Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D

Published: May 19, 2018 doi: 10.3791/57739
Automatic Translation
*1, *2, 1, 2
1Department of Bioengineering, Stanford University, 2Department of Materials Science and Engineering, Stanford University
* These authors contributed equally

Summary

Polimer omurga ve bu nedenle, hücre microenvironment tam ayar için izin olarak Rekombinant protein mühendislik hydrogels 3D hücre kültürü için avantajlı olan. Burada, rekombinant elastin benzeri protein arıtma süreci ve kendi uygulamasında 3D hidrojel hücre kapsülleme açıklanmaktadır.

Abstract

İki boyutlu (2D) doku kültürü teknikleri temel hücre biyoloji anlayışımız için gerekli olmuştur. Ancak, geleneksel 2B doku kültürü sistemleri olmaması önemli bir sonuçlanan bir üç boyutlu (3D) matris kesin-den sonuçlanmak arada toplanan vitro ve içinde vivo. Bu sınırlamaya yönelik olarak, araştırmacılar-si mühendislik in vivo hücre microenvironment Biyokimya ve biyofizik özelliklerini taklit edebilirsiniz 3D hidrojel doku kültürü platformlar. Bu araştırma gerek 3D hücre saklama ve aşağı akım biyokimyasal testleri destek malzeme platformlar geliştirmek için motive vardır. Rekombinant protein mühendisliği protein sıra ayrıntılı denetim için izin vererek ve bu nedenle, dolayısıyla, sonuç potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin 3D hidrojel malzemesi tasarım ve geliştirme için benzersiz bir araç seti sunar matris. Burada, bağımsız olarak ayarlanabilir mekanik özellikleri ve hücre yapışkanlı ligand konsantrasyonu ile form hydrogels için kullanılan recombinantly türetilmiş elastin benzeri protein (ELP), bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde için bir metodoloji sunmak ve sonraki immünfloresan boyama, hücreleri aşağı akım Analizi ve miktar için gömülü.

Introduction

Son yüzyıl içinde iki boyutlu (2D) doku kültürü temel hücre biyolojisi vitroçalışmak için ayrılmaz bir araç haline geldi. Ayrıca, 2D hücre kültürü için nispeten ucuz ve basit protokoller kabulünün için birçok biyolojik ve tıbbi disiplinler arasında açmıştır. Bununla birlikte, araştırmaları bu toplanan vivo içindegelen belirgin sapma, değerli zaman ayrılır ve fon klinik olarak odaklı araştırma1,2içinboşa olduğunu geleneksel 2D platform sonuçlara yol açabilir göstermektedir, 3. Bu tutarsızlık en uygun yayılması ve çeşitli hücre tiplerinin olgunlaşma için gerekli olabilir 2D yüzeylerde kültürlü hücrelere sağlanan yerel Biyokimya ve biyofizik cues eksikliği ilişkilendirilebilir ki biz ve diğerleri öngörmekteyiz.

Bu sınırlamalar ve yardım Köprüsü 2D arasındaki boşluğu gidermek için Gelişmiş üç boyutlu (3D) hidrojel platformlar için hücre-kapsülleme1,4,5 vitro ve in vivo çalışmalar, araştırmacılar var ,6. Hydrogels doku gibi mekanik özellikleri ve besinlerin hızlı ulaşım sağlar su şişmiş yapısı nedeniyle hücre dışı matriks (ECM) vivo endojen microenvironment özetlemek için ideal maddeler olduğunu ve sinyal7,8faktörler. Ayrıca, 3D hydrogels iskele mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin üzerinde bağımsız denetim sağlamak için tasarlanabilir. Matris mekaniği9,10,11,12 ve hücre yapışkanlı ligandlar13,14,15 hücre etkilemek için iyi bilinen davranış vitro ve içinde vivo. Böylece, ayarlanabilir özellikleri ile 3D hydrogels hücreler ve onların microenvironment arasındaki nedensel ilişkiyi incelemek için bir platform sunuyoruz. Bir ideal 3D hidrojel matris için ölçüt basit, Sigara sitotoksik hücre kapsülleme yanı sıra fizyolojik ilgili mekanik özelliği bağımsız ayar ve taklit eder yerel hücre yapışkanlı motifler içerir.

Her iki sentetik (Örn., Polietilen glikol, polylactic asit, poli (Glikolik asit)) ve doğal olarak elde edilen (e.g., aljinat, kollajen, Matrigel) hydrogels var avantajları 2D vitro kültür platformlarına; Ancak, aynı zamanda onların uygulanabilirliği sınırı önemli eksiklikleri var. İlk, birçok sentetik ve doğal olarak elde edilen platformlar memeli hücrelere potansiyel olarak toksik olabilir sert crosslinking koşullar gerektirir, önde gelen azalma hücre canlılığı7. Ayrıca, birçok sentetik platformlar yerli bioactivity eksikliği ve artan maliyetini ve karmaşıklığını16ekleyebilirsiniz ikincil kimyasal reaksiyonlar ile functionalized gerekir. Son olarak, doğal olarak elde edilen malzemeler genellikle iç biyo-aktif etki alanları içerir iken, onlar sık sık yüksek toplu iş toplu iş değişkenlik tarafından boğulmuş ve genellikle nispeten zayıf jelleri7,17şekillendirme için sınırlıdır.

Protein sıra üzerinde açık denetime izin vererek Rekombinant protein mühendislik malzemeleri tasarımı için benzersiz bir araç seti sunar ve uzatma tarafından son hidrojel potansiyel mekanik ve biyokimyasal özelliklerinin18İskele yapısı. Ayrıca, Escherichia coli (e.coliproteinler ifade etmek için) iyi bilinen biyolojik makine yararlanarak, malzemeler düşük maliyetle ve tutarlı bir şekilde sınırlı Inter - ve içi-toplu değişkenliği ile üretilmektedir. Burada sunulan elastin benzeri protein (ELP) üç mühendislik etki alanı vardır: (1) bir T7 ve His6 etiket etiketleme yoluyla fluorescently antikorlar öğesini için izin veren, elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal için izin veren (2) bir 'elastin-gibi' bölgesi Crosslinking ve (3) hücre yapışkanlı motifler için kodlar 'biyo-aktif' bölge.

Elastin benzeri bölgemizde nerede dört 'xaa' amino asit siteleri isoleucine (Ile), ama olabilir herhangi bir amino asit prolin hariç olacak şekilde kurallı (Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)5 elastin sırasını temel alır. Bu sıra rekombinant ELPs19,20Bisiklete binme termal üzerinden basit arıtma sonrası ifade için istismar alt kritik çözüm sıcaklık (LCST) davranışı ile endows. Bu LCST özelliği termal olarak toplamak için farklı sıcaklıklarda Konuk 'Xaa' kalıntı21,22değiştirerek ayarlanabilir.

Burada, bir beş elastin benzeri tekrarlar 'Xaa' konumuna hidrojel crosslinking için kullanılmaktadır Amin sunulması (Lys) lizin amino asit ile değiştirilmiştir. Önceki çalışmalarımız sitotoksik sigara ve sağlam crosslinking Amin-reaktif crosslinker tetrakis (hydroxymethyl) phosphonium klorür (THPC)23ile reaksiyonu ile göstermiştir. Değişen toplam protein içeriği ve crosslinker konsantrasyon tarafından bir fizyolojik ilgili sertlik aralığı (~0.5-50 kPa)9,23,24span için ayarlanan hydrogels üretmek edebiliyoruz. Mekanik özellikleri ayarlama ek olarak, hücre adezyon hidrojel içinde ELP protein omurga içinde kurallı hücre yapışkanlı etki alanlarının entegrasyonu kaynaklanır. Örneğin, genişletilmiş fibronektin kaynaklı 'RGDS' amino asit dizisi birleşme hücre adezyon ve şifreli, süre konformasyon esneklik sağlar bağlayıcı 'RDGS' değişken hücre-matris yapışması24kısıtlar. Hücre-Yapıştırıcı Yapıştırıcı proteinler hem de toplam protein konsantrasyonu oranını modüle tarafından biz etkili ligand konsantrasyonu geniş bir yayılma hydrogels üretmek edebiliyoruz. Sonuçta, bir hidrojel platform bağımsız olarak çeşitli hücre tiplerinin en iyi 3D kültür için ayarlanan bilgisini iletmiyor biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ile geliştirdik.

Matris sertlik ve yapışkanlı ligand ayar ek olarak, rekombinant hydrogels hücre yayılan, yayılması ve 3D içerik4 içinde geçiş için gerekli olan tasarım belirli malzeme bozulması profilleri, yeteneği teklif , 9. bu bozulma özellikle genişletilmiş 'RGDS'9 veya elastin benzeri sıra25hedef proteaz hücre salgılanmasını tarafından tanınan. ELP hydrogels hücre canlılığı ve işlev immunocytochemistry yanı sıra DNA/RNA/protein ayıklama nicel reverse için de dahil olmak üzere eğitim için gerekli olan sonraki biyokimyasal testleri desteklemek için de gösterilmiş olan Transkripsiyon-polimeraz zincir tepkimesi (PCR qRT) ve Western blot9. ELP türevleri de vivo içinde modeller bir dizi kullandık ve bağışıklık sistemi26tarafından iyi tolere bilinmektedir.

Hücre-kapsülleme çalışmaları için malzeme bir platform çok çeşitli yararları genellikle Biyokimya ve biyofizik ayar aynı derecede eksikliği sentetik veya doğal olarak elde edilen malzeme platformları için karşılaştırıldığında sahiptir olarak birlikte, ELP alınan ve tekrarlanabilirlik. Ayrıca, ELP'ın basit ve sitotoksik sigara kullanımı ile çok çeşitli hücre tiplerinin (Örn., piliç dorsal kök gangliyon14,24, fare nöral progenitör hücre9, insan mezenkimal kök hücrelerin27, sığır Yenidoğan kondrosit28, insan endotel hücreleri29,30) 2D hücre kültürü için karşılaştırıldığında endojen 3D ECM daha fizyolojik ilgili bir model sağlar. Burada, biz recombinantly türetilmiş bir ifade için bir iletişim kuralı mevcut, kapsülleme ELPs tunable hidrojel platformu olarak kullanmak için 3D hücre. Biz daha fazla metodoloji ve kapsüllenmiş hücre confocal mikroskobu aşağı akışı floresan etiketleme için mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. ELP ifade iletişim kuralı

  1. 1. gün: başlangıç kolonisi büyüyor
    1. Ampisilin ve kloramfenikol ağar kaplamalar ısıyla Luria 25 gr et suyu ve agar Ultrasaf Su 1 litre başına 15 g hazırlayın. Çözüm ~ 60 ° C'ye soğuduktan sonra 1 mL (100 mg/mL Ultrasaf Su) ampisilin stokunun ve kloramfenikol hisse senedi (% 70 etanol içinde 34 mg/mL) 1 mL 1 L 100 µg/mL ve 34 µg/mL son konsantrasyonları için agar çözümü ekleyin , sırasıyla. 10 cm Petri yemekler serolojik pipet ile 20 mL nihai çözüm aktarmak ve agar kuvvetlendirmek izin verir. Parafilm ve mağaza 4 ° C'de Petri yemekler şal
      Not: Petri yemekler 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir.
    2. BL21 küçük bir örnek çizgi (DE3) pLysS E. coli önceden yapılmış bir bakteriyel stoktan bir ampisilin ve kloramfenikol agar plaka üzerinde ilgi ELP kodlama pET15b vektör içeren.
      Not: Ampisilin ve kloramfenikol vektörler, pET15b ve pLysS sırasıyla içeren bakteriler için seçin.
    3. Çizgili plaka baş aşağı bir kuluçka 37 ° C'de yer. Bakteri kolonileri gecede büyümeye izin.
      Not: 16 h daha uzun süre plakaları ampisilin düşer ve ampisilin direnç olarak yerine kolonileri oluşabilir kuluçkaya değil.
  2. 2. gün: Starter kültür ve ifade medya hazırlanması
    1. E. coli kültür kuluçka makinesi kaldırın. Parafilm plaka ve mağaza için en fazla 4 gün 4 ° C'de
    2. Starter kültür şişesi (250 mL) ve ifade kültür şişeler (12 x 1 L) ve basınçlı kap hazırlamak. 1 L ifade medya için müthiş suyu 47,6 g ve 4 mL gliserol 1 L bir 2 L şaşkın kültür şişesi ultrasaf su ekleyin ve alüminyum folyo ile kap.
      Not: 60-100 mg/L protein ifade medya tipik verimleri vardır.
    3. Önceden ısıtılmış, 37 ° C sallayarak kuluçka makinesi autoclaved starter yüklemek ve ajitasyon kuluçkaya.
    4. Steril filtre (0,22 µm filtre) ampisilin stok (Ultrasaf Su 100 mg/mL) 250 µL starter kültür 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyin. Hemen 250 devirde starter kültür Tantanacı başlar.
      Not: Kloramfenikol sadece koloni seçimi agar plakaları için kullanılan ve sıvı kültürleri için dahil değildir.
    5. Çizgili tabaktan bir tek ELP plazmid içeren E. coli kolonisi ekleyerek starter kültürü aşılamak ve 16 h için 37 ° C'de titremeye starter kültür sağlar.
    6. Şişeler içine ısındı, 37 ° C İnkübatörler sallayarak önceden ifade kültür ortamı yerleştirin ve şişeler ertesi sabah aşılamak hazır durumda gecede ajitasyon kuluçkaya.
  3. 3. gün: E. coli ifadede protein Inducing
    1. Temiz, steril filtre ampisilin stok (Ultrasaf Su 100 mg/mL) olun. Ampisilin stokunun 1 mL her şişesi 100 µg/mL nihai bir konsantrasyon için ifade medya ekleyin.
    2. 250 d/d de ifade medya Tantanacı başlar.
    3. Medya 2 mL örneğini herhangi bir ifade şişeyi alın ve bir küvet için bir optik yoğunluk 600 okuma için boş bir eklemek nm (OD600).
    4. 16 h starter kültür kuluçka tamamlanmasından sonra her ifade şişesi 20 mL starter kültür her ifade şişesi ile serolojik pipet aktararak aşılamak.
    5. 1 h ajitasyon tamamlanmasından sonra bir ifade şişeler OD600 ölçmek. Bu adımı OD600 farklı bir şişesi her zaman kontrol her 20 dk ölçmek.
    6. Bir OD600 0,6 olarak, ifade şişeler ile 32 ° c içeren shakers sıcaklığını azaltmak
    7. OD600 her 10 min denetleyin. Bir OD600 0,8, 1 mL 1 m, steril filtre β-izopropil thiogalactoside (IPTG) her ifade şişesi için Ultrasaf Su ekleyerek ifade ikna etmek.
    8. 7 h için ifade etmek E. coli ifade şişeler içinde izin.
    9. ifade sonu önce 20 dk önceden serin büyük kat santrifüj ile 4 ° c
    10. Tüm 12 L ifade medya bireysel santrifüj kapsayıcılar ve denge toplamak.
    11. Santrifüj kapasitesi de ifade Medya > 12.000 x g zemin santrifüj kullanarak 4 ° C'de 15 dakika.
    12. Kapalı süpernatant her santrifüj konteyner üzerinden dökün. Bir spatula kullanarak, hücre topakları önceden ağırlığını zip kilit torba toplamak.
    13. Pelet on tampon (25 g Pelet başına arabellek 100 mL) steril filtre yeniden askıya alma ve Pelet masaj tarafından herhangi bir aşırı hava kabarcıkları kaldırın. On tampon 1 litre 5.8 g sodyum klorür, 1.21 g tris temel ve ethylenediamine tetraacetic asit (EDTA) disodyum tuzu dihydrate 0,37 gr 900 mL ultrasaf su ekleyin. 8,0 pH ayarlama ve 1 M'ye getirin Bu adımda, pH şeritler yeterlidir.
    14. İkincil bir konteyner içine yeniden askıya alınan hücre Pelet içeren zip kilit çanta yere ve gece-80 ° C'de dondurmak.
  4. Gün 4-6: bakteriyel hücre duvarı donma-çözülme çevrimleri ile rüptür
    1. Donmuş Pelet dondurucudan kaldırmak ve yavaş yavaş bir orbital çalkalayıcı kullanarak nazik ajitasyon ile 4 ° C'de erimek izin.
    2. Bazı sıvı mevcut olana çözülme Pelet izin. Ekle ~ 30-40 mg deoksiribonükleaz ben (DNaz) için lysate çözdürülen. Ayrıca, 100 mM phenylmethylsulphonyl Flor (PMSF; bir proteaz inhibitörü) 1 mL isopropanol hücre lysate 100 mL başına ekleyin. Lysate gecede sarsmaya izin.
      Not: DNaz ve PMSF ekleme yalnızca ilk donma-çözülme döngüsü için gereklidir.
      Dikkat: PMSF Eğer inhale zehirlidir. Bir yüz maskesi PMSF toz işlerken kullanılır.
    3. Hücre lysate tamamen çözdürülen sonra lysate-80 ° C'de gecede, veya kadar tamamen donmuş dondurmak.
    4. Donma-çözülme yordamı üç devir toplam için yineleyin. Lysate 4 ° C'de son donma-çözülme sonra çözdürülen bırakın. 100 µL ham, lysate Sodyum Lauryl Sülfat-polyacrylamide jel elektroforez (SDS-sayfa) analysis arıtma ve sonuç için saklayın.
    5. Sonra son tezcan, çözdürülen 1 M NaOH kullanarak 9.0 lysate pH ayarlayın. Bu adımda, pH şeritler yeterlidir. En az 1 h için 4 ° C'de kuluçkaya (gecede uygundur) bir orbital çalkalayıcı üzerinde.
  5. Gün 7-9: sıcak ve soğuk spin termal Bisiklete binme aracılığıyla ELP arıtma
    1. 4 ° c 20 dk aralıklarla önce kat santrifüj ne yapıyorsun?
    2. Aliquot ve denge çözdürülen santrifüj kaplara lysate.
    3. Örnekleri, santrifüj kapasitesi > 15.000 x g 4 ° C'de 1 h için 100 µL süpernatant SDS-sayfa analizi için arıtma tamamlanmasından sonra saklamak.
      Not: centrifuging sonra ELP protein süpernatant onun yüksek suda onun LCST altındaki sıcaklıklarda nedeniyle içinde kalmalıdır (< 32 ° C).
    4. Süpernatant yeni santrifüj kaplarına aktarın ve uygun şekilde dengelemek.
    5. Sodyum klorür (NaCl) 1 M (için süpernatant her 100 mL NaCl 5,84 g) son bir konsantrasyon üç ayrı bölümde ekleyin. NaCl için yeterli dağılmasına izin vermek için üç bölümde eklenir emin olun.
    6. Titreyen bir kuluçka 250 rpm'de 37 ° C'de 3 h için tahrik.
    7. ajitasyon, sonundan önce 1 saat önceden sıcak bir yere santrifüj ile 37 ° c
    8. Santrifüj kapasitesi > 37 ° C'de 1 h için 15.000 x g Arıtma tamamlanmasından sonra 100 µL süpernatant SDS-sayfa analizi için depolamak ve kalan süpernatant atın.
      Not: centrifuging sonra ELP protein, düşük suda onun LCST üzerindeki sıcaklıklarda nedeniyle pelleted (> 32 ° C).
    9. Pelet pelet 1 g autoclaved, Ultrasaf Su 10 mL ekleyerek yeniden askıya alma. Protein dağılmasına yardımcı olmak için Pelet püre için metal bir spatula kullanın.
    10. Çözdürülen 1 M NaOH kullanarak 9.0 lysate pH ayarlayın. Bu adımda, pH şeritler yeterlidir.
    11. Gecede bir orbital çalkalayıcı üzerinde 4 ° C'de kışkırtmak.
    12. Toplam üç devir için sıcak ve soğuk spin termal Bisiklete binme yordamı yineleyin (i.e., üç toplam devir için adımları 1.5.1 1.5.11 aracılığıyla yineleyin).
  6. Gün 10-15: ELP diyaliz ve lyophilization
    1. Önceden soğutulmuş bir santrifüj yeniden askıya alınmış Pelet santrifüj kapasitesi > 15.000 x g 4 ° C'de 1 h için 100 µL süpernatant SDS-sayfa analizi için arıtma tamamlanmasından sonra saklamak.
    2. Protein çözüm kalan süpernatant 3,5 kDa diyaliz zarda 4 L 4 ° C'de önceden soğutulmuş Ultrasaf Su karşı dialyzing tarafından desalt Diyaliz su günde 6 kere 3 gün olmak üzere toplam iki kez değiştirin.
      Not: 5 ve 30 mL arasında tipik süpernatant birimleri vardır.
    3. Önceden Soğutmalı Santrifüj diyaliz çözümde santrifüj kapasitesi > 15.000 x g 4 ° C'de 1 h için Süpernatant arıtma sonundaki SDS-sayfa analizi için 100 µL saklayın.
    4. Çıkan süpernatant önceden ağırlığını konik tüpler-80 ° C'de dondurmak.
    5. Donmuş çözüm 3 gün ve kütle protein verim belirlemek için nihai ürün için lyophilize.
    6. Parafilm son içeren tüpler ELP ürün ve mağaza liyofilize 4 ° C'de
    7. SDS-protein saflığı sayfayı çalıştırın.
      Not: SDS-sayfa protokollerde belirli özel jel koşullara göre değişir. Bizim deneyler için son liyofilize protein konsantrasyonu 0.5 mg/mL deiyonize su içinde çözünmüş ve 140 V denaturing koşullar altında (w/v) % 12'si akrilamid jel 70-100 dk için çalıştırın.

2. hücre katma 3D Elastin benzeri Protein Hydrogels

  1. Silikon kalıp hazırlama
    1. Bir biyopsi yumruk ile istenilen çap delik bir 0,5 mm kalın silikon sayfası oluşturur ve her deliğin çevresinde bir kare kesip için kullanın. Kalıplar istenilen sayıda için yineleyin.
      Not: Çap ve kalıpları kalınlığı hücre kültür koşul ve belirli bir uygulama için ayarlanabilir. Pratik, hücre kültürlerinde 50 106 hücre/mL, 4 mm ve 5 mm çapları 0,5 mm kalınlığında kalıpları are salık vermek yeterli DNA/RNA ve protein çıkarma, anılan sıraya göre. İmmunostaining için 2 mm biyopsi yumruk yerine üç çoğaltır iyi boyanabilen üç bitişik delik başına kare kalıp oluşturmak için kullanılabilir.
    2. Bireysel kalıp her tarafında plastik wrap cımbızla kaldırın.
      Not: kirlenme gelecekteki plazma verimliliği bağ düşürebilir maruz silikon yüzeyi ile temas önlemek.
    3. Cımbız kullanarak, aynı sayıda çıplak Silikon kalıplar ve cam coverslips (No. 1, 12 mm çapında) 48-şey plaka ters kapağındaki satır dönüşümlü olarak düzenleyin. Bir kez tam, kirlenmesini önlemek için 48-şey plaka kapak kapak.
    4. Oksijen Plazma tedavi tüm 48-şey plaka kapak (i.e., kalıpları ve cam slaytlar). Hemen sonra forseps bitişik cam coverslip üzerine silikon kalıp ters çevirmek için kullanın. Bağ sağlamak için kalıp bastırın. 1s için oda sıcaklığında kuluçkaya kalıpları izin.
      Not: Oksijen plazma tedavi süresi kullanılan araç bağlı olarak değişir. Bizim araç için tipik koşullar bir çalışma gaz basınç pencerede 0,3-4 arasında bulunmaktadır mbar, oksijen gaz akışı 20 cm3/min ve plazma için 10-20 s maruz örnek.
    5. Kalıpları tarafından ısıyla sterilize. Oda sıcaklığında kalıpları kullanmak kadar steril bir ortamda saklamak.
      Not: Kalıpları bu aşamada süresiz olarak saklanır.
  2. Elastin benzeri protein hisse senedi çözüm hazırlanması
    1. ELP liyofilize 4 ° C depolama biriminden çıkarın. Sıcak tüp buğu yok emin olmak için açmadan önce oda sıcaklığına protein protein üzerinde tekrar tekrar kullanımı üzerinde oluşturur.
    2. Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) sabit ajitasyon ile 4 ° C'de ELP dağıtılması (i.e., iplik) bir gecede.
      Not: ELP hisse senedi çözüm konsantrasyonu daha fazla Kullanıcı tanımlı hacimsel oranı crosslinker çözüm ilavesi ile seyreltilmiş. Örneğin, bir % 3 (w/v) son ELP konsantrasyon için 4:1 bir hacimsel oranı ELP çözüm: crosslinker çözüm seyreltilmiş hisse senedi çözüm ELP %3,75 (w/v) hazırlayın. Konsantrasyon istenen uygulama için gerektiği şekilde ayarlayın.
    3. Steril ELP hisse senedi çözüm 0,22 µm şırınga filtre kullanarak filtre. ELP buz kullanılmadığı zaman saklamak.
  3. Biyogüvenlik kabini, bir 24-iyi doku kültürü plakasına steril Cımbız kullanarak steril kalıpları aktarın.
  4. THPC hisse senedi çözüm hazırlanması
    1. THPC kullanmak için sadece önceden DPBS içinde sulandırmak. THPC çözüm son ELP konsantrasyon ve istenen crosslinking oranı göre konsantrasyon ayarlayın.
      Not: iletişim kuralı için bir final ELP konsantrasyonu % 3 (w/v) ELP hisse senedi çözüm THPC çözüm 4:1 oranında hacimsel ile karıştırılarak yapılır. Gerektiği gibi ayarlayın.
    2. THPC çözüm (suda % 80) 2.6 µL DPBS 997.4 µL için ekleyin.
      Not: Bu konsantrasyon THPC 1:1 stokiometrik oran hidroksi metil gruplarının THPC tarih ve ELP protein üzerinde birincil aminler açıklanan 4:1 hacimsel oranı için son %3 (w/v) ELP hidrojel Solutions'da karıştırma zaman karşılık gelir. THPC çözüm viskoz ve çözüm damlacıkları pipet ucu tarafına yapışabilir. Doğru konsantrasyonları için DPBS sulandrarak böyle damlacıkları kaçının. THPC hisse senedi kapsayıcı fosfamin oksidasyonunu ve crosslinker inactivation önlemek için azot gazı ile tasfiye.
    3. Girdap çözüm mix ve buz üzerinde tutmak için.
    4. Steril filtre THPC stok 0,22 µm şırınga filtre kullanarak çözüm. THPC hisse senedi çözümle daha fazla alt stokiometrik crosslinking oranları elde etmek için steril DPBS seyreltik (Örn., 0.5:1 veya 0.75:1).
      Not: THPC oksijen duyarlı ve seyreltik çözüm hazırlık sonraki birkaç saat içinde kullanılmalıdır.
  5. Hücreleri tek hücre süspansiyon içine tripsin-EDTA ile kuluçka tarafından ayırmak, hücreleri cips ve bir hemasitometre kullanarak ortamda yeniden askıya hücreleri saymak.
    Not: Bu adım için tam iletişim kuralları ağır istenen hücre tipi ve uygulama üzerinde bağlıdır. Bu iletişim kuralı kullanılan nöral progenitör hücre için % 0,025 tripsin-EDTA kuluçka 1,5 dakika oda sıcaklığında yapılmıştır. Hücreleri 200 x g 2 min için de pelleted. Artan hücre canlılık için hücreleri normal Orta koşullarda askıya. 1-50 106 hücre/mL son hidrojel birim hücre kapsülleme aralığından için kullanılan tipik hücre yoğunluğu. Gerektiği gibi ayarlayın.
  6. Aliquot steril 1,5 mL santrifüj tüpü hücrelere istediğiniz sayıda.
  7. Dikkatle Senaryo Özeti ~ 200 x g 3 dakika süreyle santrifüj kapasitesi, süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet buz üzerinde tutun.
    Not: Tamamen ELP ve THPC crosslinker daha fazla seyreltme azaltmak için tüm süpernatant Aspire için önemlidir. Belirli aralıklarla hızları ile hücre tipi değişir.
  8. Öyle ki son hacim (ELP çözüm: THPC çözüm 4:1 oranında varsayarak) % 80'i birimdir hücre Pelet ELP hisse senedi çözümde yeniden askıya alma. Mix 20 - 25 kez pipet hücreleri ve ELP homojen karışımı üretmek için.
    Not: sıcaklık artışı ve sonraki aşama geçiş ELP azaltmak için tüp alt sürükleyici kaçının. Her 2 mm kalıp üç çoğaltır ile son hacim 7.5 µL gerektirir (i.e., 6 µL ELP hisse senedi çözüm ve THPC hisse senedi çözüm 1.5 µL) eşit 3 delik bölünmüş (i.e., 2.5 µL son hacim delik başına). 4 ve 5 mm kalıpları için son hacmi 7,5 µL ve 15.5 µL sırasıyla gereklidir.
  9. THPC hisse senedi çözüm hücre/ELP süspansiyon kalan % 20 son hacim için ekleyin. Mix 20 - 25 kez pipet homojen bir karışım üretmek için.
  10. Hemen karşılık gelen son birim hücre/ELP/THPC karışımı bir dairesel hareket tarafından her kalıba pipette. Tüm kalıpları için yineleyin.
  11. Örnekleri, oda sıcaklığında 15 dk, 15 dk 37 ° C'de ek bir kuluçka takip için kuluçkaya.
    Not: İlk kuluçka dönemi bu sıcaklığı yukarıda ELP'ın LCST artan ve onun termal faz ayrımı inducing önce ilk hidrojel polietilenin kolaylaştırmak yardımcı olacaktır.
  12. Yavaş yavaş sıcak hücre kültür ortamının 750 µL jelleri engellemeden kaçınarak 24-şey plaka her şey için ekleyin.
  13. 37 ° C'de hydrogels için 7 gün kuluçkaya.
    Not: 1-2 günde hücre türüne bağlı olarak önerilen değişiklikleri orta tam. Jel üzerinde stres sınırlamak için Pasteur pipet yapıştırılmış bir cam ile 200 µL pipet ucu orta kuyudan alıyorum kullanın.

3. Immunocytochemistry 3D ELP Hydrogels hücrelerinin

  1. Fiksasyon çözüm 10 mL % 16 (w/v) paraformaldehyde (PFA) 30 ml DPBS karıştırarak hazırlayın. Çözüm ile 37 ° c sıcak
  2. 24-şey plaka ortamından Aspire edin ve yavaşça DPBS 1 mL ile yıkayın.
  3. Her şey için 750 µL fiksasyon çözüm ekleyin ve 30 dk 37 ° C'de kuluçkaya. Doku kültürü kuluçka PFA buharı ile diğer kültürlerin kirlenmesini önlemek için kullanmayın.
  4. Dikkatle her şey için bir uygun tehlikeli atık konteyner PFA atarak, fiksasyon çözümden Aspire edin.
    Dikkat: PFA maruz deri ve göz tahrişine neden olabilir. Eldiven/koruyucu gözlük giymek ve kimyasal duman mahallede çalışma.
  5. 1 mL DPBS her örnek için ekleyin. Hemen DPBS Aspire edin ve İngiltere'de yılın atık konteyner içine atın.
  6. Örnekleri DPBS 1 mL 10 dakika ile iki kez yıkayın.
    Not: Örnekleri DPBS içinde 4 ° C'de için Parafilm ile plaka mühürleme sonra bir haftaya kadar saklanabilir.
  7. Her örnek permeabilization çözüm (DPBS 100 mL ve Triton X-100; 0.25 mL 750 µL ile permeabilize PBST) üzerinde bir rocker 15 dönüş/dak, oda sıcaklığında 1 h için.
  8. PBST Aspire edin ve her örnek için çözüm (PBS 95 mL, 5 gram Sığır serum albumin (BSA), 5 mL serum ve Triton X-100 0.5 mL) engelleme 750 µL ekleyin. Bir rocker 15 dönüş/dak, üzerinde 3 h için oda sıcaklığında kuluçkaya.
    Not: Serum içinde ikincil antikorlar yükseltilmiş ana tür engelleme çözüm bulunması gerekir (Örn., keçi, eşek) ve bir 0,22 ile steril filtre µm filtre kullanımdan önce.
  9. Antikor seyreltme çözüm (97 mL DPBS, BSA 2.5 g, 2.5 mL serum (Kimden adım 3.8 olduğu gibi aynı ana tür) ve Triton X-100 0.5 mL) hazırlayın. Antikor seyreltme çözüm kullanarak birincil antikor sulandırmak ve her örnek için 500 µL çözüm ekleyin. Parafilm ile plaka mühür ve bir gecede bir rocker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Testin ve Sox2 birincil antikor antikor seyreltme çözümden üreticilerin orijinal konsantrasyon içinde seyreltilmiş 1: 400.
  10. Her örnek antikor çözümden Aspire edin ve 15 dönüş/dak, bir rocker üzerinde oda sıcaklığında PBST örnekleriyle 60 dakika yıkayın. Yıkama adım 3 kez tekrarlayın.
  11. İkincil antikorlar ve 5 mg/mL stok DAPI (1:2, 000) antikor seyreltme çözüm kullanarak sulandırmak ve her örnek için 500 µL çözüm ekleyin. Alüminyum folyo ile 24-şey plaka kapak ve bir gecede bir rocker üzerinde 4 ° C'de kuluçkaya.
    Not: ikincil antikorlar ışığa duyarlı olduğundan, örnekleri üzerinden photobleaching tüm sonraki adımlar için korunması gerekir. Keçi Anti-fare ve keçi Anti-tavşan ikincil antikor antikor seyreltme çözümden üreticilerin orijinal konsantrasyon içinde seyreltilmiş 1:500 vardı.
  12. Her örnek antikor çözümden Aspire edin ve rocker üzerinde oda sıcaklığında PBST ile örnekleri 30 dakika yıkayın. Yıkama adım 3 kez tekrarlayın.
  13. Bir damla hard-set montaj orta bir cam slayt yüzeyine yerleştirin. Forseps kullanarak, aşırı çözüm hafifçe bir kağıt havlu üzerinde kalıp kenarına Blot tarafından kalıptan çıkarın. Dikkatle kalıp montaj Orta baş aşağı üzerine yerleştirin ve kabarcıklar tanıtan kaçının.
  14. Montaj Orta oda sıcaklığında 48 h için sertleşmesine izin. Mağaza oda sıcaklığında veya 4 ° c, örnekleri Montaj orta tam 48 h için kırılma indisi orta sertleştirme boyunca değişeceği gibi görüntüleme önce ayarlamak izin verir. Mühür ile cam kapak örnekleri slayt oje kirlenme veya örnek hareketi azaltmak için temizleyin.
  15. Confocal mikroskop kullanarak örnekleri görüntü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol için kullanılan ELPs beş bölgelerinde oluşmaktadır: T7 etiketi, His6 etiketi, enterokinase (EK) bölünme sitesi, biyo-aktif bölge ve elastin benzeri bölge (Şekil 1). T7 ve His6 Etiketler standart Western blot teknikleri ile kolay tanımlanması için izin verir. EK bölünme sitenin giriş gerekirse etiket bölge enzimatik kaldırılması için izin verir. Biyo-aktif bölge genişletilmiş, fibronektin türetilmiş hücre-yapıştırıcı ('RGDS') veya non-yapıştırıcı ('RDGS') dizileri için kodlar. Son olarak, elastin benzeri bölge merkezi tekrarı kanat tekrarlar bir LCST ~ 32 ° C31ulaşmak için isoleucine içerirken crosslinking üzerinden THPC sağlayan Konuk kalıntı sitesinde lizin grubunu içerir.

Yazı ifade, SDS-sayfa veya Western blot molekül ağırlığı görselleştirmek ve T7 (MASMTGGQQMG) veya His6 (HHHHHH) (Şekil 2) gibi antikor Etiketler içeren ELPs kimliğini onaylamak için kullanılabilir. Başarılı ifade kontrollü şartlar altında yaklaşık molekül ağırlığı (~ 37 kDa) adlı tek bir karanlık bant varlığı gösterdiği son derece homojen bir ürün her iki SDS-sayfa (Şekil 2A) kullanarak bu proteinlerin verir ve Western blot) Şekil 2B).

Kontrolsüz şartlarda bir Western blot üzerinde düşük moleküler ağırlıklı bandından varlığı bazı proteinler kısmını değil tamamen çevrildi ve/veya ifade (Şekil 2C) sonra bozulmuş olduğunu göstermektedir. Özellikle, burada kitleler tarafından yaklaşık ağırlığı bir biyo-aktif bölge ve üç elastin gibi bölgeler (bir ' tekrar'), veya yaklaşık dördüncü hedef protein karşılık gelen ~ 9 kDa eşit aralıklandırılmış. Bu küçük protein parçaları ifade daha yüksek bir sıcaklıkta işlenirken genellikle mevcut (> 32 ° C) Şekil 2Colduğu gibi. Bu daha düşük moleküler ağırlıklı proteinler varlığı öngörülemeyen mekanik özellikleri için yol açabilir. Böylece, düzenli posta ifade eleme yüksek kaliteli nihai ürün sağlamak için önerilir.

ELP tabanlı hydrogels mekanik sertlik ELP konsantrasyon veya THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler oranını işleyerek değiştirilebilir. Aynı anda, hücre yapışkanlı ligandlar konsantrasyonu ELP değişik hücre-yapıştırıcı (RGDS) ile oranını değiştirerek yapışkan olmayan (RDGS) sıralarını herhangi bir sertlik rejimi içinde ayarlanabilir. Bu iki değişken manipüle ederek, mekanik özellikleri ve ligand konsantrasyonu (Şekil 3) bir spektrum var jelleri üretebilir.

3D ELP hydrogels hücrelerde kapsüllemek için hücreler için istediğiniz sayıyı ortamda askıya ve hücre Pelet (Şekil 4A) üretmek için centrifuged. Orta tüm tüpünden Aspire ve istenen konsantrasyon ELP çözüm aynı şekilde yeniden askıya alınmış hücrelerdir. Daha sonra THPC çözüm için hücre/ELP süspansiyon eklenir ve homojen bir karışım oluşturmak için iyice pipetted. Bu çözüm hızlı bir şekilde steril Silikon kalıplar içinde bir pipet kullanarak bir 24-şey plaka aktarılır ve crosslink oda sıcaklığında ve 37 ° C 15 dakika her (Şekil 4B) izin. Son olarak, orta iyi plakasına eklenir ve deneyinde 37 ° C'de inkübe.

Boyama canlı/ölü hücre canlılığı ve başarılı hücre kapsülleme ELP hydrogels içinde değerlendirmek için kullanılabilir. Şekil 5' te gösterildiği gibi yetişkin fare nöral progenitör hücre (NPCs) yüksek hücre canlılığı üzerinde 7 gün içinde % 3 (w/v) ELP hidrojel göster.

3D ELP hydrogels daha önce gösterilmiştir NPC kök bakım kurallı NPC protein işaretleri SRY (bölge Y belirleme seks) ifade aracılığıyla ölçülen desteklemek için-kutu 2 (Sox2) ve testin9. NPCs %3 (w/v) ELP hydrogels düşük THPC crosslinking Haritayı yüksek ifade lokalize nükleer Sox2 ve sitoplazmik testin filamentler yolu ile immunostaining ve confocal görüntüleme (Şekil 6) ile kapsüllenir.

Figure 1
Resim 1 : ELP ve karşılık gelen amino asit dizileri şematik gösterimi. Bu çalışmada kullanılan ELP antikor tabanlı görüntüleme, biyoaktif bir bölge için giriş hücre yapışkanlı etki alanlarının ve elastik mekanik özellikleri confers ve kimyasal çapraz için izin veren bir elastin benzeri bölge T7 ve His6 etiket içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 : Hedef protein ifadesi SDS-sayfa ve Western blot ile molekül ağırlığı ve nihai lyophilized ürün kimliğini onaylamak için doğrulanmış. Saf tam uzunlukta ELP çalışır 6 (HHHHHH) etiket SDS-sayfa (A) ve Western blot T7 (MASMTGGQQMG) veya histidin kullanarak tarafından belirlendiği şekilde 37 kDa bir molekül ağırlığı (B). (C). ELP saf olmayan toplu işlemleri ELP ifade protokolündeki sapmalar nedeniyle ELPs ifadesiyle daha düşük moleküler ağırlık yol açabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: RGDS ligand içeriği bağımsız olarak ELP hydrogels içinde mekanik özelliklerindeki ayarlanmış. %5 (w/v) ve % 3 (w/v) ELP hydrogels var kesme dönmeler ~ 800 Pa ve ~ 400 Pa, anılan sıraya göre. Hydrogels THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler 1:1 oranında çapraz 15dk 37 ° C'ye ısıtılmış için oda sıcaklığında vardı ve 5 dk önce ölçüm için equilibrate için izin. Ortalama ± s.d., *p bilgilerse < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: Şematik ELP hydrogels hücre kapsüllemenin. (A). hücreleri tek hücre süspansiyon orta ve pelleted santrifüj kullanarak içine başlangıçta ayrışmış. Orta tüm tüpünden Aspire ve hücreleri istenilen konsantrasyon, ELP çözümde yeniden askıya ve de karışık. Son olarak, THPC crosslinking çözüm eklenir ve de karışık. (B). THPC eklenmesi hemen ardından, çözüm bir pipet ile bir silikon kalıp içine atıldı. Çözüm için oda sıcaklığında crosslink 15dk 37 ° C'de ikinci bir 15 dk kuluçka takip için izin verilir Orta daha sonra kültür için de deneme süresi için eklenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: Nöral progenitör hücre korumak yüksek canlılık ELP hydrogels. Temsili resim nöral progenitör hücre kültüründe 7 gün sonra hydrogels 1:1 crosslinking (THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler) ile %3 (w/v) ELP kapsüllü. Yeşil: Canlı Boyama (calcein-AM); Kırmızı: ölü (etidyum homodimer) boyama. Ölçek çubuğu 100 µm =.

Figure 6
Şekil 6 : 3D ELP hydrogels nöral progenitör hücre kök maker ifade destek. Ayirt görüntü Sox2 ifade ve kültür ELP hydrogels 7 gün sonra proteinler testin nöral progenitör hücre. Görüntüleri %3 (w/v) ELP jelleri 0.5:1 crosslinking (THPC reaktif Grup: ELP Birincil aminler) ile kapsüllü hücreleri gösterir. Mavi: DAPI (çekirdek); Kırmızı: Sox2; Yeşil: testin. Ölçek çubuğu 25 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Rekombinant protein ifade ve arıtma ile yüksek tekrarlanabilirlik Biyomalzeme sentezlemek için güçlü bir araç var. Ticari moleküler klonlama advent büyük ölçüde nedeniyle, özel rekombinant plazmid birkaç terdarikçilerin ELPs gibi malzemeler ile çalışmak için zaman önemli ölçüde küçültür satın alınabilir. Benzer şekilde, plazmid doğrudan kaynak laboratuvardan ne zaman orijinal çalışma bir federal anlaşma tarafından desteklenen ve gelecekteki iş kar amacı gütmeyen kullanım için olacak istenebilir. Tam ELP amino asit dizisi daha önce birkaç ELP türevleri31için yayınladı. Ancak, ifade işlemi rekombinant proteinlerin nihai arıtma için genellikle düşük verimleri veya daha düşük kaliteli bir ürün yol açabilir kritik adımlar bir dizi içerir. ELP kursları en yaygın sorunlardan bazıları aşağıdakilerden birini ortaya çıkar: (1) saklı bakteriyel stokları kalitesini, (2 ilk donma-çözülme döngüsü bakteriyel membran ve termal aracılığıyla (3) protein saflaştırma bozmaya.

Biz biyolojik makine polimerler sentezlemek için rekombinant ana yararlanarak protein ifade ve malzemeleri üreten diğer biyolojik olmayan araçlarla arasında büyük bir fark olduğunu. Daha sonra bu teknik bir benzersiz sınırlama ile gelir: hücresel ölüm ya da zarar. Hücre ölümü en çok bakteri kolonileri azaltılmış bir dizi olarak bir tabak ya da nispeten yavaş yavaş büyümeye anormal derecede küçük koloniler çizgiler sonra ortaya çıkmaktadır. Bakteriyel hisse senetleri, dikkatli bir şekilde muhafaza Eğer yıl boyunca kararlı kalabilir; Ancak, art arda gelen donma-çözülme döngüsü tekrarlanan kullanımı ya da dondurucu hatası nedeniyle hücre canlılığı azaltmak veya DNA hasara yol. Tipik BL21 bakteri stokları askıya alınan hücrelerle karışık hacmen % 10 ve % 40 gliserol arasında kullanın. Gliserol membran zarar donma sırasında buz kristalleri nucleating azaltmak için amaçtır. Bu nedenle, düşük konsantrasyonlarda kullanarak (< % 10) daha yüksek konsantrasyonlarda sırasında güvenliği aşılan bir membran yol açabilir (> % 40) yeterince için nerede hisse senedi donuyor hiç hücre ölümü için önde gelen donma noktası önleyebilirsiniz. Ancak, en iyi gliserol seviyede bile, bakteriyel hisse senetleri için tamamen yeniden donma ve sitotoksik etkilerinden gliserol membran hasarı birleşimidir yol açabilir gibi tezcan hisse senedi canlılığı ve DNA hasarı azaltmak izin verilmemelidir. Bu bakteriyel bir hisse senedi bir düşük koloni sayımı sonuçları veya hücre sürekli olarak yavaş bir hızda (yavaş OD600 rampa oranı ifade sırasında tecelli) bölünmesi görülmektedir, bu nedenle, plazmid yeniden dönüştürme ve yeni bir stok yapma basit bir ise Bu sorunu gidermek için ilk yaklaşım. Bunu aklýnýzda tutarak, bakteriyel hisse senetleri uzun vadeli bakım ve DNA, bütünlüğünü sağlamak için bu saf DNA su ve hücre içinde donmuş olarak, plazmid kopyalarını depolamak en iyisidir. Bu şekilde DNA depolamak başarısız hisse senedi veya dondurucu başarısızlık gibi beklenmedik olaylar, dönüşüm için orijinal DNA'ın güvenilir bir kaynak kullanılabilir sağlayacaktır.

Başka bir kritik ELP imalat ifade ana hedef protein saflaştırma adımdır. E. coli çıkarma protein daha fazla ardışık donma-çözülme çevrimleri ile bileşik olduğunu askıya alınan hücre dondurma üzerine, lysate boyunca formu nucleating buz kristalleri kullanarak hücre duvarı kırarak elde edilir. Hücre duvarı parçalanma için alternatif yöntemler sonication veya bir basın gibi yararlı olabilir. Sadece bir dondurucu ve diğer özel ekipman gerektirir gibi özellikle, lysate, üst üste dondurma çözdürme avantajlıdır. Ancak, bu yordamı nonspecifically DNA, RNA ve protein kirleticiler, hedef protein bozulmasına yol açar potansiyeline sahip proteaz yanı sıra serbest bırakır. Bu nedenle, için kirlenmesini önlemek ve verim, ben (DNaz) ve phenylmethanesulfonyl florür (PMSF) hücre DNA aşağılamak ve proteaz, sırasıyla inhibe lysate eklenir deoksiribonükleaz azaltılmış. DNA'ın varlığını DNaz eklenmesi önce görsel olarak yeniden askıya alınan hücre boyunca 'kılçıklı' bir görünüm olarak ilk tezcan takip lysate görülebilmektedir. DNaz aktif olarak bu DNA'yı düşürür ve böylece viskozite Santrifüjü arındırmak daha kolay hale lysate hücrenin azaltır. DNA'ın en iyi bozulmak görsel olarak hücre lysate tamamen sıvı gibi görünüyor ve lifli görünüm artık görünür olduğundan emin olarak onaylanabilir. Biz pratikte DNaz ~0.1 mg mL hücre lysate başına eklenmesi gerekli bozulması ulaşmak için yeterli olduğunu gözlemledim. DNA varlığı hala görülmektedir, ancak, daha fazla DNaz takip ajitasyon an munzam iki ya da üç saat tarafından eklenebilir. Herhangi bir lysate olmuştur önce yeterince çözülme potansiyeline DNaz zamanından önce eklenirse, benzer bir sorunu da ortaya çıkabilir. Bu durumda, daha soğuk sıcaklıklarda DNA bozulması nedeniyle DNaz erken inactivation verimliliğini sınırlayabilirsiniz. Bu sorunu önlemek için bu kez yaklaşık 8 saat önce DNaz tedaviyle çözülme yeniden askıya alınmış Pelet izin vermek için en iyi yöntem var. Buna ek olarak, düşük protein verimleri bildirilir ve DNA dökümünü yeterli oldu, daha fazla potansiyel protein yıkımı proteaz üzerinden azaltmaya yardımcı olmak için daha fazla PMSF eklenmesi gerekli olabilir.

ELPs en iyi ifade sağlamak için dikkat edilecek diğer noktalar faydaları dikkatli bir anlayış ve seçilmiş bir antibiyotik sınırlamaları içerir. Burada, ampisilin direnç geni içeren pET15b vektörler için protein ifadesi kullanıldı. İşlevsel olarak, evde beslenen hayvan vektör serisi kadar %50 ile önemli protein ifadesidir bir başarılı indüksiyon32,33takip hedef protein adanmış bir bakteri'nın protein ifade sağlar. Ancak, Obama seçim antibiyotik olarak en iyi ifade ile girişime neden olabilir bazı sınırlamalarla birlikte gelir. İlk olarak, ampisilin E. coli huzurunda bozulma hızla beta-lactamase yayın nedeniyle oluşabilir. Ampisilin yeterli miktarda bozulmuş, ampisilin kodlama plazmid (yani ELP kodlama plazmid) tamamen kaybolabilir. Sonuç olarak, ELPs daha uzun süreler için ifade edilirken, protein ifade düzeyleri dikkatle her başarılı zaman noktalarda arzu ifade için izin vermek için yeterli miktarda ELP kodlama gen kalır emin olmak için takip edilmelidir. Beta-laktamaz birikimini sorun giderme için olası yöntemleri starter kültür iplik ve ifade orta aşı önce Orta antibiyotik içermeyen hücreleri yeniden askıya alma içerir. Bu işlem etkin antibiyotik aşağılayıcı enzim devrinin sınırlar ve daha büyük bir bölümünü sağlar hedef protein kodlama vektör hücre içeriyor. Ayrıca, ampisilin yaklaşık 2-3 hafta sınırlı bir raf ömrü vardır. Bu nedenle, kültür plakaları protein ifade için en fazla iki hafta kullanmadan önce 4 ° C'de muhafaza edilmelidir. Son olarak, ampisilin starter ve ifade medya, ampisilin hisse senedi çözüm içinde etkinliği sağlamak için olmak üretilen taze hemen kullanmadan önce uzun süreli depolama için daha az etkili bir antibiyotik neden olabilir gibi.

Bir LCST varlığı ELPs basit arıtma termal aracılığıyla sağlar. Özellikle, daha yüksek bir sıcaklıkta ve tuzları huzurunda, Entropik kuvvetleri ELPs daha az çözünür hale ve daha sonra bir polimer zengini coacervate faz oluşturmak neden. Öte yandan, daha düşük sıcaklıklarda ELPs çözünür kalır ve çözüm içine kolayca çözülür. Toplamak ve ELP içeren faz sırayla atmak için Santrifüjü adımları ile birleştiğinde bu iki sıcaklık rejimleri arasında bisiklet protein konsantreleri ve aynı anda ELP olmayan kirletici varlığı azaltır.

Ancak, nerede ELPs bu arıtma işleminde kayıp olabilir aşamaları bir dizi vardır. İlk olarak, soğuk her spin öncesinde protein içeren çözüm pH 9.0 için alkalized. Bu daha yüksek pH deprotonate için hizmet etkili onları dolu bir durumda bırakarak ve daha fazla kendi çözünürlük geliştirme protein omurga üzerindeki belirli amino asitler. Sigara çözündürüldükten proteinler olması sırasında Santrifüjü pelleted atılır gibi ve sonuç olarak, bu adım yukarıda veya protein dağılması için yeterli zaman izin vermiyor verim bir azalma yol açabilir.

Benzer şekilde, ne zaman seminerine pelleted, sıcak spin işlemi sırasında hedef proteinler kaybolmuş olabilir. Başlangıçta, NaCl seminerine çözünürlük azaltmaya protein açısından zengin süpernatant için eklenir. Tuzları neden sulu faz ayırmak protein protein ve su molekülleri arasındaki elektrostatik etkileşimler kalkan çalışmak. Bu etki, Entropik etkileri nedeniyle daha fazla ELPs çevreleyen sulandırılmışperklorid 'kafes' tatili ve proteinlerin toplama zorlar çözüm Isıtma tarafından güçlendirilmiş. Düşük protein konsantrasyonlarda (i.e., ilk termal döngüsü), tuzları yalnız eklenmesi sık sık bu aşama ayrılık neden için yeterli değil. Ancak, protein konsantrasyonu artırır (i.e., daha sonra ısı devir) ve orada tuzları ile etkileşim daha az ikincil kirleticiler, ELP daha kolay çökelti. Tuzları çok hızlı bir şekilde eklenirse, sonuç olarak, onlar fiziksel olarak proteinler, toplayarak tarafından hangi etkili çözüm tuz konsantrasyonu azaltır ve daha fazla protein yağış sınırlar tuzak haline. Böylece, tuz homojen çözüm dağıtmak için yeterli zaman sahip emin olmak için üç küçük gruplar halinde eklenmelidir. Son bir not olarak Konuk kalıntı değişiklikler elastin benzeri bölgesinin çeşitlemeleri ELP omurgasına, yoluyla daha ya da biyo-aktif bölgesine değişikliklerin önemli ölçüde LCST davranışını etkileyebilir. Sonuç olarak, protein çeşitleri arasında en iyi protein verim sağlamak için bu pH, tuz konsantrasyonu ve tuz türü optimize etmek önemlidir (Örn., monovalent veya divalent) sıcak ve soğuk spin için.

Gibi kolayca önemli bir ELP kayıp herhangi bir arıtma adım sırasında oluşup oluşmayacağını belirlemek için kullanılabilir SDS-sayfa iletişim kuralı tamamlandıktan sonra çalışan öneririz. ELP sıcak bir spin takip süpernatant içinde tespit edilirse, kısaca, sonra protein etkili çöktürülmüş değil. ELPs çözündürüldükten Pelet soğuk bir spin aşağıdaki örnekte tanımlanan, benzer şekilde, sonra protein etkili bir şekilde feshedilmiştir değil.

ELP hydrogels sentetik veya doğal olarak elde edilen malzemeler birçok avantajlar sunuyor. Özellikle, Amin-reaktif crosslinker THPC kullanımı protein crosslinking ucuz, basit ve akort mekanizmasının affords. Ancak, unutulmamalıdır crosslinking iletişim kuralına farklı sınırlamalar vardır. THPC oksijen hassas olduğunu ve uygun olmayan koşullarda depolanmış olsa, hızlı bir şekilde tepki verimliliği bozulabilir. Buna ek olarak, Birincil aminler ile onun reaktivite nedeniyle THPC aminler içinde zengin proteinler medya veya hücre yüzeyinde çevreleyen ile tepki. Bu nedenle, ELP hydrogels oluşturan, bu mümkün eksojen protein olan ve bu nedenle, bir azalma crosslinking etkinliğini azaltmak için hücre Pelet ile medya kirlenmesini önlemek için önerilir. Son olarak, bu crosslinking mekanizma yok lizin kalıntılar içeren biyo-aktif bölge dizisine önler ve böylece, bazı hücre yapışkanlı motifler potansiyel tümleştirme sınırlar (Örn., IKVAV34). Bu sınırlamalar, değişiklikleri adrese ELP omurgasına azid ve bicyclononyne (BCN) ile reaksiyon ortaklarının verir yukarıda açıklanan27olarak biyo-ortogonal crosslinking için.

ELP LCST davranış hidrojel mikroyapı dikte önemli bir rol oynadığı unutulmamalıdır. LCST yukarıda sıcaklık rejimleri ELPs dışarı matris porozite etkileyebilir protein açısından zengin ve protein eksikliği aşamaları oluşumu ve matris9crosslinking verimliliği için önde gelen çözüm çökelti. ELP LCST üzerindeki fizyolojik ilgili sıcaklıklarda (~ 37 ° C) çoğu hücre kültür deneyler yaptı çünkü bu etkiler dikkate alınmalıdır. Hydrogels etkili bir şekilde crosslink ve form için bir birbirine bağlı protein ağ lizin gelen birincil Amin THPC crosslinker fiziksel olarak erişilebilir olmalıdır. ELP toplama yeterli crosslinking ulaşmadan önce ortaya çıkarsa, protein açısından zengin faz içinde sıkışıp ELPs ulaşılmaz ve böylece crosslinking içinde katılmak kurulamıyor olabilir. Bu sınırlama gidermek için bir ilk 15 dk crosslinking dönem ELP onun termal faz geçiş geçer önce hidrojel ön polietilenin sağlayan oda sıcaklığında bizim protokol gerektirir. Bu oda sıcaklığında kuluçka bir ek 15 dk kuluçka 37 ° C'de hidrojel crosslinking sonuçlandırmak için izler. Bu yordamı yeterli crosslinking ve sağlam, tekrarlanabilir jelleşme ELP malzeme için önemlidir.

Sonuç olarak, ELP kullanarak fabrikasyon Rekombinant protein hydrogels protein sıra ve bu nedenle 3D Cep microenvironment olağanüstü ayar sunuyoruz. ELP polimerler vitro ve in vivo sistemleri çok çeşitli olarak gösterilen ifade yüksek verimleri, kolayca LCST davranışlarını sayesinde, saf olmak ve biyouyumlu olmuştur. E. coli kullanımı rekombinant ana bilgisayar olarak polimer molekül ağırlığı ve fonksiyonelliği mükemmel kontrol yakınındaki açmaktadır basit ve ucuz bir yordam sağlar. Birlikte, bu teknik sağlam ayar ve tekrarlanabilirlik bırakmak için geniş bir hücre tiplerinin 3D kültür hidrojel platformu sağlar. Son olarak, bu ELP hidrojel için birçok aşağı akım biyokimyasal deneyleri qRT-PCR, Western blot, DNA ekstraksiyon ve hücre immunostaining9dahil olmak üzere mükellef bir platformdur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Yazarlar T. Palmer teşekkür ve H. Şekil 4 fare NPCs. vektör sanat sağlamak için Babu (Stanford Nöroşirürji) kullanılmış ve sunucusu tıbbi Sanat altında Creative Commons Attribution 3,0 dağıtıma açıktır Lisansı (https://creativecommons.org/ uyarlanmıştır licenses/by/3.0/legalcode). Bu eser parçası, Stanford Nano paylaşılan özellikleri (Ödülü ECCS-1542152 altında Ulusal Bilim Vakfı tarafından desteklenen SNSF), gerçekleştirildi. Üssü destek üzerinden ulusal genel tıbbi Bilimler Enstitüsü Ulusal Sağlık Enstitüleri (32 GM 008412) olarak kabul eder. C.M.M. bir NIH NRSA desteğinden önceden Doktora Bursu (F31 EB020502) ve Siebel akademisyenler Program kabul eder. S.C.H. Ulusal Sağlık Enstitüleri (U19 AI116484 ve R21 EB018407), Ulusal Bilim Vakfı (DMR 1508006) ve California Institute desteği rejeneratif tıp (RT3-07948) kabul eder. Bu araştırma Eunice Kennedy Shriver Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD), Ulusal Enstitüsü tarafından desteklenen İttifak'ın rejeneratif rehabilitasyon araştırma ve eğitim (AR3T), fon aldı Nörolojik bozukluklar ve kontur (NINDS) ve Ulusal Enstitüsü Biyomedikal görüntüleme ve Biyomühendislik (NIBIB) Ulusal Ödülü numarası P2CHD086843 altında Sağlık Enstitüleri. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri görüşlerini temsil etmiyor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Elastin-Like Protein Expression and Purification
10 cm Petri Dishes Thermo Fisher Scientific FB0875713
70% Ethanol RICCA Chemical 2546.70-1
Ammonium Sulfate Sigma-Aldrich A3920-500G
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25G
Bacto Agar Thermo Fisher Scientific 9002-18-0 
BL21(DE3)pLysS Competent Cells Invitrogen C606003
Chloramphenicol Amresco 0230-100G 
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma-Aldrich DN25
EDTA disodium salt, dihydrate Thermo Fisher Scientific O2793-500
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-4
Isopropanol Thermo Fisher Scientific A451-4
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)  Thermo Fisher Scientific BP1755-10G
Luria Broth EMD Millipore 1.10285.5007
Parafilm VWR 52858-000
Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) MP Biomedicals 195381
Sodium Chloride Thermo Fisher Scientific BP358-212
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S 8045-1KG
Syringe Filter Unit (0.22 μm) Millipore SLGP033RB
Terrific Broth Millipore 71754-4
Tris Base Thermo Fisher Scientific BP152-1
Cell Encapsulation in 3D ELP Hydrogels
0.22 μm syringe filters Millipore SLGV004SL
0.5 mm thick silicone sheet Electron Microscopy Science 70338-05
24-well tissue culture plates  Corning 353047
Disposable Biopsy Punch (2 mm) Integra Miltex 33-31
Disposable Biopsy Punch (4 mm) Integra Miltex 33-34
Disposable Biopsy Punch (5 mm) Integra Miltex 33-35
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS)  Corning 21-031-CM
No. 1 12 mm glass coverslips Thermo Fisher Scientific 12-545-80
Tetrakis(hydroxymethyl)phosphonium chloride (THPC) Sigma-Aldrich 404861-100ML
0.5% Tryspin/EDTA Thermo Fisher  15400054
Immunocytochemistry of Cells in 3D ELP Hydrogels
16% (w/v) Paraformaldehyde (PFA) Electron Microscopy Sciences 15701
Bovine Serum Albumin (BSA) Roche 3116956001
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Molecular Probes D1306 
Donkey Serum Lampire Biological Labs 7332100
Goat anti-mouse Secondary Antibody (AF488) Molecular Probes A-11017
Goat anti-rabbit Secondary Antibody (AF546) Molecular Probes A-11071
Goat Serum Gibco 16210-072
Mouse Nestin Primary Antibody BD Pharmingen 556309
Mouse Sox2 Primary Antibody Cell Signaling Technology 23064S
Nail Polish Electron Microscopy Sciences 72180
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-100ML
Vectashield Hardset Mounting Medium  Vector Labs H-1400 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking Cell-Matrix Adhesions to the Third Dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  2. Birgersdotter, A., Sandberg, R., Ernberg, I. Gene expression perturbation in vitro-A growing case for three-dimensional (3D) culture systems. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 405-412 (2005).
  3. Gómez-Lechón, M. J., et al. Long-term expression of differentiated functions in hepatocytes cultured in three-dimensional collagen matrix. Journal of Cellular Physiology. 177 (4), 553-562 (1998).
  4. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension - how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  5. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  6. Justice, B. A., Badr, N. A., Felder, R. A. 3D cell culture opens new dimensions in cell-based assays. Drug Discovery Today. 14 (1-2), 102-107 (2009).
  7. Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
  8. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and Bioengineering. 103 (4), 655-663 (2009).
  9. Madl, C. M., et al. Maintenance of neural progenitor cell stemness in 3D hydrogels requires matrix remodelling. Nature Materials. 16 (12), 1233-1242 (2017).
  10. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310 (5751), 1139-1143 (2005).
  11. Sun, Y., Villa-Diaz, L. G., Lam, R. H. W., Chen, W., Krebsbach, P. H., Fu, J. Mechanics Regulates Fate Decisions of Human Embryonic Stem Cells. PLoS ONE. 7 (5), e37178 (2012).
  12. Ehrbar, M., et al. Elucidating the Role of Matrix Stiffness in 3D Cell Migration and Remodeling. Biophysical Journal. 100 (2), 284-293 (2011).
  13. Rowlands, A. S., George, P. A., Cooper-White, J. J. Directing osteogenic and myogenic differentiation of MSCs: interplay of stiffness and adhesive ligand presentation. American Journal of Physiology - Cell Physiology. 295 (4), 1037-1044 (2008).
  14. Lampe, K. J., Antaris, A. L., Heilshorn, S. C. Design of three-dimensional engineered protein hydrogels for tailored control of neurite growth. Acta Biomaterialia. 9 (3), 5590-5599 (2013).
  15. Kilian, K. A., Mrksich, M. Directing Stem Cell Fate by Controlling the Affinity and Density of Ligand-Receptor Interactions at the Biomaterials Interface. Angewandte Chemie International Edition. 51 (20), 4891-4895 (2012).
  16. Tse, J. R., Engler, A. J. Preparation of Hydrogel Substrates with Tunable Mechanical Properties. Current Protocols in Cell Biology. , 10.16.1-10.16.16 (2010).
  17. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: A complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  18. DiMarco, R. L., Heilshorn, S. C. Multifunctional Materials through Modular Protein Engineering. Advanced Materials. 24 (29), 3923-3940 (2012).
  19. Meyer, D. E., Chilkoti, A. Purification of recombinant proteins by fusion with thermally-responsive polypeptides. Nature Biotechnology. 17 (11), 1112-1115 (1999).
  20. Aladini, F., Araman, C., Becker, C. F. W. Chemical synthesis and characterization of elastin-like polypeptides (ELPs) with variable guest residues. Journal of Peptide Science. 22 (5), 334-342 (2016).
  21. McMillan, R. A., Caran, K. L., Apkarian, R. P., Conticello, V. P. High-Resolution Topographic Imaging of Environmentally Responsive, Elastin-Mimetic Hydrogels. Macromolecules. 32 (26), 9067-9070 (1999).
  22. McMillan, R. A., Conticello, V. P. Synthesis and Characterization of Elastin-Mimetic Protein Gels Derived from a Well-Defined Polypeptide Precursor. Macromolecules. 33 (13), 4809-4821 (2000).
  23. Chung, C., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. Tetrakis(hydroxymethyl) Phosphonium Chloride as a Covalent Cross-Linking Agent for Cell Encapsulation within Protein-Based Hydrogels. Biomacromolecules. 13 (12), 3912-3916 (2012).
  24. Romano, N. H., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Matrix RGD ligand density and L1CAM-mediated Schwann cell interactions synergistically enhance neurite outgrowth. Acta Biomaterialia. 11, 48-57 (2015).
  25. Shah, M., Hsueh, P. Y., Sun, G., Chang, H. Y., Janib, S. M., MacKay, J. A. Biodegradation of elastin-like polypeptide nanoparticles. Protein Science. 21 (6), 743-750 (2012).
  26. Nettles, D. L., Chilkoti, A., Setton, L. A. Applications of elastin-like polypeptides in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 62 (15), 1479-1485 (2010).
  27. Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Tyrosine-Selective Functionalization for Bio-Orthogonal Cross-Linking of Engineered Protein Hydrogels. Bioconjugate Chemistry. 28 (3), 724-730 (2017).
  28. Zhu, D., Wang, H., Trinh, P., Heilshorn, S. C., Yang, F. Elastin-like protein-hyaluronic acid (ELP-HA) hydrogels with decoupled mechanical and biochemical cues for cartilage regeneration. Biomaterials. , 132-140 (2017).
  29. Madl, C. M., Katz, L. M., Heilshorn, S. C. Bio-Orthogonally Crosslinked, Engineered Protein Hydrogels with Tunable Mechanics and Biochemistry for Cell Encapsulation. Advanced Functional Materials. 26 (21), 3612-3620 (2016).
  30. Cai, L., Dinh, C. B., Heilshorn, S. C. One-pot synthesis of elastin-like polypeptide hydrogels with grafted VEGF-mimetic peptides. Biomater Sci. 2 (5), 757-765 (2014).
  31. Straley, K. S., Heilshorn, S. C. Independent tuning of multiple biomaterial properties using protein engineering. Soft Matter. 5 (1), 114-124 (2009).
  32. Baneyx, F. Recombinant protein expression in Escherichia coli. Current Opinion in Biotechnology. 10 (5), 411-421 (1999).
  33. Graumann, K., Premstaller, A. Manufacturing of recombinant therapeutic proteins in microbial systems. Biotechnology Journal. 1 (2), 164-186 (2006).
  34. Tashiro, K., et al. A Synthetic Peptide Containing the IKVAV Sequence from the A Chain of Laminin Mediates Cell Attachment, Migration, and Neurite Outgrowth. Journal of Biological Chemistry. 264 (27), 16174-16182 (1989).

Tags

Biyomühendislik sorunu 135 Elastin benzeri protein ELP hidrojel 3D hücre kültürü immunostaining protein ifade Rekombinant protein
Elastin benzeri Protein Hydrogels üretimi için saklama ve Immunostaining hücre 3D
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, … More

LeSavage, B. L., Suhar, N. A., Madl, C. M., Heilshorn, S. C. Production of Elastin-like Protein Hydrogels for Encapsulation and Immunostaining of Cells in 3D. J. Vis. Exp. (135), e57739, doi:10.3791/57739 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter