Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57739
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Recombinant eiwit-engineered hydrogels zijn voordelig voor 3D-celkweek als ze toe voor volledige tunability van de ruggengraat van het polymeer, en dus de cel communicatie. Hier beschrijven we het proces van recombinante elastine-achtige EiwitReiniging en de toepassing ervan in 3D hydrogel cel inkapseling.

Abstract

Tweedimensionale (2D) weefselkweek technieken zijn essentieel voor ons begrip van de fundamentele celbiologie. Traditionele 2D weefselkweek systemen ontbreken een driedimensionale (3D)-matrix, wat resulteert in een aanzienlijke discrepantie tussen resultaten worden echter verzameld in vitro en in vivo. Om deze beperking, hebben onderzoekers ontworpen 3D hydrogel weefselkweek platforms die de biochemische en biofysische eigenschappen van de cel in vivo communicatie kunnen nabootsen. Dit onderzoek heeft gemotiveerd met de noodzaak te ontwikkelen van materiële platforms die ondersteuning 3D cel inkapselen en downstream biochemische tests. Recombinante Eiwittechnologie biedt een unieke toolset voor 3D hydrogel materiaalontwerp en ontwikkeling doordat voor de specifieke controle van eiwit sequentie en daarom, bij uitbreiding, de potentiële mechanische en biochemische eigenschappen van de resulterende matrix. Hier presenteren we een protocol voor de expressie van recombinantly afkomstige elastine-achtige eiwitten (ELP), die kan worden gebruikt om het formulier hydrogels met onafhankelijk afstembare mechanische eigenschappen en cel-lijm ligand concentratie. Verder presenteren we een methodologie voor de inkapseling van de cel binnen ELP hydrogels en latere immunefluorescentie kleuring van ingesloten cellen voor downstream analyse en kwantificering.

Introduction

In de afgelopen eeuw, tweedimensionale (2D) weefselkweek uitgegroeid tot een integraal toolset voor studeren fundamentele cel biologie in vitro. Bovendien, hebben de relatief goedkope en eenvoudige protocollen voor 2D celkweek geleid tot de goedkeuring ervan in veel biologische en medische disciplines. Afgelopen onderzoek heeft echter aangetoond dat de traditionele 2D platforms tot resultaten leiden kunnen dat afwijken aanmerkelijk van die verzameld in vivo, waardoor kostbare tijd en middelen verspild voor klinisch georiënteerd onderzoek1,2, 3. Wij en anderen veronderstellen dat deze discrepantie kan worden toegeschreven aan het ontbreken van inheemse biochemische en biofysische signalen aan de cellen gekweekt op 2D oppervlakken, die nodig zijn voor de optimale proliferatie en rijping van verschillende celtypes kunnen worden verstrekt.

Om deze beperkingen en help brug de kloof tussen 2D hebben in vitro en in vivo studies, onderzoekers ontwikkelde driedimensionale (3D) hydrogel platforms voor cel-inkapseling1,4,5 ,6. Hydrogels zijn ideale materialen te recapituleren de endogene communicatie van de extracellulaire matrix (ECM) in vivo als gevolg van hun weefsel-achtige mechanische eigenschappen en de water-gezwollen structuur waarmee snelle transport van voedingsstoffen en signalering factoren7,8. Bovendien kan 3D hydrogels worden ontworpen om onafhankelijke controle hebben over de mechanische en biochemische eigenschappen van de steiger. Matrix mechanica9,10,11,12 zowel cel-lijm liganden13,14,15 zijn bekend om te beïnvloeden van de cel gedrag in vitro en in vivo. Dus bieden 3D hydrogels met afstembare eigenschappen een platform om te bestuderen van de causale relaties tussen cellen en hun communicatie. Criteria voor een ideale 3D hydrogel matrix omvatten eenvoudige, niet-cytotoxische cel-inkapseling, alsmede onafhankelijke tunability van fysiologisch relevante mechanische eigenschappen en nabootsers van inheemse cel-lijm motieven.

Beide synthetische (bv., Polyethyleenglycol, polylactic acid, poly (glycolic zuur)) en natuurlijk afkomstige (bv., alginaat, collageen, Matrigel) hydrogels hebben voordelen ten opzichte van 2D in vitro cultuur platformen; echter, ze hebben ook aanzienlijke tekortkomingen waardoor hun toepasbaarheid beperkt. Eerste, vele synthetische en natuurlijk afkomstige platformen vereist harde crosslinking voorwaarden die potentieel giftig voor de cellen van zoogdieren kunnen, wat leidt tot verminderde cel levensvatbaarheid7. Bovendien, vele synthetische platformen gebrek aan inheemse topicale en moeten worden matiemaatschappij via secundaire chemische reacties, die meer kosten en complexiteit16kunnen toevoegen. Tot slot, terwijl natuurlijk afkomstige materialen doorgaans intrinsieke bio-actieve domeinen bevatten, ze worden vaak geplaagd door hoge-charges-variabiliteit en zijn vaak beperkt tot de vorming van relatief zwakke gels7,17.

Recombinante Eiwittechnologie presenteert een unieke toolset voor materialen ontwerp doordat expliciete controle over eiwit sequentie en, bij uitbreiding, de potentiële mechanische en biochemische eigenschappen van de definitieve hydrogel steigerwerk18. Bovendien, door gebruik te maken van de bekende biologische machines van Escherichia coli (E. coli) uitspreken eiwitten, kunnen materialen worden geproduceerd rendabel en consequent met beperkte inter - en intra-batch variabiliteit. De elastine-achtige eiwitten (ELP) hier gepresenteerd heeft drie gemanipuleerde domeinen: (1) een T7 en His6 tag waarmee voor labeling via fluorescently gelabeld antilichamen, (2) een 'elastine-like'-regio die verleent elastische mechanische eigenschappen en zorgt voor chemische crosslinking, en (3) een 'bio-active'-gebied dat voor cel-lijm motieven codeert.

Onze regio elastine-achtige is gebaseerd op de canonieke (Val-Pro-Glycine-Xaa-Glycine)5 elastine sequentie waar vier van de 'Xaa' aminozuur sites zijn isoleucine (Ile), maar kunnen worden ontworpen om elk aminozuur behalve proline. Deze reeks schenkt recombinante ELPs met lagere temperatuur (LCST) gedrag van kritische oplossing die kan worden benut voor eenvoudige reiniging na expressie via thermische fietsen19,20. Deze eigenschap van de LCST kan worden afgestemd op thermisch statistische bij verschillende temperaturen door aanpassing van de gast 'Xaa' residu21,22.

De positie van de 'Xaa' op één van de vijf elastine-achtige herhalingen is hier, met de amine-presenteren lysine (Lys) aminozuur, die wordt gebruikt voor de hydrogel crosslinking vervangen. Onze vorige werk is gebleken niet-cytotoxische en robuuste crosslinking via reactie met de amine-reactieve crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) fosfonium chloride (THPC)23. Door verschillende algemene inhoud en crosslinker eiwitconcentratie kunnen we produceren hydrogels die kunnen worden afgestemd om te beslaan een fysiologisch relevante stijfheid bereik (~0.5-50 kPa)9,23,24. Naast tuning mechanische eigenschappen, cel adhesie binnen de hydrogel vloeit voort uit de integratie van canonieke cel-lijm domeinen binnen de ruggengraat van de ELP-eiwit. Bijvoorbeeld, de opneming van de uitgebreide fibronectine afkomstige 'RGDS' aminozuur sequentie zorgt voor cel adhesie en conformationele flexibiliteit, terwijl de gecodeerde, niet-bindende 'RDGS' variant cel-matrix hechting24beperkt. Door het moduleren van de verhouding van cel-lijm niet-klevende eiwitten, evenals de totale eiwitconcentratie, kunnen we effectief produceren hydrogels die een grote verscheidenheid aan ligand concentratie bestrijken. Resultantly, hebben we een hydrogel platform met ontkoppelde biochemische en biofysische eigenschappen, die onafhankelijk van elkaar kunnen worden afgestemd voor optimale 3D cultuur van verschillende celtypes.

Naast de matrix stijfheid en zelfklevende ligand tunability bieden recombinante hydrogels de mogelijkheid om ontwerp specifieke materiële achteruitgang profielen, die nodig voor het verspreiden van cel proliferatie en migratie binnen een 3D-kader4 is , 9. deze afbraak wordt geboden door cel secretie van proteasen die specifiek gericht zijn op de uitgebreide 'RGDS'9 of elastine-achtige reeks25. ELP hydrogels is ook gebleken dat ter ondersteuning van de latere biochemische tests die nodig zijn voor het bestuderen van de levensvatbaarheid van de cellen en de functie met inbegrip immunocytochemie evenals DNA/RNA/eiwit extractie voor kwantitatieve reverse transcriptie-polymerase-kettingreactie (qRT-PCR) en Western blot9. ELP varianten zijn ook gebruikt in een aantal in vivo modellen en is bekend dat ze goed worden verdragen door het immuunsysteem26.

Tezamen, ELP zoals een materiële platform voor cel-inkapseling studies beschikt over een breed scala aan voordelen ten opzichte van synthetisch of natuurlijk afgeleide materiaal platforms, die vaak niet dezelfde mate van biochemische en biofysische tunability en reproduceerbaarheid. Bovendien, ELP van eenvoudig en niet-cytotoxische gebruik met een breed scala aan celtypes (bv., chick dorsal root ganglia14,24, lymfkliertest neurale progenitor cells9, menselijke mesenchymale stamcellen cellen27, runderen neonatale chondrocyten28, mens endotheliale cellen29,30) zorgt voor een meer fysiologisch relevante model voor de endogene 3D ECM in vergelijking met 2D celkweek. Hierin presenteren we een protocol voor de expressie van het recombinantly-afgeleide, ELPs voor het gebruik als een afstembare hydrogel platform voor 3D cel inkapseling. Verder presenteren we de methodologie voor het stroomafwaarts fluorescerende benoemen en confocale microscopie van ingekapselde cellen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ELP expressie Protocol

  1. Dag 1: Groeit de kolonie starter
    1. Bereiden ampicilline en chlooramfenicol agar platen in autoclaaf 25 g van Luria Bouillon en 15 g agar per 1 L ultrazuiver water. Zodra de oplossing is afgekoeld tot ~ 60 ° C, voeg 1 mL ampicilline voorraad (100 mg/mL in ultrazuiver water) en 1 mL chlooramfenicol voorraad (34 mg/mL in 70% ethanol) toe aan 1 L agar oplossing voor eindconcentraties van 100 µg/mL en 34 µg Mo/mL , respectievelijk. Breng 20 mL van de eindoplossing 10 cm petrischaaltjes met een serologische pipet en laat de agar te stollen. Wikkel de petrischaaltjes met parafilm en winkel bij 4 ° C.
      Opmerking: petrischalen kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal twee weken.
    2. Strijk een kleine steekproef van BL21 (DE3) pLysS E. coli uit een pre-en-klare bacteriële voorraad met een pET15b-vector codering van de ELP van rente op een ampicilline en chlooramfenicol agarplaat.
      N.B.: De ampicilline en chlooramfenicol selecteren voor zowel de pET15b als de pLysS vectoren, respectievelijk met bacteriën.
    3. De gestreepte plaat ondersteboven plaatsen in een incubator bij 37 ° C. Toestaan dat de bacteriële kolonies groeien 's nachts.
      Opmerking: Niet Incubeer de platen gedurende langer dan 16 h zoals ampicilline degraderen zal en de koloniën die draag niet ampicilline-resistentie kunnen vormen.
  2. Dag 2: Voorbereiding van de starter cultuur en expressie media
    1. Verwijder de E. coli cultuur uit de incubator. Parafilm de plaat en winkel voor een maximum van 4 dagen bij 4 ° C.
    2. Een starter cultuur kolf (250 mL) en expressie cultuur kolven (12 x 1 L) en autoclaaf voorbereiden. Voor 1 liter van expression media, 47.6 g van geweldig Bouillon en 4 mL glycerol toevoegen aan 1 L ultrazuiver water in een erlenmeyer van 2 L verbijsterd cultuur en kap met aluminiumfolie.
      Opmerking: Typische opbrengsten zijn 60-100 mg/L eiwit van expression media.
    3. Laad de gesteriliseerde met autoclaaf starter in voorverwarmde, 37 ° C schudden incubator en incubeer zonder agitatie.
    4. Voeg 250 µL van steriele gefiltreerd (0,22 µm filter) ampicilline voorraad (100 mg/mL in ultrazuiver water) toe aan de starter cultuur voor een eindconcentratie van 100 µg/mL. Onmiddellijk beginnen met het schudden van de starter cultuur op 250 toeren per minuut.
      Opmerking: Chlooramfenicol wordt alleen gebruikt voor de selectie van de kolonie op agar platen en is niet inbegrepen voor vloeibare culturen.
    5. Enten van de starter cultuur door het toevoegen van een enkele ELP plasmide-bevattende E. coli kolonie van de gestreepte plaat en laat de starter cultuur te schudden bij 37 ° C gedurende 16 uur.
    6. Plaats de expressie voedingsbodems kolven in vooraf opgewarmd, 37 ° C schudden van starterscentra en na een nacht bebroeden zonder agitatie zodat de kolven zijn klaar om te enten de volgende ochtend.
  3. Dag 3: Inducerende eiwituitdrukking in E. coli
    1. Het maken van verse, steriele gefiltreerd ampicilline voorraad (100 mg/mL in ultrazuiver water). Voeg 1 mL ampicilline voorraad aan elke maatkolf van expression media voor een eindconcentratie van 100 µg/mL.
    2. Begin schudden van de media van de expressie van 250 toeren per minuut.
    3. Neem een steekproef van 2 mL van de media uit elke kolf expressie en toevoegen aan een cuvet als een leeg voor een optische dichtheid lezen op 600 nm (OD600).
    4. Na de voltooiing van 16 h starter cultuur incubatie, Inoculeer elke kolf expressie door 20 mL van de starter cultuur aan elke maatkolf expressie overbrengen via een serologische pipet.
    5. Na de voltooiing van 1 h agitatie, meten de OD600 van één van de expressie kolven. Na deze stap, meten de OD600 iedere 20 min, een verschillende kolf elke tijd controleren.
    6. Bij een OD600 voor 0.6, verlaag de temperatuur van de shakers met de expressie kolven tot 32 ° C.
    7. Controleer de OD600 elke 10 min. Bij een OD600 van 0,8, veroorzaken u de expressie door toevoeging van 1 mL 1 M, steriele gefiltreerd β-isopropyl thiogalactoside (IPTG) in ultrazuiver water aan elke maatkolf expressie.
    8. Laat de E. coli in expressie kolven uitspreken voor 7 h.
    9. 20 min vóór het einde van expressie, cool vooraf een grote vloer centrifuge tot 4 ° C.
    10. Verzamel alle 12 L van expression media in individuele centrifuge containers en evenwicht.
    11. Centrifugeer de expressie media op > 12.000 x g gedurende 15 minuten staan bij 4 ° C met behulp van een centrifuge vloer.
    12. Giet af het supernatant vanuit elke container centrifuge. De cel pellets in een vooraf gewogen zip-lock zak met behulp van een spatel, verzamelen.
    13. Resuspendeer de pellet in steriele gefiltreerd tien buffer (100 mL buffer per 25 g pellet) en eventuele overtollige luchtbellen verwijderen door het masseren van de pellet. Voor 1 liter tien buffer, 5,8 g natriumchloride, 1,21 g van tris basis en 0,37 g ethyleendiamine Dinatriumethyleendiaminetetra zuur (EDTA) Dinatrium zout (dihydraat) p.a. toevoegen aan 900 mL ultrazuiver water. Breng de pH op 8.0 en brengen 1 L. Voor deze stap zijn pH strips voldoende.
    14. Plaats de zip-lock zak met de cel opnieuw gesuspendeerde pellet secundaire verpakkingsgasssen en bevriezen bij-80 ° C's nachts.
  4. Dag 4-6: bezwijken van de bacteriële celwand via cycli bevriezen-ontdooien
    1. De bevroren pellet verwijderen uit de vriezer en laat ze langzaam ontdooien bij 4 ° C met zachte agitatie met behulp van een roteerschudapparaat.
    2. Laat de pellet te ontdooien totdat wat vloeistof aanwezig is. Voeg ~ 30-40 mg voor deoxyribonuclease I (DNase) bij ontdooid lysate. Bovendien, voeg 1 mL 100 mM phenylmethylsulphonyl fluoride (PMSF; een proteaseinhibitor) in isopropanol per 100 mL van cel lysate. Laat de lysate te schudden 's nachts.
      Opmerking: De DNase en PMSF toe te voegen is alleen nodig voor de eerste freeze-dooi cyclus.
      Let op: De PMSF is toxisch inademing. Een gezichtsmasker moet worden gebruikt bij de behandeling van PMSF poeder.
    3. Zodra de cel lysate is volledig ontdooid, bevriezen de lysate bij-80 ° C's nachts, of tot volledig bevroren.
    4. Herhaal de procedure bevriezen-ontdooien voor een totaal van drie cycli. Laat de lysate ontdooid bij 4 ° C na de laatste bevriezen-ontdooien. Opslaan van 100 µL van raw lysate p.a. natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gel elektroforese (SDS-pagina) aan het einde van de zuivering.
    5. Na de laatste dooi, de pH van de ontdooide lysate tot 9.0 met behulp van de 1 M NaOH te regelen. Voor deze stap zijn pH strips voldoende. Incubeer bij 4 ° C gedurende ten minste 1 uur ('s nachts is passende) op een roteerschudapparaat.
  5. Dag 7-9: ELP zuivering via koude en warme spin temperatuurcycli
    1. Koel de centrifuge vloer tot 4 ° C 20 min vóór centrifugeren.
    2. Aliquot en evenwicht de ontdooide lysate in centrifuge containers.
    3. Centrifugeer de monsters op > 15.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opslaan 100 µL van het supernatans dat voor SDS-pagina-analyse na de voltooiing van de reiniging.
      Opmerking: Na het centrifugeren wordt de ELP-eiwit moet blijven in de bovendrijvende substantie als gevolg van de hoge oplosbaarheid in water bij temperaturen onder de LCST (< 32 ° C).
    4. Breng het supernatant aan nieuwe centrifuge containers en evenwicht op de juiste manier.
    5. Natriumchloride (NaCl) in drie delen toevoegen om een eindconcentratie van 1 M (5,84 g NaCl voor elke 100 mL van het supernatans dat). Ervoor zorgen dat NaCl in drie delen te voorzien van voldoende ontbinding is toegevoegd.
    6. Agitate gedurende 3 uur bij 37 ° C op 250 toeren per minuut in een schudden incubator.
    7. 1 uur vóór het einde van agitatie, warm vooraf een centrifuge vloer tot 37 ° C.
    8. Centrifugeer bij > 15.000 x g gedurende 1 uur bij 37 ° C. Opslaan van 100 µL van het supernatans dat voor SDS-pagina-analyse na de voltooiing van de reiniging en de resterende vloeistof wordt weggeworpen.
      Opmerking: Na het centrifugeren wordt de ELP-eiwit moet worden pelleted vanwege zijn lage oplosbaarheid in water bij temperaturen boven de LCST (> 32 ° C).
    9. Resuspendeer de pellet in door het toevoegen van 10 mL gesteriliseerde met autoclaaf, ultrazuiver water per 1 g pellet. Gebruik een metalen spatel aan beslag van de pellet om te helpen bij de ontbinding van het eiwit.
    10. Breng de pH van de ontdooide lysate tot 9.0 met behulp van de 1 M NaOH. Voor deze stap zijn pH strips voldoende.
    11. Agitate's nachts bij 4 ° C op een roteerschudapparaat.
    12. Herhaal de spin van koude en warme thermische fietsen procedure voor een totaal van drie cycli (dwz., herhaal 1.5.1 via 1.5.11 voor drie totale cycli).
  6. Dag 10-15: ELP dialyse en lyofilisatie
    1. Centrifugeer het opnieuw gesuspendeerde pellet in een vooraf gekoeld centrifuge op > 15.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. Opslaan 100 µL van het supernatans dat voor SDS-pagina-analyse na de voltooiing van de reiniging.
    2. Desalt van de eiwit-oplossing door het dialyzing van de resterende bovendrijvende substantie in een 3,5 kDa dialyse membraan tegen 4 L vooraf gekoeld ultrazuiver water bij 4 ° C. Wijzig de dialyse water twee keer per dag voor een totaal van 6 keer meer dan 3 dagen.
      Opmerking: Typische supernatant volumes zijn tussen 5 en 30 mL.
    3. Centrifugeer de dialyzed oplossing in een vooraf gekoelde centrifuge op > 15.000 x g gedurende 1 uur bij 4 ° C. 100 µL van het supernatans dat aan het einde van de zuivering p.a. SDS-pagina worden opgeslagen.
    4. Bevriezen de resulterende supernatant bij-80 ° C in de vooraf gewogen conische buizen.
    5. Lyophilize de bevroren oplossing voor 3 dagen en massa het uiteindelijke product om te bepalen van het rendement van het eiwit.
    6. Parafilm de buizen met de finale gelyofiliseerd ELP product en winkel bij 4 ° C.
    7. SDS-pagina om de zuiverheid van het eiwit vast te lopen.
      Opmerking: Protocollen voor SDS-pagina zal variëren op basis van specifieke agarose gel voorwaarden. Onze experimenten, werd definitieve gelyofiliseerd eiwit ontbonden tot een concentratie van 0,5 mg/mL in gedeïoniseerd water en uitvoeren voor op 140 V voor 70-100 min in een 12% (m/v) acrylamide gel onder denaturerende omstandigheden.

2. cel inkapseling in 3D elastine-achtige eiwitten Hydrogels

  1. Voorbereiding van siliconen mallen
    1. Gebruik een biopsie punch met de gewenste diameter maken van gaten in een 0.5 mm dikke siliconen blad en knip een vierkantje rond elke hole. Herhaal dit voor het aantal mallen gewenst.
      Opmerking: De diameter en de dikte van de mallen kunnen worden aangepast voor de specifieke toepassing en de cel cultuuromstandigheden. In de praktijk, celculturen van 50 106 cellen/mL, 0,5 mm dik mallen met 4 mm en 5 mm diameter worden aanbevolen voor voldoende DNA/RNA en eiwit extractie, respectievelijk. Voor immunokleuring, kunt een 2 mm biopsy punch worden gebruikt om in plaats daarvan drie aangrenzende gaatjes per vierkante mal zodat drie replicaat-organismen kunnen worden gekleurd per putje.
    2. Verwijder de plastic wikkel aan elke kant van de individuele schimmel met een pincet.
      Opmerking: Vermijd contact met het oppervlak van de blootgestelde siliconen zoals besmetting kunt verkleinen toekomstige plasma verlijmen van efficiëntie.
    3. Regelen met pincet, hetzelfde aantal kale siliconen mallen en glas coverslips (nr. 1, 12 mm diameter) in wisselende rijen op de omgekeerde deksel van een 48-well-plaat. Zodra voltooid, betrekking hebben op het deksel van de 48-well plaat om verontreiniging te voorkomen.
    4. Zuurstof plasma behandelen de gehele 48-well plaat deksel (dwz., mallen en glas dia's). Onmiddellijk na, gebruik pincet omkeren de siliconen mal op de aangrenzende glas dekglaasje aan. Druk stevig op de mal om hechting. Laat de mallen Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
      Opmerking: De duur van de zuurstof plasma behandeling zal variëren afhankelijk van het instrument. Typische voorwaarden voor ons instrument zijn een operationele gas druk venster tussen 0.3-4 mbar, zuurstof gasstroom bij 20 cm3/min en monster blootstelling aan plasma voor 10-20 s.
    5. De mallen in autoclaaf steriliseren. De mallen bij kamertemperatuur bewaren in een steriele omgeving tot gebruik.
      Opmerking: De mallen kunnen worden opgeslagen in dit stadium voor onbepaalde tijd.
  2. Bereiding van de stockoplossing elastine-achtige eiwitten
    1. Verwijder gelyofiliseerd ELP van 4 ° C-opslag. Warm het eiwit tot kamertemperatuur alvorens de buis om ervoor te zorgen dat geen condensatie bouwt voort op het eiwit over herhaald gebruik te openen.
    2. ELP ontbinden in de Dulbecco-fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) bij 4 ° C, met constante agitatie (dwz., draaiende) 's nachts.
      Opmerking: ELP stockoplossing concentratie zal verder worden verdund met de toevoeging van crosslinker-oplossing bij een zelfgedefinieerde volumetrische verhouding. Bijvoorbeeld voor een 3% (m/v) ELP eindconcentratie, bereiden een 3,75% (m/v) ELP stamoplossing, die zal worden verdund in een verhouding 4:1 volumetrische van ELP oplossing: crosslinker oplossing. Aanpassen van de concentratie als nodig is voor de gewenste toepassing.
    3. Steriel filter ELP stockoplossing met behulp van een filter van de spuit 0,22 µm. ELP opslaan op het ijs wanneer niet in gebruik.
  3. Transfer in het biosafety kabinet, de steriele mallen met steriel pincet aan een 24-well-weefselkweek plaat.
  4. Bereiding van de stockoplossing THPC
    1. Verdun THPC in DPBS net vooraf te gebruiken. Aanpassen van de concentratie van THPC oplossing volgens de eindconcentratie ELP en gewenste crosslinking verhouding.
      Nota: Voor het protocol een eindconcentratie van de ELP van 3% (m/v) zal worden gemaakt door het mengen van de ELP-stockoplossing met de THPC oplossing bij een volumetrische verhouding van 4:1. Pas als dit nodig is.
    2. 2.6 µL van THPC oplossing (80% in water) toevoegen aan 997.4 µL van DPBS.
      Opmerking: Deze concentratie van THPC komt overeen met een stoechiometrische verhouding van 1:1 van hydroxy methylgroepen op THPC en primaire aminen op de ELP eiwit bij het mengen van oplossingen op de beschreven volumetrische 4:1-verhouding voor een laatste 3% (m/v) ELP hydrogel. De THPC oplossing is viskeuze en druppels van de oplossing kunnen vasthouden aan de kant van het uiteinde van de pipet. Voor nauwkeurige concentraties, Vermijd deze druppeltjes bij verdunning in DPBS. Leegmaken van de container THPC voorraad met stikstofgas om te voorkomen dat de oxidatie van de Fosfine en inactivatie van de crosslinker.
    3. Vortex de oplossing om te mengen en houd op ijs.
    4. Steriel filter de THPC stockoplossing met behulp van een filter van de spuit 0,22 µm. Verdun de THPC-stockoplossing verder met steriele DPBS tot lagere stoichiometrische crosslinking verhoudingsgetallen (bv., 0.5:1 of 0.75:1).
      Opmerking: THPC is zuurstof-gevoelige en de verdunde oplossing moet binnen een paar uur na de bereiding worden gebruikt.
  5. Distantiëren van de cellen door incubatie met trypsine-EDTA in de schorsing van een eencellige, pellet van de cellen en de cellen opnieuw geschorst in medium gebruik van een hemocytometer tellen.
    Opmerking: Exacte protocollen voor deze stap hangt zwaar gewenste celtype en toepassing. Voor de neurale stamcellen gebruikt in dit protocol, werd een incubatie trypsine-EDTA 0,025% bij kamertemperatuur voor 1,5 min uitgevoerd. De cellen waren Ingehuld bij 200 x g gedurende 2 min. Voor de levensvatbaarheid van de verhoogde cellen, moeten cellen worden opgeschort in middelgrote normaal. Typische cel dichtheden gebruikt voor cel inkapseling variëren van 1-50 106 cellen/mL van definitieve hydrogel volume. Pas als dit nodig is.
  6. Aliquot het gewenste aantal cellen in een centrifugebuis steriele 1,5 mL.
  7. Centrifugeer de cellen bij ~ 200 x g gedurende 3 min. zorgvuldig, gecombineerd het supernatant en houd de cel pellet op ijs.
    Opmerking: Het is cruciaal voor het volledig alle het supernatant ter beperking van de verdere verdunning van de ELP en THPC crosslinker gecombineerd. Specifieke centrifugeren snelheden zal variëren met celtype.
  8. Resuspendeer de pellet van de cel in de ELP-stockoplossing, zodanig dat het volume 80% van het uiteindelijke volume is (uitgaande van een 4:1 verhouding ELP oplossing: THPC oplossing). Pipetteer mix 20 - 25 keer tot een homogeen mengsel tussen de cellen en ELP.
    Opmerking: Voorkomen dat de onderkant van de buis te verzachten van de temperatuurstijging en latere faseovergang van ELP aangrijpend. Elke 2 mm schimmel met drie replicaat-organismen vereist 7,5 µL van eindvolume (dwz., 6 µL van de stockoplossing ELP en 1,5 µL van de stockoplossing THPC) gelijkelijk verdeeld in de 3 gaten (dwz., 2.5 eindvolume van het µL per hole). Voor de 4 en 5 mm mallen is een eindvolume van 7,5 µL en 15,5 µL vereist, respectievelijk.
  9. THPC stockoplossing toevoegen aan de cel/ELP schorsing voor de resterende 20% eindvolume. Pipetteer mix 20 - 25 keer tot een homogeen mengsel.
  10. Pipetteer onmiddellijk de corresponderende definitieve volumes van cel/ELP/THPC mengsel in elke schimmel door een cirkelbeweging. Herhaal voor alle mallen.
  11. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, gevolgd door een extra incubatie bij 37 ° C gedurende 15 minuten.
    Opmerking: De eerste incubatietijd zal helpen vergemakkelijken eerste crosslinking de hydrogel voor verhoging van de temperatuur die boven de de ELP LCST en inducerende zijn thermische fase segregatie.
  12. Voeg langzaam 750 µL van warme cel kweekmedium aan elk putje van de plaat 24-well, vermijden de gels verstoren.
  13. Incubeer de hydrogels bij 37 ° C gedurende 7 dagen.
    Opmerking: Volledige medium wijzigingen worden aanbevolen om 1-2 dagen afhankelijk van het celtype. Als u wilt beperken de nadruk op de gel, gebruik u een glazen pipet van Pasteur aangebracht met een 200 µL pipette uiteinde wanneer zuigen medium uit de put.

3. immunocytochemie van cellen in 3D ELP Hydrogels

  1. Bereid de fixatie-oplossing door het mengen van 10 mL 16% (m/v) paraformaldehyde (PFA) in 30 ml DPBS. Warm de oplossing tot 37 ° C.
  2. Het medium van de 24-well plaat gecombineerd en zachtjes wassen met 1 mL van DPBS.
  3. Voeg 750 µL van de fixatie oplossing aan elk putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten. Gebruik niet de weefselkweek incubator om besmetting van andere culturen met PFA damp te voorkomen.
  4. Zorgvuldig gecombineerd de fixatie-oplossing van elk putje, teruggooi de PFA naar een passende gevaarlijk afval container.
    Let op: Blootstelling aan PFA kan huid- en oogirritatie veroorzaken. Draag handschoenen/veiligheidsbril en werken in een chemische zuurkast.
  5. 1 mL van DPBS aan elk monster toevoegen. Onmiddellijk de DPBS gecombineerd en gooi deze weg in PFA afval container.
  6. Wassen van de monsters tweemaal met 1 mL van DPBS voor elke 10 min.
    Opmerking: Monsters kunnen worden opgeslagen in DPBS bij 4 ° C voor tot een week na de afdichting van de plaat met Parafilm.
  7. Permeabilize van elk monster met 750 µL van permeabilization-oplossing (100 mL DPBS en 0,25 mL van Triton X-100; PBST) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een rocker bij 15 omwentelingen per minuut.
  8. De PBST gecombineerd en voeg 750 µL van het blokkeren van oplossing (95 mL PBS, 5 g bovien serumalbumine (BSA), 5 mL serum en 0,5 mL van Triton X-100) aan elk monster. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 3 uur op een rocker bij 15 omwentelingen per minuut.
    Opmerking: De blokkerende oplossing moet bevatten serum van de soorten van de host waarop de secundaire antilichamen zijn gerezen (bv., geit, ezel) en steriele-gefilterd door een 0,22 µm filter voorafgaand aan gebruik.
  9. Bereid de oplossing van antilichaam verdunning (97 mL DPBS, 2,5 g van BSA 2,5 mL serum (van dezelfde soort van de host zoals in stap 3.8) en 0,5 mL van Triton X-100). Verdun het primaire antilichaam met behulp van de antilichaam verdunning oplossing en voeg 500 µL van de oplossing aan elk monster. Afdichting van de plaat met Parafilm en na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een rocker.
    Opmerking: Nestin en Sox2 primaire antilichamen waren verdunde 1:400 in antilichaam verdunning oplossing van de oorspronkelijke concentratie de fabrikanten.
  10. De antilichaam-oplossing van elk monster gecombineerd en wassen van de monsters met PBST gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur op een rocker bij 15 omwentelingen per minuut. Herhaal de wassen stap 3 keer.
  11. Verdun de secundaire antilichamen en 5 mg/mL voorraad DAPI (1:2, 000) met behulp van de antilichaam verdunning oplossing en voeg 500 µL van de oplossing aan elk monster. De 24-well afdekplaat met aluminiumfolie en na een nacht bebroeden bij 4 ° C op een rocker.
    Opmerking: Als de secundaire antilichamen lichtgevoelig zijn, de monsters moeten worden beschermd tegen photobleaching voor alle volgende stappen. Geit-antimuis- en geitensector anti-konijn secundaire antilichamen werden verdunde 1:500 in antilichaam verdunning oplossing van de oorspronkelijke concentratie de fabrikanten.
  12. De antilichaam-oplossing van elk monster gecombineerd en wassen van de monsters met PBST gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur op de rocker. Herhaal de wassen stap 3 keer.
  13. Plaats een daling van hard-set montage medium op het oppervlak van een glasplaatje. Met pincet, Verwijder overtollige oplossing uit de mal door licht het bevlekken van de rand van de mal op een papieren handdoek. Zorgvuldig plaatst de mal ondersteboven op de montage-medium en Vermijd invoering van bubbels.
  14. Toestaan dat het medium van de montage te verharden gedurende 48 uur bij kamertemperatuur. Opslaan van de monsters bij kamertemperatuur of 4 ° C. Laat de montage middellange tot volledig ingesteld voor 48 uur voordat het imaging als brekingsindex van het medium in de loop van de verharding veranderen zal. Het zegel van de monsters naar de dekking glasplaatje met duidelijke nagellak ter vermindering van verontreiniging of monster beweging.
  15. Het imago van de monsters met behulp van een confocal microscoop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De ELPs gebruikt in dit protocol bestaan uit vijf regio's: een T7-label His6 label, breukzijde van de enterokinase (EK), een bio-actieve regio en een elastine-achtige regio (Figuur 1). De T7 en His6 tags toestaan voor gemakkelijke identificatie door middel van standaard westelijke vlek technieken. Invoering van de breukzijde EK voorziet de enzymatische verwijdering van de tag-regio, indien nodig. De bio-actieve regio codeert voor de uitgebreide, fibronectine afkomstige cel-lijm ('RGDS') of niet-klevende ('RDGS') sequenties. Tot slot, de centrale herhaling van de elastine-achtige regio bevat een lysine-groep op de site van de gast-residu waarmee crosslinking via THPC terwijl de begeleidende herhalingen isoleucine bevatten om een LCST van ~ 32 ° C31.

Post expressie, SDS-pagina of westelijke vlek kan worden gebruikt om te visualiseren het molecuulgewicht en de identiteit bevestigen van ELPs waarin antilichaam codes, zoals T7 (MASMTGGQQMG) of His6 (HHHHHH) (Figuur 2). Succesvolle expressie onder gecontroleerde omstandigheden levert een zeer homogeen product vertegenwoordigd door de aanwezigheid van een enkele donkere band op het geschatte molecuulgewicht (~ 37 kDa) van deze proteïnen met behulp van zowel SDS-pagina (figuur 2A) en Western blot) Figuur 2B).

In ongecontroleerde omstandigheden suggereert de aanwezigheid van lager molecuulgewicht bands op een westelijke vlek dat een deel van de eiwitten is niet volledig vertaald en/of waren gedegradeerd na expressie (figuur 2C). In het bijzonder zijn de massa's hier gelijkmatig verdeeld door ~ 9 kDa die ongeveer overeenkomt met het gewicht van een bio-actieve regio en elastine-achtige gewesten (een ' herhalen'), of ongeveer een vierde van het target-eiwit. Deze kleinere eiwit fragmenten zijn gewoonlijk aanwezig wanneer de expressie wordt uitgevoerd bij een hogere temperatuur (> 32 ° C) zoals in figuur 2C. De aanwezigheid van deze lager molecuulgewicht proteïnen kan leiden tot onvoorspelbaar mechanische eigenschappen. Dus is regelmatige screening post expressie aangeraden om een hoge kwaliteit eindproduct.

De mechanische stijfheid van ELP gebaseerde hydrogels kan worden gewijzigd door het manipuleren van de concentratie van ELP of de verhouding van THPC reactieve groepen: ELP primaire amines. Gelijktijdig, kan de concentratie van cel-lijm liganden worden afgestemd door het veranderen van de verhouding tussen de ELP varianten met de cel-lijm (RGDS) aan niet-klevende (RDGS) sequenties binnen elk stijfheid regime. Door het manipuleren van deze twee variabelen, kunnen wij produceren gels die een spectrum van mechanische eigenschappen en ligand concentraties (Figuur 3 hebben).

Om weer de cellen binnen 3D ELP hydrogels inkapselen, zijn het gewenste aantal cellen geschorst in het medium en gecentrifugeerd om te produceren een cel pellet (figuur 4A). Het medium is aanzuiging uit de buis, en de cellen worden opnieuw gesuspendeerde uniform in de ELP-oplossing van de gewenste concentratie. Vervolgens THPC oplossing is toegevoegd aan de schorsing van de cel/ELP en afgepipetteerde grondig om te vormen van een homogeen mengsel. Deze oplossing is snel overgebracht naar steriele siliconen mallen binnen een 24-well-plate met behulp van een precisiepipet en mogen dwarslijn bij kamertemperatuur en 37 ° C gedurende 15 minuten elke (figuur 4B). Tot slot is het medium toegevoegd aan de goed plaat en geïncubeerd bij 37 ° C in het experiment.

Leven/dood kleuring kan worden gebruikt om te beoordelen van de levensvatbaarheid van de cellen en succesvolle cel inkapseling binnen ELP hydrogels. Zoals geïllustreerd in Figuur 5, Toon volwassen lymfkliertest neurale voorlopercellen (NPC) levensvatbaarheid van hoge cellen over 7 dagen binnen een 3% (m/v) ELP hydrogel.

3D ELP hydrogels eerder gebleken ter ondersteuning van NPC stam onderhoud gemeten via de expressie van canonieke NPC eiwit markers SRY (geslacht bepalen regio Y)-vak 2 (Sox2) en nestin9. NPC's ingekapseld in 3% (m/v) ELP hydrogels met lage THPC crosslinking Toon hoge expressie van nucleaire-gelokaliseerde Sox2 en cytoplasmatische nestin gloeidraden via immunokleuring en confocal beeldvorming (Figuur 6).

Figure 1
Figuur 1 : Een schematische voorstelling van de ELP en overeenkomstige aminozuur sequenties. De ELP gebruikt in deze studie bevat een T7 en His6 tag voor antilichaam gebaseerde imaging, een bioactieve regio voor invoering van cel-lijm domeinen en een elastine-achtige regio die verleent elastische mechanische eigenschappen en chemische crosslinking voorziet. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Target eiwit expressie kan worden gevalideerd met SDS-pagina en westelijke vlek te bevestigen van het moleculaire gewicht en de identiteit van het gelyofiliseerd eindproduct. Pure full-length ELP loopt op een moleculair gewicht van 37 kDa zoals gerapporteerd door zowel de SDS-pagina (A) en de westelijke vlek met behulp van de T7 (MASMTGGQQMG) of histidine 6 (HHHHHH) tag (B). (C). onzuiver batches van ELP als gevolg van de afwijkingen in het protocol van de expressie ELP kunnen leiden tot de uitdrukking van ELPs met lager molecuulgewicht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: RGDS ligand-inhoud onafhankelijk van elkaar kan worden afgestemd van mechanische eigenschappen binnen ELP hydrogels. 5% (m/v) en 3% (m/v) ELP hydrogels hebben schuintrekken moduli van ~ 800 Pa en ~ 400 Pa, respectievelijk. Hydrogels met een 1:1 verhouding THPC reactieve groepen: ELP primaire amines waren kruisverwijzende bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten, verwarmd tot 37 ° C, en mag equilibreer gedurende 5 minuten vóór de meting. Gegevens zijn gemiddelde ± s.d., *p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Schema voor de inkapseling van de cel in ELP hydrogels. (A). cellen zijn in eerste instantie los in een eencellige suspensie in het medium en Ingehuld met behulp van een centrifuge. Het medium is aanzuiging uit de buis en de cellen worden opnieuw geschorst in ELP oplossing bij de gewenste concentratie en goed gemengd. Tot slot is de THPC crosslinking oplossing toegevoegd en goed gemengd. (B). onmiddellijk na de toevoeging van THPC, is de oplossing gegoten in een siliconen mal met een pipet. De oplossing is toegestaan om dwarslijn bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten gevolgd door een tweede 15 minuten incubatie bij 37 ° C. Het medium wordt vervolgens toegevoegd aan de cultuur goed voor de duur van het experiment. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 5
Figuur 5: Neurale voorlopercellen handhaven hoge levensvatbaarheid in ELP hydrogels. Representatief beeld van neurale voorlopercellen ingekapseld in 3% (m/v) ELP hydrogels met 1:1 crosslinking (THPC reactieve groepen: ELP primaire amines) na 7 dagen in de cultuur. Groen: live kleuring (calceïne-AM); Rood: dode vlekken (ethidium homodimer). Schaal Bar = 100 µm.

Figure 6
Figuur 6 : 3D ELP hydrogels ondersteunen neurale progenitor cel stam maker expressie. Afbeelding van de immunofluorescentie neurale van voorlopercellen van het uitspreken van Sox2 en nestin eiwitten na 7 dagen van de cultuur in ELP hydrogels. Beelden tonen cellen ingekapseld in 3% (m/v) ELP gels met 0.5:1 crosslinking (THPC reactieve groepen: ELP primaire amines). Blauw: DAPI (kernen); Rood: Sox2; Groen: nestin. Schaal Bar = 25 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Recombinant eiwit expressie en zuivering is een krachtig hulpmiddel voor het synthetiseren van biomaterialen met hoge reproduceerbaarheid. Als gevolg van grotendeels de komst van gecommercialiseerde moleculaire klonen, kunnen aangepaste recombinante plasmiden worden gekocht bij verschillende leveranciers, die aanzienlijk vermindert de tijd om te werken met materialen zoals ELPs. Evenzo, plasmiden kunnen aangevraagd worden rechtstreeks vanuit de oorspronkelijke lab als het originele werk werd ondersteund door een federaal contract en de toekomstige werkzaamheden voor non-profit gebruik zal worden. De volledige reeks van de ELP aminozuur is eerder gepubliceerd voor verschillende varianten van de ELP31. Echter, het proces van expressie tot uiteindelijke zuivering van recombinante eiwitten omvat een aantal kritische stappen die vaak tot lagere opbrengsten of een lagere kwaliteitsproduct leiden kunnen. Enkele van de meest voorkomende problemen ELP voorbereiding zich voordoen in een van de volgende: (1) kwaliteit van opgeslagen bacteriële voorraden, (2) de eerste freeze-dooi cyclus te verstoren de bacteriële membraan, en (3) eiwitreiniging door temperatuurcycli.

Een belangrijk verschil tussen eiwit expressie en andere niet-biologische middelen van de productie van materialen is dat wij de biologische machines van recombinante hosts voor het synthetiseren van de polymeren leveraging. Vervolgens deze techniek komt met een unieke beperking: cellulaire dood of schade. Celdood manifesteert meestal zich als een beperkt aantal bacteriële kolonies na de strepen van een plaat of abnormaal kleine kolonies die relatief langzaam groeien. Bacteriële voorraden, kunnen als zorgvuldig, gehandhaafd blijven stabiel jarenlang; echter kunnen opeenvolgende bevriezen-ontdooien cycli wegens herhaalde gebruik of vriezer verkleinen van de levensvatbaarheid van de cellen of leiden tot schade aan DNA. Typische BL21 bacteriën voorraden gebruiken tussen 10% en 40% glycerol volumepercentage gemengd met zwevende cellen. Het doel van de glycerol is membraan om schade te verminderen van ijskristallen kiemvormers tijdens bevriezing. Dus, met behulp van lage concentraties (< 10%) kan leiden tot een gecompromitteerde membraan, terwijl hogere concentraties (> 40%) kunt onderdrukken het vriespunt voldoende aan waar de voorraad nooit wat leidt tot celdood bevriest. Echter, zelfs in optimale glycerol niveaus, bacteriële voorraden niet mogen volledig dooi als een combinatie van membraan schade als gevolg van opnieuw bevriezen en cytotoxische effecten van de glycerol tot leiden kan verminderde voorraad levensvatbaarheid en DNA-schade. Daarom, indien het wordt waargenomen dat een bacteriële voorraad in een lage kolonie telling resulteert of dat de cellen een consistent traag tempo (manifesteerde als een langzame OD600 oprit tarief tijdens expressie) delen, opnieuw transformeren de plasmide en het maken van een nieuwe voorraad is een eenvoudige eerste aanpak van dit probleem op te lossen. Met dit in gedachten, zodat het op lange termijn onderhoud van bacteriële voorraden en de integriteit van DNA, is het het beste voor het opslaan van de exemplaren van uw plasmide als gezuiverde DNA bevroren water en niet in de cellen. Opslag van DNA op deze manier zal ervoor zorgen dat in onvoorziene gebeurtenissen zoals een mislukte voorraad of een vriezer mislukking, een betrouwbare bron van de oorspronkelijke DNA kan worden gebruikt voor transformatie.

Een andere kritische stap in ELP fabricage is de zuivering van het eiwit van de doelstelling van de expressie-host. Eiwit extractie van E. coli wordt bereikt door het doorbreken van de wand van de cel met behulp van kiemvormers ijskristallen die vormen in de geschorste cel lysate op bevriezing, die wordt verder verergerd met opeenvolgende bevriezen-ontdooien cycli. Alternatieve methoden voor het bezwijken van de celwand kunnen worden gebruikt zoals het ultrasoonapparaat of een toets. In het bijzonder, is opeenvolgende bevriezen-ontdooien van de lysate voordelig aangezien het vereist alleen een vriezer en geen andere gespecialiseerde apparatuur. Deze procedure brengt echter nonspecifically DNA, RNA en eiwitten contaminanten, naast proteasen die de potentie hebben om degraderen de doel-eiwit. Daarom, om besmetting te voorkomen en verminderd rendement, deoxyribonuclease ik (DNase) en phenylmethanesulfonyl-fluoride (PMSF) worden toegevoegd aan de cel lysate remmen proteasen, respectievelijk te degraderen van het DNA. De aanwezigheid van DNA, voordat het prestatiemeteritembestand van DNase waarneembaar visueel als een 'stringy' verschijning in het opnieuw gesuspendeerde cel lysate na de eerste dooi. DNase actief degradeert dit DNA en vermindert dus de viscositeit van de cel lysate waardoor het makkelijker om te zuiveren via centrifugeren. Optimale afbraak van DNA kan visueel worden bevestigd door ervoor te zorgen dat de cel lysate lijkt volledig vloeibaar en dat het stringy uiterlijk niet langer zichtbaar is. In de praktijk hebben wij gemerkt dat de toevoeging van ~0.1 DNase mg per mL cel lysate uiteindelijk voldoende om de noodzakelijke afbraak. Echter, indien de aanwezigheid van DNA nog steeds waargenomen wordt, meer DNase kan worden toegevoegd gevolgd door een extra twee tot drie uur van agitatie. Een soortgelijk probleem kan zich ook voordoen als DNase voortijdig wordt toegevoegd voordat een van de lysate heeft de potentie om voldoende ontdooien. In dit geval kunnen de koudere temperaturen beperken de doeltreffendheid van DNA afbraak als gevolg van de vroegtijdige inactivering van DNase. U voorkomt dit probleem, is het vaak raadzaam om het opnieuw gesuspendeerde pellet te ontdooien voor ongeveer 8 uur voorafgaand aan de behandeling met DNase. Bovendien, indien laag eiwitgehalte opbrengsten worden gemeld en de verdeling van DNA voldoende is geweest, de toevoeging van meer PMSF om te helpen met het verder verminderen van potentiële eiwit-afbraak van proteasen worden verlangd.

Aanvullende overwegingen voor het waarborgen van optimale expressie van ELPs omvatten een zorgvuldige inzicht in de voordelen en beperkingen van een gekozen antibioticum. Hier, werden pET15b vectoren met een ampicilline-resistentie gen gebruikt voor eiwit expressie. Het huisdier vector serie is functioneel, voorzien van significante eiwit expressie met maar liefst 50% van van een bacterie eiwituitdrukking gewijd aan het doel-eiwit na een succesvolle inductie32,33. Echter, als een selectie antibioticum ampicilline komt met een paar beperkingen die met optimale expressie interfereren kunnen. Eerst, afbraak van ampicilline in aanwezigheid van E. coli mogelijk snel door de vrijval van bèta-lactamase. Als een voldoende hoeveelheid van de ampicilline is aangetast, kan de ampicilline-encoding plasmide (d.w.z. het plasmide ELP-encoding) worden volledig verloren. Dientengevolge, wanneer uiten ELPs voor langere looptijden, moeten expressie eiwitniveaus worden zorgvuldig gecontroleerd op opeenvolgende tijdstippen om ervoor te zorgen dat voldoende hoeveelheid van de ELP-encoding gen blijft zodat wenselijk expressie. Mogelijke methoden voor het oplossen van de opbouw van bèta-lactamases omvatten spinnen beneden de starter cultuur en opnieuw het opschorten van de cellen in antibioticum-gratis medium vóór het enten van het medium van expressie. Dit proces effectief beperkt de overdracht van de antibiotica-vernederende enzymen en zorgt voor een groter deel van de cellen bevatten de doel-eiwit-encoding vector. Bovendien, heeft ampicilline een beperkte houdbaarheid van ongeveer twee tot drie weken. Daarom moeten de cultuur platen voor eiwit expressie bij 4 ° C voor maximaal twee weken vóór gebruik worden opgeslagen. Ten slotte, om ervoor te zorgen de werkzaamheid van ampicilline binnen de starter en expressie media, de ampicilline-stockoplossing moet worden geproduceerd vers onmiddellijk voordat gebruiken, omdat langdurige opslag kan leiden tot een minder effectieve antibioticum.

De aanwezigheid van een LCST zorgt voor de eenvoudige zuivering van ELPs door temperatuurcycli. In het bijzonder veroorzaken bij een hogere temperatuur en in aanwezigheid van zouten, entropische krachten ELPs om minder oplosbaar en vervolgens vormen een polymeer-rijke coacervate fase. Aan de andere kant, bij lagere temperaturen, ELPs blijven oplosbaar en gemakkelijk los in de oplossing. Fietsen tussen deze twee temperatuur regimes in combinatie met centrifugeren stappen te verzamelen en te verwijderen de niet-ELP-bevattende fase achtereenvolgens concentreert het eiwit en tegelijkertijd vermindert het bestaan van niet-ELP contaminanten.

Er zijn echter een aantal stappen waar de ELPs in dit zuiveringsproces kunnen worden verloren. Ten eerste, vóór elke koude draai, de eiwithoudende oplossing is alkalized aan een pH van 9,0. Deze hogere pH dient om deprotonate bepaalde aminozuren op de backbone van het eiwit, waardoor ze effectief een opgeladen en verdere versterking van hun oplosbaarheid. Voorgaande deze stap of die niet voldoende tijd voor eiwit ontbinding kan daarom leiden tot een afname van de opbrengst zoals niet-ontbindend eiwitten worden Ingehuld tijdens centrifugeren en weggegooid.

Evenzo kunnen doel eiwitten worden verloren tijdens de hete spin procedure wanneer de ELP is Ingehuld. Aanvankelijk, wordt NaCl toegevoegd aan het supernatant eiwitrijke te verminderen de oplosbaarheid van de ELP. De zouten werken aan het schild van elektrostatische interacties tussen de eiwit en water moleculen, waardoor het eiwit scheiden van de waterige fase. Dit effect wordt versterkt door verwarming van de oplossing, die, als gevolg van entropische effecten, verder breekt de hydrous 'kooi' omringende ELPs en dwingt de aggregatie van de eiwitten. Bij lagere concentraties van eiwit (dwz., de eerste thermische cyclus), de toevoeging van zouten alleen volstaat vaak veroorzaken deze fase-separatie zichtbaar. Echter, aangezien de concentratie van eiwit stijgt (dwz., later thermische cycli), en er zijn minder secundaire contaminanten om te interageren met de zouten, de ELP gemakkelijker zullen neerslaan. Dientengevolge, als zouten te snel worden toegevoegd, kunnen zij worden fysiek gevangen door het aggregeren van eiwitten, die effectief vermindert het zoute concentratie van de oplossing en verdere eiwit neerslag beperkt. Dus, het zout moet worden toegevoegd in drie kleine partijen om ervoor te zorgen dat zij voldoende tijd hebben om homogeen distribueren via de oplossing. Een laatste opmerking: variaties op de ELP-backbone, hetzij via verdere wijzigingen aan het residu van de gast van de elastine-achtige regio of wijzigingen in de bio-actieve regio kunnen beduidend beïnvloeden het gedrag van de LCST. Dus, om te zorgen voor optimale eiwit opbrengst in eiwit varianten, het is van cruciaal belang voor het optimaliseren van de pH, zoute concentratie en zout type (bv., monovalent of divalente) voor de koude en warme spins.

SDS-pagina uitgevoerd na voltooiing van het protocol wordt aanbevolen als het kan worden gebruikt om gemakkelijk als ELP verlies tijdens de zuivering stappen optreedt. Kortom, als ELP wordt aangetroffen in het supernatans dat na een hete spin, vervolgens het eiwit wordt niet wordt effectief neergeslagen. Op dezelfde manier als ELPs worden vermeld in een steekproef van ontbindend pellet na een koude spin, is vervolgens het eiwit niet effectief achterblijft.

ELP hydrogels bieden vele voordelen ten opzichte van synthetisch of natuurlijk verkregen materialen. In het bijzonder biedt het gebruik van de amine-reactieve crosslinker THPC een goedkope, eenvoudige en afstembare mechanisme van eiwit crosslinking. Er zijn echter verschillende beperkingen binnen het crosslinking protocol dat dient te worden opgemerkt. THPC is zuurstof gevoelige en als opgeslagen onder verkeerde omstandigheden, het snel kan verslechteren in reactie efficiëntie. Bovendien, als gevolg van de reactiviteit met primaire amines, kan THPC reageren met omringende eiwitten in media of die op het celoppervlak die rijk aan amines zijn. Daarom, wanneer de vorming van ELP hydrogels, verdient media verontreiniging met de cel pellet te verminderen mogelijk exogene eiwit Kruisallergie en dus een vermindering in crosslinking efficiëntie te vermijden. Tot slot, dit mechanisme crosslinking verzet zich tegen de volgorde van de bio-actieve regio aan degenen die geen residuen van lysine en zo beperkt mogelijke integratie van sommige cel-lijm motieven (bijv., IKVAV34). Inspelen op deze beperkingen, wijzigingen met de ELP-backbone met azide en bicyclononyne (BCN) reactie partners zorgt voor bio-orthogonale crosslinking, als eerder beschreven27.

Opgemerkt moet worden dat het gedrag van de ELP LCST een belangrijke rol speelt in het dicteren hydrogel microstructuur. Bij de regelingen van de temperatuur boven de LCST precipiteren ELPs uit oplossing leidt tot de vorming van eiwitrijke en eiwit-deficiënte fasen die invloed op de matrix porositeit uitoefenen kan en crosslinking efficiëntie van de matrix-9. Omdat de meeste cel cultuur experimenten worden uitgevoerd bij fysiologisch relevante temperaturen (~ 37 ° C) boven de ELP LCST, moeten deze effecten worden beschouwd. Voor de hydrogels effectief dwarslijn en vorm een onderling verbonden eiwit netwerk, de primaire amine uit de lysine moet fysiek toegankelijk is voor de THPC crosslinker. Als de ELP-aggregatie optreedt vóór het bereiken van voldoende crosslinking, kunnen ELPs gevangen binnen de eiwitrijke fase worden benaderd en dus niet kunnen deelnemen aan crosslinking. Om deze beperking, vereist onze protocol een eerste 15 min crosslinking periode bij kamertemperatuur, waarmee een voorontwerp crosslinking de hydrogel voordat de ELP zijn thermische faseovergang ondergaat. Deze kamertemperatuur incubatie wordt gevolgd door een extra 15 minuten incubatie bij 37 ° C om af te ronden hydrogel crosslinking. Deze procedure is van cruciaal belang voor voldoende crosslinking en robuuste, reproduceerbare gelering van de ELP-materiaal.

Kortom, bieden recombinant eiwit hydrogels vervaardigd gebruikend ELP uitzonderlijke tunability van het eiwit sequentie en dus de 3D-cel communicatie. ELP polymeren zijn getoond te worden uitgedrukt in hoge opbrengsten, gemakkelijk ten gevolge van hun LCST gedrag, gezuiverd en biocompatibel in een breed scala van systemen in vitro en in vivo . Het gebruik van E. coli als een recombinant host biedt een eenvoudige en goedkope procedure die leidt tot het in de buurt van perfecte beheersing van polymeer moleculair gewicht en functionaliteit. In combinatie zorgt deze techniek voor robuuste tunability en reproduceerbaarheid van het platform van de hydrogel waardoor de cultuur van een groot aantal celtypes in 3D. Tot slot, dit ELP hydrogel platform is vatbaar voor veel downstream biochemische bepalingen, met inbegrip van qRT-PCR, westelijke vlek, DNA-extractie en cel immunokleuring9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs bedanken T. Palmer en H. Babu (Stanford Neurochirurgie) voor het verstrekken van lymfkliertest NPCs. Vector kunst in Figuur 4 werd gebruikt en aangepast van clientverzoeken medische kunst onder Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Onderdeel van dit werk werd uitgevoerd op de Stanford Nano gedeelde faciliteiten (SNSF), ondersteund door de National Science Foundation onder award ECCS-1542152. N.A.S. erkent dat ondersteuning van het National Institute of General Medical Sciences van de National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. erkent steun van een NRSA NIH-gepromoveerde fellowship (F31 EB020502) en het Siebel-programma voor academici. S.C.H. erkent ondersteund door de National Institutes of Health (U19 AI116484 en R21 EB018407), National Science Foundation (DMR-1508006), en het California Institute voor regeneratieve geneeskunde (RT3-07948). Dit onderzoek financiering ontvangen van de Alliantie voor regeneratieve Rehabilitation Research & Training (AR3T), die wordt ondersteund door de Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health en de menselijke ontwikkeling (NICHD), National Institute of Neurologische stoornissen en Stroke (NINDS) en National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering (NIBIB) van de National Institutes of Health onder nummer P2CHD086843 Award. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs, en niet noodzakelijkerwijs de standpunten van de National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713
70% Ethanol RICCA Chemical 2546.70-1
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich A3920-500G
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25G
Bacto Agar Thermo Fisher Scientific 9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent Cells Invitrogen C606003
Chloramphenicol Amresco 0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
EDTA disodium salt, dihydrate Thermo Fisher Scientific O2793-500
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-4
Isopropanol Thermo Fisher Scientific A451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Thermo Fisher Scientific BP1755-10G
Luria Broth EMD Millipore 1.10285.5007
Parafilm VWR 52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals 195381
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm) Millipore SLGP033RB
Terrific Broth Millipore 71754-4
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filters Millipore SLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheet Electron Microscopy Science 70338-05
24-well tissue culture plates  Corning 353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm) Integra Miltex 33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm) Integra Miltex 33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm) Integra Miltex 33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  Corning 21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) Sigma-Aldrich 404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA Thermo Fisher  15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15701
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306 
Donkey Serum Lampire Biological Labs 7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) Molecular Probes A-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) Molecular Probes A-11071
Goat Serum Gibco 16210-072
Mouse Nestin Primary Antibody BD Pharmingen 556309
Mouse Sox2 Primary Antibody Cell Signaling Technology 23064S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium  Vector Labs H-1400 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Tags

Bioengineering kwestie 135 elastine-achtige eiwitten ELP hydrogel 3D cel immunokleuring eiwit expressie cultuur recombinant eiwit
Productie van elastine-achtige eiwitten Hydrogels voor inkapselen en immunokleuring van cellen in 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, … More

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D. J. Vis. Exp. (135), e57739, doi:10.3791/57739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter