Summary
Hier präsentieren wir ein Protokoll bestätigen das Vorhandensein von Punktmutation für die Diagnose einer erblichen Transthyretin-Amyloidose, mit Ala97Ser, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan, als Beispiel.
Abstract
Gentests ist der zuverlässigste Test für erbliche Transthyretin Amyloidose und sollte in den meisten Fällen der Transthyretin-Amyloidose (ATTR) durchgeführt werden. ATTR ist eine seltene, aber tödlichen Krankheit mit heterogenen Phänotypen; Daher wird die Diagnose manchmal verzögert. Mit zunehmender Aufmerksamkeit und breitere Anerkennung auf frühen Äusserungen der ATTR sowie aufstrebenden Behandlungen, geeignete diagnostische Studien, einschließlich der genetischen Transthyretin (TTR) zu testen, um die Typen zu bestätigen und Varianten der ATTR sind daher grundlegender Bedeutung für die Prognose zu verbessern. Genetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden bestätigen das Vorhandensein von TTR Punktmutationen sehr viel schneller und sicherer als herkömmliche Methoden wie Südlicher Fleck. Hier zeigen wir genetische Bestätigung der ATTR Ala97Ser Mutation, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan. Das Protokoll umfasst vier Hauptschritte: Sammeln von Vollblut-Probe, DNA-Extraktion, genetische Analyse der alle vier TTR Exons mit PCR und DNA-Sequenzierung.
Introduction
Transthyretin (TTR) Amyloidose (ATTR) ist die häufigste Form des erblichen systemische Amyloidose1und kann durch eine autosomal dominant vererbte Mutation im Transthyretin (TTR) gen2verursacht werden. TTR Mutationen destabilisieren die tetrameres Protein-Struktur und führen zu seiner Dissoziation in Monomere, die Amyloid-Fibrillen2setzt. Mehr als 100 Amyloidogenic TTR Mutationen wurden berichteten weltweit1. Genetische Analysen mit der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Methoden bestätigen das Vorhandensein von TTR Punktmutation und haben Vorteile, einschließlich den Umgang mit radioaktiv markierte Sonden im Vergleich zu Südlicher Fleck3zu vermeiden. PCR ist eine schnell, einfach, billig und zuverlässige Technik, die auf zahlreichen Feldern in modernen Wissenschaften4angewendet wurde.
Die Früherkennung dieser progressive und tödliche Krankheit ist schwierig, angesichts ihrer phänotypischen Heterogenität. Mit zunehmender Aufmerksamkeit und breitere Anerkennung auf den frühen Manifestationen der ATTR sowie die aufstrebenden Behandlungen5, sind entsprechende diagnostische Untersuchungen einschließlich TTR Gentest daher kritisch grundlegend für die Prognose zu verbessern. Darüber hinaus sind verschiedene Mutationen im Zusammenhang mit unterschiedlicher Penetranz des Merkmals, Erkrankungsalter, Muster der Progression, schwere der Erkrankung, mediane Überlebenszeit, Wirksamkeit der Lebertransplantation oder TTR Stabilisatoren2,6, und Variable Grad der neurologischen und kardiologischen Beteiligung, die große Auswirkungen auf die genetische Beratung7,8,9haben. Ein hochgenauer Gentest ist übrigens das einzige Werkzeug, das unterscheidet zwei verschiedenen Arten von ATTR: erbliche (mutierten) und Wildtyp (nicht mutierte Form, senile systemische Amyloidose, SSA)7. Es ist zwingend notwendig, um die Arten von ATTR, bestätigen, weil die Therapien2unterschiedlich. Daher ist eine zunehmende Notwendigkeit, das schrittweise Protokoll der TTR-Gentest zu beschreiben.
Die molekularen Ansatz zu erkennen, die Mutation wird mit Ala97Ser, die am häufigsten verwendeten endemische Mutation in Taiwan, als Beispiel veranschaulicht werden. Änderungen in der DNA-Extraktionsschritt reduzieren die Menge der drei Lösungen verwendet und liefert eine ausreichende Menge an DNA. In diesem Protokoll alle vier TTR Exons wurden analysiert, während Regionen einschließlich 5' stromaufwärts, 3' flussabwärts, Promotoren, Introns und unübersetzte Regionen (UTR) wurden nicht sequenziert.
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Protocol
Die Tests im Labor wurde gemäß den Anforderungen von den klinischen Labor Verbesserung Änderungen (CLIA) von 1988, die Vorschriften genehmigt durch die institutionelle Review Board der Chang Gung Memorial Hospital durchgeführt und Universität (Lizenz Nr. 100 - 4470A3 und 104-2462A3). Die Einwilligung wurde von allen Patienten.
1. Probe Blutentnahme
- Sammeln Sie Vollblut in handelsübliche EDTA behandelt Röhren. Vorsichtig mischen und Blutprobe bei 4 ° C bis zur Verarbeitung lagern.
(2) DNA-Extraktion aus dem peripheren Blut
Verwenden Sie den DNA-Extraktion Kit für die genomische DNA-Extraktion (siehe Tabelle der Materialien).
- Die Blutprobe 4,0 mL 10 mL der Lösung 1 hinzufügen. Inkubation der Probe für 10 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 2.000 x g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie und entsorgen Sie überstand sorgfältig. Das Pellet in 3 mL der Lösung 1 aufzuwirbeln.
- Die Probe bei 2.000 x g für 5 min bei 4 ° C wieder Zentrifugieren und überstand verwerfen. Das Pellet in 3 mL der Lösung 2 aufzuwirbeln.
- Fügen Sie 10 µL Pronase Stammlösung (225 mg/mL) um eine Endkonzentration von 100 µg/mL und gut mischen. Über Nacht bei 37 ° C inkubieren.
- Das Rohr auf dem Eis für 10 min. Add 0,8 mL der Lösung 3 zum Beispiel Chill und invertieren 3 - 5 Mal. Legen Sie Beispiel für 5 min auf Eis.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 3.000 x g für 15 min bei 4 ° C. Übertragen Sie überstand sorgfältig auf eine 15 mL sterile konische Zentrifugenröhrchen.
- Fügen Sie 6 µL RNase-Stammlösung (10 mg/mL) um eine Endkonzentration von 20 µg/mL zu erhalten. Inkubation bei 37 ° C für 15 Minuten.
- Fügen Sie 2,5 mL Isopropylalkohol und Mischung gründlich durch sanft invertieren mehrmals, DNA auszufällen (Stränge aus Weißen, flockiges Material bilden). Mit einer großen Bohrung pipettieren übertragen Sie DNA Fällungsmittel, eine neue 1,5 mL Zentrifugenröhrchen.
- Zentrifuge bei 12.000 x g für 3 min bei 4 ° C. Überstand vorsichtig zu verwerfen. Waschen Sie DNA-Pellet durch Zugabe von 500 µL 70 % Ethanol.
- 12.000 x g für 1 min zentrifugieren und überstand verwerfen. DNA-Pellet bei Raumtemperatur Lufttrocknen. Fügen Sie 100 µL DdH2O und inkubieren Sie bei 65 ° C für 15 min zur DNA aufzuwirbeln.
(3) genomischer DNA Quantifizierung
Verwenden Sie ein Spektralphotometer (siehe Tabelle der Materialien), die Quantität und Qualität der genomic DNA zu erkennen.
- Melden Sie sich bei dem Computer mit dem Spektralphotometer-Computer angeschlossen. Öffnen Sie die Software.
- Die Spektralphotometer-Maschine zu initialisieren:
- Das Spektralphotometer-Software "Nukleinsäure" anklicken.
- Reinigen Sie den Sockel mit einem Einweg-Papier abwischen und gereinigtes Wasser.
- Das Spektralphotometer leer:
- Laden Sie 2 µL des gereinigten Wassers auf dem Podest.
- Senken Sie den oberen Arm des Spektralphotometers und klicken Sie auf "Leer", um es zu kalibrieren.
- Wenn es fertig ist, heben Sie den Oberarm und trocknen Sie den Sockel mit einem Tuch.
- Messen der Probenmaterials:
- Klicken Sie auf "DNA-50" auf Probe.
- Laden Sie 2 µL DNA-Probe auf dem Podest.
- Senken Sie den oberen Arm, und klicken Sie auf "Messen", um das A260/A280-Verhältnis und die Konzentration der Probe zu messen.
- Reinigen Sie das Podest zwischen jedem Lauf mit einem Tuch und gereinigtes Wasser.
- Klicken Sie auf "Print Screen", um die Daten zu sammeln.
4. genetische Analysen von Mutationen
Die Ziel DNA mit dem PCR-4zu verstärken. Führen Sie PCR in eine 25 µL Reaktion Mischung mit einer DNA-Polymerase kit (siehe Tabelle der Materialien). Tabelle 1 zeigt das TTR-gen intronischen Primer.
| gen | Primer Sequenz |
| Exon1 | F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3 " R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3 " |
| Exon2 | F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3 " R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3 " |
| Exon3 | F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3 " R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3 " |
| Exon4 | F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3 " R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3 " |
Tabelle 1. TTR-gen intronischen Primer. (NCBI Referenzsequenz: NC_000018.10)
- Eine 0,2 mL PCR-Tube die Reagenzien in Tabelle 2 hinzufügen.
| Komponenten | Volumen (µL) | Endkonzentration |
| 10 x Puffer | 2.5 | 1 x |
| MgCl2 (25 mM) | 1.5 | 1,5 mM |
| 360 GC Enhancer | 1 | - |
| 360-DNA-Polymerase | 0,2 | 2 U/Reaktion |
| dNTP Mix (25 mM) | 2 | 2 mM |
| Grundierung F (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| Grundierung R (10 µM) | 1 | 0,4 ΜM |
| DNA (100 ng) | 2 | |
| PCR-Klasse Wasser | 13.8 | - |
| Gesamtvolumen | 25 | - |
Tabelle 2. PCR-Reaktion Zustände.
- Vorsichtig mischen und kurz Zentrifugieren auf einer Benchtop-Zentrifuge, alle Komponenten an der Unterseite des Rohres zu sammeln. Legen Sie Rohr in einem Thermocycler.
- Durchführen Sie für 30 Zyklen PCR. Jeder Zyklus besteht aus einer Denaturierung Schritt für 30 s bei 94 ° C, Grundierung glühen für 30 s bei 58 ° C und Polymerase-Erweiterung für 45 s bei 72 ° C (siehe Tabelle 3).
| Schritt | Temperatur (° C) | Zeit | Zyklus |
| Anfängliche Denaturierung | 95 | 5 min | 1 |
| DNA-Denaturierung Schritt | 94 | 30 s | 30 Zyklen |
| Primer annealing Schritt | 58 | 30 s | 30 Zyklen |
| Polymerase-Erweiterung Schritt | 72 | 45 s | 30 Zyklen |
| Post Dehnung Schritt | 72 | 10 min | 1 |
| Ende der PCR Radfahren | 4 | Unbestimmte |
Tabelle 3. Bedingungen zur Verstärkung der PCR-Produkte mit dem Fahrrad.
- Überprüfen Sie das PCR-Produkt durch die Visualisierung mit Gelelektrophorese:
- Bereiten Sie eine 1,2 % Agarosegel:
- 1,2 g Agarose-Pulver mit 100 mL 0,5 mischen X TBE in microwavable Kolben. Mikrowelle für 2 min bis die Agarose komplett aufgelöst ist. Die Agarose-Mischung auf 55 ° c abkühlen
- Die Agarose-Mischung 2 µL einer Interkalation-Bromid-Lösung (10 mg/mL) hinzufügen und vorsichtig mischen. Die Agarose-Teig in eine Gel-tiefziehschiene auf ca. 5-7 mm, dann fügen Sie die Comb(s) im Ort. Lassen Sie es zu festigen (mindestens 30 min) und entfernen vorsichtig Comb(s).
- Proben zu laden und Ausführen einer Agarose-Gels:
- Legen Sie Gel und Tablett in der Elektrophorese-Zelle. Füllen Sie die Elektrophorese-Zelle mit 0,5 X TBE bis das Gel bedeckt ist.
- Sorgfältig laden 2 µL eines 100 bp DNA-Leiter (siehe Tabelle der Materialien), in der eine Spur des Gels als molekulare Größe Marker. Last Farbstoff/Probe Mischung (5 µL des PCR-Produkt-Mix mit 1 µL 6 x laden Farbstoff) in den zusätzlichen Fahrspuren.
- Schalten Sie die Stromversorgung. Führen Sie das Gel für 25 min bei 100 V.
- Entfernen Sie das Gel aus der Elektrophorese-Zelle. Visualisieren Sie die DNA-Fragmente unter UV-Licht in ein bildgebendes System.
- Bereiten Sie eine 1,2 % Agarosegel:
(5) DNA-Sequenzierung
- PCR-Produkte mit einem kommerziellen Kit reinigen und kommerziell oder mit einem automatischen Sequenzer-Sequenz (siehe Tabelle der Materialien).
- Senden Sie Nukleotidsequenzen an den BLAST NCBI-Server die Abfrage Nukleotid Nukleotid Datenbanken10zu vergleichen. Nachdem die Ergebnisse angezeigt werden, führen Sie Reihenfolge Ausrichtungen und identifizieren Sie die erwarteten Mutation zu.
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Representative Results
Agarose-Gelelektrophorese von zwei Patienten und eine gesunde individuelle offenbarten Bands der erwarteten Größen, einschließlich ein 454 bp-PCR-Produkt für Exon 4 des TTR-Gens (Abbildung 1).
Abbildung 1 . Gelelektrophorese Darstellung PCR verstärkt TTR gen. Normal: ein gesunder Mensch. Lane M: 100 bp DNA-Leiter als molekulare Größe Marker. Bahnen 1:246 bp (Exon 1). Fahrspuren 2:292 bp (Exon 2). Bahnen 3:299 bp (Exon 3). Lanes 4:454 bp (Exon 4). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Direkte Sequenzierung ein Nukleotid T Ersatz für G in Exon 4 des Gens TTR ausgewiesen. Diese Missense-Mutation führte ein Alanin, Serin-Substitution am Aminosäure-Position 97 in zwei Patienten. Sequenz Chromatogramme von diesen zwei Patienten und einem gesunden Individuum sind in Abbildung 2gezeigt.
Abbildung 2 . Sequenzierung von einer gesunden Person (Wildtyp) und eine heterozygote G > T Mutation im Exon 4 des TTR-Gens (Patienten 1 und 2). Pfeile in die Patienten 1 und 2 Patienten Chromatogramme zeigen zwei überlappenden Peaks in verschiedenen Farben. Die beiden Gipfel sind etwa halb so hoch wie der Rest der Sequenz. Diese heterozygote Substitution (G/T) wird in umgekehrter Reihenfolge (c/a) bestätigt. Teile davon wurden von einer Figur in unseren vorherigen Veröffentlichung5geändert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Es gibt zwei wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens sollte ein Hemodiluted Exemplar um ausreichende Anzahl von weißen Blutkörperchen, vermiedene11. Zweitens ist die Verwendung von entsprechenden PCR Primer grundlegend für zuverlässige Ergebnisse12zu erhalten. Wir verwendet die Primer-BLAST-Web-Tool, um Primer4,13zu entwerfen; ein Minimum von 40 Basenpaare auf jeder Seite vier TTR Exons sollten abgedeckt werden. Wir führen auch BLAST am NCBI, die Spezifität der Primer zu überprüfen.
Einige Änderungen sind in der DNA-Extraktionsschritt. Zuerst die drei Lösungen verwendet werden reduziert. Diese Änderung ergibt sich eine ausreichende Menge an DNA auch Lösungen spart. Zweitens, Isopropanol oder 100 % Ethanol sind die beiden Alternativen in die Fällung von DNA-14,15verwendet. Im Vergleich mit Ethanol, Ausscheidungen Isopropanol DNA bei Raumtemperatur, die Coprecipitation von Salz15reduziert. Darüber hinaus sein länger Niederschlag bei Gefrierschrank Temperaturen erforderlich, um die DNA-Ausbeute15zu maximieren. Drittens ist doppelt destilliertes Wasser (DdH2O) zur DNA Aufschwemmen TE-Puffer ersetzt. Die DNA-Vorbereitung in diesem Protokoll ist für die anschließende PCR verwendet, so Schutz bei Lagerung nicht von Belang ist. EDTA hemmen Enzym-Aktivität auch, wenn die DNA in PCR15verwendet wird.
Für eine kostengünstigere und weniger Wartezeit wurden PCR-Produkt Reinigung und Sequenzierung von einem Biotechnologieunternehmen durchgeführt. Die Beschränkung in diesem Protokoll sollte die manuelle Methoden, einschließlich wiederholter Zentrifugation Schritte sein. Eine automatisierte Nukleinsäure-Extraktion-System wurde entwickelt und ist vorteilhaft für die Verkürzung der Arbeitszeit und Reproduzierbarkeit und Qualität der Ergebnisse16.
Bei allen Patienten mit Amyloid-Ablagerungen sollten Differentialdiagnose der systemischen Amyloidosen durchgeführt werden. Massenspektrometrie (MS) kann angewendet werden, um festzustellen, die Protein-Untereinheit und klassifizieren die Krankheit als Immunglobulin Lichterkette Amyloidose (AL, mit eine mediane Überlebenszeit unterlegen ATTR)17 oder im Zusammenhang mit Transthyretin-Amyloidose18, 19, welche direkte nachgelagerten Gentests vor allem für jene Patienten nicht tun kann, bei denen erbliche ATTR ursprünglich nicht19verdächtigt wurde.
Massenspektrometrie-basierte Proteomic Analysen wurde verwendet für screening und Typisierung von TTR Amyloidose19,20,21. Dennoch MS allein genügt nicht auszuschließende eine pathogene Mutation bei Patienten mit erblichen ATTR22, weil einige der atypischen oder seltene TTR Varianten nicht durch MS-basierte Analyse von Amyloid-Ablagerungen Probe oder Serum Proben in getrennt werden kann eine Klinisches Labor19,23. Darüber hinaus erschwert mögliche Stichprobenfehler und die ungleiche Verteilung von Amyloid Fibrillen führen können zu einer falschen negativen Gewebe Biopsien5,21,24, die nachgelagerten Proteomik-Analyse. Daher, DNA-Tests, der zuverlässigste Test für ATTR, sollte erfolgen in den meisten Fällen der ATTR5,22, sowie in jedem idiopathische progressive axonalen Neuropathie oder distale symmetrische schmerzhafte kleine Faser Neuropathie 25 , 26.
Andere Faktoren, die möglicherweise im Zusammenhang mit der phänotypischen Variation für ATTR und zukünftige Richtungen Reiseführer enthalten Post-translationale Modifikation (PTMs) Varianten in Serum und ATTR Fibrille Zusammensetzung27,28. Obwohl erbliche ATTR monogenetischen Krankheiten ist, hat beträchtliche Variabilität auch bei denen mit der gleichen Mutation oder innerhalb der gleichen Familie27beobachtet. Genetische Heterogenität allein schlägt fehl, die vielfältig einsetzen und Pathologie der ATTR28aufzuklären. Daher beide genetischen und Proteomics Methoden sollten genutzt werden, wenn diese Faktoren berücksichtigt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir wollen Miss Shin-Fun Wu für ihre Hilfe in den Experimenten zu danken. Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) und IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Taiwan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EDTA-treated tubes | BD | ||
| DNA Extraction Kit | Stratagen | 200600 | |
| NanoDrop ND2000 spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark | Kimtech Science Kimwipes | |
| AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit | Applied Biosystems | 4398823 | |
| TTR gene intronic primers | Exon1 | F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’ | |
| Exon1 | R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’ | ||
| Exon2 | F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’ | ||
| Exon2 | R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’ | ||
| Exon3 | F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’ | ||
| Exon3 | R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’ | ||
| Exon4 | F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’ | ||
| Exon4 | R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’ | ||
| thermocycler | Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| electrophoresis cell | ADVANCE | Mupid-2plus | |
| DNA ladder | Protech | PT-M1-100 | |
| dye | BioLabs | B7021 | |
| AlphaImager EC | Alpha Innotech | AlphaImager EC | |
| automatic sequencer | Applied Biosystems | 3730xl DNA Analyzer |
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