Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以确认存在的点突变诊断遗传性 transthyretin 淀粉样变性, 使用 Ala97Ser, 最常见的地方性突变在台湾, 作为一个例子。
Abstract
遗传检测是遗传性 transthyretin 相关淀粉样变性的最可靠的试验, 应在 transthyretin 淀粉样变性 (ATTR) 的大多数病例中进行。ATTR 是一种罕见的, 但致命的疾病与异构表型;因此, 诊断有时会延迟。因此, 随着对 ATTR 早期表现的关注和广泛的认识, 以及新的治疗方法, 适当的诊断研究, 包括 transthyretin (TTR) 基因检测, 以确认 ATTR 的类型和变种, 因此改善预后的基础。利用聚合酶链反应 (PCR) 方法进行遗传分析, 证实 TTR 点突变比传统方法 (如南方印迹) 的存在更为迅速和安全。在此, 我们展示了基因确认的 ATTR Ala97Ser 突变, 最常见的地方性突变在台湾。该协议包括四个主要步骤: 收集全血标本, dna 提取, 所有四 TTR 外显子的基因分析与 PCR, 和 DNA 测序。
Introduction
Transthyretin (TTR) 淀粉样变性 (ATTR) 是遗传性系统性淀粉样变性1的最常见形式, 可由 Transthyretin (TTR) 基因2中的常染色体显性遗传突变引起。TTR 突变破坏 tetrameric 蛋白结构的稳定, 并导致其离解成单体, 重组成淀粉样纤维2。超过 100 amyloidogenic TTR 突变已被报告全球1。用聚合酶链反应 (PCR) 方法进行遗传分析, 证实了 TTR 点突变的存在, 具有避免放射性标记探针处理与南方印迹3相比较的优点。PCR 是一种快速、简便、廉价、可靠的技术, 已应用于现代科学的众多领域4。
由于其表型异质性, 早期诊断这一进步和致命的疾病是有挑战性的。随着对 ATTR 早期表现的关注和广泛的认识, 以及新出现的治疗方法5, 适当的诊断研究, 包括 TTR 基因检测, 对于改善预后至关重要。此外, 不同的突变与不同显性的特点, 发病年龄, 进展模式, 疾病严重性, 中位生存率, 肝移植的疗效, 或 TTR 稳定剂2,6, 和不同程度的神经和心脏参与, 这对基因咨询有很大的影响7,8,9。此外, 高度准确的基因检测是唯一的工具, 区分两种不同类型的 ATTR: 遗传性 (突变) 和野生类型 (非突变体, 老年系统性淀粉样变性, SSA)7。必须确认 ATTR 的类型, 因为治疗方法相差很大2。因此, TTR 遗传试验的逐步性协议的描述越来越有必要。
以台湾最常见的地方性突变 Ala97Ser 为例, 说明了检测突变的分子方法。dna 提取步骤的修改减少了三种溶液的用量, 并产生了足够数量的 dna。在该协议中, 对所有四 TTR 外显子进行了分析, 而包括 5 ' 上游、3 ' 下游、启动子、内含子和未翻译区域 (UTR) 的区域未进行排序。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
在实验室进行的测试是根据1988年《临床实验室改善修订》 (CLIA) 的要求而进行的, 由昌热心纪念医院机构评审委员会批准的规例及大学 (执照100-4470A3 和 104-2462A3)。所有患者均获得知情同意。
1. 采血标本收集
- 将全血收集到商用的 EDTA 处理管中。轻轻混合, 将血液样本储存在4摄氏度, 直到加工。
2. 从外周血中提取 DNA
使用 dna 提取试剂盒进行基因组 dna 提取 (见材料表)。
- 在4.0 毫升血液样本中加入10毫升溶液1。在冰上孵化样品10分钟。
- 离心样品在 2000 x g 5 分钟在4°c。小心去除和丢弃上清液。并用重悬3毫升溶液1中的颗粒。
- 离心样品在 2000 x g 5 分钟在4°c 再和放弃上清。并用重悬3毫升溶液2中的颗粒。
- 添加10µL 的链霉蛋白酶库存溶液 (225 毫克/毫升), 以获得最终浓度100µg/毫升和混合良好。孵化在37°c 过夜。
- 在冰上把管子冷却10分钟. 将0.8 毫升溶液3添加到样品中, 反转 3-5 次。将样品放在冰上5分钟。
- 离心样品在 3000 x g 15 分钟在4°c。小心地将上清转移到15毫升无菌锥形离心管。
- 添加6µL 的 RNase 库存溶液 (10 毫克/毫升), 以获得最终浓度20µg/毫升。孵育37°c 15 分钟。
- 加入2.5 毫升的异丙醇, 并通过轻轻反转几次, 以沉淀 DNA (白色的股, 絮凝材料将形成) 彻底混合。使用大口径吸管, 将 DNA 沉淀转移到一个新的1.5 毫升离心管。
- 离心机在 1.2万 x g 3 分钟在4摄氏度。小心丢弃上清液。通过添加500µL 70% 乙醇来清洗 DNA 颗粒。
- 离心机在 1.2万 x g 1 分钟, 并丢弃上清。室温下的空气干 DNA 颗粒。添加100µL ddH2O 和孵化65°c 15 分钟并用重悬 DNA。
3. 基因组 DNA 量化
使用分光光度计 (见材料表) 来检测基因组 DNA 的数量和质量。
- 登录到连接到分光光度计机器的计算机上。打开软件。
- 初始化分光光度机:
- 在分光光度计软件上单击 "核酸"。
- 用一次性纸擦拭和纯净水清洁底座。
- 空白分光光度计:
- 在基座上装载2µL 纯净水。
- 降低分光光度计的上臂, 点击 "空白" 校准。
- 完成后, 抬起上臂, 用擦拭擦干底座。
- 测量样品:
- 在示例类型上单击 "DNA-50"。
- 在基座上装载2µL 的 DNA 样本。
- 下上臂, 点击 "测量" 测量 A260/A280 比和样品浓度。
- 清洁的基座之间的每一个运行与擦拭和纯净水。
- 单击 "打印屏幕" 以收集数据。
4. 突变的遗传分析
用 PCR4放大靶 DNA。使用 DNA 聚合酶试剂盒在25µL 反应混合物中进行 PCR (见材料表)。表 1显示了 TTR 基因内含子底漆。
| 基因 | 底漆序列 |
| Exon1 | F: 5 '-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3 ' R: 5 '-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3 ' |
| Exon2 | F: 5 '-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3 ' R: 5 '-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3 ' |
| Exon3 | F: 5 '-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3 ' R: 5 '-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3 ' |
| Exon4 | F: 5 '-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3 ' R: 5 '-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3 ' |
表1。TTR 基因内含子底漆.(NCBI 参考序列: NC_000018.10)
- 将表 2中的试剂添加到0.2 毫升 PCR 管中。
| 组件 | 容积 (µL) | 最终浓度 |
| 10x 缓冲器 | 2。5 | 1x |
| 氯化镁2 (25 毫米) | 1。5 | 1.5 毫米 |
| 360 GC 增强器 | 1 | - |
| 360脱氧核糖核酸聚合酶 | 0。2 | 2 U 或反应 |
| dNTP 混合 (每25毫米) | 2 | 每2毫米 |
| 底漆 F (10 µM) | 1 | 0.4 µM |
| 底漆 R (10 µM) | 1 | 0.4 µM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR 级水 | 13。8 | - |
| 总容积 | 25 | - |
表2。PCR 反应条件。
- 在台式离心机上轻轻地混合离心机, 将所有部件收集到管子的底部。把管子放在 thermocycler。
- 进行30个周期的 PCR。每个周期包括变性步骤三十年代在94°c, 底漆退火为三十年代在58°c, 并且聚合酶引伸为四十五年代在72°c (参见表 3)。
| 步 | 温度 (°c) | 时间 | 周期 |
| 初始变性 | 95 | 5分钟 | 1 |
| DNA 变性步骤 | 94 | 三十年代 | 30个周期 |
| 底漆退火步骤 | 58 | 三十年代 | 30个周期 |
| 聚合酶扩展步骤 | 72 | 四十五年代 | 30个周期 |
| 后伸长步骤 | 72 | 10分钟 | 1 |
| PCR 循环结束 | 4 | 不定 |
表3。用于扩增 PCR 产品的循环条件。
- 用凝胶电泳可视化技术验证 PCR 产品:
- 准备1.2% 琼脂糖凝胶:
- 将1.2 克琼脂糖粉与100毫升的0.5x 微波瓶混合在一起。微波2分钟, 直到琼脂糖完全溶解。将琼脂糖混合物冷却到55摄氏度。
- 加入2µL 的溴溴溶液 (10 毫克/毫升) 的琼脂糖混合物, 并轻轻搅拌。将琼脂糖混合物倒入凝胶托盘中约 5-7 毫米, 然后添加梳 (s) 到位。允许它固化 (至少30分钟), 并小心地移除梳子 (s)。
- 载入样品并运行琼脂糖凝胶:
- 将凝胶和托盘放入电泳室。用0.5x 填充电泳细胞, 直到凝胶覆盖。
- 仔细地装载2µL 100 bp 脱氧核糖核酸梯子 (参见材料表) 入胶凝体的一条车道作为分子大小标记。负载染料/样品混合物 (5 µL PCR 产品混合1µL 6x 负载染料) 进入额外的车道。
- 打开电源。在 100 v 的时候用25分钟的凝胶。
- 从电泳细胞中取出凝胶。在成像系统中, 在紫外线照射下对 DNA 片段进行可视化。
- 准备1.2% 琼脂糖凝胶:
5. DNA 测序
- 使用商业工具包和序列进行商业或自动排序器 (参见材料表) 来纯化 PCR 产品。
- 提交核苷酸序列到 NCBI 爆炸服务器, 以比较核苷酸查询到核苷酸数据库10。显示结果后, 执行序列对齐并识别预期的突变。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
琼脂糖凝胶电泳两个病人和一个健康的个人揭示了预期大小的带, 包括 454 bp PCR 产品的外显子4的 TTR 基因 (图 1)。
图 1.凝胶电泳描述 PCR 扩增 TTR 基因.正常: 健康的个体。车道 M: 100 bp DNA 梯子作为分子大小标记。车道 1: 246 bp (外显子 1)。车道 2: 292 bp (外显子 2)。车道 3: 299 bp (外显子 3)。车道 4: 454 bp (外显子 4)。请单击此处查看此图的较大版本.
直接测序揭示了 TTR 基因外显子4中 G 的核苷酸 T 取代。这无义突变导致在两个病人的氨基酸位置97的丙氨酸到丝酸的替代。图 2显示了这两名患者和一个健康个体的序列图谱。
图 2.TTR 基因 (患者1和 2) 外显子4的健康个体 (野生型) 和异型 G > T 突变的测序.箭头在患者1和患者2图谱表明两个重叠的高峰不同的颜色。两个峰值大约是序列其余部分高度的一半。这个异型替代, (克/T) 是确认的反向序列, (C/A)。这个数字的部分已经从我们以前的出版物5中的一个数字中修改过。请单击此处查看此图的较大版本.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
协议中有两个关键步骤。首先, 为了有足够数量的白细胞, 应避免 hemodiluted 标本11。其次, 使用合适的 PCR 引物是取得可靠结果12的根本。我们使用的底漆爆破 web 工具设计引物4,13;在四 TTR 外显子的每一侧至少有40基对。我们还在 NCBI 上进行爆炸检查底漆的特异性。
在 DNA 提取步骤中进行了一些修改。首先, 使用的三解决方案的数量减少。这种修改还会产生足够数量的 DNA 并保存解决方案。第二, 异丙醇或100% 乙醇是在 DNA14,15的沉淀中使用的两种替代品。与乙醇相比, 异丙醇在室温下沉淀 DNA, 降低了盐15的共沉淀。此外, 在冷冻温度下, 可能需要更长的降水时间以最大限度地提高15的 DNA 产量。三是用 TE 缓冲液代替双蒸馏水 (ddH2O) 并用重悬 DNA。该协议中的 DNA 制备用于后续 PCR, 因此对存储的保护并不令人关注。此外, EDTA 将抑制酶活性, 当 DNA 用于 PCR15。
为了降低成本和更少的等待时间, PCR 产品纯化和排序是由生物技术公司进行的。该协议的局限性应该是手动方法, 包括重复的离心步骤。开发了一种自动化的核酸提取系统, 有利于缩短工作时间, 提高结果的重现性和质量16。
在所有淀粉样蛋白沉积的患者中, 应进行系统性 amyloidoses 的鉴别诊断。质谱 (MS) 可用于确定蛋白亚基, 并将该病归类为免疫球蛋白轻链淀粉样变性 (AL, 中位存活率低于 ATTR)17或 transthyretin 相关的淀粉样变性18,19, 直接下游基因测试不可能做, 特别是为那些遗传性 ATTR 最初不怀疑19的患者。
以质谱为基础的蛋白质组学分析已用于 TTR 淀粉样变性19、20、21的筛选和分型。然而, 单 ms 并不足以排除遗传性 ATTR22患者的致病性突变, 因为一些非典型或罕见的 TTR 变种可能不会被分离的淀粉样体沉积标本或血清样品的 MS 分析临床实验室19,23。此外, 可能的取样误差, 淀粉样纤维的分布不均匀可能导致假阴性组织活检5,21,24, 使下游蛋白质组分析困难。因此, DNA 检测是最可靠的 ATTR 测试, 应在大多数情况下进行 ATTR5,22, 以及任何特发性进展轴突周围神经病变或远端对称性疼痛小纤维神经病变25,26。
其他可能与 ATTR 表型变异相关的因素和指导未来方向包括在血清和 ATTR 纤维成分27,28的转化后修饰 (PTMs) 变体。尽管遗传性 ATTR 是一种单疾病, 但在相同突变或同一家族内的变异人中, 也有相当大的变异性27。单基因异质性无法阐明 ATTR28的不同发病和病理。因此, 当考虑到这些因素时, 应利用遗传和蛋白质组学方法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢新趣吴小姐在实验中的帮助。这项研究得到了长功夫医学研究计划 (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) 和 100-4470A3, 104-2462A3, 台湾的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
