Summary
Vi præsenterer her, en protokol for at bekræfte tilstedeværelsen af punkt mutation til diagnosticering af arvelige transthyretin amyloidose, ved hjælp af Ala97Ser, den mest almindelige endemiske mutation i Taiwan, som et eksempel.
Abstract
Genetiske test er den mest pålidelige test for arvelige transthyretin relaterede amyloidose og skal udføres i de fleste tilfælde af transthyretin amyloidose (ATTR). ATTR er en sjælden men alvorlig sygdom med heterogene fænotyper; Derfor, diagnosen er undertiden forsinkes. Med stigende opmærksomhed og bredere anerkendelse på tidlige manifestationer af ATTR samt nye behandlinger, relevante diagnostiske undersøgelser, herunder transthyretin (TTR) genetiske test for at bekræfte typerne og varianter af ATTR er derfor grundlæggende at forbedre prognosen. Genetiske analyser med polymerase kædereaktion (PCR) metoder bekræfte tilstedeværelsen af TTR punktmutationer langt hurtigere og sikrere end konventionelle metoder som sydlige skamplet. Heri, vise vi genetisk bekræftelse af ATTR Ala97Ser mutation, den mest almindelige endemiske mutation i Taiwan. Protokollen omfatter fire hovedtrin: indsamling fuldblod modellen, DNA-ekstraktion, genetisk analyse af alle fire TTR exons med PCR, og DNA-sekventering.
Introduction
Transthyretin (TTR) amyloidose (ATTR) er den mest almindelige form for arvelig Systemisk amyloidose1, og kan være forårsaget af en autosomal overvejende nedarvede mutation i transthyretin (TTR) gen2. TTR mutationer destabilisere tetramert protein struktur og føre til dens dissociation i monomerer, der samler ind amyloid fibriller2. Mere end 100 amyloidogenic TTR mutationer har været rapporteret på verdensplan1. Genetiske analyser med polymerase kædereaktion (PCR) metoder bekræfte tilstedeværelsen af TTR punkt mutation og har fordele, herunder at undgå håndtering af radioaktivt mærket sonder i forhold til det sydlige skamplet3. PCR er en hurtig, nem, billig og pålidelig teknik, der er blevet anvendt på mange områder i moderne videnskaber4.
Tidlig diagnosticering af denne progressive og dødelig sygdom er udfordrende givet sin fænotypiske heterogenitet. Med stigende opmærksomhed og bredere anerkendelse på de tidlige manifestationer af ATTR samt de nye behandlinger5, er relevante diagnostiske undersøgelser herunder TTR genetiske test derfor kritisk grundlæggende at forbedre prognose. Desuden forskellige mutationer er forbundet med forskellige penetrans af træk, symptomdebut, mønstre af progression, sygdommens sværhedsgrad, median overlevelse, effekten af levertransplantation, eller TTR stabilisatorer2,6, og varierende grader af neurologisk og Kardiologisk engagement, som har store konsekvenser for genetisk rådgivning7,8,9. Desuden en meget nøjagtig genetisk test er det eneste værktøj, der adskiller de to forskellige typer af ATTR: arvelig (mutant) og vildtype (ikke-mutant form, senil Systemisk amyloidose, SSA)7. Det er bydende nødvendigt at bekræfte slags ATTR, fordi behandlingsformer varierer meget2. Derfor er der en voksende nødvendighed at beskrive trinvis protokollen af TTR genetiske test.
Den molekylære tilgang til at påvise mutationen vil blive illustreret ved hjælp af Ala97Ser, den mest almindelige endemiske mutation i Taiwan, som et eksempel. Ændringer i DNA ekstraktionstrinet reducere mængden af de tre løsninger anvendes og giver en tilstrækkelig mængde af DNA. I denne protokol, alle fire TTR exons blev analyseret, mens regioner herunder 5' opstrøms, 3' nedstrøms, initiativtagere, introns, og utranslaterede regioner (UTR) var ikke sekventeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Afprøvning udføres i laboratoriet blev gennemført i overensstemmelse med kravene i den kliniske laboratorium forbedring ændringsforslag (CLIA) i 1988, de forordninger, der er godkendt af den institutionelle Review Board af Chang Gung Memorial Hospital og Universitet (licens nummer 100 - 4470A3 og 104-2462A3). Informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.
1. blod prøvetagning
- Indsamle fuldblods til kommercielt tilgængelige EDTA-behandlede rør. Bland forsigtigt og gemme blodprøve ved 4 ° C indtil behandling.
2. DNA-ekstraktion fra perifert blod
Bruge en DNA udvinding Kit til den genomisk DNA-ekstraktion (Se Tabel af materialer).
- Der tilsættes 10 mL af løsning 1 til 4,0 mL blodprøve. Inkuber prøven i isbad i 10 min.
- Centrifugeres stikprøve på 2.000 x g i 5 min. ved 4 ° C. Fjern og kassér supernatanten omhyggeligt. Resuspenderes i 3 mL af løsning 1.
- Centrifugeres stikprøve på 2.000 x g i 5 min. ved 4 ° C igen og kassér supernatanten. Resuspenderes i 3 mL løsning 2.
- Tilsæt 10 µL af pronase stamopløsning (225 mg/mL) til at få en endelig koncentration på 100 µg/mL og bland godt. Der inkuberes ved 37 ° C natten over.
- Chill tube i isbad i 10 min. Tilføj 0,8 mL løsning 3 til prøven og invertere 3 - 5 gange. Anbring prøven i isbad i 5 min.
- Centrifugeres prøve ved 3.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Omhyggeligt overføre supernatanten til en 15 mL sterilt konisk centrifugeglas.
- Tilføj 6 µL af RNase stamopløsning (10 mg/mL) til at få en endelig koncentration på 20 µg/mL. Der inkuberes ved 37 ° C i 15 min.
- Tilføje 2,5 mL isopropylalkohol og bland grundigt ved forsigtigt invertere flere gange at udfælde DNA (tråde af hvide, flocculent materiale vil danne). Bruger en stor-bar med pipette overfoeres, overføre DNA fældningsmiddel til en ny 1,5 mL-centrifugerør.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 3 min. ved 4 ° C. Kassér supernatanten omhyggeligt. Vaske DNA pellet ved at tilføje 500 µL af 70% ethanol.
- Der centrifugeres ved 12.000 x g i 1 min og kassér supernatanten. Luft tørre DNA pellet ved stuetemperatur. Tilsæt 100 µL af Hedeselskabet2O og inkuberes ved 65 ° C i 15 min til resuspend DNA.
3. genomisk DNA kvantificering
Bruger et spektrofotometer (Se Tabel af materialer) til at registrere mængden og kvaliteten af genomisk DNA.
- Logge ind på den computer tilsluttet Spektrofotometer maskine. Åbn softwaren.
- Initialisere Spektrofotometer maskine:
- Klik på "Nukleinsyre" på Spektrofotometer software.
- Ren piedestal med en engangs papir tør og renset vand.
- Tom spektrofotometrets:
- Indlæse 2 µL af renset vand på piedestal.
- Sænke overarmen spektrofotometrets og klik på "Blank" for at kalibrere det.
- Når det er gjort, løfte overarmen og tørre piedestal med en serviet.
- Måle prøven:
- Klik på "DNA-50" på prøvetypen.
- Indlæse 2 µL af DNA-prøve på piedestal.
- Sænke overarmen og klik på "Foranstaltning" for at måle A260/A280 ratio og koncentrationen af prøven.
- Ren piedestal i mellem hver kørsel med en tør og renset vand.
- Klik på "Print Screen" for at indsamle data.
4. genetiske analyser af mutationer
Forstærke target-DNA med PCR4. Udføre PCR i en 25 µL reaktion blandingen ved hjælp af en DNA-Polymerase kit (Se Tabel af materialer). Tabel 1 viser TTR gen intronic primere.
| gen | Primer sekvens |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3' |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3' R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3' |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3' |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3' |
Tabel 1. TTR gen intronic primere. (NCBI Reference sekvens: NC_000018.10)
- Tilføje reagenserne i tabel 2 til en 0,2 mL PCR rør.
| Komponenter | Volumen (µL) | Endelig koncentration |
| 10 x Buffer | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1,5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360 DNA Polymerase | 0,2 | 2 U/reaktion |
| dNTP Mix (25 mM) | 2 | 2 mM |
| Primer F (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| Primer Rasmussen (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-grade vand | 13.8 | - |
| Samlede volumen | 25 | - |
Tabel 2. PCR reaktionsbetingelser.
- Bland forsigtigt og kort centrifugeres på en benchtop centrifuge til at indsamle alle komponenter til bunden af røret. Placer røret i en thermocycler.
- Udføre PCR for 30 cykler. Hver cyklus består af en denaturering skridt for 30 s på 94 ° C, primer udglødning for 30 s på 58 ° C og polymerase udvidelse til 45 s ved 72 ° C (Se tabel 3).
| Trin | Temperaturen (° C) | Tid | cyklus |
| Indledende denaturering | 95 | 5 min | 1 |
| DNA denaturering trin | 94 | 30 s | 30 cykler |
| Primer udgloedning trin | 58 | 30 s | 30 cykler |
| Polymerase udvidelse trin | 72 | 45 s | 30 cykler |
| Stilling brudforlængelse trin | 72 | 10 min | 1 |
| Slutningen af PCR cykling | 4 | Ubestemt |
Tabel 3. Cykling betingelser for uddybning af PCR-produkter.
- Validere PCR produkt ved at visualisere med gelelektroforese:
- Forberede en 1,2% agarosegel:
- Bland 1,2 g Agarosen pulver med 100 mL 0,5 x TBE i en mikrobølgeovn kolbe. Mikroovn i 2 min. indtil Agarosen er fuldstændigt opløst. Køle ned Agarosen blandingen til 55 ° C.
- Tilsæt 2 µL af ethidium bromid opløsning (10 mg/mL) til Agarosen blanding og bland forsigtigt. Hæld Agarosen blandingen i en gel bakke til omkring 5-7 mm, hvorefter der tilsættes comb(s) på plads. Lad den størkne (mindst 30 min.) og fjern forsigtigt comb(s).
- Indlæse prøver og køre en agarosegel:
- Sted gel og bakke ind i cellen elektroforese. Udfylde cellen elektroforese med 0,5 x TBE indtil gel er dækket.
- Omhyggeligt indlæses 2 µL af en 100 bp DNA stigen (Se Tabel af materialer) i én vognbane af gel som Molekylær størrelse markør. Belastning farvestof/prøve blandingen (5 µL PCR produkt mix med 1 µL 6 x lastning farvestof) i de ekstra baner.
- Tænd strømforsyningen. Kør gelen i 25 min. ved 100 V.
- Fjerne gel fra cellen elektroforese. Visualisere DNA fragmenter under UV-lys i et billedbehandlingssystem.
- Forberede en 1,2% agarosegel:
5. DNA-sekventering
- Rense PCR produkter ved hjælp af en kommerciel kit og sekvens kommercielt eller med en automatisk sequencer (Se Tabel af materialer).
- Indsende nukleotidsekvenser til NCBI BLAST serveren at sammenligne nukleotid forespørgslen til nukleotid databaser10. Når resultaterne vises, udføre sekvens alignments og identificere den forventede mutation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Agarosen gelelektroforese af to patienter og en sund individuelle afslørede bands af de forventede størrelser, herunder en 454 bp PCR produkt til exon 4 af TTR gen (figur 1).
Figur 1 . Gelelektroforese skildrer PCR forstærket TTR gen. Normal: en sund person. Lane M: 100 bp DNA ladder som Molekylær størrelse markør. Spor 1:246 bp (exon 1). Baner 2:292 bp (exon 2). Spor 3:299 bp (exon 3). Baner 4:454 bp (exon 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Direkte sekventering oplyst et nukleotid T substitution for G i exon 4 af TTR-genet. Denne missense mutation resulterede i en alanin til Serin substitution i aminosyre holdning 97 i to patienter. Sekvens kromatogrammer af disse to patienter og en sund person er vist i figur 2.
Figur 2 . Sekventering af en sund person (wild-type) og en heterozygous G > T mutation i exon 4 af TTR-genet (patienter 1 og 2). Pilene i Patient 1 og patienten 2 kromatogrammer angiver to overlappende toppe i forskellige farver. De to toppe er omkring halvdelen af resten af sekvensen højde. Denne heterozygous substitution, (G/T) er bekræftet i den omvendte rækkefølge, (C/A). Dele af denne figur er blevet ændret fra en figur i vores tidligere publikation5. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Der er to kritiske trin i protokollen. Først, for at have tilstrækkeligt antal hvide blodlegemer, et hemodiluted eksemplar bør undgås11. Andet, anvendelsen af passende PCR primere er grundlæggende at opnå pålidelige resultater12. Vi brugte Primer-BLAST webværktøj til at designe primere4,13; et minimum af 40 basepar på hver side af de fire TTR exons skal dækkes. Vi kører også BLAST på NCBI at kontrollere specificiteten af primere.
Der foretages nogle ændringer i DNA ekstraktionstrinet. Først, reduceres mængden af de tre løsninger anvendes. Denne ændring også giver en tilstrækkelig mængde af DNA og sparer løsninger. Andet, isopropanol eller 100% ethanol er de to alternativer anvendes i udfældning af DNA14,15. Sammenlignet med ethanol, udfældes isopropanol DNA ved stuetemperatur, hvilket reducerer coprecipitation af salt15. Derudover kan længere nedbør gange ved fryser temperaturer være nødvendigt at maksimere DNA udbytte15. For det tredje er TE buffer erstattede dobbelt destilleret vand (ddH2O) til resuspend DNA. DNA forberedelse i denne protokol bruges til efterfølgende PCR, så beskyttelse på opbevaring ikke er en bekymring. Også, EDTA vil hæmme enzymaktivitet, når DNA bruges i PCR15.
For en billigere og mindre ventetid, blev PCR produkt rensning og sekventering udført af et bioteknologivirksomhed. Begrænsning i denne protokol bør de manuelle metoder, herunder gentagne centrifugering trin. En automatiseret nukleinsyre udvindingssystem er blevet udviklet, og er til gavn for nedsættelse af arbejdstiden og øget reproducerbarhed og kvaliteten af resultater16.
Hos alle patienter med amyloid aflejringer, skal differentialdiagnosticering af systemisk amyloidoses udføres. Massespektrometri (MS) kan anvendes for at bestemme protein-underenheder og klassificere sygdommen som immunoglobulin lys-kæde amyloidose (AL, med en median overlevelse ringere end ATTR)17 eller transthyretin-relaterede amyloidose18, 19, som direkte downstream gentest ikke specielt til disse patienter for hvem arvelige ATTR ikke var i første omgang mistanke19.
Massespektrometri-baseret proteom analyse har været anvendt til screening og typning af TTR amyloidose19,20,21. MS alene er imidlertid ikke tilstrækkelig til at udelukke en sygdomsfremkaldende mutation hos patienter med arvelig ATTR22, fordi nogle af de atypiske eller sjældne TTR varianter ikke kan være adskilt af MS-baseret analyse af amyloid aflejringer modellen eller serum prøver i en kliniske laboratorium19,23. Desuden vanskeliggør muligt stikprøvefejl og den ulige fordeling af amyloid fibriller kan føre til en falsk negative væv biopsier5,21,24, downstream proteom-analyse. Derfor skal DNA-test, de mest pålidelige test for ATTR, udføres i de fleste tilfælde af ATTR5,22, såvel som i enhver idiopatisk progressive cytoskeletale perifer neuropati eller distal symmetrisk smertefulde små-fiber neuropati 25 , 26.
Andre faktorer, der kan relateret til fænotypisk variation for ATTR og guide fremtidige retninger omfatter posttranslationel modifikation (PTMs) varianter til stede i serum og ATTR fibril sammensætning27,28. Selv om arvelige ATTR er en monogenetic sygdom, er stor variation selv blandt dem med den samme mutation eller inden for samme familie blevet observeret27. Genetiske heterogenitet alene undlader at belyse forskellige debut og patologi af ATTR28. Derfor både genetiske og proteomics metoder bør udnyttes, når disse faktorer tages i betragtning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Miss Shin-sjov Wu for hendes hjælp i eksperimenter. Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling fra Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) og IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
References
- Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).
- Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).
- Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).
- Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
- Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17 (1), 178 (2017).
- Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).
- Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).
- Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).
- Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
- Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
- Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
- Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).
- Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
- Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
- Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
- Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).
- Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).
- Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).
- Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).
- Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
- Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).
- Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).
- Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).
- Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12 (9), 0183948 (2017).
- Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
- Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).
- Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
