative proteomics evaluation of plasma exosome isolation techniques and assessment of the stability of exosomes in normal human blood plasma. Proteomics. 13, 3354-3364 (2013).
  34. Baranyai, T., et al. Isolation of Exosomes from Blood Plasma: Qualitative and Quantitative Comparison of Ultracentrifugation and Size Exclusion Chromatography Methods. PloS one. 10, e0145686 (2015).
  35. Nordin, J. Z., et al. Ultrafiltration with size-exclusion liquid chromatography for high yield isolation of extracellular vesicles preserving intact biophysical and functional properties. Nanomedicine : nanotechnology, biology, and medicine. 11, 879-883 (2015).

Tags

Genetik spørgsmålet 135 Exosomes MicroRNA miR-155 miR-146 LP'ER lunge sepsis
Bronchoalveolar Lavage Exosomes i LPS-induceret septisk lunge skade
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yuan, Z., Bedi, B., Sadikot, R. T.More

Yuan, Z., Bedi, B., Sadikot, R. T. Bronchoalveolar Lavage Exosomes in Lipopolysaccharide-induced Septic Lung Injury. J. Vis. Exp. (135), e57737, doi:10.3791/57737 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter