Summary
복 LPS에 드러낸 쥐에는 miRNAs와 함께 패키지 된 Broncho-치경 게 (BAL) 액체에 exosomes 분 비. 공동 문화 시스템을 사용 하 여, 우리 보여줍니다 발 액체에서 발표 하는 exosomes 기관지 상피 세포에서 꽉 접합 단백질의 표현을 방해 폐 상해를 강조 하는 프로 염증 성 cytokines의 표현을 증가.
Abstract
심각한 폐 상해 (알리) 및 급성 호흡 곤란 증후군 (아즈)는 높은 질병 률 및 사망률을가지고 계속 해 서 폐 질환의 이질적인 그룹을 나타냅니다. 알리의 분자 병 인 되 고 더 나은 정의; 그러나, 질병의 복잡 한 특성으로 인해 분자 치료는 아직 개발. 여기 급성 패 혈 증 폐 상해의 lipopolysaccharide (LPS) 유도 마우스 모델 사용 하 여 exosomes 염증 반응에서의 역할의 윤곽을 그리 다. 이 모델을 사용 하 여, 쥐 복 LPS에 노출 되는 miRNA와 염증 반응 조절 cytokines 패키지 된 폐에서 Broncho 치경 게 (BAL) 액체에 exosomes 분 비는 보여줄 수 있었습니다. 추가 공동 문화 모델 시스템을 사용 하 여, 우리는 대 식 세포에서 풀어 놓인 exosomes 기관지 상피 세포에서 꽉 접합 단백질의 표현을 방해 보여. 이 결과 건의 염증 반응에 기여 하는 크로스 토크 1) exosomal 왕복을 통해 타고 난 면역 및 구조 세포 사이 및 구조상 방 벽 및 2) 타겟팅이 miRNAs의 치료 하는 새로운 플랫폼을 제공할 수 있습니다. 알리 고 아즈입니다.
Introduction
알리와 아즈 생명이 형태의 약 1 백만 명 전세계에 영향을 미치는 비 cardiogenic 폐 부 종으로 인 한 심한 hypoxemia 호흡 실패는 매년1. 아즈의 병 인 폐 감염 또는 포부와 간접 모욕의 다양 한에서 직접 상해를 포함합니다. 그러나 지난 10 년간 아즈의 분자 병 인의 증가 이해 되었습니다, 그리고, 아즈에 대 한 특정 타겟된 치료는 아직 수 개발2,3.
심각한 폐 상해의 여러 동물 모델 실험 치료 인간 연구4,5번역에 대 한 다리를 제공 하는 개발 되었습니다. 일반적으로 사용 되는 모델의 올레 산, 박테리아, LPS, 및 bleomycin 로컬 설치 포함. 다른 접근 국 소 빈 혈 reperfusion, cecal 결 찰 빵 꾸, 기계 환기-유발 스트레치 부상, hyperoxia 또는 박테리아의 LPS5조직 관리 포함. 임상 가설을 테스트 하는 유용한 생물 학적 시스템을 제공 하는 이러한 모델 및 잠재적인 치료의 개발에 대 한. 인간의 아즈 시뮬레이션, 동물 모델 염증 및 폐에 장벽 기능에 결함을 가진 상피 그리고 내 피 세포에 급성 부상 재현 한다.
Exosomes 분자 내용이 포함, DNA, RNA, 단백질과 지질, 직경에서 20-200 nm와 막 소포 그리고 분자 구성 송금을 통해 조직 microenvironment에서 간 세포 커뮤니케이션을 촉진. Exosomes 여러 종류의 세포, 내 피 세포, 상피 세포, 평활 근 세포와 종양 세포 등에서 분 비 되 고 인간의 체액에 존재. 연구 나타냅니다 exosomes는 염증 성 질환, 전염 성 및 살 균 동안 잡담 stromal 세포와 면역 세포를 통제 하 고 그들의 비정상적인 릴리스 생리 기간 동안 다양 한 자연 및 실험적인 자극에 의해 통제 될 것으로 보인다 그리고 병 적인 프로세스6. 이러한 통신 네트워크 폐 질환의 병 인에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다 그리고 pathophysiological 진행7,8에 영향을 미칠 수 있습니다. 비 코딩 RNAs, miRNAs 조직과 체액, 플라즈마, 세라에 존재 하며 닢 레벨9,10에 mRNA 식 조절에 뉴클레오티드를로 18-22
Exosomes 패키지 miRNAs 차별화 및 여러 종류의 세포의 기능에 영향을 미칠 및 과도 한 수준의 다양 한 질병, 암, 폐 질환, 비만, 당뇨병 및 심혈 관 질환11를 포함 하 여와 관련 된 12,,1314,,1516. 받는 사람 세포와 exosomal miRNAs의 왕복으로 항목 수정 microenvironment17,18hemostasis 세포 커뮤니케이션을 촉진 한다. 심각한 폐 상해 여러 셀 형식 exosomes8통해 광범위 한 세포 통신 관련 된 복잡 한 프로세스입니다. 미르-155와 미르-146a 일반적인 transcriptional 규제 메커니즘을 공유 하 고 염증 반응과 면역 관용19,20을. 최근 연구는 모두 exosomal miRNAs 면역 세포21사이 였죠 통해 염증 반응을 조절 나타냅니다. 그러나, 밑에 치경 응답에 exosomal miRNAs의 modulatory 효과 분자 메커니즘 불분명 남아, 의심할 여 지 없이 잠재적인 임상 관련성 및 변환 의미 가치 추가 조사.
공동 문화 모델 염증과 암22,23같은 복잡 한 환경에서 특정 세포 유형의 상호 작용을 정의 하기 위해 채용 되 고 있다. 이러한 플랫폼 특히 면역 및 구조 셀에 대 한 세포 유형 사이 교차 하는 대화가 대체 전략을 제공 합니다.
내부 tracheal LPS의 aerosolized, 복 또는 조직의 관리 유도 실험 폐 상해24,,2526, 널리 사용 되 고 상피 그리고 내 피 침투성을 유도 하는 것으로 나타났습니다. 결함입니다. 여기 복 LPS 사용 하 여 마우스에 심각한 폐 상해의 정화 조 모델을 유도 하. LPS의 복 관리의 24 시간 이내 침투성 결함은 염증 세포의 모집과 폐에서 유도 된. 또한, 우리는 발에서 exosomes 포함 155 미르와 미르-146a, 그리고 발 액체에서 exosomes 프로 염증 성 cytokines 일리노이-6와 TNF-α를 포함 하 여 받는 사람 상피 세포에서 식 유도 보여줍니다. 이 데이터는 먼저 보여 그 exosomal miRNAs는 급성 패 혈 증 폐 상해의이 모델에 발에서 분 비.
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Protocol
전체 프로토콜에는 패 혈 증 유도의 첫날 및 동물, 및 마우스 BALF exosomes 절연에 대 한 두 번째 날에서 발 액체의 절연을 포함 하 여 2 일 필요 합니다. 모든 절차를 검토 하 고 기관 동물 관리 및 사용 위원회 애틀랜타 VA 의료 센터에 의해 승인 되었습니다.
1. 마우스 급성 패 혈 증 폐 상해 모델
- 사용 6-8 주-오래 된 남성 야생-타입 C57BL/6J 마우스 (20-22 g 중량) 동물에 대 한 모델, 그리고 무 균 기술 및 장비를 사용 하 여 모든 절차를 수행 합니다. 오토 클레이 브 집게와가 위 121 ° c.에 20 분을 포함 한 모든 수술 기구
- 임의로 실험에 쥐 및 제어 그룹을 배포 합니다. 외과 보드에 쥐를 제 지. 복 경로 의해 대장균 lipopolysaccharide (LPS, 15 mg/kg)와 쥐를 취급 합니다. 개별 몸 무게에 따라 적절 한 LPS 복용량 마우스, 당 0.1 mL PBS에 희석 다음 LPS 솔루션 27 G 바늘 1 mL 주사기를 사용 하 여 주입 하 고 주입 제어 동물 PBS의 해당 볼륨.
- 동물 BSL2 시설, 적절 한 실내 온도에서 깨끗 한 케이지로 구성 되어 마우스를 유지.
- 24 h 후, CO2 흡입 된 마우스를 안락사.
- 마우스 목의 중앙에 수술 영역을 선택 합니다. 작은 절 개 (약 5 m m), 고 기도 노출까지 무딘 집게를 사용 하 여 기도에 대 한 액세스에 대 한 근육을 부드럽게 분리 합니다.
- 27 G 바늘으로 마우스 발 액체 10 mL의 멸 균 주사기를 철회. 첫째, 부드럽게, 기관지에 바늘을 삽입 및 기도, 살 균 PBS의 1 mL를 천천히 주입 다음 3 mL 일회용 주사기에 27g 바늘으로 BALF 그릴. 완료 되 면 절차, 주사기와 바늘 biohazard sharps 컨테이너에서 삭제 합니다.
- 앞에서 설명한 Chauret 그 외 여러분 에 의해 이산화 염소와 수술 도구를 치료 27, 121 ° c.에 20 분 동안 압력가 마로 소독 하 여 모든 수술 기구를 소독
2. Exosomes 절연 직렬 울트라-원심 분리 및 특성
- 15 mL 원뿔 튜브에 마우스 발 액체를 수집 합니다. 치경 세포, 4 ° c.에 1000 g에서 10 분 원심 분리기 샘플 수확
- 새로운 15 mL 원뿔 튜브에는 상쾌한 전송 후 원심 4000 x g 세포 파편을 제거 하 4 ° C에서 30 분에 대 한 샘플.
- Ultracentrifuge 튜브에 더 큰 세포 입자를 제거 하 4 ° C에서 10000 x g에서 60 분 동안 원심 분리기 샘플 상쾌한을 수집 합니다.
- 새로운 원뿔 관에는 상쾌한 전송 다음 0.2 µ m 주사기-남아 있는 더 큰 입자를 제거 하려면 필터를 통해 샘플을 필터링 합니다.
- Ultracentrifuge 튜브에서 샘플을 수집 하 고 튜브를 균형. 샘플은 exosomes 펠 렛을 4 ° C에서 140000 x g에서 2 h에 대 한 원심
참고: exosomes의 크기는 20-200 nm을 다릅니다. 0.2 µ m 필터는 이상의 200는 더 큰 입자를 제거 사용 nm 크기에서. - 삭제는 supernatants 부드럽게 합니다. 100 µ L PBS 또는 세포 솔루션 및 전송 exosomes 샘플 1.5 mL 튜브에 펠 릿을 녹이 고 사용까지-80 ° C에서 저장.
참고: 전송 전자 현미경은 고립 된 exosomes를 확인 것이 좋습니다. - 프로토콜28처리 표준 편 샘플을 따릅니다. 전송 전자 현미경 검사 법, 그리고 촬영할, 눈금 200 막대를 사용 하 여 exosomes 샘플을 분석 nm.
3. 미르와 공연 미르-q-RT-PCR의 준비
참고: 미르-q-RT-PCR miRNAs의 식 수준 분석 하는 것이 좋습니다.
- 표준 miRNAs 격리 프로토콜에 따라 고 정화 RNAs의 동일한 금액을 사용 하 여 단일 가닥 반전 녹음 방송24에 확인.
- 발 액체에서 exosomal 예측에 관한 레벨을 감지 하는 표준 실시간 PCR 프로토콜을 따릅니다. 미르-155, 미르-146a, 그리고 U6 SnRNA 특정 실시간 PCR 뇌관을 사용 합니다. PCR 반응 정량 PCR 장치를 실행 하 고 내부 통제 U6 snRNA에 식 값을 정상화.
참고: 각 그룹 triplicate 샘플24이루어져 있다.
4. Exosomes 라벨 및 정화
- 1.5 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 100 µ L 정지 솔루션 exosomes 펠 릿을 일시 중지 다음 정지 솔루션의 100 µ L로 다른 튜브에 exosomes 염료의 0.4 µ L를 추가 합니다.
- 신속 하 게 염료 솔루션 exosomes 솔루션에 추가 하 고 pipetting으로 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분에 대 한 샘플을 계속, 빛 으로부터 보호 합니다.
- 한 exosome 스핀 열 차입 1.5 mL 튜브에 넣어. Exosome 스핀 열 센터 솔루션 혼합물을 전송 합니다.
- 실 온에서 800 x g 2 분에 대 한 열을 회전 합니다.
- 열을 삭제 하 고 사용까지-20 ° C에서 eluted 샘플을 저장 합니다.
5. 받는 사람 세포에 의해 Exosomes의 유효성 검사
- 1 x 104 8 잘 챔버 슬라이드에 37 ° C, 5% CO2에 문화 세포 MLE 12 /cell 씨앗
- 셀에 10 µ L 형광 표시 된 exosomes를 추가 합니다. 1 h 37 ° c.에 품 어
- 문화 미디어와 PBS 가진 세포를 씻어 다음 실 온에서 10 분 동안 1 %paraformaldehyde 셀을 수정.
- DAPI와 마운트 중간에 슬라이드를 탑재 합니다.
- 형광 현미경을 통해 샘플을 분석 하 고 이미지, 40 배 확대.
6. Exosomes와 받는 사람 세포 사이 상호 작용의 확인
- 시드 2 x 105 MLE12/잘 적절 한 문화 매체, 및 37 ° C, 5% CO2에 문화 세포를 포함 하는 12-잘 문화 접시.
- MLE12 셀에 마우스 발 액체에서 20 µ g exosomes를 추가 하 고 실험적인 그룹 당 복제 설정.
- 24 h 후 PBS로 세포를 세척 하 고 잘으로 600 µ L 세포의 용 해 버퍼를 추가. 부드럽게 접시를 흔들어 하 고 피펫으로 1.5 mL 튜브에 세포 샘플을 수집 합니다.
- 표준 총 RNA 격리 프로토콜 및 cDNA 반전 녹음 방송 프로토콜 따라, 단일 가닥 cDNA 반전 녹음 방송29를 완료.
- 받는 사람 셀29에 mRNA 표현 레벨을 감지 하는 표준 실시간 PCR 프로토콜을 따릅니다. TNF-α, 일리노이 대 한 특정 실시간 PCR 뇌관을 사용 하 여-6, 그리고 조 1. PCR 반응 정량 PCR 장치를 실행 하 고 내부 제어 GAPDH 식 값 정상화.
참고: 각 그룹 triplicate 샘플 구성 됩니다.
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Representative Results
정화 조 폐 상해를 유도, 쥐 복 LPS (15 mg/kg)로 대우 되었다. 그림 1A와 같이 LPS 관리의 24 시간 이내 neutrophilic 유입 폐에서 본 했다. 마우스 발 유체, 격리 및 정화 exosomes의 그려 했다. 형태학 BALF exosomes의 전자 전송 현미경 검사 법 (그림 1B)에 의해 확인 됐다.
선택적 프로-염증 성 miRNAs 미르-155와 미르-146a 표현 순화 exosomes에서 q-RT-PCR에 의해 감지 되었다. 미르-155와 미르-146a 식 수준 LPS, PBS (미르-155, 1 ± 0.16 대 11.6 ± 0.6, 미르-146a, 1 ± 0.12 대 13.5 ± 1.186) 제어 마우스 치료에 비해 치료 된 쥐에서 발 유체 exosomes에 크게 증가 했다 (그림 2).
Exosomes의 기능 효과 정의 하려면 마우스 기관지 상피 세포 (MLE12)는 각각 LPS 또는 PBS, 대우 하는 쥐의 발 액에서 추출한 정제 exosomes와 치료 했다. 첫째, 우리는 받는 사람 상피 세포로 BALF exosomes의 항목을 증명. BALF exosomes PKH-67, 표시 했다 MLE12 세포로, 공동 경작 그리고 형광 현미경 이미지 상피 세포 (그림 3A)에 의해 exosomes의 통풍 관을 표시 하는 다음. 프로-염증 성 중재자, 일리노이-6와 TNF-α의 표현 (TNF-α, 1 ± 0.13 대 5.01 ± 0.22; 제어 그룹에 비해 취급 LPS 마우스에서 exosomes와 공동 경작 된 상피 세포에서 크게 증가 했다 IL-6, 1 ± 0.02 vs 1.72 ± 0.17) (그림 3B). 우리는 또한 상피 무결성에 대 한 대리로 꽉 접합 단백질 ZO-1의 식을 결정합니다. LPS에서 exosomes로 치료 했다 셀 치료 쥐 조-1, LPS 처리 제어 마우스 (조-1, 1 ± 0.12 vs 0.66 ± 0.13)에 비해 크게 감쇠 식 보였다 (그림 3C).
그림 1: exosomes LPS 처리 쥐의 발 액체에서 고립의. C57BL/6J 쥐 복 LPS (15 mg/kg) 주사로 치료 했다 (N = 5), PBS 제어로 사용 되었다 (N = 5). 24 h 후, 마우스 했다 안락사와 발 유체 수행한. 마우스 폐 조직의 대표 이미지 처리 LPS와 급성 폐 상해, 눈금 막대, 50 µ m, A PBS). Exosomes 발 액체에서 추출 되었다. 전송 전자 현미경 (TEM) 분석 표시 exosomes, 스케일 바, 200 nm, B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Exosomal miRNAs 식 발 액체 LPS 처리 쥐에서 분리에. C57BL/6J 쥐 복 LPS와 도전을 했다. 표현의 선택적 microRNAs q-RT-PCR 및 정규화 U6 식. 을 통해 분석 되었다 A) 미르-155; B) 미르-146a입니다. n = 그룹 당 5 쥐. 학생의 테스트, * P < 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 선 동적인 cytokines 및 마우스 상피 세포에 꽉 접합 단백질의 식이 치료 exosomes. 발 유체 파생 된 exosomes PKH-67, 표시 했다 그리고 형광 현미경 PKH67를 보여주는 분류 exosomes (녹색), DAPI(Blue) 및 MLE12 셀, 눈금 막대, 50 µ m, exosomes의 표시 이해의 병합 된 이미지 A와 같이). 마우스 상피 세포 MLE12는 쥐 LPS 또는 PBS 치료에서 벨 액체에서 고립 된 exosomes와 공동 경작 했다. 24 h 후, 셀 수확 했다, 및 총 RNA 격리 했다. 일리노이-6와 TNF-α의 식 q-RT-PCR로 측정 되었다 GAPDH 내부 제어 표준화. (B) TNF-α 및 (C) IL6; (D) 조-1 mRNA 식 q-RT-PCR로 측정 되었다. * P < 0.05, 학생의 시험. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
질병 마우스 모델은 특정 유전자의 생리 기능을 평가 하 고 실험2의 비용을 줄이기 위해 일반적으로 사용 됩니다. 설명 된 급성 패 혈 증 폐 상해 여기 아즈와 인간에서 선 동적인 응답을 싫어 하지. 이 모델은 관련 분자 병 인, 바이오 마커의 개발 조사 하 고 잠재적인 새로운 치료5를 테스트 합니다.
공동 문화 시스템은 RNA, DNA, 지질, 및 단백질 체 외 시스템23,30에 같은 생물 분자의 이동의 잠재적인 메커니즘을 조사 하는 맥락에서 vivo에서 학문에 대 한 관련. 이러한 플랫폼의 일부 기계적 이해의 평가 및 복잡 한 질병22,23에 대 한 치료의 개발에 큰 유틸리티가 있다. 다음과 같이 게 세포 (대 식 세포, 호 중구)에서 exosomes exosomes의 전송을 통해 구조 상피 세포의 무결성의 영향을 줄 수 있습니다.
Exosomes의 pathobiological 효과 모두 진단 및 치료 적 관점에서 인간의 질병에 중요 한 측면으로 나오고 되며 질병 병 인31,32를 이해. Exosomes 생물 학적 체액에서 분리, 가장 일반적으로 사용 되는 기술에는 차동 원심 ultracentrifugation33,34여기에 설명 된 대로 함께 포함 되어 있습니다. 그것은 시간이 오래 걸릴 수 있다는 사실과 비 exosomal 단백질 오염 위험에 의해 제한 됩니다이 기술은 여러 강점을. 소설 접근 밀도 그라데이션 또는 면역 선호도 또는 크기에 따라 다릅니다 방법35exosome 격리 등 이러한 한계를 극복 하기 위해 제안 되었습니다. Exosomes 생체 진단 및 예 후, 및 표적으로 한 치료의 개발으로 임상 연구에서 조사 되 고 있다.
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Disclosures
이 작품은 버지니아 장점 검토 2I01BX001786 06A1 rs 자금에 의해 지원 되었다.
Acknowledgments
저자는 관심 없음 충돌 선언 하 고 있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
References
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