Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Produksjonen av Elastin som Protein Hydrogels for innkapsling og immunostai-celler i 3D

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57739
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Rekombinant protein-konstruert hydrogels er fordelaktig for 3D cellekultur for fullstendig tunability av polymer ryggraden og derfor celle microenvironment. Her beskriver vi rekombinant elastin som protein rense og dens anvendelse i 3D hydrogel celle innkapsling.

Abstract

Todimensjonal (2D) vev kultur teknikker har vært viktig for vår forståelse av grunnleggende cellebiologi. Men samlet tradisjonelle 2D vev kultur systemer mangel en tredimensjonal (3D) matrise, noe som resulterer i en betydelig koble mellom resultater i vitro og i vivo. For å løse denne begrensningen, har forskere konstruert 3D hydrogel vev kultur plattformer som kan etterligne egenskapene biokjemiske og Biofysiske i vivo celle microenvironment. Denne forskningen har motivert måtte utvikle materiale plattformer som støtter 3D-cellen innkapsling og nedstrøms biokjemiske analyser. Rekombinant protein engineering tilbyr et unikt verktøysett for 3D hydrogel materielt design og utvikling ved at for bestemte kontrollen av protein og derfor potensielle mekaniske og biokjemiske egenskaper for resulterende matrise. Her presenterer vi en protokoll for uttrykk for recombinantly-avledet elastin som protein (ELP), som kan brukes til skjemaet hydrogels med uavhengig tunable mekaniske egenskaper og celle-klebende ligand konsentrasjon. Presenterer vi ytterligere en metodikk for cellen innkapsling innen ELP hydrogels og senere immunofluorescent farging av innebygde celler for nedstrøms og kvantifisering.

Introduction

Over det siste århundret, har todimensjonal (2D) vev kultur utviklet seg til et integrert verktøysett for å studere grunnleggende celle biologi i vitro. I tillegg har relativt lave kostnader og enkel protokollene for 2D cellekultur ført til innføringen på tvers av mange biologisk og medisinsk disipliner. Men har tidligere forskning vist at tradisjonelle 2D plattformer kan føre til resultater som avviker markant fra de samlet i vivo, forårsaker dyrebare tid og finansiering bortkastet for klinisk orientert forskning1,2, 3. Vi og andre hypothesize at dette avviket kan tilskrives mangel på innfødt biokjemiske og Biofysiske signaler gitt til cellene kultivert på 2D overflater, som kan være nødvendig for optimal spredning og modning av ulike celletyper.

For å løse disse begrensninger og hjelpe broen gapet mellom 2D har i vitro og vivo studier, forskere utviklet tredimensjonale (3D) hydrogel plattformer for celle-innkapsling1,4,5 ,6. Hydrogels er ideelle materialer til recapitulate endogene microenvironment av ekstracellulær matrix (EFM) i vivo deres vev som mekaniske egenskaper og vann-hovne struktur som muliggjør rask transport av næringsstoffer og signalisering faktorer7,8. Videre kan 3D hydrogels utformes uavhengig kontroll over mekaniske og biokjemiske egenskaper av stillaset. Både matrise, mekanikere,9,,10,,11,,12 og celle-klebende ligander13,14,15 er godt kjent for å påvirke celle virkemåten i vitro og i vivo. Dermed tilbyr 3D hydrogels med tunable egenskaper en plattform for å studere årsaksforhold mellom celler og deres microenvironment. Kriteriene for en ideell 3D hydrogel matrise er enkel, non-cytotoksiske celle-innkapsling samt uavhengige tunability av fysiologisk relevante mekaniske egenskaper og forfalsker av innfødte celle-klebende motiver.

Begge syntetisk (f.eks., polyetylenglykol, polylactic syre, poly (glycolic acid)) og naturlig (f.eks., alginate, kollagen, Matrigel) hydrogels har fordeler over 2D i vitro kultur plattformer; men har de også betydelige mangler som begrenser deres anvendbarhet. Først mange syntetiske og naturlig plattformer krever sterke crosslinking forhold som kan være potensielt giftig for pattedyrceller, fører til redusert celle levedyktighet7. I tillegg mange syntetiske plattformer mangler innfødte bioactivity og vil være functionalized gjennom sekundære kjemiske reaksjoner, som kan legge til økte kostnader og kompleksitet16. Til slutt, mens naturlig materialer vanligvis inneholder innebygde bio-aktive domener, de er ofte plaget av høye parti til parti variasjon og er ofte begrenset til danner relativt svake gels7,17.

Rekombinant protein engineering presenterer en unik verktøysett for materialer design gir eksplisitt kontroll over protein sekvens, og dermed potensielle mekaniske og biokjemiske egenskaper for den endelige hydrogel stillas18. I tillegg, ved å utnytte det velkjente biologiske maskineriet av Escherichia coli (E. coli) å uttrykke proteiner, kan materialer produseres kostnadseffektivt og konsekvent med begrenset inter - og intra-batch variasjon. Elastin som protein (ELP) presenteres her har tre utvikling domener: (1) en T7 og His6 kode som tillater merking fluorescently merket antistoffer, (2) en "elastin-like"-regionen som gir elastisk mekaniske egenskaper og gir kjemisk crosslinking, og (3) en 'bio-aktive'-regionen som koder for celle-klebende motiver.

Vår elastin som region er basert på kanonisk (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sekvensen der fire 'Xaa' aminosyre nettsteder isoleucin (Ile), men kan være designet for å være noen aminosyre unntatt proline. Denne sekvensen endows rekombinant ELPs med lavere kritisk løsning temperatur (LCST) atferd som kan utnyttes for enkel rensing etter uttrykket via termisk sykling19,20. Denne LCST-egenskapen kan være innstilt til termisk samlet ved forskjellige temperaturer ved å endre de gjest 'Xaa' rester21,22.

Her er 'Xaa' posisjon på en av fem elastin-lignende gjentakelser erstattet med Amin-presentere lysin (Lys) aminosyren, som benyttes for hydrogel crosslinking. Våre tidligere arbeid har vist ikke-cytotoksiske og robust crosslinking via reaksjon med Amin-reaktive crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium chloride (THPC)23. Av varierende samlede protein innhold og crosslinker konsentrasjon er vi i stand til å produsere hydrogels som kan stilles inn slik at den dekker en fysiologisk relevante stivhet utvalg (~0.5-50 kPa)9,23,24. I tillegg til tuning mekaniske egenskaper, celle vedheft innen hydrogel resultatene av integrering av kanoniske celle-klebende domener i ryggraden i ELP protein. For eksempel inkorporering av den utvidede fibronectin-avledet 'RGDS' aminosyresekvens gir celleadhesjon og conformational fleksibilitet, mens den eggerøre, uforpliktende 'RDGS' variant begrenser celle matrise vedheft24. Ved modulerende forholdet mellom cellen-klebende ikke selvklebende proteiner som totalt protein konsentrasjonen, er vi kunne effektivt produsere hydrogels som spenner over et bredt spekter av ligand konsentrasjon. Resultantly, har vi utviklet en hydrogel plattform med avparet biokjemiske og Biofysiske egenskaper, som kan være uavhengig innstilt for optimal 3D kultur ulike celletyper.

Matrix stivhet og lim ligand tunability tilbyr rekombinant hydrogels muligheten design bestemt materiale fornedrelse profiler, som er nødvendig for cellen spre, spredning og Flyttinger innenfor en 3D sammenheng4 , 9. denne fornedrelse by av cellen utskillelsen av proteaser som spesifikt mà enten utvidet 'RGDS'9 eller elastin-lignende sekvens25. ELP hydrogels har også vist seg å støtte de påfølgende biokjemiske analyser som er nødvendige for å studere celle levedyktighet og funksjon inkludert immunocytochemistry samt DNA/RNA/protein utvinning for kvantitative omvendt transkripsjon-polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR) og Western blot9. ELP varianter har også blitt brukt i en rekke i vivo modeller og er kjent for å være godt tolerert av immunsystemet26.

Tatt sammen ELP som en regning plattform for celle-innkapsling studier har en rekke fordeler sammenlignet med syntetisk eller naturlig materiale plattformer, som ofte mangler den samme graden av biokjemiske og Biofysiske tunability og reproduserbarhet. I tillegg ELPS enkel og ikke-cytotoksiske bruk med en rekke celletyper (f.eks., chick dorsal root Ganglion14,24, murine nevrale celler9, menneskelige mesenchymal stamceller27, storfe neonatal chondrocytes28, menneskelige endothelial cellene29,30) gir en mer fysiologisk relevante modell av endogene 3D ECM forhold til 2D cellekultur. Her presenterer vi en protokoll for uttrykk for recombinantly-avledet, ELPs for bruk som tunable hydrogel plattform for 3D celle innkapsling. Vi presenterer ytterligere metodikken for ned-stream fluorescerende merking og AC confocal mikroskopi innkapslede celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ELP uttrykk protokollen

  1. Dag 1: Voksende starter kolonien
    1. Klargjør ampicillin og chloramphenicol agar plater ved autoklavering 25 g Luria buljong og 15 g agar per 1 L ultrapure vann. Når løsningen er avkjølt ~ 60 ° c, legge 1 mL av ampicillin lager (100 mg/mL i ultrapure vann) og 1 mL av chloramphenicol lager (34 mg/mL i 70% etanol) til 1 L agar løsning for siste konsentrasjoner av 100 µg/mL og 34 µg/mL , henholdsvis. Overføre 20 mL endelige løsningen til 10 cm Petri retter med en serologisk pipette og la agar å stivne. Vikle Petri retter med parafilm og butikk på 4 ° C.
      Merk: Petri retter kan lagres på 4 ° C i opptil to uker.
    2. Strek et lite utvalg av BL21 (DE3) pLysS E. coli fra en pre-laget bakteriell lager som inneholder en pET15b vektor koding ELP rundt på en ampicillin og chloramphenicol agar plate.
      Merk: Ampicillin og chloramphenicol velge for bakterier som inneholder både pET15b og pLysS vektorer, henholdsvis.
    3. Plassere stripete platen opp ned i en inkubator på 37 ° C. Tillate bakteriell koloniene å vokse over natten.
      Merk: Ikke ruge platene i mer enn 16 timer som ampicillin vil svekke og koloniene som ikke bære ampicillin motstand kan danne.
  2. Dag 2: Utarbeidelse av starter kultur og expression media
    1. Fjern E. coli kulturen fra inkubator. Parafilm plate og lagre maksimalt 4 dager på 4 ° C.
    2. Forberede en forrett kultur kolbe (250 mL) og uttrykk kultur flasker (12 x 1 L) og autoclave. Legge til 47.6 g kjempefint buljong og 4 mL glyserol 1 L ultrapure vann i en 2 L forbløffet kultur kolbe 1 L i expression media, og lue med aluminiumsfolie.
      Merk: Typisk gir er 60-100 mg/L protein i expression media.
    3. Legg autoklaveres starteren i forvarmes, 37 ° C risting inkubator og ruge uten agitering.
    4. Legge til 250 µL av sterile-filtrert (0.22 µm filter) ampicillin lager (100 mg/mL i ultrapure vann) av startkulturer for en siste konsentrasjon 100 µg/ml. Umiddelbart begynne agitating av startkulturer 250 RPM.
      Merk: Chloramphenicol brukes bare kolonien velges på agar plater og er ikke inkludert for flytende kulturer.
    5. Vaksinere av startkulturer ved å legge til en enkelt ELP plasmider inneholder E. coli koloni fra stripete platen og la av startkulturer å riste på 37 ° C 16 h.
    6. Plasser uttrykk kultur media flasker i pre varmet, 37 ° C risting inkubatorer og ruge over natten uten agitering slik at flasker er klar å vaksinere neste morgen.
  3. Dag 3: Inducing protein uttrykk i E. coli
    1. Gjør frisk og sterile-filtrert ampicillin lager (100 mg/mL i ultrapure vann). Legge til 1 mL av ampicillin lager hver kolbe i expression media for en siste konsentrasjon 100 µg/ml.
    2. Starte agitating expression media på 250 rpm.
    3. Ta en 2 mL prøve av media fra alle uttrykk kolbe og legge til søppel som en tom for en optisk densitet lesing på 600 nm (OD600).
    4. Etter ferdigstillelse av 16 h starter kultur inkubering, vaksinere hver uttrykk kolbe ved å overføre 20 mL av startkulturer til hver uttrykk kolbe via en serologisk pipette.
    5. Etter ferdigstillelse av 1t agitasjon, måle OD600 en av uttrykket flasker. Etter dette trinnet kan du måle OD600 hvert 20 min, sjekke en annen kolbe hver gang.
    6. På et OD600 på 0,6, redusere temperaturen på shakers som inneholder uttrykket flasker til 32 ° C.
    7. Sjekk OD600 hvert 10 min. Indusere uttrykk på en OD600 på 0.8, ved å legge til 1 mL 1 M, sterile-filtrert β-isopropyl thiogalactoside (IPTG) i ultrapure vann til hver uttrykk kolbe.
    8. Tillate E. coli i uttrykket kolber uttrykke 7 h.
    9. 20 min før slutten av uttrykk, pre-avkjøle en store etasje sentrifuge til 4 ° C.
    10. Samle alle 12 L i expression media i individuelle sentrifuge beholdere og balanse.
    11. Sentrifuge expression media på > 12.000 x g i 15 min på 4 ° C ved hjelp av en etasje sentrifuge.
    12. Hell av nedbryting fra hver sentrifuge beholder. Bruker en slikkepott, samle celle pellets i en pre-veie zip lock bag.
    13. Nytt suspendere pellet sterilt-filtrert ti buffer (100 mL buffer per 25 g pellet) og fjerne overflødig luftbobler ved masserer pellet. For 1 L ti buffer, legge til 5,8 g natriumklorid, 1.21 g tris base og 0.37 g ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate 900 mL ultrapure vann. Justere pH til 8.0 og bringe til 1 L. For dette trinnet er pH strimler tilstrekkelig.
    14. Plassere zip-lock posen som inneholder nytt suspendert celle pellet i en sekundær beholder og fryse-80 ° c over natten.
  4. Dag 4-6: Rupturing bakteriell cellen vegg via fryse-Tin sykluser
    1. Fjern den frosne pellet fra fryseren og la det tine sakte på 4 ° C med mild omrøring med en orbital shaker.
    2. Tillate pellet å tine til noen væske er tilstede. Legge til ~ 30-40 mg av deoxyribonuclease tint I (DNase) til lysate. I tillegg Legg 1 mL av 100 mM phenylmethylsulphonyl fluor (PMSF, en protease hemmer) i isopropanol per 100 mL celle lysate. Tillate lysate å riste over natten.
      Merk: DNase og PMSF er bare nødvendig for første fryse-Tin syklus.
      FORSIKTIG: PMSF er giftig ved innånding. En ansiktsmaske skal brukes ved håndtering av PMSF pulver.
    3. Når cellen lysate er helt tint, fryse lysate-80 ° c over natten, eller til helt frossen.
    4. Gjenta fryse-Tin totalt tre sykluser. La den lysate tint på 4 ° C etter siste fryse-Tin. Lagre 100 µL av rå lysate for natrium dodecyl sulfat-polyakrylamid gel geleelektroforese (SDS-side) analyse ved avslutningen av rensing.
    5. Etter siste Tin, justere pH i de tinte lysate å 9.0 med 1 M NaOH. For dette trinnet er pH strimler tilstrekkelig. Inkuber ved 4 ° C i minst 1 h (over natten er riktig) på en orbital shaker.
  5. Dag 7-9: ELP rensing via kalde og varme spinn termisk sykling
    1. Cool gulvet sentrifuge 4 ° c 20 min før sentrifugering.
    2. Aliquot og balanse i tinte lysate i sentrifuge containere.
    3. Sentrifuge prøvene på > 15.000 x g 1t på 4 ° C. Lagre 100 µL nedbryting for SDS side analyse av etter ferdigstillelse av rensing.
      Merk: Etter sentrifugering, ELP proteinet skal være i nedbryting på grunn av sin høye oppløselighet i vann ved temperaturer under sin LCST (< 32 ° C).
    4. Overføre nedbryting til nye sentrifuger beholdere og balansere riktig.
    5. Legge til natriumklorid (NaCl) i tre deler en siste konsentrasjon av 1 M (5.84 g av NaCl for hver 100 mL nedbryting). Kontroller at NaCl er lagt i tre deler å tillate tilstrekkelig oppløsning.
    6. Agitere for 3 h på 37 ° C på 250 rpm i en risting inkubator.
    7. 1 time før slutten av agitasjon, forvarme en etasje sentrifuge til 37 ° C.
    8. Sentrifuge på > 15.000 x g 1t på 37 ° C. Lagre 100 µL nedbryting for SDS side analyse av etter ferdigstillelse av rensing og forkaste gjenværende nedbryting.
      Merk: Etter sentrifugering,-ELP proteinet skal være pelleted p.g.a. dens lav oppløselighet i vann ved temperaturer over LCST (> 32 ° C).
    9. Nytt suspendere pellet ved å legge 10 mL autoklaveres, ultrapure vann per 1 g pellets. Bruk en metall spatula til MOS pellets til hjelp i oppløsningen av protein.
    10. Justere pH i de tinte lysate å 9.0 med 1 M NaOH. For dette trinnet er pH strimler tilstrekkelig.
    11. Agitere natten på 4 ° C på en orbital shaker.
    12. Gjenta kalde og varme spinn termisk sykling totalt tre sykluser (dvs., gjenta 1.5.1 gjennom 1.5.11 for tre totale sykluser).
  6. Dag 10-15: ELP dialyse og lyophilization
    1. Sentrifuge re suspendert pellet i en pre kjølt sentrifuge på > 15.000 x g 1t på 4 ° C. Lagre 100 µL nedbryting for SDS side analyse av etter ferdigstillelse av rensing.
    2. Desalt protein løsningen av dialyzing gjenværende nedbryting i en 3,5 kDa dialyse membran mot 4 L pre kjølt ultrapure vann på 4 ° C. Endre dialyse vannet to ganger om dagen for totalt 6 ganger over 3 dager.
      Merk: Typisk supernatant volumer er mellom 5 og 30 mL.
    3. Sentrifuge dialyzed løsningen i en pre-avkjølt sentrifuge på > 15.000 x g 1t på 4 ° C. Lagre 100 µL av nedbryting for SDS side analyse på slutten av rensing.
    4. Fryse det resulterende supernatant ved-80 ° C i pre vektet konisk rør.
    5. Lyophilize frosne løsningen for 3 dager og masse det endelige produktet å bestemme protein avkastningen.
    6. Parafilm rør som inneholder siste lyofiliserte ELP produktet, og lagre på 4 ° C.
    7. Kjør SDS-side for å fastslå renheten av protein.
      Merk: Protokoller for SDS side vil variere basert på bestemte agarose gel forhold. For våre eksperimenter, var siste lyofilisert protein oppløst til en konsentrasjon på 0,5 mg/mL i deionisert vann og kjøre på 140 V i 70-100 min i en 12% (w/v) akrylamid gel under denaturing forhold.

2. celle-innkapsling i 3D Elastin som Protein Hydrogels

  1. Utarbeidelse av silikon støpeformer
    1. Bruk en biopsi punch ønsket diameter å lage hull i en 0,5 mm tykk silikon ark og kutte ut en firkant rundt hvert hull. Gjenta av muggsopp ønsket.
      Merk: Diameter eller tykkelse av muggsopp kan justeres for bestemt program og celle kultur forhold. I praksis, for cellekulturer 50 106 celler/mL, 0,5 mm tykk former med 4 mm og 5 mm diameter er anbefalt for tilstrekkelig DNA/RNA og protein utvinning, henholdsvis. For immunostaining, kan en 2 mm biopsi punch brukes i stedet opprette tre tilstøtende hull per kvadrat mold slik at tre gjentak kan være farget per brønn.
    2. Fjerne plastfolie på hver side av personlige mold med pinsett.
      Merk: Unngå kontakt med utsatte silikon overflaten forurensning kan redusere fremtidige plasma liming effektivitet.
    3. Ved hjelp av pinsett, ordne samme antall nakne silikon støpeformer og glass coverslips (nr. 1, 12 mm diameter) i skiftende rader på invertert lokket av en 48-vel plate. En gang fullført, dekk lokket på 48-vel plate å unngå forurensning.
    4. Oksygen plasma behandle hele 48-vel plate lokket (dvs., muggsopp og glass lysbilder). Umiddelbart etter, bruk tang for å invertere silikon mold på tilstøtende glass dekkglassvæske. Trykk fast på mold å sikre bånd. La formene ruge ved romtemperatur 1t.
      Merk: Varigheten av oksygen plasma behandling varierer avhengig av apparatet brukes. Typisk forhold for våre instrument er et operativsystem gass trykket vindu mellom 0,3-4 mbar, oksygen gasstrømmen på 20 cm3/minutt og prøve eksponering for plasma for 10-20 s.
    5. Sterilisere formene av autoklavering. Lagre formene ved romtemperatur i et sterilt miljø før bruk.
      Merk: Formene kan lagres på dette stadiet på ubestemt tid.
  2. Utarbeidelse av elastin som protein lagerløsning
    1. Fjern lyofilisert ELP fra 4 ° C lagring. Varm protein til romtemperatur før røret for å sikre at ingen kondens bygger på protein over gjentatt bruk.
    2. Oppløse ELP i Dulbeccos fosfat-bufret saltvann (DPBS) i 4 ° C med konstant agitasjon (dvs., spinning) over natten.
      Merk: ELP lagerløsning konsentrasjon vil ytterligere fortynnes med tillegg av crosslinker løsning i brukerdefinerte volumetriske forholdet. For eksempel for en 3% (w/v) siste ELP konsentrasjon, forberede en 3,75% (w/v) ELP lager løsning som vil bli utvannet i 4:1 volumetriske forholdet ELP løsning: crosslinker løsning. Justere konsentrasjonen som kreves for ønsket program.
    3. Sterilt filter ELP lagerløsning bruke filtere 0.22 µm sprøyten. Lagre ELP på is når den ikke er i bruk.
  3. I fravær av smittefarlige stoffer skap, overføre sterilt formene ved hjelp av sterile pinsett til en 24-og vev-kultur plate.
  4. Utarbeidelse av THPC lagerløsning
    1. Fortynn THPC i DPBS like før du bruker. Justere konsentrasjonen av THPC løsning i henhold til siste ELP konsentrasjon og ønsket crosslinking forholdet.
      Merk: For protokollen, en siste ELP konsentrasjon av 3% (w/v) vil bli gjort ved å blande ELP lager løsningen med THPC løsning på volumetrisk forholdet 4:1. Justere etter behov.
    2. Legge til 2.6 µL THPC løsning (80% i vann) 997.4 µL av DPBS.
      Merk: Denne konsentrasjonen av THPC tilsvarer 1:1 stoichiometric forholdet hydroxy metylgrupper på THPC og primære aminer på ELP protein når miksing løsninger på beskrevet 4:1 volumetriske forholdet for en siste 3% (w/v) ELP hydrogel. THPC løsningen er tyktflytende dråper løsning kan stikke på siden av pipette spissen. Unngå slike dråper nøyaktig konsentrasjoner, når fortynne i DPBS. Tøm beholderen THPC lager med nitrogen gass å hindre oksidasjon av phosphine og inaktivering av crosslinker.
    3. Vortex løsningen å blande og holde på is.
    4. Sterilt filter THPC lager løsning å bruke filtere 0.22 µm sprøyten. Fortynn THPC lager løsningen videre med sterilt DPBS å oppnå lavere stoichiometric crosslinking prosenter (f.eks., 0.5:1 eller 0.75:1).
      Merk: THPC er oksygen-sensitive, og utvannet løsningen skal brukes innenfor et par timer etter forberedelse.
  5. Distansere cellene av inkubasjon med Trypsin-EDTA i en enkeltcelle suspensjon, pellets cellene og telle celler re suspendert i mediet bruker en hemocytometer.
    Merk: Nøyaktige protokoller for dette trinnet avhenger sterkt på ønsket celle type og anvendelse. For nevrale stamceller brukes i denne protokollen, ble en 0.025% Trypsin-EDTA inkubasjon i romtemperatur i 1,5 min utført. Cellene ble pelleted 200 x g i 2 minutter. For økt celle levedyktigheten, skal cellene bli suspendert i normale middels forhold. Typisk celle tettheter brukes til innkapsling celleområdet fra 1-50 106 celler/mL av siste hydrogel volum. Justere etter behov.
  6. Aliquot ønsket antall celler i et sterilt 1,5 mL sentrifuge rør.
  7. Sentrifuge cellene ~ 200 x g for 3 min. nøye, Sug opp nedbryting og holde den cellen pellet på is.
    Merk: Det er viktig helt inneholder alle nedbryting for å redusere ytterligere fortynning av ELP og THPC crosslinker. Celle type varierer etter bestemte sentrifugering hastigheter.
  8. Nytt avbryte celle pellet ELP lager løsningen slik at volumet er 80% av det siste bindet (forutsatt at 4:1 forholdet ELP løsning: THPC løsning). Pipetter blanding 20 - 25 ganger å produsere en homogen blanding av celler og ELP.
    Merk: Unngå gripende bunnen av røret for å begrense temperaturøkningen og påfølgende fasen overgang av ELP. Hver 2 mm mold med tre gjentak krever 7,5 µL av siste volum (dvs., 6 µL av ELP lagerløsning og 1,5 µL THPC lager løsning) delt likt i de 3 hullene (dvs., 2,5 µL siste volum pr hull). 4 og 5 mm formene kreves et endelig antall 7,5 µL og 15.5 µL, henholdsvis.
  9. Legge til THPC lagerløsning cellen/ELP suspensjon for resterende 20% endelige volumet. Pipetter blanding 20 - 25 ganger å produsere en homogen blanding.
  10. Umiddelbart Pipetter tilsvarende siste volum av cellen/ELP/THPC blandingen i hver mold av en sirkelbevegelse. Gjenta for alle former.
  11. Inkuber prøvene i romtemperatur i 15 min, etterfulgt av en ekstra inkubasjon på 37 ° C i 15 min.
    Merk: Første inkubasjonstiden hjelper lette første crosslinking av hydrogel før økende temperatur som ovenfor den ELPS LCST og inducing sin termisk fase raseskille.
  12. Legge til 750 µL av varm celle kultur medium hver brønn av 24-vel plate, unngå forstyrre geléer sakte.
  13. Inkuber hydrogels på 37 ° C i 7 dager.
    Merk: Full medium hver 1-2 dager avhengig av celle type anbefales. For å begrense belastningen gel, bruker du et glass Pasteur pipette festet med 200 µL pipette tips når aspirating medium fra brønnen.

3. Immunocytochemistry av celler i 3D ELP Hydrogels

  1. Forberede fiksering løsningen ved å blande 10 mL 16% (w/v) paraformaldehyde (PFA) i 30 ml DPBS. Varme løsningen på 37 ° C.
  2. Sug opp mediet fra 24-vel platen og vask forsiktig med 1 mL av DPBS.
  3. Legg 750 µL av fiksering løsningen i hver brønn og ruge på 37 ° C i 30 min. Ikke bruk vev kultur inkubator for å unngå forurensning av andre kulturer med PFA damp.
  4. Nøye Sug opp fiksering løsningen fra hver brønn, forkaster PFA til en passende spesialavfall beholder.
    FORSIKTIG: Eksponering for PFA kan føre til hud og øyne irritasjon. Hansker/sikkerhet briller og arbeid i kjemisk avtrekksvifte.
  5. Legge 1 mL av DPBS til hvert utvalg. Umiddelbart Sug opp DPBS og kast til PFA avfallsbeholderen.
  6. Vask prøvene to ganger med 1 mL av DPBS i 10 min.
    Merk: Utvalg kan lagres i DPBS på 4 ° C i opptil en uke etter tetting platen med Parafilm.
  7. Permeabilize hvert utvalg med 750 µL permeabilization løsning (100 mL DPBS og 0,25 mL Triton X-100; PBST) 1t ved romtemperatur på en rocker på 15 rpm.
  8. Sug opp PBST og legge til 750 µL av blokkering løsning (95 mL PBS, 5 g av bovin serum albumin (BSA), 5 mL av serum og 0,5 mL Triton X-100) til hvert utvalg. Inkuber ved romtemperatur for 3 h på en rocker på 15 rpm.
    Merk: Blokkerer løsningen skal inneholde serum fra verten arter som sekundær antistoffer ble reist (f.eks., geit, esel) og sterile-filtrert gjennom en 0.22 µm filtrere før bruk.
  9. Forberede antistoff fortynning løsningen (97 mL DPBS, 2.5 g av BSA, 2,5 mL av serum (fra samme verten arter som i trinn 3.8) og 0,5 mL Triton X-100). Fortynne det primære antistoffet bruker antistoff fortynning løsningen og legge 500 µL av løsningen til hvert utvalg. Seal platen med Parafilm og ruge over natten ved 4 ° C på en rocker.
    Merk: Nestin og Sox2 primære antistoffer var utvannet 1:400 i antistoff fortynning løsning fra produsentens opprinnelige konsentrasjon.
  10. Sug opp antistoff løsningen fra hver prøve og vaske prøvene med PBST for 60 min ved romtemperatur på en rocker på 15 rpm. Gjenta vask trinn 3 ganger.
  11. Fortynne sekundære antistoffer og 5 mg/mL aksjen DAPI (1:2, 000) bruker antistoff fortynning løsningen og legge 500 µL av løsningen til hvert utvalg. Dekkramme 24-vel med aluminiumsfolie og ruge over natten ved 4 ° C på en rocker.
    Merk: Som sekundær antistoffer er følsomt for lys, prøvene må beskyttes fra photobleaching for alle etterfølgende trinnene. Goat anti-musen og geit anti-kanin sekundære antistoffer var utvannet 1:500 i antistoff fortynning løsning fra produsentens opprinnelige konsentrasjon.
  12. Sug opp antistoff løsningen fra hver prøve og vaske prøvene med PBST i 30 min ved romtemperatur på rocker. Gjenta vask trinn 3 ganger.
  13. Plasser en dråpe hard-set montering medium på overflaten av et glass lysbilde. Ved hjelp av pinsett, fjerne overflødig løsningen fra formen av lett blotting kanten av formen på et papirhåndkle. Forsiktig plassere mold opp ned på montering mediet og unngå å innføre bobler.
  14. Tillat montering medium å stivne i 48 timer ved romtemperatur. Lagre prøvene i romtemperatur eller 4 ° C. Tillat montering medium å fullstendig sette for 48 timer før tenkelig som brytningsindeks av mediet endres i løpet av herding. Sel prøver å dekke objektglass med klart neglelakk å redusere forurensning eller prøve bevegelse.
  15. Bilde prøver ved AC confocal mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ELPs brukes i denne protokollen består av fem regioner: en T7 kode, His6 tag, enterokinase (EK) cleavage området, en bio-aktive region og en elastin som region (figur 1). T7 og His6-koder tillater enkel identifisering gjennom standard Western blot teknikker. Innføring av EK cleavage nettstedet tillater enzymatisk fjerning av regionen koden, hvis nødvendig. Bio-aktive regionen koder for utvidet, fibronectin-avledet celle-lim ("RGDS") eller ingen-klebe ('RDGS') sekvenser. Til slutt, sentrale gjenta av regionen elastin som inneholder en lysin gruppe gjest rester området som gjør crosslinking via THPC mens flankemanøveren rapportene inneholder isoleucin for å oppnå en LCST ~ 32 ° C31.

Innlegget uttrykk, SDS side eller Western blot kan brukes å visualisere Molekylvekten og bekrefte identiteten til ELPs som inneholder antistoff-koder, som T7 (MASMTGGQQMG) eller His6 (HHHHHH) (figur 2). Vellykket uttrykk under kontrollerte forhold gir et svært homogen produkt representert av tilstedeværelsen av en enkelt mørk band på den omtrentlige Molekylvekten (~ 37 kDa) av disse proteinene både SDS-siden (figur 2A) og Western blot) Figur 2B).

I ukontrollert forhold antyder tilstedeværelse av lavere molekylvekt band på en Western blot at en brøkdel av proteiner ikke ble fullstendig oversatt og/eller var dårligere etter uttrykk (figur 2C). Spesielt er massene her jevnt fordelt av ~ 9 kDa som omtrent tilsvarer vekten av en bio-aktive regionen og tre elastin-lignende regioner (en "gjenta"), eller omtrent en fjerdedel av målet protein. Disse mindre protein fragmentene er vanligvis når uttrykket utføres ved høyere temperatur (> 32 ° C) som i figur 2C. Tilstedeværelsen av disse lavere molekylvekt proteinene kan føre til uforutsigbar mekaniske egenskaper. Dermed anbefales vanlig screening innlegget uttrykk å sikre høy kvalitet final fabrikat.

Mekanisk stivhet av ELP-basert hydrogels kan endres ved å manipulere konsentrasjonen av ELP eller forholdet mellom THPC reaktive grupper: ELP primære aminer. Samtidig, kan konsentrasjonen av celle-klebende ligander stilles ved å endre forholdet mellom ELP varianter med celle-limet (RGDS) å ikke selvklebende (RDGS) sekvenser fra noen stivhet regimet. Ved å manipulere disse to variabler, kan vi produsere gels som har et spekter av mekaniske egenskaper og ligand konsentrasjoner (Figur 3).

For å kapsle celler i 3D ELP hydrogels, er ønsket antall celler suspendert i medium og sentrifugeres for å produsere celle pellets (figur 4A). Mediet er pustende fra tuben cellene er nytt suspendert jevnt i ELP løsningen av ønsket konsentrasjonen. Deretter er THPC løsningen lagt til celle/ELP suspensjon og pipetted grundig for å danne en homogen blanding. Denne løsningen er raskt overført til sterilt silikon støpeformer innenfor en 24-vel plate med en pipette og tillatt krysskobling ved romtemperatur og 37 ° C i 15 min hver (figur 4B). Til slutt, medium legges til godt plate og ruges på 37 ° C i eksperimentet.

Live/døde flekker kan brukes å vurdere celle levedyktighet og vellykket celle innkapsling innen ELP hydrogels. Som illustrert i figur 5, viser voksen murine nevrale stamceller (NPC) høyt levedyktighet over 7 dager innen en 3% (w/v) ELP hydrogel.

3D ELP hydrogels har vist tidligere å støtte NPC stilk vedlikehold målt gjennom uttrykk for kanoniske NPC protein markører SRY (sex bestemme regionen Y)-boks 2 (Sox2) og nestin9. NPCer innkapslet i 3% (w/v) ELP hydrogels med lav THPC crosslinking Vis høy uttrykk for kjernefysisk lokalisert Sox2 og cytoplasmatiske nestin filamenter via immunostai- og AC confocal imaging (figur 6).

Figure 1
Figur 1 : En skjematisk fremstilling av ELP og tilsvarende amino acid sekvenser. ELP brukt i denne studien inneholder en T7 og His6 kode for antistoff-basert bildebehandling, en bioaktive region for innføring av celle-klebende domener og et elastin-lignende område som gir elastisk mekaniske egenskaper og tillater kjemiske crosslinking. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 : Mål protein uttrykk kan valideres SDS side og Western blot for å bekrefte at molekylvekt og identiteten til lyofilisert sluttproduktet. Pure full-lengde ELP driver molekylær vekt 37 kDa som rapportert av både SDS-side (A) og Western blot ved hjelp av T7 (MASMTGGQQMG) eller histidin 6 (HHHHHH) koden (B). (C). urene grupper av ELP på grunn av avvik i ELP uttrykk protokollen kan føre til uttrykk for ELPs med lavere molekylvekt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: RGDS ligand innhold stilles uavhengig fra mekaniske egenskaper i ELP hydrogels. 5% (w/v) og 3% (w/v) ELP hydrogels har skjær moduli på ~ 800 Pa og ~ 400 Pa, henholdsvis. Hydrogels med en 1:1 ratio av THPC reaktive grupper: ELP primære aminer er krysskoblet i romtemperatur i 15 min, oppvarmet til 37 ° C, og kan equilibrate i 5 minutter før måling. Data er gjennomsnittlig ± SD, *p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk av celle-innkapsling i ELP hydrogels. (A). celler er utgangspunktet avstand i en enkeltcelle suspensjon i middels og pelleted ved hjelp av en sentrifuge. Mediet er pustende fra røret, og cellene er nytt suspendert i ELP løsning på ønsket konsentrasjonen og blandet godt. Endelig er THPC crosslinking løsningen lagt og blandet godt. (B). etter tillegg av THPC, er løsningen støpt i silikon mold med en pipette. Løsningen kan krysskobling ved romtemperatur i 15 min etterfulgt av en andre 15 min incubation på 37 ° C. Mediet legges deretter til kultur for varigheten av eksperimentet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Nevrale stamceller opprettholde høy levedyktighet i ELP hydrogels. Representativt bilde av nevrale stamceller innkapslet i 3% (w/v) ELP hydrogels med 1:1 crosslinking (THPC reaktive grupper: ELP primære aminer) etter 7 dager i kultur. Grønn: lever flekker (calcein-AM); Rød: døde flekker (ethidium homodimer). Skala Bar = 100 µm.

Figure 6
Figur 6 : 3D ELP hydrogels støtte nevrale celle stilk maker uttrykk. Immunofluorescence bilde av nevrale stamceller uttrykke Sox2 og nestin proteiner etter 7 dager av kultur i ELP hydrogels. Bildene viser celler innkapslet i 3% (w/v) ELP gels med 0.5:1 crosslinking (THPC reaktive grupper: ELP primære aminer). Blå: DAPI (kjerner); Rød: Sox2; Grønn: nestin. Skala Bar = 25 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant protein uttrykk og rensing er et kraftig verktøy for å syntetisere biologisk materiale med høy reproduserbarhet. På grunn hovedsak til bruk av kommersialiserte molekylær kloning, kan egendefinerte rekombinant plasmider kjøpes fra flere leverandører, noe som reduserer tiden til å arbeide med materialer som ELPs. Tilsvarende kan plasmider anmodes direkte fra den opprinnelige lab når den opprinnelige arbeidet ble støttet av en føderal kontrakt og det videre arbeidet vil være for non-profit bruk. Full ELP aminosyresekvens har tidligere publisert for flere ELP varianter31. Men innebærer prosessen fra uttrykk til eventuell rensing av rekombinante proteinene en rekke viktige tiltak som kan ofte føre til redusert avkastning eller en lavere kvalitetsprodukt. Noen av de vanligste problemene for ELP forberedelse oppstår i ett av følgende: (1) kvaliteten på lagrede bakteriell aksjer, (2) første fryse-Tin sykle til forstyrrer den bakterielle membranen, og (3) protein rensing gjennom termisk sykling.

En stor forskjell mellom protein uttrykk og andre ikke-biologiske middel til å produsere materiale er at vi er å utnytte det biologiske maskineriet rekombinant verter å syntetisere polymerer. Deretter denne teknikk kommer med en unik begrensning: cellular død eller skade. Celledød manifesterer oftest seg som et redusert antall bakteriell koloniene etter striper en plate eller unormalt liten koloniene som vokser relativt sakte. Bakteriell aksjer, kan om vedlikeholdt nøye, forbli stabil i år. men kan påfølgende fryse-Tin sykluser grunnet gjentatt bruk eller fryser redusere celle levedyktighet eller føre til DNA skade. Typisk BL21 bakterier aksjer bruker mellom 10% og 40% glyserol volumprosent blandet med suspendert celler. Formålet med glyserol er til membran nucleating iskrystaller under frysepunktet. Derfor bruker Lavinnblanding (< 10%) kan føre til en kompromittert membran, mens høyere konsentrasjoner (> 40%) kan undertrykke frysepunktet tilstrekkelig til der aksjen aldri fryser fører til celledød. Imidlertid selv innenfor optimal glyserol nivåer, skal bakteriell aksjer ikke tillates å fullt tine som en kombinasjon av membran skade fra re frysing og cytotoksiske effekter fra glyserol kan føre til redusert lager levedyktighet og DNA skade. Derfor, hvis det er observert at en bakteriell lager resulterer i en lav kolonien teller eller at cellene er å dele med en konsekvent treg hastighet (manifestert som en langsom OD600 rampen rate under uttrykk), å transformere plasmider og gjør et nytt lager er en enkel første tilnærming til å feilsøke dette problemet. Med dette i tankene, for å sikre langsiktig vedlikehold av bakteriell aksjer og integritet av DNA, er det best å lagre kopier av dine plasmider renset DNA frosset i vann og ikke i cellene. Lagre DNA på denne måten vil sikre at i uforutsette hendelser som en mislykket aksje eller fryser feil, kan en pålitelig kilde til det opprinnelige DNA brukes for transformasjon.

Et viktig skritt i ELP fabrikasjon er rensing av målet protein fra uttrykket verten. Protein utvinning fra E. coli oppnås ved å bryte cellen veggen med nucleating iskrystaller som hele suspendert cellen lysate ved frysing, som er ytterligere forverret med påfølgende fryse-Tin sykluser. Alternative metoder for rupturing cellen vegg kan benyttes som sonication eller et trykk. Spesielt er påfølgende fryse-tiner det lysate en fordel som det bare krever en fryser og ingen annen spesialitet utstyr. Men utgivelser denne fremgangsmåten nonspecifically DNA, RNA og protein forurensning, i tillegg til proteaser som har potensial til å svekke målet protein. Derfor å unngå forurensning og redusert avkastning, deoxyribonuclease jeg (DNase) og phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) legges til cellen lysate å svekke DNA og hemme proteaser, henholdsvis. Tilstedeværelsen av DNA før tilsetning av DNase kan observeres visuelt som en 'trevlet' utseende gjennom re suspendert cellen lysate etter den første tine. DNase forringer aktivt denne DNA og dermed reduserer viskositeten av cellen lysate gjør det enklere å rense via sentrifugering. Optimal bryte ned DNA kan bekreftes visuelt ved å sikre at cellen lysate synes å være helt flytende og at trevlet utseende er ikke lenger synlig. Vi har observert i praksis at tillegg av ~0.1 mg DNase per mL celle lysate er tilstrekkelig for å oppnå nødvendig degradering. Men hvis tilstedeværelsen av DNA fortsatt er observert, kan mer DNase legges fulgt av ytterligere to til tre timer av agitasjon. Et lignende problem kan også oppstå hvis DNase er lagt til for tidlig før noen av de lysate har potensial til å tilstrekkelig tine. I dette tilfellet kan de kaldere temperaturene begrense effektiviteten av DNA degradering grunnet den tidlig inaktivering av DNase. For å unngå dette problemet, er det ofte best at de re suspendert pellet å tine i cirka åtte timer før behandling med DNase. I tillegg Hvis lav protein gir rapporteres og nedbryting av DNA har vært tilstrekkelig, kan tillegg av flere PMSF for å redusere potensielle protein fornedrelse fra proteaser være nødvendig.

Ekstra hensyn for å sikre optimal uttrykk for ELPs inkluderer en grundig forståelse av fordelene og begrensningene for valgte antibiotika. Her ble pET15b vektorer som inneholder en ampicillin motstand genet brukt for protein uttrykk. Funksjonelt, gir pET vektor serien betydelig protein uttrykk med så mye som 50% av en bakterie protein uttrykk dedikert til målet protein etter en vellykket induksjon32,33. Men kommer ampicillin som utvalg antibiotika med noen begrensninger som kan påvirke optimal uttrykk. Først kan nedbrytning av ampicillin i nærvær av E. coli skyldes raskt utgivelsen av beta-lactamase. Hvis en tilstrekkelig mengde av ampicillin er degradert, gå ampicillin-koding plasmider (dvs. den ELP-koding plasmider) tapt helt. Resultatet når uttrykke ELPs for lengre varighet, bør protein uttrykk nivå nøye overvåket på etterfølgende tidspunkt å sikre tilstrekkelig mengde ELP-koding genet gjenstår for å tillate ønskelig uttrykk. Mulige metoder for feilsøking opphoping av beta-lactamases inkluderer spinne ned av startkulturer og å suspendere cellene i antibiotika-fri medium før vaksinere uttrykk medium. Denne prosessen effektivt begrenser av antibiotika-nedverdigende enzymer og sikrer en større del av cellene inneholder mål-protein-encoding vektoren. I tillegg har ampicillin en begrenset holdbarhet på ca to til tre uker. Derfor skal kultur plater for protein uttrykk lagres ved 4 ° C i opptil to uker før bruk. Til slutt, for å sikre at effekten av ampicillin innen starter og expression media, ampicillin lager løsningen bør være produsert frisk umiddelbart før bruk, som langvarig lagring kan føre til mindre effektive antibiotika.

Tilstedeværelsen av en LCST gir enkel rensing av ELPs gjennom termisk sykling. Spesielt føre ved høyere temperatur og i nærvær av salter, entropic styrker ELPs å bli mindre løselig og deretter danner en polymer-rike coacervate fase. På den annen side, ved lavere temperaturer, ELPs fortsatt løselig og oppløses lett i løsningen. Sykling mellom disse to temperatur regimer kombinert med sentrifugering trinnene til å samle og kast ikke ELP-inneholder fasen suksessivt konsentrerer protein og reduserer samtidig eksistensen av ikke-ELP forurensninger.

Imidlertid, der er et antall stadier der ELPs kan gå tapt i denne renselsesprosess. Først før hver kaldt spinn, er protein inneholder løsningen alkalized til en pH på 9.0. Dette høyere pH tjener til å deprotonate enkelte aminosyrer på protein ryggraden, effektivt forlater dem i en ladet tilstand og ytterligere forbedre deres oppløselighet. Følgelig kan foregående dette trinnet eller ikke tillater nok tid for protein oppløsning føre til en reduksjon i avkastning som ikke-solubilized proteiner pelleted under sentrifugering og forkastet.

Tilsvarende kan målet proteiner gå tapt under varme spinn prosedyren når ELP er pelleted. I utgangspunktet legges NaCl til proteinrik nedbryting å redusere Løseligheten av ELP. Salter arbeid for å skjerme elektrostatisk interaksjoner mellom protein og vann molekyler, forårsaker protein å skille fra den vandige fasen. Denne effekten forsterkes av oppvarming løsningen, som, på grunn av entropic effekter, ytterligere bryter ned hydrous 'buret"rundt ELPs og styrker aggregering av proteiner. I lave konsentrasjoner protein (dvs., den første termiske syklusen), tillegg av salter alene er ofte nok til å føre denne fasen separasjon. Men som konsentrasjonen av protein øker (dvs., senere termisk sykluser), og det er mindre sekundære forurensninger å samhandle med salter, ELP lettere fremskynde. Som et resultat, hvis salter legges for fort, kan de bli fysisk fanget ved å aggregere proteiner, som effektivt reduserer salt konsentrasjonen av løsningen og begrenser ytterligere protein nedbør. Dermed bør salt legges i tre små grupper å sikre de har tilstrekkelig tid til å homogenously distribuere løsningen. Som et siste notat, varianter av ELP ryggraden, enten gjennom ytterligere endringer gjest resten av regionen elastin-lignende eller endringer i regionen bio-aktive kan betydelig påvirke LCST atferd. For å sikre optimal protein avkastning over protein varianter, det er derfor avgjørende å optimalisere pH, saltkonsentrasjon, og salt type (f.eks., monovalent eller divalent) for den kalde og varme spinn.

Kjører SDS side ved protokollen ferdigstillelse anbefales som det kan brukes å lett finne ut om betydelig ELP tap oppstår under noen av rensing trinnene. Kort, hvis ELP oppdages i nedbryting etter en varm spinn, deretter protein ikke blir effektivt bidrar. Tilsvarende, hvis ELPs identifiseres i et utvalg av solubilized pellets etter en kald spinn, deretter protein ikke blir effektivt oppløst.

ELP hydrogels tilbyr mange fordeler over syntetisk eller naturlig materiale. Spesielt gir bruk av Amin-reaktive crosslinker THPC en rimelig, enkel og tunable mekanisme protein crosslinking. Det er imidlertid forskjellige begrensninger innen crosslinking protokollen som bør bemerkes. THPC er oksygen følsom hvis lagret under upassende forhold, kan det raskt svekkes i reaksjon effektivitet. Dessuten, på grunn av sin kryssreaksjon med primære aminer, kan THPC reagere med omkringliggende proteiner i media eller på celleoverflaten som er rike på aminer. Derfor når forming ELP hydrogels, anbefales det å unngå media forurensning med cellen pellet redusere mulig eksogene protein kryssreaktivitet og dermed en reduksjon i crosslinking effektivitet. Til slutt denne crosslinking mekanismen utelukker bio-aktive regionen rekkefølgen de inneholder ingen lysin rester og dermed begrenser potensiell integrering av noen celle-klebende motiver (f.eks., IKVAV34). Å håndtere disse begrensningene, modifikasjoner til ELP ryggraden med azide og bicyclononyne (BCN) reaksjon partnere tillater bio-ortogonale crosslinking, som beskrevet tidligere27.

Det bør bemerkes at ELP LCST virkemåten spiller en viktig rolle i dikterer hydrogel mikrostruktur. På temperatur regimer over LCST bunnfall ELPs ut av løsningen fører til dannelsen av protein-rik og protein-mangelfull faser som kan påvirke matrix porøsitet og crosslinking effektiviteten av matrix9. Fordi de fleste cellekulturer eksperimenter er gjennomført på fysiologisk relevante temperaturer (~ 37 ° C) over ELP LCST, anses disse effektene. Hydrogels å effektivt krysskobling og form en sammenhengende protein nettverk, primære Amin fra lysin må være fysisk tilgjengelig for THPC crosslinker. Hvis ELP aggregering oppstår før tilstrekkelig crosslinking, kan ELPs fanget i proteinrik fasen være utilgjengelige, og dermed ikke delta i crosslinking. For å løse denne begrensningen, krever våre protokollen en innledende 15 min crosslinking periode i romtemperatur, som tillater foreløpige crosslinking av hydrogel før ELP gjennomgår sin termisk fase overgang. Denne romtemperatur inkubasjon etterfølges av en ekstra 15 min incubation på 37 ° C å fullføre hydrogel crosslinking. Denne fremgangsmåten er kritisk for tilstrekkelig crosslinking og robust, reproduserbare gelation ELP materialet.

Avslutningsvis tilbyr rekombinante proteiner hydrogels fabrikasjon benytter ELP eksepsjonell tunability protein sekvensen og derfor 3D celle microenvironment. ELP polymerer har vært vist å være expressible i høy avkastning, lett renset på grunn av deres LCST oppførsel, og biokompatible i en rekke i vitro og vivo systemer. Bruk av E. coli som rekombinant vert gir en enkel og rimelig prosedyre som gir opphav til nær perfekte kontroll av polymer molekylvekt og funksjonalitet. Sammen gir denne teknikken robust tunability og reproduserbarhet av hydrogel plattformen tillater kulturen i en rekke celletyper i 3D. Til slutt passer denne ELP hydrogel plattformen til mange nedstrøms biokjemiske analyser inkludert qRT PCR, Western blot, DNA utvinning og celle immunostai-9.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne takker T. Palmer og H. Babu (Stanford Neurosurgery) for å gi murine NPCer. vektor kunst i Figur 4 ble brukt og tilpasset fra klientforespørslene Medical Art under Creative Commons Attribution 3.0 Unported License (https://creativecommons.org/ licenses/by/3.0/legalcode). Del av dette arbeidet ble utført på den Stanford Nano delte fasiliteter (SNSF), støttet av National Science Foundation under prisen ECCS-1542152. N.A.S. anerkjenner støtte fra National Institute of General Medical Sciences av National Institutes of Health (32GM 008412). C.M.M. anerkjenner støtte fra en NIH NRSA pre fellesskap (F31 EB020502) og den Siebel Scholars Program. S.C.H. anerkjenner støtte fra National Institutes of Health (U19 AI116484 og R21 EB018407) og National Science Foundation (DMR 1508006) California Institutt for regenerativ medisin (RT3-07948). Denne forskningen mottatt finansiering fra Alliansen for regenerativ rehabilitering forskning og opplæring (AR3T), som støttes av Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institute of Nevrologiske lidelser og strek (NINDS) og National Institute of biomedisinsk bildebehandling og bioteknologi (NIBIB) av de nasjonale instituttene for helse under prisen nummer P2CHD086843. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til National Institutes of Health.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713
70% Ethanol RICCA Chemical 2546.70-1
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich A3920-500G
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25G
Bacto Agar Thermo Fisher Scientific 9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent Cells Invitrogen C606003
Chloramphenicol Amresco 0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
EDTA disodium salt, dihydrate Thermo Fisher Scientific O2793-500
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-4
Isopropanol Thermo Fisher Scientific A451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Thermo Fisher Scientific BP1755-10G
Luria Broth EMD Millipore 1.10285.5007
Parafilm VWR 52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals 195381
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm) Millipore SLGP033RB
Terrific Broth Millipore 71754-4
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filters Millipore SLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheet Electron Microscopy Science 70338-05
24-well tissue culture plates  Corning 353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm) Integra Miltex 33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm) Integra Miltex 33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm) Integra Miltex 33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  Corning 21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) Sigma-Aldrich 404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA Thermo Fisher  15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15701
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306 
Donkey Serum Lampire Biological Labs 7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) Molecular Probes A-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) Molecular Probes A-11071
Goat Serum Gibco 16210-072
Mouse Nestin Primary Antibody BD Pharmingen 556309
Mouse Sox2 Primary Antibody Cell Signaling Technology 23064S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium  Vector Labs H-1400 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Tags

Bioteknologi problemet 135 Elastin som protein ELP hydrogel 3D celle kultur immunostai- protein uttrykk rekombinante proteiner
Produksjonen av Elastin som Protein Hydrogels for innkapsling og immunostai-celler i 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, … More

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D. J. Vis. Exp. (135), e57739, doi:10.3791/57739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter