Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para confirmar a presença da mutação de ponto para o diagnóstico de amiloidose hereditária transtirretina, usando Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo.
Abstract
Testes genéticos são o teste mais confiável para transtirretina hereditária relacionadas com amiloidose e deve ser realizado na maioria dos casos de amiloidose transtirretina (ATTR). ATTR é uma doença rara mas fatal com fenótipos heterogêneos; Portanto, o diagnóstico é por vezes adiado. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como tratamentos emergentes, estudos de diagnósticos adequados, incluindo a transtirretina (TTR) genética teste, para confirmar os tipos e variantes de ATTR são, portanto fundamental para melhorar o prognóstico. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença de mutações pontuais TTR muito mais rápido e mais seguro do que métodos convencionais tais como borrão do Sul. Aqui, demonstramos a confirmação genética da ATTR Ala97Ser mutação, a mutação mais comum endémica em Taiwan. O protocolo é composto por quatro etapas principais: coleta de amostra de sangue total, a extração de DNA, a análise genética de todos os quatro exões TTR com PCR e sequenciamento de DNA.
Introduction
Amiloidose transtirretina (TTR) (ATTR) é a forma mais comum de amiloidose sistêmica hereditária1e pode ser causada por uma mutação autossômica dominante herdada no gene transtirretina (TTR)2. Mutações de TTR desestabilizam a estrutura da proteína tetramérica e levam a sua dissociação em monômeros que reagrupa em amiloides2. Mais de 100 mutações de TTR amiloidogénicos foram relatados em todo o mundo1. Análises genéticas com métodos de reação em cadeia (PCR) polimerase confirmam a presença da mutação de ponto TTR e têm vantagens, incluindo evitar a manipulação de sondas radioactivamente etiquetadas em comparação com o borrão do Sul3. PCR é uma técnica rápida, fácil, barata e confiável que tem sido aplicada a inúmeros campos em ciências modernas4.
O diagnóstico precoce desta doença progressiva e fatal é um desafio, dada a sua heterogeneidade fenotípica. Com o aumento da atenção e reconhecimento mais amplo sobre as manifestações iniciais de ATTR, bem como as emergentes de tratamentos5, estudos de diagnóstico apropriados, incluindo teste genético de TTR, portanto, são criticamente fundamentais para melhorar o prognóstico. Além disso, diferentes mutações estão associados com penetrância diferente do traço, idade de início, os padrões de progressão, severidade da doença, a sobrevida mediana, eficácia do transplante de fígado, ou TTR estabilizadores2,6, e graus variáveis de envolvimento neurológico e cardiológico, que têm grandes implicações para o aconselhamento genético7,8,9. Além disso, um teste genético altamente preciso é a única ferramenta que diferencia os dois tipos distintos de ATTR: hereditária (mutante) e tipo selvagem (formulário não mutantes, amiloidose sistêmica senil, SSA)7. É imperativo para confirmar os tipos de ATTR, porque as terapias variam amplamente2. Portanto, há uma necessidade crescente para descrever o protocolo gradual do teste genético de TTR.
A abordagem molecular para detectar a mutação será ilustrada usando o Ala97Ser, a mutação mais comum endémica em Taiwan, por exemplo. Modificações na etapa de extração de DNA, reduzir a quantidade das três soluções usadas e produz uma quantidade suficiente de DNA. Neste protocolo, todos os quatro exões TTR foram analisados, enquanto regiões incluindo 5' montante 3' a jusante, os promotores, os intrões, e regiões untranslated (UTR) não foram sequenciadas.
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Protocol
Os testes realizados em laboratório foi realizado em conformidade com os requisitos do clínico laboratório melhoria alterações (CLIA), de 1988, os regulamentos aprovados pela institucional Review Board de Chang Gung Memorial Hospital e Universidade (licença n º 100 - 4470A3 e 2462A3-104). Foi obtido o consentimento de todos os pacientes.
1. coleta de amostras de sangue
- Colete sangue total em tubos de EDTA-Tratado comercialmente disponíveis. Misture delicadamente e armazenar a amostra de sangue a 4 ° C até o processamento.
2. o DNA extraído do sangue periférico
Usar um Kit de extração de DNA para a extração de DNA genômica (ver Tabela de materiais).
- Adicione 10 mL de solução 1 para a amostra de sangue de 4,0 mL. Incube a amostra no gelo por 10 min.
- Centrifugar a amostra a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C. Remover e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Resuspenda o pellet em 3 mL de solução 1.
- Centrifugar a amostra a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C novamente e descartar o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 3 mL de solução 2.
- Adicione 10 µ l de solução-mãe pronase (225 mg/mL) para obter uma concentração final de 100 µ g/mL e misture bem. Incube a 37 ° C durante a noite.
- Refrigere o tubo no gelo durante 10 min. Adicionar 0,8 mL de solução 3 para a amostra e inverter a 3 - 5 vezes. Coloque a amostra no gelo por 5 min.
- Centrifugar a amostra a 3.000 x g por 15 min a 4 ° C. Transferi com cuidado o sobrenadante para um tubo de centrifuga conico estéril 15 mL.
- Adicione 6 µ l da solução estoque do RNase (10 mg/mL) para obter uma concentração final de 20 µ g/mL. Incube a 37 ° C por 15 min.
- Adicione 2,5 mL de álcool isopropílico e misturar completamente suavemente várias vezes por inversão para precipitar o DNA (fios de material branco, floculante formarão). Usando uma pipeta de grande diâmetro, transferi o dessensibilizador de DNA para um novo tubo de centrifugação de 1,5 mL.
- Centrifugar a 12.000 x g por 3 min a 4 ° C. Desprezar o sobrenadante cuidadosamente. Pellet de DNA lave adicionando 500 µ l de etanol 70%.
- Centrifugar a 12.000 x g por 1 min e descartar o sobrenadante. Ar seca pelota do ADN à temperatura ambiente. Adicione 100 µ l de DDQ2O e incubar a 65 ° C por 15 min Ressuspender o DNA.
3. quantificação de DNA genômica
Use um espectrofotômetro (consulte a Tabela de materiais) para detectar a quantidade e a qualidade do DNA genômico.
- Faça logon no computador ligado à máquina Espectrofotômetro. Abra o software.
- Inicialize a máquina espectrofotômetro:
- Clique em "Ácidos nucleicos" sobre o software de Espectrofotômetro.
- Limpe o pedestal com uma toalhita de papel descartáveis e água purificada.
- Branco o espectrofotômetro:
- Carrega 2 µ l de água filtrada no pedestal.
- Abaixe o braço superior do espectrofotómetro e clique "Em branco" para calibrá-lo.
- Quando estiver pronto, levante o braço e o pedestal com uma limpeza a seco.
- Medida da amostra:
- Clique em "DNA-50" no tipo de amostra.
- Carrega 2 µ l de amostra de DNA no pedestal.
- Abaixe o braço superior e clique em "Medida" para medir a relação A260/A280 e a concentração da amostra.
- Limpe o pedestal entre cada execução com uma limpeza e água purificada.
- Clique em "Print Screen" para coletar os dados.
4. genéticas análises de mutações
Amplifica o ADN do alvo com a PCR4. Realizar a PCR em uma reação de 25 µ l kit de mistura usando uma DNA polimerase (ver Tabela de materiais). A tabela 1 mostra o gene TTR intrônicas cartilhas.
| Gene | Sequência da primeira demão |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tabela 1. As primeiras demão intrônicas de gene TTR. (Sequência de referência NCBI: NC_000018.10)
- Adicione os reagentes na tabela 2 , a um tubo PCR de 0,2 mL.
| Componentes | Volume (µ l) | Concentração final |
| 10 x Buffer | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1.5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360 da DNA polimerase | 0.2 | 2 U/reação |
| dNTP Mix (25 mM cada) | 2 | 2 mM cada |
| Primeira demão F (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| Primeira demão R (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| Água da PCR-classe | 13,8 | - |
| Volume total | 25 | - |
Tabela 2. Condições de reação de PCR.
- Misture delicadamente e centrifugue brevemente em uma centrífuga de bancada para coletar todos os componentes para o fundo do tubo. Colocar o tubo em um thermocycler.
- Realize o PCR para 30 ciclos. Cada ciclo consiste de uma etapa de desnaturação por 30 s a 94 ° C, primeira demão recozimento por 30 s a 58 ° C e extensão do polymerase para 45 s a 72 ° C (ver quadro 3).
| Passo | Temperatura (° C) | Tempo | ciclo de |
| Desnaturação inicial | 95 | 5 min | 1 |
| Passo de desnaturação do DNA | 94 | 30 s | 30 ciclos |
| Passo de recozimento da primeira demão | 58 | 30 s | 30 ciclos |
| Etapa da extensão do polymerase | 72 | 45 s | 30 ciclos |
| Etapa de alongamento do post | 72 | 10 min | 1 |
| Final do PCR ciclismo | 4 | Por tempo indeterminado |
Tabela 3. Condições de ciclismo para amplificar produtos do PCR.
- Valide o produto do PCR visualizando com eletroforese em gel:
- Prepare um gel de agarose 1,2%:
- Misturar 1,2 g de agarose em pó com 100 mL de 0.5 x TBE num balão microwavable. Microondas por 2 min até a agarose é completamente dissolvido. Arrefecer a mistura de agarose a 55 ° C.
- Adicionar 2 µ l de uma solução de brometo de etídio (10 mg/mL) para a mistura de agarose e misture delicadamente. Despeje a mistura de agarose em uma bandeja de gel para cerca de 5 a 7 mm, em seguida, adicione o comb(s) no lugar. Deixe-o solidificar (pelo menos 30 min) e remova cuidadosamente comb(s).
- Carregar amostras e executar um gel de agarose:
- Coloque o gel e bandeja para a célula de electroforese. Preencher a célula de eletroforese com 0,5 x TBE até que o gel é coberto.
- Cuidadosamente, carregar 2 µ l de uma 100 bp DNA ladder (ver Tabela de materiais) para a um faixa do gel como marcador de tamanho molecular. Mistura de corante/amostra de carga (5 µ l do mix de produtos PCR com 1 µ l 6 x tintura de carregamento) em pistas adicionais.
- Ligue a fonte de alimentação. Funcione o gel para 25 min a 100 V.
- Remova o gel da célula de electroforese. Visualize os fragmentos de DNA sob UV luz em um sistema da imagem latente.
- Prepare um gel de agarose 1,2%:
5. sequenciamento de DNA
- Purificar os produtos de PCR usando um kit comercial e sequenciar comercialmente ou com um sequenciador automático (consulte a Tabela de materiais).
- Envie sequências de nucleotídeos para o servidor de NCBI BLAST para comparar a consulta de bancos de dados o nucleotídeo10nucleotídeo. Depois que os resultados são exibidos, realizar alinhamentos de sequência e identificar a mutação esperada.
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Representative Results
Electroforese do gel de agarose de dois pacientes e uma saudável individual revelou bandas dos tamanhos esperados, incluindo um produto PCR bp 454 para exon 4 do gene TTR (Figura 1).
Figura 1 . Eletroforese em gel retratando PCR amplificados gene TTR. Normal: um indivíduo saudável. Escada de DNA Lane m: 100 bp como marcador de tamanho molecular. Faixa 1:246 bp (exon 1). Faixa 2:292 bp (exon 2). Faixa 3:299 bp (exon 3). Faixa 4:454 bp (exon 4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arranjar em sequência direto divulgada uma substituição de T de nucleotídeos para G no exon 4 do gene TTR. Esta mutação missense resultou em uma substituição de alanina-para-serina no aminoácido posição 97 em dois pacientes. Sequência de cromatogramas destes dois pacientes e saudável são demonstradas na Figura 2.
Figura 2 . Sequenciamento de um indivíduo saudável (tipo selvagem) e um heterozigoto G > mutação T no exon 4 do gene TTR (pacientes 1 e 2). As setas nos paciente 1 e 2 do paciente cromatogramas indicam dois picos sobrepostos de cores diferentes. Os dois picos são cerca de metade da altura do resto da sequência. Esta substituição heterozigota, (G/T) é confirmado na sequência inversa, (c/a). Partes desta figura foram modificadas de uma figura no nosso anterior publicação5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Há duas etapas críticas dentro do protocolo. Em primeiro lugar, a fim de ter o número suficiente de células brancas do sangue, um espécime de hemodiluted deve ser evitada11. Em segundo lugar, o uso de primers PCR apropriados é fundamental para obter resultados fiáveis12. Usamos a ferramenta web de Primer-BLAST para projetar as primeiras demão4,13; um mínimo de 40 pares de base em cada lado dos exões TTR quatro deve ser coberto. Também corremos explosão em NCBI para verificar a especificidade dos primers.
Algumas modificações são feitas na etapa de extração de DNA. Em primeiro lugar, o montante das três soluções usadas são reduzidos. Essa modificação também produz uma quantidade suficiente de DNA e salva soluções. Em segundo lugar, isopropanol ou 100% de etanol são as duas alternativas usadas para a precipitação de DNA14,15. Comparado com o etanol, isopropanol precipita DNA à temperatura ambiente, que reduz de sal15coprecipitation de cálcio. Além disso, os tempos de precipitação mais a temperatura do congelador podem ser necessários para maximizar o rendimento de DNA15. Em terceiro lugar, buffer de TE é substituída pela água bidestilada (ddH2O) Ressuspender o DNA. A preparação de DNA neste protocolo é usada para PCR subsequente assim proteção no armazenamento não é uma preocupação. Também, EDTA vai inibir a atividade enzimática quando o DNA é usado em PCR15.
Para um menor custo e menos tempo de espera, sequenciamento e purificação de produtos PCR foram realizados por uma empresa de biotecnologia. A limitação no presente protocolo deve ser os métodos manuais, incluindo etapas de centrifugação repetidas. Foi desenvolvido um sistema de extração automatizada de ácidos nucleicos e é benéfico para reduzir o tempo de trabalho e aumentar a reprodutibilidade e qualidade dos resultados16.
Em todos os pacientes com depósitos amiloides, diagnóstico diferencial das amyloidoses sistêmica deve ser realizado. Espectrometria de massa (MS) pode ser aplicada para determinar o subunit da proteína e classificar a doença como amiloidose de cadeia leve de imunoglobulina (AL, com uma sobrevida média inferior a ATTR)17 ou transtirretina relacionados amiloidose18, 19, que direcionam a jusante de testes genéticos não pode fazer, especialmente para aqueles pacientes para os quais ATTR hereditário não inicialmente suspeitou-se19.
Análise de espectrometria de massa-baseado proteomic tem sido usado para triagem e digitação de TTR amiloidose19,20,21. Não obstante, MS sozinha não é suficiente para excluir uma mutação patogénica em pacientes com hereditária ATTR22, porque algumas das variantes TTR atípicas ou raras não podem ser separadas por análise baseada em MS dos depósitos amiloides amostras de soro ou amostra em uma laboratório clínico19,23. Além disso, erros de amostragem possível e a distribuição desigual de amiloide fibrilas podem levar a um falso negativo tecido biópsias5,21,24, dificultando a análise proteômica a jusante. Portanto, testes de DNA, o teste mais confiável para ATTR, deve ser realizada na maioria dos casos de ATTR5,22, bem como em qualquer neuropatia periférica axonal idiopática progressiva ou neuropatia de pequenas fibras dolorosa simétrica distal 25 , 26.
Outros fatores que podem relacionados a variação fenotípica para ATTR e guia direções futuras incluem modificação pós-traducional (PTMs) variantes presentes no soro e ATTR fibrila composição27,28. Embora ATTR hereditária é uma doença eurogenética, variabilidade considerável, mesmo entre aqueles com a mesma mutação ou dentro da mesma família tem sido observada27. Heterogeneidade genética sozinha não consegue elucidar o início diverso e a patologia do ATTR28. Portanto, ambos genética e proteômica métodos devem ser utilizados quando estes fatores são tidos em conta.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a Srta Wu Shin-diversão pela ajuda nos experimentos. Este estudo foi suportado por uma concessão do Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) e IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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