Summary
Os ratos expostos ao LPS intraperitoneal secretam exosomes no líquido de lavagem (BAL) bronco-alveolar que são embalados com miRNAs. Usando um sistema de co-cultura, mostramos que exosomes lançados no fluido BAL perturbará a expressão de proteínas de junção apertada nas células epiteliais brônquicas e aumentar a expressão de citocinas pró-inflamatórias que acentuam a lesão pulmonar.
Abstract
Lesão pulmonar aguda (LPA) e síndrome da angústia respiratória (Sara) representam um grupo heterogêneo de doenças pulmonares, que continua a ter uma alta taxa de morbidade e mortalidade. A patogénese molecular de ALI está sendo melhor definido; no entanto, devido à natureza complexa da doença terapias moleculares ainda precisam ser desenvolvido. Aqui nós usamos um modelo de rato induzida de lipopolissacarídeo (LPS) de lesão pulmonar aguda séptico para delinear o papel do exosomes na resposta inflamatória. Usando este modelo, fomos capazes de mostrar que os ratos expostos a LPS intraperitoneal secretam exosomes no líquido de lavagem (BAL) bronco-alveolar dos pulmões que são embalados com miRNA e citocinas que regulam a resposta inflamatória. Ainda mais usando um sistema de modelo co-cultura, mostramos que exosomes lançados de macrófagos interromper a expressão de proteínas de junção apertada nas células epiteliais brônquicas. Estes resultados sugerem que 1) conversas cruzadas entre inatas células imunes e estruturais através do vaivém exosomal contribuem para a resposta inflamatória e rompimento de barreira estrutural e 2) segmentação destes miRNAs pode fornecer uma nova plataforma para tratar ALI e SDRA.
Introduction
ALI e Sara é as formas de vida-ameaçando de insuficiência respiratória com hipoxemia grave causada por edema pulmonar não-cardiogênico, que afeta cerca de 1 milhão pessoas no mundo anualmente1. A etiologia da SDRA inclui lesão direta para os pulmões de infecções ou aspiração e uma variedade de insultos indiretas. Na última década, tem havido uma maior compreensão da patogênese molecular da SDRA, no entanto, tratamentos alvo específicos para SDRA estão ainda a ser desenvolvido,2,3.
Foram desenvolvidos vários modelos animais de lesão pulmonar aguda que fornecem uma ponte para traduzir terapias experimentais para estudos humanos4,5. Modelos comumente usados incluem a instalação local do ácido oleico, bactérias, LPS e bleomicina. Outras abordagens incluem isquémia-reperfusão, punção cecal ligadura, lesão de estiramento induzida pela ventilação mecânica, hiperóxia ou administração sistémica de bactérias e LPS-5. Esses modelos fornecem um sistema biológico útil para testar hipóteses clínicas e para o desenvolvimento de terapias potenciais. Para simular a SDRA humana, modelos animais devem reproduzir inflamação e lesão aguda para as células epiteliais e endoteliais com defeitos na função de barreira nos pulmões.
Exosomes são vesículas de membrana com 20-200 nm de diâmetro, cujo conteúdo molecular contém proteínas, DNA, RNA e lipídios, e facilitar a comunicação intercelular no microambiente tecido via transferência de composição molecular. Exosomes são secretadas por vários tipos de células, como células endoteliais, células epiteliais, células musculares lisas e células tumorais e existem em fluidos do corpo humano. Estudos indicam que a exosomes regular conversas cruzadas entre células do estroma e células do sistema imunológico durante doenças inflamatórias, infecciosas e estéril, e sua liberação anormal parece ser regulada por vários estímulos naturais e experimentais durante fisiológica e processos patológicos6. Essa rede de comunicação pode desempenhar um importante papel na patogênese de doenças pulmonares e pode afetar a progressão fisiopatológicos7,8. 18-22 como nucleotídeos RNAs não-codificantes, miRNAs existem em ambos os tecidos e fluidos corporais, plasma, soro e modulam a expressão de RNAm no nível pós-traducional9,10.
MiRNAs embalados em exosomes influenciam a diferenciação e função dos vários tipos de células, e níveis excessivos são associados com uma variedade de doenças, incluindo câncer, doenças pulmonares, obesidade, diabetes e doença cardiovascular11, 12,13,14,15,16. Entrada em células da destinatários e vaivém de miRNAs exosomal facilitar a comunicação intercelular, modificando a hemostasia do microambiente17,18. Lesão pulmonar aguda é um processos complexos, envolvendo vários tipos de células com extensa comunicação intercelular através de exosomes8. miR-155 e miR-146 compartilham o mecanismo regulador transcricional comum e contribuam para a resposta inflamatória e a tolerância imunológica19,20. Estudos recentes indicam que ambos modulam a resposta inflamatória via exosomal miRNAs vaivém entre células do sistema imunológico21. No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes moduladora efeitos de miRNAs exosomal na resposta alveolar a endotoxina permanecem pouco claras, sem dúvida, o potencial relevância clínica e translacional implicação mérito mais investigações.
Modelos de co-cultura estão sendo empregados para definir a interação dos tipos de célula específica no complexo ambiente, tais como inflamação e câncer22,23. Estas plataformas fornecem uma estratégia alternativa para interrogar conversas cruzadas entre tipos de células, particularmente por células imunes e estruturais.
Intratraqueal, aerossol, intraperitoneal ou sistêmica administração de LPS são amplamente utilizados para induzir a lesão de pulmão experimental a24,25,26e mostraram para induzir permeabilidade endotelial e epitelial defeitos de fabricação. Aqui usamos LPS intraperitoneal para induzir um fossa séptico modelo de lesão pulmonar aguda em camundongos. Dentro de 24 horas da administração intraperitoneal de LPS, permeabilidade defeitos são induzidos nos pulmões com recrutamento de células inflamatórias. Além disso, mostramos que exosomes de BAL contêm miRNA-155 e miR-146, e exosomes de fluido BAL induzir a expressão de citocinas pró-inflamatórias em pilhas epithelial do destinatários, incluindo IL-6 e TNF-α. Estes dados são os primeiros a mostrar que os miRNAs exosomal são secretadas no BAL neste modelo de lesão pulmonar aguda séptico.
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Protocol
O protocolo global requer 2 dias, incluindo o primeiro dia da indução de sepse e isolamento do fluido BAL de animais e o segundo dia para isolamento de exosomes do mouse BALF. Todos os procedimentos foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso no centro médico do VA de Atlanta e institucional Cuidado Animal.
1. modelo de lesão pulmonar aguda séptico Mouse
- Use 6-8 semanas - velho selvagem-tipo C57BL/6J camundongos machos (20 a 22 g de peso) para o animal modelo e executar todos os procedimentos utilizando técnicas assépticas e instrumentos. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos, incluindo fórceps e a tesoura por 20 min a 121 ° C.
- Distribua aleatoriamente os ratos na experimental e grupo controle. Controle de ratos em um quadro de cirurgias. Trate ratos com Escherichia coli lipopolissacarídeo (LPS, 15 mg/kg) por via intraperitoneal. De acordo com o peso do corpo individual, diluir dosagens adequadas de LPS de 0,1 mL de PBS por rato, em seguida, injetar solução LPS utilizando uma seringa de 1 mL com agulha 27G e injetar uma quantidade equivalente de PBS para controle de animais.
- Manter os ratos na instalação de BSL2 animal, que consiste em gaiolas limpas à temperatura adequada.
- 24h depois, eutanásia em ratos com inalação de CO2 .
- Selecione a área cirúrgica no centro do pescoço do mouse. Faça uma pequena incisão (cerca de 5 mm) e separar suavemente os músculos para o acesso à traqueia usando fórceps rombudo até a traqueia é exposta.
- Retire o fluido de BAL rato com seringa estéril de 10 mL com agulha 27G. Delicadamente, introduza a agulha na traqueia e injectar 1 mL de PBS estéril lentamente para a traqueia, depois desenhar BALF uma seringa descartável de 3 mL com agulha 27G. Após a conclusão do procedimento, descarte de seringas e agulhas em recipiente de objectos cortantes de risco biológico.
- Tratar de instrumentos cirúrgicos com dióxido de cloro, conforme descrito anteriormente por Chauret et al 27e em seguida esterilizar todos os instrumentos cirúrgicos em autoclave por 20 min a 121 ° C.
2. Exosomes isolamento-série Ultracentrifugação e caracterização
- Recolha o líquido de BAL rato nos tubos cônico de 15 mL. A colheita de células alveolares, centrifugar amostras durante 10 minutos a 1.000 g, a 4 ° C.
- Transferir o sobrenadante para novos tubos de 15ml cónico e, em seguida, centrifugar amostras durante 30 min a 4.000 x g a 4 ° C para remover os resíduos de célula.
- Recolha o sobrenadante em tubos se e centrifugar amostras para 60 min a 10.000 x g a 4 ° C para remover as partículas maiores do celulares.
- Transferir o sobrenadante para novos tubos cónicos e, em seguida, filtrar as amostras através de 0,2 µm seringa-filtro para remover restantes partículas maiores.
- Coletar amostras em tubos de se e equilibrar os tubos. Centrifugar as amostras por 2 h a 140.000 x g a 4° C para o exosomes de Pelotas.
Nota: O tamanho de exosomes varia de 20-200 nm. 0,2 µm filtro é usado para a remoção de partículas maiores que são mais de 200 nm de tamanho. - Descarte os sobrenadantes suavemente. Dissolva a pelota com 100 µ l PBS ou solução de Lise e transferência exosomes amostras para tubos de 1,5 mL e armazenar a-80 ° C até o uso.
Nota: Microscópio eletrônico de transmissão é recomendado para verificar exosomes isolado. - Siga a amostra-padrão TEM protocolo28de processamento. Analisar amostras de exosomes usando microscopia eletrônica de transmissão e tirar fotos, escala bar 200 nm.
3. preparação de miRNA e Performing miRNA-q-RT-PCR
Nota: miRNA-q-RT-PCR é aconselhável analisar o nível de expressão dos miRNAs.
- Seguir o protocolo de isolamento padrão miRNAs e certifique-se de usar uma quantidade igual de RNAs purificadas na transcrição reversa do único-fio24.
- Siga o protocolo padrão de PCR em tempo real para detectar o nível de microRNA exosomal no fluido de BAL. Uso específicos iniciadores de PCR em tempo real contra miR-155 e miR-146 U6 SnRNA. Executar a reação de PCR com o aparelho PCR quantitativo e normalizar os valores de expressão para controle interno U6 snRNA.
Nota: Cada grupo consiste de três vias amostras24.
4. Exosomes de rotulagem e de purificação
- Suspender o sedimento exosomes com solução de suspensão de 100 µ l em um tubo de polipropileno de 1,5 mL e, em seguida, adicione 0,4 µ l do corante exosomes no outro tubo com 100 µ l da solução de suspensão.
- Rapidamente adicionar exosomes na solução para a solução de corante e misture completamente por pipetagem. Manter amostras por 5 min à temperatura ambiente, proteger da luz.
- Colocar uma coluna de rotação exossomo em um tubo de eluição de 1,5 mL. Transfira a mistura de solução para o centro da coluna exossomo de rotação.
- Gire a coluna por 2 min a 800 x g, à temperatura ambiente.
- Descartar a coluna e armazenar a amostra eluted a-20 ° C até o uso.
5. validação de Exosomes Up tomadas pelo destinatários células
- Sementes de 1 x 104 12 MLE /cell em um slide de câmara de 8 poços e células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2.
- Adicione 10 µ l fluorescente-etiquetadas exosomes para as células. Incubar durante 1 h a 37 ° C.
- Remover os meios de cultura e lavam-se células com PBS e, em seguida, corrigir células com paraformaldeído 1% por 10 minutos em temperatura ambiente.
- Monte o slide no meio de montagem com DAPI.
- Analisar as amostras através de um microscópio de fluorescência e tirar fotos, ampliação de 40 X.
6. verificação da interação entre Exosomes e células destinatários
- Semente de 2 x 105 MLE12/poço em uma placa de cultura de 12 poços, contendo meio de cultura apropriado e células de cultura a 37 ° C, 5% de CO2.
- Adicionar 20 µ g exosomes de fluido do mouse BAL para células MLE12 e configurar repetições por grupo experimental.
- 24h depois, lavam-se células com PBS e adicionar tampão de Lise 600 µ l em poço. Homogeneizar a placa e coletar amostras de Lise no tubo de 1,5 mL com pipeta.
- Siga o protocolo de isolamento de RNA total padrão e protocolo de transcrição reversa do cDNA, completar a transcrição reversa de cDNA da único-Costa29.
- Siga o protocolo padrão de PCR em tempo real para detectar o nível de expressão do mRNA em células destinatário29. Uso específicos iniciadores de PCR em tempo real contra o TNF-α, IL-6 e ZO-1. Executar as reações de PCR com o aparelho PCR quantitativo e normalizar os valores de expressão para o controle interno GAPDH.
Nota: Cada grupo consiste de amostras de três vias.
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Representative Results
Para induzir lesão pulmonar séptico, os ratos foram tratados com LPS intraperitoneal (15 mg/kg). Dentro de 24 horas da administração de LPS, neutrofílico influxo foi visto nos pulmões, conforme mostrado na figura 1A. Fluido de mouse BAL foi desenhado, seguido pelo isolamento e purificação de exosomes. Morfologia do LBA exosomes foi confirmada por microscopia eletrônica de transmissão (figura 1B).
Expressão de miRNAs pró-inflamatórias seletiva miRNA-155 e miR-146 foram detectados por q-RT-PCR do exosomes purificado. Níveis de expressão de miR-155 e miR-146 aumentaram significativamente em BAL fluido exosomes de ratos que foram tratados com LPS, comparados com o controle de ratos tratados com PBS (miR-155, 1 ± 0,16 vs 11,6 ± 0,6; miR-146, 1 ± 0,12 vs 13,5 ± 1.186) (Figura 2).
Para definir os efeitos funcionais de exosomes, rato brônquico epitelial células (MLE12) foram tratadas com exosomes purificado extraído do fluido BAL de ratos tratados com LPS ou PBS, respectivamente. Primeiro, provamos a entrada do LBA exosomes em células epiteliais destinatários. BALF exosomes foram rotulados com PKH-67 e co cultivadas com células MLE12, e então imagens de microscópio de fluorescência mostram a absorção de exosomes por células epiteliais (Figura 3A). Expressão de mediador pró-inflamatórios, TNF-α e IL-6 foram aumentados significativamente nas células epiteliais que foram co cultivadas com exosomes de ratos LPS tratados, comparados ao grupo controle (TNF-α, 1 ± 0,13 vs 5.01 ± 0.22; Il-6, 1 ± 0,02 vs 1,72 ± 0,17) (Figura 3B). Nós também determinou a expressão da proteína de junção apertada ZO-1 como um substituto para integridade epitelial. Células que foram tratadas com exosomes de LPS trataram ratos mostraram uma expressão significativamente atenuada da ZO-1, em comparação com ratos controle de LPS tratados (ZO-1, 1 ± 0,12 vs 0,66 ± 0,13) (Figura 3).
Figura 1: caracterização de isolados de fluido BAL de ratos tratados com LPS de exosomes. Camundongos C57Bl/6J foram tratados com injeção intraperitoneal de LPS (15mg/kg) (N = 5), PBS foi usado como controle (N = 5). 24 h, mais tarde, os ratos foram sacrificados, e realizou-se fluido de BAL. Imagens representativas do tecido do pulmão do rato trataram com LPS e PBS mostrando lesão pulmonar aguda, barra de escala, 50 µm, A). Exosomes foram extraídos do fluido de BAL. Transmissão (TEM) microscopia eletrônica de varredura análise apresentando exosomes, escala bar, 200 nm, B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exosomal expressão de miRNAs em fluido de BAL isolado de ratos tratados com LPS. Camundongos C57Bl/6J foram desafiados com LPS intraperitoneal. Expressão de microRNAs seletiva foram analisados através de q-RT-PCR e normalizado a expressão U6. A) miR-155; B) miR-146. n = 5 ratos por grupo. Teste de Student, * P < 0,05. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: expressão de citocinas inflamatórias e junção apertada proteína nas células epiteliais do mouse tratados com exosomes. Exosomes fluido-derivado de BAL foram rotulados com PKH-67, e microscópio de fluorescência mostrando PKH67 rotulado exosomes (verde), DAPI(Blue) e mescladas imagens do show de captação de exosomes em células MLE12, barra de escala, 50 µm, conforme mostrado na). Células epiteliais de mouse MLE12 foram co cultivadas com exosomes isoladas de fluido BAL de ratos tratados com LPS ou PBS. 24 h, mais tarde, as células foram colhidas e o RNA total foi isolado. Expressão de TNF-α e IL-6 foi medido com q-RT-PCR, normalizado para controle interno de GAPDH. (B) TNF-α e (C) IL6; (D) a expressão de RNAm de ZO-1 foi medida com q-RT-PCR. * P < 0.05, teste de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Modelos de mouse de doenças são comumente usados para avaliar a função fisiológica de genes específicos e para reduzir o custo de experimentação2. A lesão pulmonar aguda séptico descrita aqui imita a resposta inflamatória nos seres humanos com SDRA. Este modelo é relevante para investigar a patogénese molecular, desenvolvimento de biomarcadores e testar potenciais novas terapias5.
Sistemas de co-cultura são relevantes para estudos em vivo no contexto de investigar potenciais mecanismos de transferência de moléculas biológicas como RNA, DNA, lipídios e proteínas em um sistema in vitro23,30. Algumas destas plataformas têm grande utilidade na avaliação da compreensão mecanicista e o desenvolvimento de terapias para doenças complexas22,23. Como mostrado aqui o exosomes de células de lavagem (macrófagos, neutrófilos) podem afetar a integridade das células epiteliais estruturais através de transferência de exosomes.
Os efeitos pathobiological do exosomes estão emergindo como aspecto crítico em doenças humanas, tanto desde o diagnóstico e o ponto de vista terapêutico e compreender a patogênese de doenças31,32. Para isolar exosomes de fluidos biológicos, a técnica mais comumente usados inclui centrifugação diferencial acoplada com ultracentrifugação conforme descrito aqui33,34. Esta técnica tem vários pontos fortes, embora é limitado pelo fato que pode ser demorado e o risco de contaminação com proteínas não-exosomal. Novas abordagens têm sido propostas para superar essas limitações, tais como o isolamento do exossomo pelo gradiente de densidade ou a imunológico-afinidade ou o método dependente do tamanho35. Exosomes estão sendo investigados em estudos clínicos como biomarcadores para diagnóstico e prognóstico e desenvolvimento de terapias alvo.
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Disclosures
Este trabalho foi apoiado pela revisão de mérito VA 2I01BX001786-06A1 financiamento para RS.
Acknowledgments
Os autores declararam que não há conflito de interesses.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| lipopolysaccharide | Sigma-Aldrich | Escherichia coli 055:B5 | |
| PBS pH7.2(1X) | Life technologies | 20012-027 | |
| mirVana miRNA isolation kit | Thermo Fisher | 449774 | |
| TaqMan Gene Expression Master Mix | Thermo Fisher | 4369016 | |
| mmu-miR-155 (002571) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| has-miR-146a (000468) primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| U6snRNA primer | Thermo Fisher | 4427975 | |
| TNF-α(Mm00443258_m1 ) primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| IL-6 (Mm00446190_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| ZO-1 (Mm00493699_m1 )primer | Thermo Fisher | 4331182 | |
| minimal essential medium (MEM) | Thermo Fisher | 11095-072 | |
| Trysin-EDTA solution(0.05%) | Thermo Fisher | 25300054 | |
| Exosomes were labeled with PKH67 through PKH67 Green Fluorescent Cell linker Mini Kit | Sigma-Aldrich | MINI67-1KT | |
| Exosome Spin Columns (MW3000) | Thermo Fisher | 4484449 | |
| Beckman Coulter Optima L-100XP ultracentrifuge | Beckman Coulter | L-100XP | |
| Ultra-clear centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344058 | |
| Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System | Thermo Fisher | ||
| transmission electron microscopes (TEM) | JEOL Ltd | 120 kV TEM | |
| Olympus BX41 microscope | Olympus | BX41 |
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