Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס

doi: 10.3791/57743 Published: June 9, 2018

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לאשר הנוכחות של נקודת מוטציה לאבחון של עמילואידוזיס transthyretin תורשתי, Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמא.

Abstract

בדיקה גנטית היא הבדיקה האמינה ביותר עבור transthyretin תורשתי הקשורים עמילואידוזיס צריכה להתבצע ברוב המקרים של transthyretin עמילואידוזיס (הפו). הפו היא מחלה נדירה אך קטלנית עם פנוטיפים הטרוגניות; לכן, האבחנה לפעמים מתעכב. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הגילויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולי המתעוררים, מחקרים האבחון המתאים, כולל את transthyretin (TTR) גנטי לבדוק, כדי לאשר את סוגי, ולכן הם וריאציות של הפו היסוד כדי לשפר את הפרוגנוזה. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז ולאשש את קיומן של מוטציות נקודה TTR הרבה יותר מהר ובטוח יותר מאשר בשיטות המקובלות כגון תספיג דנ א. במסמך זה, נדגים אישור גנטי של המוטציה Ala97Ser הפו, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן. הפרוטוקול כוללת ארבעה שלבים עיקריים: איסוף דגימות דם, הפקת דנ א, ניתוח גנטי של כל ארבע TTR exons עם PCR, ואת רצפי DNA.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transthyretin (TTR) עמילואידוזיס (הפו) היא הצורה הנפוצה ביותר של עמילואידוזיס מערכתית תורשתי1, עלולה להיגרם כתוצאה מוטציה דומיננטית תורשתית אוטוזומלית ג'ין transthyretin (TTR)2. מוטציות TTR יציבות מבנה החלבון tetrameric, להוביל דיסוציאציה שלה לתוך מונומרים זה ומרכיב לתוך הסיבים עמילואיד2. יותר מ-100 מוטציות TTR amyloidogenic כבר דווח על ברחבי העולם1. ניתוח גנטי עם שיטות (PCR) תגובת שרשרת של פולימראז לאשר הנוכחות של מוטציה נקודת TTR ויש יתרונות כולל הימנעות הטיפול radioactively שכותרתו הגששים בהשוואה תספיג דנ א3. PCR הוא מהיר, קל, זול ואמין טכניקה שהוחלו לשדות רבים מדעי מודרני4.

אבחון מוקדם של המחלה מתקדמת, חמורה הוא מאתגר בהתחשב הטרוגניות פנוטיפי שלה. עם הגדלת תשומת לב והכרה רחבה יותר על הביטויים המוקדמים של הפו, כמו גם טיפולים המתעוררים5, מחקרים האבחון המתאים, כולל בדיקות גנטיות TTR ולכן הם אנושות הבסיסית כדי לשפר את הפרוגנוזה. יתר על כן, מוטציות שונות קשורים עם penetrance שונים של התכונה, הגיל של תחילת, דפוסים של התקדמות, חומרת המחלה, חציון ההישרדות, היעילות של השתלת כבד, או מייצבים TTR2,6, ו מעלות משתנה במעורבות נוירולוגית, תרופות, אשר יש השלכות נהדר על יעוץ גנטי-7,-8,-9. חוץ מזה, בדיקה גנטית ומדויקים הוא הכלי היחיד אשר מבדיל בין שני סוגי הפו ברורים: תורשתי (מוטציה) וסוג הפרוע (טופס שאינו-מוטציה, עמילואידוזיס מערכתית סנילי, הסוכן המיוחד)7. זה הכרחי כדי לאשר את סוגי הפו, כי הטיפולים קיימים הבדלים2. לכן, אין הצורך הגובר לתאר את הפרוטוקול stepwise של הבדיקה הגנטית TTR.

הגישה מולקולרית כדי לזהות את המוטציה יומחשו באמצעות Ala97Ser, המוטציה אנדמיים הנפוץ ביותר בטייוואן, כדוגמה. שינויים בשלב הפקת דנ א להפחית את כמות הפתרונות שלושה בשימוש ותשואות כמות מספקת של ה-DNA. פרוטוקול זה, כל ארבע TTR exons נותחו, בעוד אזורים כולל 5' במעלה הזרם, 3' במורד הזרם, היזמים, אינטרונים, אזורים לא מתורגם (UTR) היו לא רציף.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

בדיקה שבוצעה במעבדה בוצע בהתאם לדרישות של קלינית מעבדה שיפור תיקונים (CLIA) בשנת 1988, התקנות שאושרו על-ידי מוסדיים סקירה לוח של צ'נג קונג אנדרטת החולים ו האוניברסיטה (רשיון מס ' 100 - 4470A3 ו- 104-2462A3). הסכמה מדעת היה המתקבלים לכל החולים.

1. דם דוגמה אוסף

  1. לאסוף דם לתוך צינורות שטופלו EDTA זמינים מסחרית. לערבב בעדינות, לאחסן דגימת דם ב 4 ° C עד עיבוד.

2. DNA החילוץ מדם היקפי

להשתמש ערכת חילוץ DNA להפקת DNA גנומי (ראה טבלה של חומרים).

  1. להוסיף 10 מ של פתרון 1 דגימת הדם 4.0 מ"ל. דגירה המדגם על קרח למשך 10 דקות.
  2. Centrifuge הדגימה ב g x 2,000 דקות 5-4 מעלות צלזיוס. להסיר ולמחוק את תגובת שיקוע בקפידה. Resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של פתרון 1.
  3. Centrifuge המדגם-g x 2,000 עבור 5 דקות ב 4 ° C שוב ולמחוק את תגובת שיקוע. Resuspend בגדר ב- 3 מ"ל של פתרון 2.
  4. להוסיף 10 µL של pronase מניות פתרון (225 מ"ג/מ"ל) כדי לקבל ריכוז הסופי של µg 100/מ"ל ומערבבים היטב. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  5. להרגיע את הצינורית על קרח במשך 10 דקות הוסף 0.8 מ של פתרון 3 לדגימת, היפוך 3 - 5 פעמים. במקום מדגם על קרח למשך 5 דקות.
  6. Centrifuge הדגימה ב 3000 g x למשך 15 דקות ב 4 º C. להעביר בזהירות את תגובת שיקוע שפופרת צנטרפוגה חרוט סטרילי 15 מ"ל.
  7. הוסף µL 6 בפתרון RNase מניות (10 mg/mL) כדי לקבל ריכוז סופי של 20 µg/mL. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  8. להוסיף 2.5 מ ל אלכוהול איזופרופיל, לערבב היטב על-ידי היפוך בעדינות מספר פעמים, כדי לזרז את הדנ א (קווצות חומר לבן, צימרי, דמויי אניץ יהוו). שימוש pipet נשא גדול, להעביר את precipitant DNA שפופרת צנטרפוגה 1.5 mL החדש.
  9. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור מינימום 3-4 מעלות צלזיוס. תבטל את תגובת שיקוע בקפידה. צניפה לשטוף את הדנ א על-ידי הוספת µL 500 של 70% אתנול.
  10. תגובת שיקוע צנטריפוגה-g x 12,000 עבור 1 דקות וזורקים. האוויר יבש DNA צניפה בטמפרטורת החדר. להוסיף 100 µL של ddH2O, דגירה-65 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות עד resuspend ה-DNA.

3. הדנ א כמת

להשתמש ספקטרופוטומטרים (ראה טבלה של חומרים) כדי לזהות את כמות ואיכות הדנ א הגנומי.

  1. להיכנס לתוך המחשב מחובר למכונה ספקטרופוטומטרים. פתח את התוכנה.
  2. אתחול המכשיר ספקטרופוטומטרים:
    1. לחץ על "חומצת גרעין" על התוכנה ספקטרופוטומטרים.
    2. לנקות את המעמד עם מגבון נייר חד פעמיות, מים מורתחים.
  3. בלנק ספקטרופוטומטרים:
    1. לטעון את 2 µL של מים מטוהרים על הכן.
    2. הנמך את הזרוע העליונה של ספקטרופוטומטרים ולחץ על "ריק" לכיול.
    3. כאשר זה נעשה, להרים את הזרוע ויבש את המעמד עם מגבון.
  4. למדוד את הדגימה:
    1. לחץ על "ה-DNA-50" על סוג הדגימה.
    2. לטעון µL 2 של דנ א על הכן.
    3. להוריד את הזרוע ולחץ על "מדד" כדי למדוד את היחס A260/A280, הריכוז של המדגם.
    4. לנקות את המעמד בין כל הפעלה עם מגבון, מים מורתחים.
  5. לחץ על "Print Screen" כדי לאסוף את הנתונים.

4. גנטית ניתוחים של מוטציות

להגביר את המטרה DNA עם ה-PCR4. לבצע PCR בתגובה 25 µL תערובת באמצעות של ה-DNA פולימראז קיט (ראה טבלה של חומרים). טבלה 1 מציגה הגן TTR תחל intronic.

ג'ין פריימר רצף
Exon1 F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'
R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'
Exon2 F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'
R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'
Exon3 F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3'
R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'
Exon4 F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'
R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'

טבלה 1. ג'ין TTR תחל intronic. (רצף ההתייחסות NCBI: NC_000018.10)

  1. הוסף את ריאגנטים בטבלה מס ' 2 צינור PCR 0.2 מ"ל.
רכיבים נפח (µL) ריכוז סופי
10 x מאגר 2.5 1 x
MgCl2 (25 מ מ) 1.5 1.5 מ מ
משפר GC 360 1 -
360 DNA פולימראז 0.2 2 U-תגובה
dNTP מיקס (25 מ מ כל אחד) 2 2 מ מ
פריימר F (10 מיקרומטר) 1 מיקרומטר 0.4
פריימר R (10 מיקרומטר) 1 מיקרומטר 0.4
דנ א (100 ng) 2
כיתה ה-PCR מים 13.8 -
הנפח הכולל 25 -

בטבלה 2. תנאי ריאקציה PCR.

  1. לערבב בעדינות, צנטריפוגה בקצרה על צנטריפוגה benchtop כדי לאסוף את כל הרכיבים לתחתית הצינור. הכנס צינור thermocycler.
  2. לבצע PCR 30 מחזורים. כל מחזור מורכב צעד דנטורציה עבור 30 s ב 94 ° C, פריימר חישול ב-30 s-58 ° C ופולימראז סיומת עבור 45 s ב-72 מעלות (ראו טבלה 3).
שלב טמפרטורה (° C) זמן מחזור
דנטורציה הראשונית 95 5 דקות 1
שלב דנטורציה דנ א 94 30 s מחזורים
שלב מחזק פריימר 58 30 s מחזורים
שלב ההרחבה של פולימראז 72 45 s מחזורים
שלב התארכות פוסט 72 10 דקות 1
סוף ה-PCR רכיבה על אופניים 4 לא מוגדר

בטבלה 3. תנאי הרכיבה עבור הגברה מוצרי ה-PCR.

  1. לאמת את המוצר PCR דמיין עם אלקטרופורזה בג'ל:
    1. הכנת ג'ל 1.2% agarose:
      1. מערבבים 1.2 גר' אבקת agarose עם 100 מ של 0.5 x TBE בבקבוקון שניתן לחמם במיקרוגל. מיקרוגל למשך 2 דקות עד agarose זה התפרקה לחלוטין. לקרר את התערובת agarose עד 55 מעלות צלזיוס.
      2. להוסיף התערובת agarose 2 µL של אתידיום ברומיד פתרון (10 mg/mL) ומערבבים בעדינות. שופכים את התערובת agarose לתוך מגש ג'ל שבו כ 5-7 מ מ, ולאחר מכן להוסיף את comb(s) במקום. לאפשר את לחזק (לפחות 30 דקות), הסר בזהירות comb(s).
    2. דוגמיות ולהפעיל של ג'ל agarose:
      1. המקום ג'ל ומגש לתוך התא אלקטרופורזה. למלא את התא אלקטרופורזה 0.5 x TBE עד הג'ל מכוסה.
      2. בזהירות לטעון 2 µL של דנ א. לחץ דם 100 סולם (ראה טבלה של חומרים) לנתיב אחד של הג'ל כמו סמן גודל מולקולרי. עומס לצבוע/מדגם תערובת (5 µL של תמהיל המוצרים PCR עם µL 1 6 x צבע הטעינה) לתוך מסלולים נוספים.
      3. הפעל את אספקת החשמל. הפעל את הג'ל במשך 25 דקות ב- 100 וולט.
      4. להסיר את הג'ל מהתא אלקטרופורזה. דמיינו את שברי DNA תחת אולטרא סגול בכל מערכת הדמיה.

5. רצפי DNA

  1. לטהר PCR מוצרים באמצעות ערכת מסחרי, רצף מסחרית או עם ברצף אוטומטית (ראה טבלה של חומרים).
  2. להגיש רצפי לשרת NCBI הפיצוץ כדי להשוות שהשאילתה נוקלאוטיד מסדי הנתונים של נוקלאוטיד10. לאחר הצגת התוצאות, לבצע רצף היישורים ולזהות את השינוי הצפוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Agarose בג'ל של שני חולים, אחת הלהקות חשף בריא בודדים של גודל הצפוי, כולל מוצר ה-PCR bp 454 עבור אקסון 4 של הגן TTR (איור 1).

Figure 1
איור 1 . אלקטרופורזה בג'ל המתארים PCR מוגבר TTR ג'ין. רגיל: אדם בריא. 100 מ': ליין bp סולם הדנ א כמו סמן גודל מולקולרי. מסלולים 1:246 bp (אקסון 1). מסלולים 2:292 bp (אקסון 2). מסלולים 3:299 bp (אקסון 3). נתיבים 4:454 bp (אקסון 4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

רצף ישיר גלוי נוקלאוטיד T החלפה עבור G ב אקסון 4 של הגן TTR. מוטציה זו missense הביא ההחלפה אלנין-כדי-סרין-חומצת אמינו עמדה 97 עובדים בשני חולים. Chromatograms רצף של שני חולים אלה, אדם בריא מודגמות באיור2.

Figure 2
איור 2 . רצף של אדם בריא (פראי-סוג) ו- G משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים > T מוטציה ב אקסון 4 של הגן TTR (חולים 1 ו- 2). חצים chromatograms החולה 1 ו- 2 המטופל להצביע על שתי הפסגות חופפים בצבעים שונים. שתי הפסגות הן בערך חצי הגובה של שאר הרצף. החלפה זו משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, (G/T) הוא אישר ברצף הפוך, (C/A). חלקים של איור זה שונו מן דמות הפרסום הקודם שלנו5. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ישנם שני שלבים קריטיים בתוך הפרוטוקול. ראשית, על מנת לקבל מספר מספיק של כדוריות הדם הלבנות, הדגימה hemodiluted צריך להיות נמנעה11. שנית, השימוש תחל PCR המתאים הוא היסוד כדי להשיג תוצאות אמינות12. השתמשנו בכלי האינטרנט פריימר-הפיצוץ כדי לעצב את4,תחל13; מינימום של 40 בסיסי זוגות בכל צד של exons TTR ארבע שאמור להיות מכוסה. אנחנו גם פועלים הפיצוץ NCBI לבדוק יחודיות של תחל.

כמה שיפורים מבוצעים בשלב הפקת דנ א. ראשית, כמות שלושה פתרונות שימוש מופחתים. שינוי זה גם התשואות כמות מספקת של ה-DNA ושומר פתרונות. שנית, אתנול אלכוהול איזופרופיל או 100% אינם שתי חלופות המשמשים את המשקעים של הדנ א14,15. אלכוהול איזופרופיל ארגונייט לעומת אתנול, שוקע DNA בטמפרטורת החדר, אשר מפחית את coprecipitation של מלח15. בנוסף, יותר פעמים משקעים בטמפרטורות מקפיא עשוי להיות נחוץ כדי למקסם את התשואה של הדנ א15. שלישית, מוחלף טה מאגר מים מזוקקים כפול (ddH2O) resuspend דנ א. הכנת ה-DNA של פרוטוקול זה משמש PCR עוקבות כך הגנה על אחסון היא לא דאגה. כמו כן, EDTA לעכב פעילות אנזים כאשר ה-DNA משמש ב- PCR15.

בעלות נמוכה יותר ופחות זמן המתנה, ה-PCR המוצר טיהור ורצף בוצעו על ידי חברת ביוטכנולוגיה. המגבלה של פרוטוקול זה צריך להיות השיטות הידניות, כולל צעדים צנטריפוגה חוזרות ונשנות. מערכת חילוץ חומצת גרעין אוטומטיות פותחה, ייטיב עם הפחתת זמן העבודה והגדלת הפארמצבטית והאיכות של תוצאות ה-16.

בחולים כל עם משקעי עמילואיד, לבצע אבחנה מבדלת של amyloidoses מערכתית. ספקטרומטר מסה (MS) יכול להיות מיושם לקבוע את יחידת משנה של חלבונים ולסווג את המחלה כמו עמילואידוזיס שרשרת אור אימונוגלובולינים (AL, עם נחות מקודמו 10C חציון ההישרדות)17 או עמילואידוזיס הקשורות transthyretin18, 19, אשר ישיר בדיקה גנטית במורד הזרם לא יכול לעשות, במיוחד עבור חולים אלה שעבורם הפו תורשתית לא בתחילה נחשד19.

ניתוח מבוססת ספקטרומטר מסה פרוטיאומיה מבנית שימש במשך הקרנת והקלדה של TTR עמילואידוזיס19,20,21. למרות זאת, MS לבד אינה מספיקה לא לכלול מוטציה פתוגניים בחולים עם הפו תורשתי22, כי חלק גרסאות TTR טיפוסיות או נדירים עשויים להיות מופרדים באמצעות ניתוח מבוססי MS של משקעי עמילואיד הדגימה או סרום דוגמאות מעבדה קלינית19,23. יתר על כן, טעויות דגימה אפשרי, התפלגות לא אחידה של עמילואיד הסיבים עלולה להוביל רקמות שלילי כוזב ביופסיות5,21,24, מקשה על ניתוח פרוטיאומיה מבנית במורד הזרם. לכן, בדיקות DNA, הבדיקה האמינה ביותר עבור הפו, צריכה להתבצע ברוב המקרים של הפו5,22, כמו גם בכל מתקדמת עצב היקפי נירופתיה או דיסטלי נוירופתיה סימטרית כואב סיבים קטנים 25 , 26.

גורמים אחרים ייתכן הקשורים פנוטיפי וריאציה על הפו, מדריך כיוונים לעתיד כוללים שינוי post-translational (PTMs) וריאנטים מתנה סרום, ATTR fibril הרכב27,28. למרות הפו תורשתית היא מחלה monogenetic, השתנות ניכר גם בקרב אלה עם מוטציה זהה או בתוך אותה משפחת נצפתה27. הטרוגניות גנטית לבד נכשלת התירי את תחילת מגוונים, פתולוגיה של הפו28. לכן, מבחינה גנטית, צריך להיות מנוצל פרוטאומיקס שיטות כאשר הגורמים הללו נלקחים בחשבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

אנו מאחלים תודה גברת שין-כיף וו לה עזרה בניסויים. מחקר זה נתמך על ידי מענק של תכנית המחקר הרפואי של צ'נג קונג (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) ו IRB 100-4470A3, 104-2462A3, טייוואן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA-treated tubes BD
DNA Extraction Kit Stratagen 200600
NanoDrop ND2000 spectrophotometer  Thermo Fisher Scientific NanoDrop 2000
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Kimtech Science Kimwipes
AmpliTaq Gold 360 DNA Polymerase kit Applied Biosystems 4398823
TTR gene intronic primers  Exon1 F: 5’-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3’
Exon1 R: 5’-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3’
Exon2 F: 5’-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3’
Exon2 R: 5’-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3’
Exon3 F: 5’-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3’
Exon3 R: 5’-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3’
Exon4 F: 5’-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3’
Exon4 R: 5’-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3’
thermocycler Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700
electrophoresis cell  ADVANCE Mupid-2plus
DNA ladder Protech PT-M1-100
dye BioLabs B7021
AlphaImager EC Alpha Innotech AlphaImager EC
automatic sequencer  Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Planté-Bordeneuve, V., Said, G. Familial amyloid polyneuropathy. The Lancet Neurology. 10, (12), 1086-1097 (2011).
  2. Planté-Bordeneuve, V., et al. Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study. Journal of Neurology. 264, (2), 268-276 (2017).
  3. Nichols, W. C., Benson, M. D. Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences. Clinical Genetics. 37, (1), 44-53 (1990).
  4. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. Journal of Visualized Experiments. (63), e3998 (2012).
  5. Hsu, H. C., et al. Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese. BMC Neurology. 17, (1), 178 (2017).
  6. Barroso, F. A., et al. Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years. Amyloid. 24, (3), 194-204 (2017).
  7. Rapezzi, C., et al. Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective. European Heart Journal. 34, (7), 520-528 (2013).
  8. Mariani, L. L., et al. Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France. Annals of Neurology. 78, (6), 901-916 (2015).
  9. Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).
  10. Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. NCBI BLAST: a better web interface. Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).
  11. Fox, A. J., et al. Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors. Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).
  12. Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues. Journal of the Neurological Sciences. 150, (2), 143-148 (1997).
  13. Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction. BMC Bioinformatics. 13, 134 (2012).
  14. Green, M. R., Sambrook, J. Molecular cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).
  15. Buckingham, L., Flaws, M. L. Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications. F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).
  16. Tan, S. C., Yiap, B. C. DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).
  17. Rapezzi, C., et al. Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types. Circulation. 120, (13), 1203-1212 (2009).
  18. Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis. Nature Reviews Cardiology. 12, (2), 91-102 (2015).
  19. Vrana, J. A., et al. Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics. Haematologica. 99, (7), 1239-1247 (2014).
  20. Nakamura, M., et al. Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay. Human Heredity. 49, (4), 186-189 (1999).
  21. Ueda, M., Ando, Y. Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy. Translational Neurodegeneration. 3, 19 (2014).
  22. Brown, E. E., et al. Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis. Amyloid. 24, (2), 92-95 (2017).
  23. Tasaki, M., et al. Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins. Annals of Clinical Biochemistry. 53, (4), 508-510 (2015).
  24. Plante-Bordeneuve, V., et al. Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP). Neurology. 69, (7), 693-698 (2007).
  25. Hsu, J. L., et al. A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy. PLoS ONE. 12, (9), 0183948 (2017).
  26. Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis. Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).
  27. Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition. Journal of Internal Medicine. 281, (4), 337-347 (2017).
  28. Vilà-Rico, M., et al. Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS. Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).
ניתוח גנטי של Transthyretin Ala97Ser תורשתיות הקשורות עמילואידוזיס
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).More

Hsu, H. C., Liao, M. F., Hsu, J. L., Lee, Y. L., Ro, L. S. Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis. J. Vis. Exp. (136), e57743, doi:10.3791/57743 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter