Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Produktionen af Elastin-lignende Protein Hydrogels til indkapsling og immunfarvning af celler i 3D

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57739
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Rekombinante protein-manipuleret hydrogels er fordelagtige for 3D cellekultur, som de giver mulighed for komplet tunability af polymer rygrad og derfor celle mikromiljø. Her, beskriver vi processen med rekombinant elastin-lignende protein oprensning og dens anvendelse i 3D hydrogel celle indkapsling.

Abstract

Todimensionale (2D) vævskultur teknikker har været afgørende for vores forståelse af grundlæggende cellebiologi. Men, traditionelle 2D vævskultur systemer mangler en tredimensional (3D) matrix, hvilket resulterer i en betydelig afbryde mellem resultater indsamlet in vitro- og in vivo. For at løse denne begrænsning, har forskere udviklet 3D hydrogel vævskultur platforme, der kan efterligne i vivo celle mikromiljø biokemiske og biofysiske egenskaber. Denne forskning har motiveret behovet for at udvikle materiale platforme, der understøtter 3D celle indkapsling og downstream biokemiske assays. Rekombinante protein engineering tilbyder en unik værktøjssæt til 3D hydrogel materiel design og udvikling ved at give mulighed for den specifikke kontrol af protein sekvens og derfor i forlængelse heraf resulterende potentielle mekaniske og biokemiske egenskaber matrix. Vi præsenterer her, en protokol for at udtrykke recombinantly afledt elastin-lignende protein (ELP), som kan bruges til form hydrogels med selvstændigt afstemmelige mekaniske egenskaber og celle-klæbende ligand koncentration. Præsenterer vi yderligere en metode for celle indkapsling i ELP hydrogels og efterfølgende immunfluorescent farvning af indlejrede celler for downstream analyse og kvantificering.

Introduction

I det forløbne århundrede, har todimensionale (2D) vævskultur udviklet sig til en integreret værktøjssæt til at studere grundlæggende celle biologi i vitro. Derudover har de relativt billige og enkle protokoller for 2D cellekultur ført til dens vedtagelse på tværs af mange biologiske og medicinske discipliner. Dog har tidligere forskning vist, at traditionel 2D platforme kan føre til resultater at afvige markant fra de indsamlede i vivo, forårsager kostbar tid og finansiering spildt for klinisk orienteret forskning1,2, 3. Vi og andre hypotesen om, at denne uoverensstemmelse kan tilskrives manglen på native biokemiske og biofysiske stikord til cellerne kulturperler på 2D overflader, som kan være nødvendige for optimal spredning og modning af forskellige celletyper.

For at løse disse begrænsninger og hjælp bro over kløften mellem 2D har i in vitro og i vivo undersøgelser, forskerne udviklet tre-dimensionelle (3D) hydrogel platforme for celle-indkapsling1,4,5 ,6. Hydrogels er ideelle materialer til at sammenfatte den endogene mikromiljø ekstracellulære matrix (ECM) i vivo på grund af deres væv-lignende mekaniske egenskaber og vand-hævede struktur, der giver mulighed for hurtig transport af næringsstoffer og signalering faktorer7,8. Derudover kan 3D hydrogels være designet til at have uafhængig kontrol over de mekaniske og biokemiske egenskaber ved skafottet. Både matrix mekanik9,10,11,12 og celle-klæbende ligander13,14,15 er velkendt at påvirke celle adfærd i vitro og in vivo. Således, 3D hydrogels med afstemmelige egenskaber tilbyder en platform for at studere årsagssammenhænge mellem celler og deres mikromiljø. Kriterier for en ideel 3D hydrogel matrix omfatter enkle, ikke-cytotoksiske celle-indkapsling samt uafhængige tunability af fysiologisk relevante mekaniske egenskaber og efterligner af indfødte celle-dobbeltklæbende motiver.

Både syntetisk (fx., polyethylenglycol, polylactic syre, poly (glykolsyre)) og naturligt afledt (fx., natriumalginat, kollagen, Matrigel) hydrogels har fordele over 2D i vitro kultur platforme; men de har også betydelige mangler, som begrænser deres anvendelighed. Første, mange syntetisk og naturligt afledt platforme kræver barske crosslinking betingelser, som kan være potentielt giftige for pattedyrceller, hvilket fører til nedsat celle levedygtighed7. Derudover mange syntetiske platforme mangler native bioactivity og skal være functionalized gennem sekundære kemiske reaktioner, som kan tilføje øget omkostningerne og kompleksiteten16. Endelig, mens naturligt afledt materialer indeholder typisk iboende bio-aktive domæner, de er ofte plaget af høj batch til batch variationer og ofte er begrænset til danner relativt svage geler7,17.

Rekombinante protein engineering præsenterer en unik værktøjssæt til materialedesign af så eksplicit kontrol over protein sekvens, og dermed de potentielle mekaniske og biokemiske egenskaber af den endelige hydrogel stillads18. Derudover ved at udnytte den velkendte biologiske maskiner af Escherichia coli (E. coli) til at udtrykke proteiner, kan materialer produceres omkostningseffektivt og konsekvent med begrænset inter - og intra-batch variabilitet. Elastin-lignende protein (ELP) præsenteres her har tre manipuleret domæner: (1) en T7 og His6 tag, der giver mulighed for mærkning fluorescently mærkede antistoffer, (2) en 'elastin-lignende' region giver elastisk mekaniske egenskaber og giver mulighed for kemiske Crosslinking, og (3) en 'bio-aktive' region, der koder for celle-dobbeltklæbende motiver.

Vores elastin-lignende region er baseret på den kanoniske (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sekvens hvor fire af 'Xaa' aminosyre websteder er isoleucin (Ile), men kunne være designet til at være nogen aminosyre undtagen prolin. Denne sekvens forlener rekombinant ELPs med lavere kritisk løsning temperatur (LCST) adfærd, der kan udnyttes til simpel rensning efter udtryk via termisk cykling19,20. Denne LCST egenskab kan indstilles til termisk samlede ved forskellige temperaturer ved at ændre gæst 'Xaa' rester21,22.

Her, er 'Xaa' holdningen på en af de fem elastin-lignende gentagelser blevet erstattet med Amin-præsenterer lysin (Lys) amino syre, som er udnyttet til hydrogel crosslinking. Vores tidligere arbejde har vist ikke-cytotoksiske og robust crosslinking via reaktion med Amin-reaktive crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chlorid (THPC)23. Af varierende samlede protein indhold og crosslinker koncentration er vi i stand til at producere hydrogels, der kan indstilles til at spænde over en fysiologisk relevante stivhed vifte (~0.5-50 kPa)9,23,24. Ud over tuning mekaniske egenskaber, celle vedhæftning inden for hydrogel resultaterne fra integration af canonical celle-klæbende domæner i rygraden i ELP protein. For eksempel, indarbejdelse af den udvidede fibronektin-afledte 'RGDS' aminosyresekvens giver mulighed for celle vedhæftning og konformationelle fleksibilitet, mens den scrambled, bindende 'RDGS' variant begrænser celle-matrix vedhæftning24. Af modulerende forholdet mellem celle-klæbende til ikke-klæbende proteiner samt den samlede proteinkoncentration, er vi i stand til effektivt at producere hydrogels, der spænder over en bred vifte af ligand koncentration. Resultantly, har vi udviklet en hydrogel platform med afkoblede biokemiske og biofysiske egenskaber, som kan indstilles uafhængigt for optimal 3D kultur af forskellige celletyper.

Matrix stivhed og klæbende ligand tunability har rekombinante hydrogels kapacitet til at design specifikke materialet nedbrydning profiler, som er nødvendige for celle spredning, spredning, og migration inden for en 3D sammenhæng4 , 9. denne nedbrydning, der ydes af celle sekretion af proteaser, der specifikt målretter enten udvidet 'RGDS'9 eller elastin-lignende sekvens25. ELP hydrogels har også vist sig at støtte de efterfølgende biokemiske analyser, der er nødvendige for at studere cellernes levedygtighed og funktion, herunder immuncytokemi samt DNA/RNA/protein udvinding for kvantitative bakgear transskription-polymerase kædereaktion (qRT-PCR) og Western blot9. ELP varianter har også været brugt i en række i vivo modeller og er kendt for at være veltolereret af immunsystemet26.

Taget under ét, ELP som en væsentlig platform for celle-indkapsling undersøgelser kan prale af en lang række fordele i forhold til syntetisk eller naturligt afledt materiale platforme, som ofte ikke har samme grad af biokemiske og biofysiske tunability og reproducerbarhed. Derudover ELPS enkle og ikke-cytotoksiske brug med en lang række celletyper (fx., chick dorsalrodsganglier14,24, murine neurale stamfader celler9, humane mesenkymale stamceller celler27, kvæg neonatal chondrocytter28, menneskelige endothelial celler29,30) giver mulighed for en mere fysiologisk relevante model af den endogene 3D ECM sammenlignet med 2D cellekultur. Heri, præsenterer vi en protokol for udtryk for recombinantly udvundet, ELPs til brug som en afstemmelige hydrogel platform for 3D cell indkapsling. Yderligere præsenterer vi metoden for down-stream fluorescerende mærkning og konfokal mikroskopi af indkapslede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ELP udtryk protokol

  1. Dag 1: Voksende starter koloni
    1. Forberede ampicillin og chloramphenicol agar plader ved autoklavering 25 g Luria, bouillon og 15 g agar per 1 L ultrarent vand. Når løsningen er afkølet til ~ 60 ° C, der tilsættes 1 mL ampicillin stock (100 mg/mL i ultrarent vand) og 1 mL af chloramphenicol stock (34 mg/mL i 70% ethanol) til 1 L af agar løsning for endelige 100 µg/mL og 34 µg/mL , henholdsvis. Overføre 20 mL af endelige løsning til 10 cm petriskåle med en serologisk pipette og tillade agar størkne. Wrap petriskåle med parafilm og opbevares ved 4 ° C.
      Bemærk: petriskåle kan opbevares ved 4 ° C i op til to uger.
    2. Streak et lille udsnit af BL21 (DE3) pLysS E. coli fra en pre-made bakteriel lager, der indeholder en pET15b vektor kodning ELP af interesse på en ampicillin og chloramphenicol agar plade.
      Bemærk: Ampicillin og chloramphenicol Vælg for bakterier, der indeholder både pET15b og pLysS vektorer, henholdsvis.
    3. Placer den stribede plade op og ned i en inkubator ved 37 ° C. Tillade bakteriel kolonier til at vokse natten over.
      Bemærk: Ikke Inkuber plader i mere end 16 h, som ampicillin vil nedbrydes og de kolonier, der ikke bærer ampicillin-resistens kan danne.
  2. Dag 2: Forberedelse af starteren kultur og expression media
    1. Fjerne E. coli kultur fra rugemaskinen. Parafilm pladen og butik for højst 4 dage ved 4 ° C.
    2. Forbered en igangsætter kultur kolbe (250 mL) og udtrykket kultur kolber (12 x 1 L) og autoklave. 1 L i expression media, tilføje 47,6 g fantastisk bouillon og 4 mL glycerol til 1 L ultrarent vand i en 2 L forbløffet kultur kolbe og cap med aluminiumsfolie.
      Bemærk: Typisk udbyttet er 60-100 mg/L protein i expression media.
    3. Indlæse autoklaveres starteren i pre varmede, 37 ° C ryster inkubator og inkuberes uden agitation.
    4. Tilføje 250 µL sterilt-filtreret (0,22 µm filter) ampicillin materiel (100 mg/mL i ultrarent vand) til starteren kultur til en endelig koncentration på 100 µg/mL. Straks begynde at agitere starter kultur ved 250 omdrejninger i minuttet.
      Bemærk: Chloramphenicol bruges kun til kolonien udvalg på agar plader og er ikke inkluderet for flydende kulturer.
    5. Podes starter kultur ved at tilføje en enkelt ELP plasmid-holdige E. coli koloni fra stribede pladen og lad starteren kultur til at ryste ved 37 ° C i 16 h.
    6. Placere udtryk Kulturmedier kolber i pre varmet, 37 ° C ryster væksthuse og inkuberes natten over uden agitation, således at kolberne er klar til at finde den næste morgen.
  3. Dag 3: Inducerende protein udtryk i E. coli
    1. Gøre friske, steril-filtreret ampicillin stock (100 mg/mL i ultrarent vand). Der tilsættes 1 mL ampicillin materiel til hver kolbe af expression media til en endelig koncentration på 100 µg/mL.
    2. Begynd agiterer expression media ved 250 omdrejninger i minuttet.
    3. Tage en 2 mL prøve af medierne fra ethvert udtryk kolbe og tilføje til en kuvette som en tom for en optisk tæthed læsning på 600 nm (OD600).
    4. Efter afslutningen af 16 h starter kultur inkubation, podes hver udtryk kolben ved at overføre 20 mL af starteren kultur til hver udtryk kolbe via en serologisk pipette.
    5. Efter afslutningen af 1 h agitation, måle OD600 en af udtryk kolber. Efter dette trin, måle OD600 hver 20 min, kontrollerer en anden kolbe hver gang.
    6. På en OD600 på 0,6, reducere temperaturen i shakers indeholdende udtryk kolber til 32 ° C.
    7. Kontrollere OD600 hver 10 min. En OD600 af 0,8, medføre udtrykket ved tilsætning af 1 mL af 1 M, steril-filtreret β-isopropyl thiogalactoside (IPTG) i ultrarent vand til hvert udtryk kolbe.
    8. Tillad E. coli i udtryk kolber udtrykke 7 h.
    9. 20 min før udgangen af udtryk, pre-afkøle et stort gulv centrifuge til 4 ° C.
    10. Indsamle alle 12 L af expression media i individuelle centrifuge containere og balance.
    11. Centrifugeres expression media på > 12.000 x g i 15 min. ved 4 ° C ved hjælp af en floor centrifuge.
    12. Hæld supernatanten fra hver beholder, centrifuge. Ved hjælp af en spatel, indsamle celle pellets ind en pre vejes zip-lock pose.
    13. Genopslæmmes pellet i steril-filtreret ti buffer (100 mL buffer pr. 25 g pellet) og fjerne eventuelle overskydende luftbobler af masserer pelleten. 1 L ti buffer, tilføje 5,8 g natriumchlorid, 1,21 g af tris base og 0,37 g ethylendiamin tetraacetic syre (EDTA) dinatrium salt dihydrat til 900 mL i ultrarent vand. PH indstilles til 8,0 og bringe til 1 L. For dette trin er pH-strips tilstrækkelig.
    14. Læg zip-lock pose indeholder re suspenderede celle pellet i en sekundær beholder og fryse ved-80 ° C natten over.
  4. Dag 4-6: sprænges den bakterielle cellevæg via fryse-tø cykler
    1. Fjern frosne toerstoffet fra fryseren og lad den langsomt tø ved 4 ° C med blid agitation ved hjælp af en orbitalryster.
    2. Tillad pellet at tø indtil nogle væske er til stede. Tilføje ~ 30-40 mg af deoxyribonuclease optøet I (DNase) til lysate. Derudover tilsættes 1 mL 100 mM phenylmetylsulfonylfluorid (PMSF; en protease hæmmer) i isopropanol pr. 100 mL af cellen lysate. Tillade lysate at ryste natten over.
      Bemærk: Tilføje DNase og PMSF er kun nødvendig for den første fryse-tø cyklus.
      Forsigtig: PMSF er giftigt ved indånding. En ansigtsmaske bør anvendes, når du håndterer PMSF pulver.
    3. Når cellen lysate er helt optøet, Frys den lysate ved-80 ° C natten over, eller indtil helt frosset.
    4. Gentag proceduren fryse-tø for ialt tre cyklusser. Forlade den lysate optøet ved 4 ° C efter den sidste fryse-tø. Gemme 100 µL af rå lysate for sodium dodecyl sulfat-polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE) analyse ved afslutningen af rensning.
    5. Efter den sidste tø, pH-værdien af de optøede lysate til 9,0 med 1 M NaOH. For dette trin er pH-strips tilstrækkelig. Der inkuberes ved 4 ° C i mindst 1 time (natten er passende) på en orbitalryster.
  5. Dag 7-9: ELP rensning via kolde og varme spin varmepåvirkning
    1. Cool gulvet centrifuge til 4 ° C 20 min inden centrifugering.
    2. Alikvot og balance den optøede lysate til centrifuge beholdere.
    3. Centrifugeres prøver på > 15.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Gemme 100 µL af supernatanten for SDS-PAGE analyse efter afslutningen af rensning.
      Bemærk: Efter centrifugering ELP protein bør forblive i supernatanten på grund af dets høje Opløselighed i vand ved temperaturer under sin LCST (< 32 ° C).
    4. Overføre supernatanten til nye centrifuge containere og balance korrekt.
    5. Tilføje natriumchlorid (NaCl) i tre dele til en endelig koncentration på 1 M (5.84 g NaCl for hver 100 mL af supernatanten). Sikre, at NaCl er tilføjet i tre dele til at give mulighed for tilstrækkelig opløsning.
    6. Agitere i 3 timer ved 37 ° C ved 250 rpm i en rystende inkubator.
    7. 1 h inden udgangen af agitation, varme pre gulvet centrifuge til 37 ° C.
    8. Der centrifugeres ved > 15.000 x g i 1 timer ved 37 ° C. Gemme 100 µL af supernatanten for SDS-PAGE analyse efter gennemfoerelsen af rensning og resterende supernatanten.
      Bemærk: Efter centrifugering ELP protein bør være pelleted på grund af dets lave Opløselighed i vand ved temperaturer over sin LCST (> 32 ° C).
    9. Genopslæmmes pellet ved tilsætning af 10 mL af autoklaveres, ultrarent vand pr. 1 g pellet. Brug en metal spatel til mash pellet til støtte i opløsningen af proteinet.
    10. PH-værdien af de optøede lysate til 9,0 med 1 M NaOH. For dette trin er pH-strips tilstrækkelig.
    11. Agitere natten over ved 4 ° C på en orbitalryster.
    12. Gentag den kolde og varme spin termisk cykling procedure for ialt tre cyklusser (dvs., Gentag trin 1.5.1 gennem 1.5.11 for tre samlede cykler).
  6. Dag 10-15: ELP dialyse og ingot
    1. Centrifugeres igen suspenderede pellet i en pre kølet centrifuge på > 15.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Gemme 100 µL af supernatanten for SDS-PAGE analyse efter afslutningen af rensning.
    2. Desalt protein løsning af dialyzing de resterende supernatanten i en 3,5 kDa dialyse membran mod 4 L pre kølet ultrarent vand ved 4 ° C. Ændre dialyse vandet to gange om dagen for ialt 6 gange over 3 dage.
      Bemærk: Typisk supernatanten diskenheder er mellem 5 og 30 mL.
    3. Centrifugeres den dialyzed løsning i en pre afkølede centrifuge på > 15.000 x g i 1 time ved 4 ° C. Gemme 100 µL af supernatanten for SDS-PAGE analyse for enden af rensning.
    4. Fryse den resulterende supernatanten ved-80 ° C i pre vejes koniske rør.
    5. Lyophilize den frosne løsning for 3 dage og masse slutproduktet til at bestemme protein udbyttet.
    6. Parafilm de rør, der indeholder endelige frysetørret ELP produkt og opbevares ved 4 ° C.
    7. Køre SDS-PAGE for at bestemme renheden af proteinet.
      Bemærk: Protokoller for SDS-PAGE vil variere baseret på specifikke Agarosen gel betingelser. Vores eksperimenter, var endelige frysetørrede protein opløst til en koncentration på 0,5 mg/mL deioniseret vand og køre på 140 V i 70-100 minutter i en 12% (w/v) acrylamid gel under denatureringen betingelser.

2. celle indkapsling i 3D Elastin-lignende Protein Hydrogels

  1. Forberedelse af silikoneforme
    1. Brug en biopsi punch med den ønskede diameter til at skabe huller i en 0,5 mm tykt silikone ark og skære en firkant omkring hvert hul. Gentag for antallet af forme ønskes.
      Bemærk: Diameteren og tykkelsen af formene kan justeres til særlig anvendelse og celle kultur betingelser. I praksis, for cellekulturer af 50 106 celler/mL, 0,5 mm tyk forme med 4 mm og 5 mm diameter anbefales til tilstrækkelig DNA/RNA og protein udvinding, henholdsvis. For immunfarvning, kan et 2 mm biopsi punch bruges i stedet oprette tre tilstødende huller pr. kvadrat skimmel, så tre gentagelser kan farves pr. brønd.
    2. Fjerne plastikfolie på hver side af den enkelte mug med pincet.
      Bemærk: Undgå kontakt med den udsatte silikone overflade som forurening kan reducere fremtidige plasma limning effektivitet.
    3. Brug af pincet, arrangere det samme antal nøgne silikoneforme og glas coverslips (nr. 1, 12 mm i diameter) i skiftende rækker på det inverterede låget af en 48-godt plade. Når først færdig, dække låget af 48-godt pladen til at undgå forurening.
    4. Ilt plasma behandle hele 48-godt plade låg (dvs., forme og glas lysbilleder). Umiddelbart efter, skal du bruge pincet til at invertere silikone formen på den tilstødende glas coverslip. Tryk fast på formen at sikre limning. Lad formene Inkuber ved stuetemperatur i 1 time.
      Bemærk: Ilt plasma behandlingens varighed vil variere afhængigt af måleapparatet. Typiske betingelser for vores instrument er en drift gas pres vindue mellem 0,3-4 mbar, ilt gasflow på 20 cm3/min, og prøven eksponering for plasma for 10-20 s.
    5. Sterilisere formene ved autoklavering. Gemme forme ved stuetemperatur i et sterilt miljø indtil brug.
      Bemærk: Formene kan gemmes i denne fase på ubestemt tid.
  2. Forberedelse af elastin-lignende protein stamopløsning
    1. Fjern frysetørret ELP fra 4 ° C opbevaring. Varm protein til stuetemperatur før åbning af røret for at sikre ingen kondensering bygger på protein over gentagen brug.
    2. Opløse ELP i Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) ved 4 ° C med konstant agitation (dvs., spinning) natten over.
      Bemærk: ELP Stamopløsningens koncentration vil fortyndes yderligere med tilføjelsen af crosslinker løsning på en bruger-defineret volumetriske ratio. For eksempel, for en 3% (w/v) Endelig ELP koncentration, forberede en 3,75% (w/v) ELP stamopløsning, der vil være fortyndet i forholdet 4:1 volumetriske ELP løsning: crosslinker løsning. Justere koncentration som nødvendigt for ønskede program.
    3. Sterile filter ELP stamopløsning ved hjælp af et 0,22 µm sprøjte filter. Gemme ELP på is når den ikke er i brug.
  3. Overføre sterile formene med sterile pincetter til en 24-godt vævskultur plade i biosikkerhed kabinet.
  4. Forberedelse af THPC stamopløsning
    1. Fortynd THPC i DPBS lige før at bruge. Justere koncentrationen af THPC løsning ifølge ELP slutkoncentration og ønskede crosslinking ratio.
      Bemærk: For protokollen, en endelig ELP koncentration på 3% (w/v) sker ved at blande ELP stamopløsningen med THPC løsning på en volumetrisk forholdet 4:1. Justere efter behov.
    2. Tilføje 2.6 µL af THPC løsning (80% i vand) til 997.4 µL af DPBS.
      Bemærk: Denne koncentration af THPC svarer til en 1:1 Støkiometrisk forhold mellem hydroxy methylgrupper på THPC og primære aminer på ELP protein når blandingsopløsninger på beskrevet 4:1 volumetriske ratio for en afsluttende 3% (w/v) ELP hydrogel. THPC løsning er tyktflydende og dråber af løsning kan holde sig til siden af pipette tip. For nøjagtig koncentrationer, undgå sådanne dråber når fortynding i DPBS. Rense THPC stock container med nitrogen gas at forhindre oxidation af phosphine og inaktivering af crosslinker.
    3. Vortex løsning til at blande og holde på is.
    4. Sterile filter THPC lagerfører løsning ved hjælp af et 0,22 µm sprøjte filter. Fortynd THPC stamopløsning yderligere med steril DPBS at opnå lavere støkiometriske crosslinking nøgletal (fx., 0.5:1 eller 0.75:1).
      Bemærk: THPC er ilt-følsomme, og den fortyndede opløsning bør bruges inden for et par timer efter tilberedning.
  5. Adskille cellerne ved inkubering med Trypsin-EDTA i en enkelt celle suspension, sammenpresse cellerne, og tælle de celler igen suspenderet i medium ved hjælp af en hemocytometer.
    Bemærk: Nøjagtige protokoller for dette trin vil afhænge stærkt ønskede celletype og anvendelse. For de neurale stamceller anvendes i denne protokol, blev et 0.025% Trypsin-EDTA inkubation ved stuetemperatur til 1,5 min gennemført. Cellerne var pelleted ved 200 x g i 2 min. For øget cellernes levedygtighed, bør celler suspenderes ved medium normal. Typiske celle tætheder anvendes til indkapsling celleområde fra 1-50 106 celler/mL af endelige hydrogel volumen. Justere efter behov.
  6. Alikvot det ønskede antal celler i et sterile 1,5 mL-centrifugerør.
  7. Centrifugeres celler ved ~ 200 x g i 3 min. omhyggeligt, Aspirér supernatanten og holde celle pellet på is.
    Bemærk: Det er afgørende at helt Aspirér alle supernatanten for at afbøde den yderligere fortynding af ELP og THPC crosslinker. Specifikke centrifugering hastigheder varierer med celletype.
  8. Genopslæmmes celle pellet i ELP stamopløsning, således at lydstyrken er 80% af det endelige rumfang (forudsat forholdet 4:1 af ELP løsning: THPC løsning). Der afpipetteres mix 20 - 25 gange til at producere en homogen blanding af celler og ELP.
    Bemærk: Undgå gribende bunden af røret at afbøde temperaturstigning og efterfølgende fase overgang af ELP. Hver 2 mm skimmel med tre replikater kræver 7,5 µL af endelige rumfang (dvs., 6 µL af ELP stamopløsning og 1,5 µL af THPC stamopløsning) ligeligt i de 3 huller (dvs., 2,5 µL endelige mængden pr. hul). For de 4 og 5 mm forme er en endelige mængden af 7,5 µL og 15,5 µL nødvendig, henholdsvis.
  9. Tilføj THPC stamopløsning celle/ELP affjedring for de resterende 20% endelige rumfang. Der afpipetteres mix 20 - 25 gange til at producere en homogen blanding.
  10. Straks afpipetteres tilsvarende endelige mængden af ELP-celle-THPC blandingen i hver skimmel af en cirkulær bevægelse. Gentag for alle forme.
  11. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 15 min, efterfulgt af en yderligere inkubation ved 37 ° C i 15 min.
    Bemærk: Den første inkubationstiden vil bidrage til at lette indledende crosslinking af hydrogel før stigende temperatur som ovenfor ELP'S LCST og overtalelse sin termiske fase adskillelse.
  12. Langsomt tilføje 750 µL af varm cellekulturmedium til hver brønd af 24-godt plade, undgå forstyrre geler.
  13. Inkubér hydrogels ved 37 ° C i 7 dage.
    Bemærk: Fuld medium ændringer anbefales hver 1-2 dage afhængig af celletype. For at begrænse belastningen på gelen, skal du bruge et glas Pasteur pipette anbringes med en 200 µL pipette tip, når sugning medium fra brønden.

3. immuncytokemi af celler i 3D ELP Hydrogels

  1. Forberede fiksering løsning ved at blande 10 mL 16% (w/v) PARAFORMALDEHYD (PFA) i 30 ml DPBS. Varm løsning til 37 ° C.
  2. Opsug medium fra 24-godt plade og forsigtigt vaske med 1 mL af DPBS.
  3. Tilføje 750 µL af opløsningen fiksering til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 30 min. Brug ikke vævskultur inkubator til at undgå forurening af andre kulturer med PFA damp.
  4. Omhyggeligt Aspirér fiksering løsning fra hver brønd, udsmid PFA til en passende farligt affald container.
    Forsigtig: Eksponering for PFA kan forårsage hud- og øjenirritation. Bære handsker/sikkerhedsbriller og arbejde i en kemisk stinkskab.
  5. Der tilsættes 1 mL af DPBS til hver prøve. Straks Opsug DPBS og kassér i PFA spildbakken.
  6. Vask prøver to gange med 1 mL af DPBS i 10 min.
    Bemærk: Prøver kan opbevares i DPBS ved 4 ° C i op til en uge efter forsegling pladen med Parafilm.
  7. Permeabilize hver prøve med 750 µL af permeabilization løsning (100 mL af DPBS og 0,25 mL Triton X-100; PBST) i 1 time ved stuetemperatur på en rocker på 15 rpm.
  8. Opsug PBST og tilføje 750 µL blokerende løsning (95 mL PBS, 5 g af bovint serumalbumin (BSA), 5 mL serum og 0,5 mL Triton X-100) til hver prøve. Inkuber ved stuetemperatur i 3 timer på en rocker på 15 rpm.
    Bemærk: Den blokerende løsning bør indeholde serum fra værten arter som de sekundære antistoffer var rejst (fx., ged, donkey) og sterile filtreres gennem et 0,22 µm filter før brug.
  9. Forberede antistof fortynding løsning (97 mL af DPBS, 2,5 g af BSA, 2,5 mL serum (fra samme vært arter som i trin 3.8) og 0,5 mL Triton X-100). Fortynd den primære antistof ved hjælp af antistof fortynding løsning og tilføje 500 µL af opløsningen til hver prøve. Forsegle pladen med Parafilm og inkuberes natten over ved 4 ° C på en rocker.
    Bemærk: Nestin og Sox2 primære antistoffer var fortyndet 1: 400 i antistof fortynding løsning fra producentens oprindelige koncentration.
  10. Opsug antistof løsningen fra hver prøve og vaske prøver med PBST for 60 min. ved stuetemperatur på en rocker på 15 rpm. Gentag trinnet vask 3 gange.
  11. Fortynd den sekundære antistoffer og 5 mg/mL stock DAPI (1:2, 000) ved hjælp af antistof fortynding løsning og tilføje 500 µL af opløsningen til hver prøve. Dække de 24-godt plade med alufolie og inkuberes natten over ved 4 ° C på en rocker.
    Bemærk: Som de sekundære antistoffer er lysfølsomt, prøverne skal beskyttes fra photobleaching for alle efterfølgende trin. Ged anti-mus og ged anti-kanin sekundære antistoffer var fortyndet 1: 500 i antistof fortynding løsning fra producentens oprindelige koncentration.
  12. Opsug antistof løsningen fra hver prøve og vaske prøver med PBST i 30 min. ved stuetemperatur på rocker. Gentag trinnet vask 3 gange.
  13. Anbring en dråbe hard-set montering medium på overfladen af et glas dias. Brug af pincet, fjerne overskydende løsning fra formen af let blotting kanten af skimmelsvamp på et stykke køkkenrulle. Omhyggeligt placere skimmel hovedet på montering medium og undgå at indføre bobler.
  14. Tillad montering medium til at hærde i 48 timer ved stuetemperatur. Opbevare prøver ved stuetemperatur eller 4 ° C. Tillad montering medium til fuldt angivet for 48 h før imaging som brydningsindekset af mediet vil ændre løbet af hærdning. Forsegle prøver til glas dækning dias med klar neglelak til at mindske forurening eller prøve bevægelse.
  15. Billede prøverne ved hjælp af en Konfokal mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De ELPs bruges i denne protokol består af fem regioner: en T7 tag, His6 tag, enterokinase (EK) kavalergang site, en bio-aktive region og en elastin-lignende region (figur 1). Koderne T7 og His6 giver mulighed for nem identifikation gennem standard vestlige skamplet teknikker. Indførelsen af EK kavalergang site giver mulighed for den enzymatiske fjernelse af tag-regionen, hvis det er nødvendigt. Den bio-aktive region koder for udvidet, fibronektin-afledte celle-klæbende ('RGDS') eller ikke-klæbende ('RDGS') sekvenser. Endelig, den centrale gentagelse af elastin-lignende regionen indeholder en lysin gruppe på webstedet gæst rester, som giver crosslinking via THPC, mens de flankerende gentager indeholder isoleucin for at opnå en LCST ~ 32 ° C31.

Indlæg udtryk, SDS-PAGE og Western blot kan bruges til at visualisere molekylvægt og bekræfte identiteten af ELPs, der indeholder antistof tags, såsom T7 (MASMTGGQQMG) eller His6 (JANNICK) (figur 2). Vellykket udtryk under kontrollerede forhold giver en meget homogen byggevare repræsenteret ved tilstedeværelsen af en enkelt mørkt bånd på den omtrentlige molekylvægt (~ 37 kDa) af disse proteiner ved hjælp af begge SDS-PAGE (figur 2A) og Western blot) Figur 2B).

Tilstedeværelsen af lavere molekylvægt bands på en vestlige skamplet foreslår i ukontrollerede forhold, at nogle brøkdel af proteiner ikke var fuldstændig oversat og/eller blev forringet efter udtryk (figur 2 c). Specifikt, er masserne her jævnt fordelt af ~ 9 kDa, hvilket omtrent svarer til vægten af en bio-aktive region og tre elastin-lignende regioner (en ' gentagelse'), eller cirka en fjerdedel af target proteinet. Disse mindre protein fragmenter er som regel til stede når udtrykket udføres ved en højere temperatur (> 32 ° C) som i figur 2 c. Tilstedeværelsen af disse lavere molekylvægt proteiner kan føre til uforudsigelige mekaniske egenskaber. Derfor, regelmæssig screening indlæg udtryk anbefales at sikre en høj kvalitet slutprodukt.

Den mekaniske stivhed af ELP-baseret hydrogels kan ændres ved at manipulere koncentrationen af ELP eller forholdet mellem THPC reaktive grupper: ELP primære aminer. Samtidigt, kan koncentrationen af celle-klæbende ligander indstilles ved at ændre forholdet mellem ELP varianter med celle-klæbende (RGDS) til ikke-klæbende (RDGS) sekvenser i enhver stivhed regime. Ved at manipulere disse to variabler, kan vi producere geler, der har et spektrum af mekaniske egenskaber og ligand koncentrationer (figur 3).

For at indkapsle celler inden for 3D ELP hydrogels, er det ønskede antal celler suspenderet i mediet og centrifugeres for at producere en celle pellet (figur 4A). Mediet er indsugning fra røret, og cellerne er re suspenderede ensartet i ELP løsning af den ønskede koncentration. Næste, THPC løsningen føjes til celle/ELP suspension og pipetted grundigt for at danne en homogen blanding. Denne løsning er hurtigt overført til sterile silikoneforme inden for en 24-godt plade ved hjælp af en pipette og tilladt at bitmapgenkendelse ved stuetemperatur og 37 ° C i 15 min. hver (figur 4B). Endelig er mediet tilføjet til godt pladen og inkuberes ved 37 ° C i eksperimentet.

Live/døde pletter kan bruges til at vurdere cellernes levedygtighed og vellykket celle indkapsling i ELP hydrogels. Som illustreret i figur 5, Vis voksen murine neurale stamceller (NPC) høj cellernes levedygtighed over 7 dage inden for en 3% (w/v) ELP hydrogel.

3D ELP hydrogels har tidligere vist sig at støtte NPC stilk vedligeholdelse målt gennem udtryk af canonical NPC protein markører SRY (sex bestemmelse af regionen Y)-boks 2 (Sox2) og nestin9. NPCs indkapslet i 3% (w/v) ELP hydrogels med lav THPC crosslinking Vis høj udtryk for nuklear-lokaliseret Sox2 og cytoplasmatisk nestin filamenter via immunfarvning og konfokal imaging (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : En skematisk gengivelse af ELP og tilsvarende aminosyresekvenser. ELP anvendes i denne undersøgelse indeholder en T7 og His6 tag til antistof-baseret tænkelig, en bioaktive regionen for indførelsen af celle-klæbende domæner og en elastin-lignende område, der giver elastisk mekaniske egenskaber og giver mulighed for kemiske crosslinking. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Target protein udtryk kan valideres med SDS-PAGE og Western blot at bekræfte molekylvægt og identiteten af det frysetørrede slutproduktet. Ren fuld længde ELP kører med en molekylevægt på 37 kDa som rapporteret af SDS-PAGE (A) og Western blot ved hjælp af T7 (MASMTGGQQMG) eller histidin 6 (JANNICK) tag (B). (C). urene partier af ELP på grund af afvigelser i ELP udtryk protokol kan føre til udtryk for ELPs med lavere Molekylær vægt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: RGDS ligand indhold kan indstilles uafhængigt fra mekaniske egenskaber inden for ELP hydrogels. 5% (w/v) og 3% (w/v) ELP hydrogels har shear moduli ~ 800 Pa og ~ 400 Pa, henholdsvis. Hydrogels med en 1:1 ratio af THPC reaktive grupper: ELP primære aminer var crosslinked ved stuetemperatur i 15 min., opvarmet til 37 ° C, og lov til at Blandingen henstår i 5 min før måling. Data er gennemsnit ± SD, *p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Skematisk af celle indkapsling i ELP hydrogels. (A). celler er oprindeligt adskilt i en enkelt celle suspension i medium og pelleted ved hjælp af en centrifuge. Mediet er indsugning fra røret, og cellerne er re suspenderet i ELP løsning på den ønskede koncentration og blandes godt. Endelig THPC crosslinking løsning tilsættes og blandes godt. (B). umiddelbart efter tilsætning af THPC, er løsningen kastet ud i en silikone formen med en pipette. Løsningen er tilladt at bitmapgenkendelse ved stuetemperatur i 15 min. efterfulgt af en anden 15 min inkubation ved 37 ° C. Medium føjes derefter til kultur godt for varigheden af forsøget. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Neurale stamceller opretholde høj rentabilitet i ELP hydrogels. Repræsentativt billede af neurale stamceller indkapslet i 3% (w/v) ELP hydrogels med 1:1 crosslinking (THPC reaktive grupper: ELP primære aminer) efter 7 dage i kultur. Grøn: live farvning (calcein-AM); Rød: døde farvning (ethidium homodimer). Skalalinjen = 100 µm.

Figure 6
Figur 6 : 3D ELP hydrogels støtte neurale stamceller celle stilk maker udtryk. Immunfluorescens billede af neurale stamceller giver udtryk for Sox2 og nestin proteiner efter 7 dage af kultur i ELP hydrogels. Billederne viser celler indkapslet i 3% (w/v) ELP geler med 0.5:1 crosslinking (THPC reaktive grupper: ELP primære aminer). Blå: DAPI (kerner); Red: Sox2; Grøn: nestin. Skalalinjen = 25 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinante protein proteinekspression og -oprensning er et kraftfuldt værktøj til at syntetisere biomaterialer med høj reproducerbarhed. Grund stort set fremkomsten af kommercialiseret molekylære kloning, kan brugerdefinerede rekombinant plasmider købes fra flere leverandører, hvilket reducerer tid til at arbejde med materialer som ELPs. På samme måde, plasmider kan bestilles direkte fra den oprindelige lab, når den oprindelige arbejde blev støttet af en føderal kontrakt og den fremtidige arbejde bliver til non-profit brug. Den fulde ELP aminosyresekvens har tidligere offentliggjort for flere ELP varianter31. Processen fra udtryk til eventuel oprensning af rekombinante proteiner indebærer imidlertid en række vigtige skridt, der kan ofte føre til reduceret udbytte eller en lavere kvalitetsprodukt. Nogle af de mest almindelige problemer for ELP forberedelse opstår i et af følgende: (1) kvaliteten af lagrede bakteriel bestande, (2) den første fryse-tø cyklus for at forstyrre den bakterielle membran, og (3) protein oprensning gennem varmepåvirkning.

En stor forskel mellem protein udtryk og andre ikke-biologiske midler til at producere materialer er, at vi udnytter den biologiske maskiner af rekombinant værter til at syntetisere polymerer. Senere, denne teknik kommer med en entydig begrænsning: cellulære dødsfald eller skader. Celledød manifesterer oftest sig som en reduceret antallet af bakteriel kolonier efter striber en plade eller unormalt små kolonier, der vokser relativt langsomt. Bakteriel bestande, kan hvis vedligeholdes omhyggeligt, forblive stabil i år; Men, gentagne fryse-tø cykler på grund af gentagen brug eller fryser kan reducere cellernes levedygtighed eller medfoere DNA-skader. Typiske BL21 bakterier bestande bruger mellem 10% og 40% glycerol volumen blandet med suspenderet celler. Formålet med glycerol er at mindske membran skader fra kernedannende iskrystaller under frysepunktet. Derfor bruger lave koncentrationer (< 10%) kan føre til en kompromitteret membran, mens højere koncentrationer (> 40%) kan undertrykke frysepunkt tilstrækkeligt til hvor bestanden aldrig fryser fører til celledød. Men selv inden for optimal glycerol niveauer, bakteriel bestande ikke må fuldt tø som en kombination af membran skader fra re frysning og cytotoksiske virkninger fra glycerol kan føre til reduceret bestanden levedygtighed og DNA-skader. Derfor, hvis det konstateres, at en bakteriel bestand resulterer i en lav kimtal eller at cellerne dividere med en konsekvent langsom hastighed (manifesterede sig som en langsom OD600 rampe sats under udtryk), re omdanne plasmidet og gør en ny bestand er en simpel første tilgang til fejlfinding af dette problem. Med dette i tankerne, for at sikre den langsigtede vedligeholdelse af bakteriel bestande og integritet af DNA, er det bedst at gemme kopier af dine plasmid som oprenset DNA frosne i vand og ikke i cellerne. Lagring af DNA på denne måde vil sikre, at i uforudsete begivenheder såsom et mislykket bestand eller fryser fiasko, en pålidelig kilde til den oprindelige DNA kan bruges til transformation.

En anden kritisk trin i ELP fabrikation er rensning af target proteinet fra værts-udtryk. Protein udvinding fra E. coli er opnået ved at bryde cellens væg ved hjælp af kernedannende iskrystaller, der danner hele den suspenderede celle lysate ved frysning, som forværres yderligere med gentagne fryse-tø cykler. Alternative metoder for brud cellevæggen kan udnyttes som sonikering eller en presse. Især er træk fryse-optøning af den lysate fordelagtig, da det kun kræver en fryser og ingen andre specialgrafit udstyr. Men denne procedure nonspecifically frigiver DNA, RNA og protein forureninger, ud over proteaser, der har potentiale til at forringe target proteinet. Derfor, at undgå forurening og reduceret udbytte, deoxyribonuclease jeg (DNase) og phenylmethanesulfonyl fluorid (PMSF) er føjet til cellen lysate at forringe DNA og hæmme proteaser, henholdsvis. Tilstedeværelsen af DNA før tilsætning af DNase kan observeres visuelt som en "trævlet" udseende hele cellen igen suspenderede lysate efter den første optøning. DNase nedbryder aktivt denne DNA og dermed reducerer viskositet af cellen lysate gør det nemmere at rense via centrifugering. Optimal nedbryde DNA kan bekræftes visuelt ved at sikre, at cellen lysate synes at være helt flydende og at trævlet udseende er ikke længere synlig. Vi har konstateret i praksis, at tilføjelsen af ~0.1 mg DNase pr. mL celle lysate er tilstrækkelig til at opnå nødvendige nedbrydning. Men hvis tilstedeværelsen af DNA er stadig observeret, flere DNase kan tilføjes efterfulgt af en yderligere to til tre timer af agitation. Et lignende problem kan også opstå hvis DNase lægges for tidligt, før nogen af de lysate har potentiale til at tilstrækkeligt tø. I dette tilfælde kan de koldere temperaturer begrænse effektiviteten af DNA nedbrydning som følge af for tidlig inaktivering af DNase. For at undgå dette problem, er det ofte bedst praksis at tillade de re suspenderede pellet at tø i ca 8 timer inden behandling med DNase. Derudover hvis lavt proteinindhold udbytter er rapporteret og nedbrydning af DNA har været tilstrækkelig, kan tilsætning af mere PMSF til at hjælpe yderligere at reducere potentielle protein nedbrydning fra proteaser være nødvendig.

Yderligere overvejelser for at sikre optimal udtryk for ELPs omfatter en grundig forståelse af fordelene og begrænsninger af en valgte antibiotikum. Her, blev pET15b vektorer indeholdende et ampicillin-resistens gen brugt til protein udtryk. Funktionelt, pET vector-serien giver mulighed for betydelige protein udtryk med så meget som 50% af en bakterie protein udtryk dedikeret til target proteinet efter en vellykket induktion32,33. Men ampicillin som et udvalg antibiotikum kommer med nogle begrænsninger, der kan forstyrre optimale udtryk. Først, nedbrydning af ampicillin i overværelse af E. coli kan ske hurtigt som følge af udgivelsen af beta-lactamase. Hvis en tilstrækkelig mængde af ampicillin er nedbrudt, kan ampicillin-kodning plasmid (dvs. ELP-kodning plasmidet) være tabt helt. Som et resultat, når at udtrykke ELPs længere varighed, bør protein udtryk niveauer overvåges nøje ved successive tid til sikre tilstrækkelig mængde af ELP-kodning-genet er fortsat for at tillade for ønskeligt udtryk. Mulige metoder til fejlfinding ophobning af beta-lactamaser omfatter spinning ned starter kultur og re suspendere celler i antibiotikum-frit medium før vaccination udtryk medium. Denne proces effektivt begrænser overførsel af antibiotika-nedbrydende enzymer og sikrer en større del af cellerne indeholder den mål-protein-kodning vektor. Derudover har ampicillin en begrænset holdbarhed på ca. to til tre uger. Derfor skal kultur plader til protein udtryk opbevares ved 4 ° C i højst to uger før brug. Endelig, for at sikre effektiviteten af ampicillin inden for starteren og udtryk medierne, ampicillin stamopløsningen bør være produceret frisk straks før brug, da langtidsopbevaring kan føre til en mindre effektiv antibiotikum.

Tilstedeværelsen af en LCST giver mulighed for simpel rensning af ELPs gennem varmepåvirkning. Specifikt, forårsage ved en højere temperatur og salte, entropic styrker ELPs bliver mindre opløselige og efterfølgende danner en polymer-rige coacervate fase. På den anden side ved lavere temperaturer, ELPs forbliver vandopløseligt og opløses let i løsningen. Cykling mellem disse to temperatur regimer kombineret med centrifugering skridt til at indsamle og kassér den ikke-ELP-holdige fase successivt koncentrerer proteinet og reducerer samtidig forekomsten af ikke-ELP forurenende stoffer.

Der er imidlertid en række faser, hvor ELPs kan gå tabt i denne rensningsprocessen. Først, før hver kolde spin, protein-holdige løsning er alkalized til pH 9,0. Denne højere pH tjener til at deprotonate visse aminosyrer på protein rygraden, effektivt forlader dem i en opladet tilstand og yderligere forbedrer deres opløselighed. Derfor kan ovenstående dette trin eller ikke giver tilstrækkelig tid til protein opløsning føre til en reduktion i udbyttet som ikke-solubilized proteiner vil være pelleted under centrifugering og kasseret.

På samme måde, target proteiner kan gå tabt under den varme spin procedure når Sprogmappen er pelleted. I første omgang, er NaCl føjet til protein-rige supernatanten at reducere opløseligheden af Sprogmappen. Salte arbejde for at beskytte elektrostatisk interaktioner mellem protein og vand molekyler, forårsager protein til at adskille fra vandfasen. Denne effekt forstærkes ved at opvarme den løsning, der på grund af entropic effekter, yderligere nedbryder den salthydrater 'bur"omkring ELPs og tvinger sammenlægning af proteiner. Ved lavere protein koncentrationer (dvs., den første varmecyklus), tilsætning af salte alene er ofte ikke tilstrækkelig til at forårsage denne faseadskillelse. Men som koncentrationen af protein øger (dvs., senere varmecykler), og der er mindre sekundære forurenende stoffer kan interagere med salte, Sprogmappen bliver mere let bundfald. Som et resultat, hvis salte er tilføjet for hurtigt, kan de blive fysisk fanget ved en sammenlægning af proteiner, der effektivt reducerer saltkoncentration af løsningen og begrænser yderligere protein nedbør. Salt bør således tilføjes i tre små partier til at sikre, at de har tilstrækkelig tid til homogen måde distribuere gennem opløsningen. Som en sidste bemærkning, variationer til ELP rygraden, enten gennem yderligere ændringer til gæst rester af elastin-lignende region eller ændringer til regionen bio-aktive kan betydeligt påvirke LCST adfærd. For at sikre optimal protein udbytter på tværs af protein varianter, er det derfor afgørende at optimere pH, saltkoncentration og salt type (fx., monovalent eller divalent) for de kolde og varme spins.

Kører SDS-PAGE ved protokollen afslutningen anbefales, da det kan bruges til nemt bestemme hvis betydelig ELP tab opstår under rensning trin. Kortvarigt, hvis ELP registreres i supernatant, som efter en hot spin, derefter protein er ikke at være effektivt fældet. Tilsvarende, hvis ELPs identificeres i en stikprøve af solubilized pellet efter en kold spin, derefter proteinet ikke bliver effektivt opløses.

ELP hydrogels tilbyder mange fordele i forhold til syntetisk eller naturligt afledt materiale. Specifikt, giver brugen af de Amin-reaktive crosslinker THPC en billig, enkel og afstemmelige mekanisme af protein crosslinking. Der er dog forskellige begrænsninger inden for den crosslinking protokol, der bør bemærkes. THPC er ilt følsomme, og hvis gemt under uhensigtsmæssige forhold, det kan hurtigt forværres i reaktion effektivitet. Derudover dens reaktivitet med primære aminer kan THPC reagere med omgivende proteiner i medier eller dem på cellens overflade, der er rige på aminer. Når danner ELP hydrogels, anbefales det derfor, medier kontaminering med celle pellet at reducere mulige eksogene protein krydsreaktivitet og dermed en reduktion i crosslinking effektivitet. Endelig, denne crosslinking mekanisme er til hinder for den bio-aktive region sekvens til dem, der indeholder ikke indeholder restkoncentrationer, lysin og dermed begrænser potentielle integration af nogle celle-dobbeltklæbende motiver (fx., IKVAV34). At tage fat på disse begrænsninger, ændringer til ELP rygraden med indeholder og bicyclononyne (BCN) reaktion partnere giver mulighed for bio-ortogonale crosslinking, som tidligere beskrevet27.

Det skal bemærkes, at funktionen ELP LCST spiller en vigtig rolle i dikterer hydrogel mikrostruktur. På temperatur regimer over LCST bundfald ELPs af løsning fører til dannelsen af protein-rige og protein-mangelfuld faser, der kan påvirke matrix porøsitet og crosslinking effektivitet af matrix9. Fordi de fleste celle kultur eksperimenter er udført på fysiologisk relevante temperaturer (~ 37 ° C) over ELP LCST, bør disse virkninger betragtes. For hydrogels effektivt bitmapgenkendelse og form en sammenkoblede protein netværk, primære Amin fra lysin skal have fysisk adgang til THPC crosslinker. Hvis ELP sammenlægning opstår før nå tilstrækkeligt crosslinking, kan ELPs fanget inden for protein-rige fase være utilgængelige og dermed ude af stand til at deltage i crosslinking. For at løse denne begrænsning, kræver vores protokollen en indledende 15 min crosslinking periode ved stuetemperatur, hvilket giver mulighed for foreløbigt crosslinking af hydrogel før Sprogmappen gennemgår sin termiske fase overgang. Denne stuetemperatur inkubation er efterfulgt af en yderligere 15 min inkubation ved 37 ° C at færdiggøre hydrogel crosslinking. Denne procedure er kritisk for tilstrækkelig crosslinking og robust, reproducerbare gellation ELP materiale.

Afslutningsvis tilbyder rekombinante protein hydrogels opdigtet benytter ELP ekstraordinære tunability af protein sekvens og derfor 3D celle mikromiljø. ELP polymerer har været vist sig at være udtrykkes i høje udbytter, let renset på grund af deres LCST adfærd, og biokompatible i en bred vifte af in vitro- og i vivo systemer. Brug af E. coli som rekombinant vært giver en enkel og billig procedure, der giver anledning til nær perfekt kontrol af polymer molekylvægt og funktionalitet. Sammen, denne teknik giver mulighed for robust tunability og reproducerbarhed af hydrogel platform giver mulighed for kulturen i en lang række celletyper i 3D. Endelig, denne ELP hydrogel platform er modtagelig for mange downstream biokemiske assays herunder qRT-PCR, vestlige skamplet, DNA-ekstraktion og celle immunfarvning9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne takker T. Palmer og H. Babu (Stanford Neurokirurgi) for at give murine NPCs. vektor kunst i figur 4 blev anvendt og tilpasset fra Servier medicinsk Art under Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). En del af dette arbejde blev udført på den Stanford Nano delte faciliteter (SNSF), støttet af National Science Foundation under award ECCS-1542152. N.A.S. anerkender støtte fra National Institute of General Medical Sciences af National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. anerkender støtte fra en NIH NRSA præ ph.d.-stipendium (F31 EB020502) og Siebel lærde Program. S.C.H. anerkender støtte fra National Institutes of Health (U19 AI116484 og R21 EB018407), National Science Foundation (DMR 1508006) og California Institute for regenerativ medicin (RT3-07948). Denne forskning har modtaget støtte fra den europæiske Alliance for regenerativ rehabilitering forskning & uddannelse (AR3T), som understøttes af Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health og menneskelige udvikling (NICHD), Statens Institut for Neurologiske lidelser og slagtilfælde (NINDS) og Statens Institut for biomedicinsk Imaging og bioteknologi (NIBIB) af de nationale kontorer i sundhed under Award nummer P2CHD086843. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis synspunkter af National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713
70% Ethanol RICCA Chemical 2546.70-1
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich A3920-500G
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25G
Bacto Agar Thermo Fisher Scientific 9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent Cells Invitrogen C606003
Chloramphenicol Amresco 0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
EDTA disodium salt, dihydrate Thermo Fisher Scientific O2793-500
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-4
Isopropanol Thermo Fisher Scientific A451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Thermo Fisher Scientific BP1755-10G
Luria Broth EMD Millipore 1.10285.5007
Parafilm VWR 52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals 195381
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm) Millipore SLGP033RB
Terrific Broth Millipore 71754-4
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filters Millipore SLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheet Electron Microscopy Science 70338-05
24-well tissue culture plates  Corning 353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm) Integra Miltex 33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm) Integra Miltex 33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm) Integra Miltex 33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  Corning 21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) Sigma-Aldrich 404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA Thermo Fisher  15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15701
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306 
Donkey Serum Lampire Biological Labs 7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) Molecular Probes A-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) Molecular Probes A-11071
Goat Serum Gibco 16210-072
Mouse Nestin Primary Antibody BD Pharmingen 556309
Mouse Sox2 Primary Antibody Cell Signaling Technology 23064S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium  Vector Labs H-1400 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Tags

Bioteknologi spørgsmålet 135 Elastin-lignende protein ELP hydrogel 3D celle kultur immunfarvning protein udtryk rekombinante protein
Produktionen af Elastin-lignende Protein Hydrogels til indkapsling og immunfarvning af celler i 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, … More

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D. J. Vis. Exp. (135), e57739, doi:10.3791/57739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter