Summary
Des souris exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent des exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaire qui sont emballés avec les miARN. À l’aide d’un système de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés dans le liquide BAL perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques et augmenter l’expression des cytokines pro-inflammatoires qui accentuent les lésions pulmonaires.
Abstract
Lésion pulmonaire aiguë (ALI) et syndrome de détresse respiratoire aiguë (SDRA) représentent un groupe hétérogène de maladies pulmonaires qui continue d’avoir un taux élevé de morbidité et de mortalité. La pathogenèse moléculaire d’ALI sont mieux définis ; Toutefois, en raison de la complexité de la maladie thérapies moléculaires doivent encore être développées. Ici, nous utilisons un modèle de souris induite de lipopolysaccharides (LPS) de la lésion pulmonaire septique aiguë afin de délimiter le rôle des exosomes dans la réponse inflammatoire. En utilisant ce modèle, nous avons été en mesure de démontrer que les souris qui sont exposées aux LPS intrapéritonéales sécrètent exosomes dans le liquide de lavage (BAL) Broncho-alvéolaires des poumons qui sont emballés avec miRNA et cytokines qui régulent la réponse inflammatoire. En utilisant un système de modèle de culture mixte, nous montrons que les exosomes libérés des macrophages perturber l’expression des protéines de jonction serrées dans les cellules épithéliales bronchiques. Ces résultats suggèrent que la diaphonie 1) entre les cellules immunitaires et structurels innées grâce à la navette d’exosomal contribuent à la réponse inflammatoire et rupture de la barrière physique et 2) ciblant ces miARN peut fournir une nouvelle plate-forme pour traiter ALI et SDRA.
Introduction
ALI et SDRA est les formes mortelles de l’insuffisance respiratoire avec hypoxémie sévère causée par un oedème pulmonaire non cardiogénique qui affecte environ 1 million de personnes de partout dans le monde chaque année1. L’étiologie de l’ARDS comprend atteinte directe aux poumons contre les infections ou aspiration et une variété d’injures indirectes. Ces dix dernières années, il y a eu une meilleure compréhension de la pathogenèse moléculaire de SDRA, cependant, des traitements spécifiques ciblés pour ARDS sont encore à être développé2,3.
Plusieurs modèles animaux de la lésion pulmonaire aiguë ont été développés qui fournissent un pont pour la traduction des traitements expérimentaux pour les études humaines4,5. Les modèles couramment utilisés incluent installation locale d’acide oléique, les bactéries, les LPS et la bléomycine. Autres approches incluent l’ischémie-reperfusion, perforation caecale ligature, lésion stretch induite par la ventilation mécanique, hyperoxie ou administration systémique de bactéries et de LPS5. Ces modèles offrent un système biologique utile pour tester des hypothèses cliniques et pour le développement des thérapies potentielles. Pour simuler le SDRA humaine, modèles animaux doivent reproduire l’inflammation et des lésions aiguës aux cellules épithéliales et endothéliales présentant des défauts en fonction de la barrière dans les poumons.
Exosomes sont des vésicules de la membrane avec 20-200 nm de diamètre, dont le contenu moléculaire contient des protéines, ADN, ARN et lipides, et faciliter les communications inter-cellulaires dans le microenvironnement des tissus par transfert de composition moléculaire. Exosomes sont sécrétées par différents types de cellules comme les cellules endothéliales, les cellules épithéliales, les cellules musculaires lisses et les cellules tumorales et existent en liquide de corps humain. Études indiquent que les exosomes réglementer la diaphonie entre les cellules immunitaires et les cellules du stroma au cours des maladies inflammatoires infectieuses et stériles, et leur libération anormale semble être régulés par divers stimuli naturels et expérimentales au cours physiologique et les processus pathologiques6. Tel réseau de communication peut-être jouer un rôle important dans la pathogenèse des maladies pulmonaires et peut affecter la progression physiopathologiques7,8. Sous le nom de 18-22 nucléotides ARN non codants, miRNAs existe dans les tissus et fluides corporels, plasma, sérum et module l’expression de l’ARNm à post-traductionnelles niveau9,,10.
MiARN emballés dans les exosomes influence la différenciation et la fonction des différents types de cellules, et des niveaux excessifs sont associées à une variété de maladies, y compris le cancer, maladies pulmonaires, obésité, diabète et maladies cardiovasculaires11, 12,13,14,15,16. Entrée dans les cellules réceptrices et faire la navette des miARN exosomal faciliter les communications intercellulaires modifiant l’hémostase du microenvironnement17,18. Lésion pulmonaire aiguë est un processus complexe, faisant intervenir plusieurs types de cellules avec une vaste communication intercellulaire à exosomes8. miR-155 et miR-146 a partagent le mécanisme de régulation transcriptionnel commun et contribuent à la réponse inflammatoire et de la tolérance immunitaire19,20. Des études récentes indiquent que les deux modulent la réponse inflammatoire via exosomal miARN faisant la navette entre cellules immunitaires21. Cependant, les mécanismes moléculaires qui sous-tendent les effets modulateurs des miARN exosomal sur réponse alvéolaire à l’endotoxine demeurent obscures, sans aucun doute la pertinence clinique potentielle et le translationnelle implication mérite un complément d’enquête.
Modèles de co-culture sont utilisées pour définir l’interaction entre les types de cellules spécifiques dans l’environnement complexe, tels que l’inflammation et le cancer22,23. Ces plates-formes fournissent une autre stratégie pour interroger la diaphonie entre les types de cellules en particulier pour les cellules immunitaires et structurels.
Intra-trachéale, administration en aérosol, intrapéritonéale ou systémique de LPS sont largement utilisés pour induire pulmonaire expérimentale blessure24,25,26et ont montré pour induire la perméabilité épithéliale et endothéliale les défauts. Ici nous utilisons intrapéritonéales LPS pour induire un modèle septique de lésion pulmonaire aiguë chez les souris. Dans les 24h de l’administration intrapéritonéale de LPS, défauts de perméabilité sont induites dans les poumons avec le recrutement des cellules inflammatoires. En outre, nous montrons qu’exosomes de BAL contiennent miRNA-155 et miR-146 a, et induire des exosomes de LBA expression de cytokines pro-inflammatoires dans les cellules épithéliales bénéficiaires, y compris l’IL-6 et TNF-α. Ces données sont les premiers à montrer qu’exosomal miARN sont sécrétées en BAL dans ce modèle de lésion pulmonaire septique aiguë.
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Protocol
Le protocole général nécessite 2 jours, y compris le premier jour de l’induction de la septicémie et l’isolement des LBA de l’animal et le deuxième jour pour les exosomes d’isolement de la souris BALF. Toutes les procédures ont été examinées et approuvées par le Comité de l’urbanisme à Atlanta VA medical center et d’institutionnels animalier.
1. souris modèle de blessure pulmonaire septique aiguë
- Utilisez 6 à 8 semaines - vieux mâles C57BL/6J souris de type sauvage (poids 20 à 22 g) pour l’animal modèle et effectuez toutes les procédures à l’aide d’instruments et techniques aseptiques. Stériliser tous les instruments chirurgicaux, y compris les pinces et ciseaux pendant 20 min à 121 ° C.
- Au hasard de distribuer souris dans expérimental et le groupe témoin. Immobiliser la souris sur un plateau chirurgical. Traiter les souris avec Escherichia coli lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg) par voie intrapéritonéale. Selon le poids du corps individuel, diluer les doses appropriées de LPS à 0,1 mL de PBS par souris, puis injecter la solution de LPS à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille 27 G et injecter un volume équivalent de PBS aux animaux témoins.
- Garder les souris dans l’animalerie BSL2, qui se compose des cages propres à la température appropriée.
- 24 h plus tard, euthanasier souris avec inhalation de CO2 .
- Sélectionnez la zone chirurgicale au centre du cou de la souris. Faire une petite incision (environ 5 mm) et de séparer doucement les muscles pour l’accès à la trachée avec une pincette émoussé jusqu'à ce que la trachée est exposée.
- Retirer le liquide BAL souris avec seringue stérile de 10 mL avec une aiguille de 27 G. Tout d’abord, doucement, introduire l’aiguille dans la trachée et injecter 1 mL de PBS stérile lentement dans la trachée, puis dessiner BALF dans une seringue de 3 mL avec une aiguille de 27 G. Une fois la procédure terminée, jeter des seringues et des aiguilles dans le conteneur pour objets tranchants biohazard.
- Traiter des instruments chirurgicaux au dioxyde de chlore, comme décrit plus haut par Chauret et al. 27et puis stériliser tous les instruments chirurgicaux à l’autoclave pendant 20 min à 121 ° C.
2. les Exosomes isolement-série Ultra-centrifugation et caractérisation
- Recueillir le liquide BAL souris en tubes coniques 15 mL. Pour récolter les cellules alvéolaires, centrifuger les échantillons pendant 10 min à 1 000 g, à 4 ° C.
- Transférer le liquide surnageant dans de nouveaux tubes coniques 15 mL, puis centrifuger les échantillons pendant 30 min à 4 000 x g à 4 ° C pour éliminer les débris cellulaires.
- Recueillir le liquide surnageant dans les tubes de l’ultracentrifugation et centrifuger les échantillons pendant 60 min à 10 000 x g à 4 ° C pour éliminer les grosses particules cellulaires.
- Transférer le liquide surnageant dans de nouveaux tubes coniques, puis filtrer les échantillons par le biais de 0,2 µm-filtre de seringue pour enlever le restant des particules plus grosses.
- Prélever des échantillons dans des tubes de l’ultracentrifugation et équilibrer les tubes. Centrifuger les échantillons pendant 2 h à 140 000 x g à 4° C pour granuler les exosomes.
Remarque : La taille des exosomes varie de 20 à 200 nm. 0,2 µm filtre est utilisé pour enlever les plus grosses particules qui sont plus de 200 nm de taille. - Jeter les surnageants doucement. Dissoudre le culot avec 100 µL PBS ou solution de lyse et transfère exosomes des échantillons aux tubes de 1,5 mL et conserver à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : Microscope électronique en Transmission est recommandé de vérifier les exosomes isolés. - Suivez l’échantillon standard de TEM protocole28de traitement. Analyser les exosomes des échantillons à l’aide de la microscopie électronique à transmission et prendre des images, balance bar 200 nm.
3. préparation de miRNA et Performing miRNA-q-RT-PCR
Note : miRNA-q-RT-PCR est recommandé d’analyser le niveau d’expression des miARN.
- Suivre le protocole d’isolement standard miRNAs et assurez-vous d’utiliser une quantité égale d’ARN purifié dans la transcription inverse monocaténaire24.
- Suivez le protocole standard de PCR en temps réel pour détecter les exosomal micro-ARN niveau liquide BAL. Utiliser des amorces PCR en temps réel spécifiques contre miR-155, miR-146 a et ARNsn U6. Exécutez la réaction PCR avec l’appareil PCR quantitative et normaliser les valeurs de l’expression de contrôle interne U6 snRNA.
Remarque : Chaque groupe se compose des échantillons en triple24.
4. les Exosomes d’étiquetage et de Purification
- Suspendre les exosomes granule avec 100 µL de solution de suspension dans un tube en polypropylène de 1,5 mL, puis ajouter 0,4 µL du colorant exosomes dans l’autre tube avec 100 µL de la solution de suspension.
- Rapidement ajouter exosomes dans la solution à la solution de colorant et bien mélanger en pipettant également. Conserver les échantillons pendant 5 min à température ambiante, protéger de la lumière.
- Mettre une colonne exosome dans un tube d’élution de 1,5 mL. Transférer le mélange de la solution vers le centre de la colonne à centrifuger exosome.
- Faire tourner la colonne pendant 2 min à 800 x g à la température ambiante.
- Jeter la colonne et conserver l’échantillon éluée à-20 ° C jusqu'à l’utilisation.
5. validation des Exosomes Up prises par cellules réceptrices
- Graines de 1 x 104 MLE 12 virus dans une lame de 8 puits chambre et des cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Ajouter 10 µL fluorescent-étiquetées exosomes aux cellules. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C.
- Retirez les supports de culture et laver les cellules avec du PBS, puis fixer les cellules avec paraformaldéhyde à 1 % pendant 10 minutes à température ambiante.
- Montez la diapositive dans le milieu de montage au DAPI.
- Analyser des échantillons par un microscope à fluorescence et prendre des photos, un grossissement de 40 X.
6. vérification de l’Interaction entre les Exosomes et cellules réceptrices
- Graine 2 x 105 MLE12/puits dans une plaque de culture de 12 puits contenant le milieu de culture approprié et des cellules de culture à 37 ° C, 5 % de CO2.
- Ajouter 20 µg exosomes de fluide de souris BAL à cellules MLE12 et mettre en place les répétitions par groupe expérimental.
- 24 h plus tard, laver les cellules avec du PBS et ajouter 600 µL de tampon de lyse dans le puits. Agiter la plaque doucement et recueillir des échantillons de lyse en tube 1,5 mL avec la pipette.
- Suivre le protocole standard d’isolement du RNA total et protocole de transcription inverse d’ADNc, complète l’ADNc monocaténaire transcription réverse29.
- Suivez le protocole standard de PCR en temps réel pour détecter le niveau d’expression ARNm dans les cellules réceptrices29. Utiliser des amorces PCR en temps réel spécifiques contre le TNF-α, IL-6 et ZO-1. Exécutez des réactions de PCR avec les appareils PCR quantitatives et normaliser les valeurs de l’expression au contrôle interne GAPDH.
Remarque : Chaque groupe se compose d’échantillons en triple.
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Representative Results
Pour provoquer des lésions pulmonaires septiques, les souris ont été traitées avec le LPS intrapéritonéales (15 mg/kg). Dans les 24h de l’administration de LPS, afflux de neutrophile a été observé dans les poumons, comme illustré dans la Figure 1 a. Souris LBA a été dessiné, suivie par l’isolement et la purification des exosomes. Morphologie des exosomes BALF a été confirmée par microscopie électronique à transmission (Figure 1 b).
Expression des miARN pro-inflammatoires sélective miRNA-155 et miR-146 a ont été détectés par q-RT-PCR à partir les exosomes purifiée. Niveaux d’expression de miR-155 et miR-146 a ont augmenté significativement chez les exosomes fluide BAL des souris qui ont été traités au LPS, par rapport aux souris témoins traités avec du PBS (miR-155, 1 ± 0,16 vs 11,6 ± 0,6 ; miR-146 a, 1 ± 0,12 vs 13,5 ± 1,186) (Figure 2).
Pour définir les effets fonctionnels d’exosomes, cellules épithéliales bronchiques de souris (cellules MLE12) ont été traités avec des exosomes purifiées extraites de liquide BAL des souris traitées avec LPS ou PBS, respectivement. Tout d’abord, nous avons prouvé entrée de BALF exosomes dans les cellules épithéliales destinataires. BALF exosomes ont été marqués par PKH-67 et conjointement mis en culture avec des cellules MLE12, et puis des images de microscopie par fluorescence montrent l’adoption des exosomes par les cellules épithéliales (Figure 3 a). Expression de médiateur pro-inflammatoire, TNF-α et IL-6 avaient considérablement augmenté dans les cellules épithéliales qui sont cultivés conjointement avec les exosomes des souris LPS traités, comparés au groupe témoin (TNF-α, 1 ± 0,13 vs 5.01 ± 0,22 ; Il-6, 1 ± 0,02 vs 1,72 ± 0,17) (Figure 3 b). Nous avons également déterminé que l’expression des protéines de jonction serrées ZO-1 comme un substitut pour l’intégrité épithéliale. Les cellules qui ont été traités avec des exosomes de LPS traitement des souris ont montré une expression nettement atténuée du ZO-1, par rapport aux souris témoins de LPS traités (ZO-1, 1 ± 0,12 vs 0,66 ± 0,13) (Figure 3).
Figure 1: caractérisation des exosomes isolées du LBA de souris traitées au LPS. Les souris C57BL/6J ont été traités par injection intrapéritonéale de LPS (15mg/kg) (N = 5), PBS a été utilisé comme contrôle (N = 5). 24 h plus tard, les souris ont été euthanasiés, et LBA a été réalisée. Des images représentatives des tissus pulmonaires de souris traitement avec LPS et PBS montrant la lésion pulmonaire aiguë, Echelle, 50 µm, A). Exosomes ont été extraites de la LBA. Transmission electron microscopy (TEM) analyse montrant exosomes, échelle bar, 200 nm, B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2: Exosomal miARN expression dans LBA isolé de souris traitées au LPS. Les souris C57BL/6J ont été contestées avec LPS intrapéritonéales. Expression des microARN sélectifs ont été analysés par le biais de q-RT-PCR et normalisé à l’expression U6. A) miR-155 ; B) miR-146 a. n = 5 souris par groupe. Test de Student, * P < 0,05. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3: Expression de cytokines inflammatoires et des protéines de jonction serrée dans les cellules épithéliales de souris traitées avec exosomes. Exosomes liquide dérivé de BAL ont été marquées avec PKH-67, et microscope à fluorescence montrant PKH67 étiquetés exosomes (vert), des DAPI(Blue) et des images fusionnées de voir la captation des exosomes dans les cellules MLE12, Echelle, 50 µm, tel qu’indiqué dans A). Les cellules épithéliales de souris MLE12 ont été cultivés conjointement avec les exosomes isolées de liquide BAL des souris traitées avec LPS ou PBS. 24 h plus tard, les cellules ont été récoltées, et l’ARN total a été isolé. Expression de TNF-α et IL-6 a été mesurée avec q-RT-PCR, normalisé au contrôle interne de GAPDH. (B) TNF-α et (C) IL6 ; (D) expression de l’ARNm ZO-1 a été mesurée avec q-RT-PCR. * P < 0,05, test de Student. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Modèles murins de maladies sont couramment utilisés pour évaluer la fonction physiologique des gènes spécifiques et de réduire le coût de l’expérimentation2. La lésion pulmonaire septique aiguë décrite ici imite la réponse inflammatoire chez les humains avec SDRA. Ce modèle est pertinent pour étudier la pathogenèse moléculaire, développement de biomarqueurs et de tester de potentielles nouvelles thérapies5.
Des systèmes de co-culture sont pertinents pour des études in vivo dans le cadre de l’enquête sur les mécanismes de transfert des molécules biologiques telles que les ARN, ADN, lipides et protéines dans un système in vitro23,30possibles. Certaines de ces plates-formes ont grande utilité dans l’évaluation de la compréhension mécaniste et le développement de thérapies pour les maladies complexes22,23. Comme le montre ici que les exosomes des cellules de lavage (macrophages, polynucléaires neutrophiles) peuvent influer sur l’intégrité des cellules épithéliales structurelles par transfert des exosomes.
Les effets pathobiological des exosomes sont en train de devenir un aspect essentiel dans les maladies humaines du diagnostic et du point de vue thérapeutique et comprendre la pathogenèse de la maladie31,32. Pour isoler les exosomes des fluides biologiques, la technique plus courantes inclut centrifugation différentielle associée à l’ultracentrifugation, tel que décrit ici33,34. Cette technique présente plusieurs points forts, mais est limitée par le fait qu’il puisse être très longue et le risque de contamination avec des protéines non-exosomal. Nouvelles approches ont été proposées pour surmonter ces limitations, telles que l’isolement de l’exosome par le gradient de densité ou l’affinité immunitaire ou la méthode de la fonction de la taille35. Exosomes sont étudiées dans les études cliniques comme biomarqueurs pour diagnostic et pronostic et le développement de thérapies ciblées.
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Disclosures
Ce travail a été soutenu par examen du mérite VA 2I01BX001786-06A1 financement de RS.
Acknowledgments
Les auteurs n’ont déclaré aucun conflit d’intérêts.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
References
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