Summary
Vi beskriver en metode til at generere glmS-baseret betinget knockdown mutanter i Plasmodium falciparum bruger CRISPR/Cas9 genom-redigering.
Abstract
Malaria er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed på verdensplan. Denne sygdom, der primært påvirker dem, der lever i tropiske og subtropiske regioner, er forårsaget af infektion med Plasmodium parasitter. Udviklingen af mere effektive lægemidler til at bekæmpe malaria kan fremskyndes ved at forbedre vores forståelse af biologi af denne komplekse parasit. Genmanipulation af disse parasitter er nøglen til at forstå deres biologi; men historisk set genomet af P. falciparum har været vanskeligt at manipulere. For nylig, CRISPR/Cas9 genom-redigering er blevet udnyttet i malariaparasitter, giver mulighed for lettere protein tagging, generation af betingede protein knockdowns og sletning af gener. CRISPR/Cas9 genom-redigering har vist sig for at være et effektivt redskab for at fremme malaria forskningsfelt. Her beskriver vi et CRISPR/Cas9 metode til at generere glmS-baseret betinget knockdown mutanter i P. falciparum. Denne metode er meget tilpasningsdygtige til andre typer af genetiske manipulationer, herunder protein tagging og gen knockouts.
Introduction
Malaria er en ødelæggende sygdom forårsaget af protozo parasitter i slægten Plasmodium. P. falciparum, den mest dødbringende menneskelige malaria parasitten, der forårsager ca 445,000 dødsfald om året, for det meste i børn under en alder af fem1. Plasmodium parasitter har en indviklet livscyklus, der involverer en myg vektor og et hvirveldyr vært. Mennesker bliver først smittet, når en inficeret myg tager en blodmel. Derefter, parasitten invaderer leveren hvor det vokser, udvikler og deler sig for ca. en uge. Efter denne proces frigives parasitterne ind i blodbanen, hvor de gennemgår aseksuelle replikering i røde blodlegemer (RBC). Vækst af parasitter i de røde blodlegemer er direkte ansvarlige for de kliniske symptomer forbundet med malaria2.
Indtil for nylig var produktionen af transgene P. falciparum en møjsommelig proces, der involverer flere runder af narkotika valg, som tog mange måneder og havde en høj fejlrate. Dette tidskrævende procedure relieson pauser generation af tilfældige DNA i det pågældende område og parasitten endogene evne til at reparere sin genom selv homologe reparation3,4,5,6 . For nylig, grupperet regelmæssigt Interspaced palindromiske Repeat/Cas9 (CRISPR/Cas9) genom-redigering har med succes udnyttet i P. falciparum7,8. Indførelsen af denne nye teknologi i malaria forskning har været afgørende for at fremme forståelse af biologi af disse dødbringende Plasmodium parasitter. CRISPR/Cas9 giver mulighed for specifikke målretning af gener gennem guide RNA'er (gRNAs), der er homologe til gen af interesse. GRNA/Cas9 komplekse genkender gen gennem gRNA, og Cas9 derefter introducerer en dobbelt-strenget pause, tvinger indledningen af reparations-mekanismer i organismen9,10. Da P. falciparum mangler maskiner for at reparere DNA bryder igennem ikke-homologe ende sammenføjning, det udnytter homologe rekombination mekanismer og integrerer transfekteret homologe DNA skabeloner for at reparere Cas9/gRNA-induceret dobbelt-strenget break11,12.
Her præsenterer vi en protokol for generation af betingede knockdown mutanter i P. falciparum bruger CRISPR/Cas9 genom-redigering. Protokollen viser brugen af glmS ribozym til betinget knockdown protein niveauer af PfHsp70x (PF3D7_0831700), en anstandsdame eksporteret af P. falciparum i vært RBC13,14. GlmS ribozym aktiveres ved behandling med glucosamin (som konverteres til glucosamin-6-fosfat i celler) for at kløve dens tilknyttede mRNA, fører til en reduktion i protein14. Denne protokol kan tilpasses nemt for at udnytte andre betinget knockdown værktøjer, såsom destabilisering domæner eller RNA aptamers4,5,15. Vores protokoloplysninger generation af en reparation plasmid bestående af hemagglutinin (HA) tag og glmS ribozymer kodende sekvens flankeret af sekvenser der er homologe til den PfHsp70x åben behandling ramme (ORF) og 3'-UTR. Vi beskriver også generation af en anden plasmid at drive udtryk for gRNA. Disse to plasmider, sammen med en tredje, som drev udtryk for Cas9, er transfekteret i røde blodlegemer og bruges til Rediger genomet af P. falciparum parasitter. Endelig vil vi beskrive en Polymerasekædereaktionen (PCR)-baseret teknik for at kontrollere integration af tag og glmS ribozym. Denne protokol er meget tilpasningsdygtige til ændring eller komplet knockout af enhver P. falciparum gener, forbedre vores evne til at generere nye indsigter i biologi af malaria parasitten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kontinuerlig kultur af P. falciparum kræver brug af humane roede blodlegemer, og vi udnyttet kommercielt købte enheder af blod, der blev frataget alle id'er og anonymiseret. Den institutionelle Review Board og Office biosikkerhed på University of Georgia gennemgået vores protokoller og godkendt alle protokoller, der bruges i vores laboratorium.
1. at vælge en gRNA sekvens
- Gå til CHOPCHOP (http://chopchop.cbu.uib.no/) og vælg ' Fasta mål '. Under 'Mål', indsætte de 200 basepar fra 3'-enden af åben behandling ramme (ORF) af et gen og 200 basepar fra starten af det gen 3'-UTR. Under 'In', Vælg 'P. falciparum' (3D 7 v3.0), og vælg ' CRISPR/Cas9 ' under 'Using'. Næste, klik på ' Find Target websteder '.
- Vælg en gRNA sekvens indstillinger præsenteret, at give fortrinsret til de mest effektive gRNA, der er tættest på webstedet for ændring og der har de færrest off-målwebsteder.
Bemærk: Potentielle gRNA sekvenser identificeres, fordi de er umiddelbart opstrøms for en Protospacer tilstødende motiv (PAM), som er nødvendig for ansættelse af Cas9 til DNA. Den sekvens, som er klonet i pMK-U6, den vektor, der driver gRNA udtryk, er de 20 baser umiddelbart opstrøms i PAM. PAM specifikke for S. pyogenes Cas9 er nucleotidsekvensen NGG og bør ikke indgå i den rækkefølge, der er klonet i pMK-U6.
Bemærk: CHOPCHOP visuelt rangerer gRNA sekvenser, vise de bedste muligheder i grøn, de mindre ideelle muligheder i rav og de værste muligheder i rød. CHOPCHOP giver hver gRNA sekvens en effektivitet score, der beregnes ved hjælp af de mest up-to-date parametre findes i litteraturen, og de forudsige off målwebsteder, der kan genkendes af gRNA. To eller tre gRNA sekvenser skal forsøges at finde gRNA bedst egnet til en bestemt gen. - Køb gRNA sekvens og omvendt-komplementet som polyacrylamid gelelektroforese-renset oligos. GRNA sekvensen bruges til at målrette PfHSP70x findes i figur 1B.
Bemærk: Denne oligo bør omfatte 15 basepar homologe til plasmid gRNA-udtryk, der er nødvendige for sekvens og ligatur-uafhængig kloning (SLIC) ind i pMK-U6 vektor16.
2. kloning gRNA sekvens i pMK-U6
-
Fordøje pMK-U6 med BtgZI.
- Digest 10 μg af pMK-U6 med 5 μl af BtgZI enzym (5.000 enheder/mL) i 3 timer ved 60 ° C. Følg fabrikantens enzym protokol for reaktionsbetingelser.
- Efter inkubationstid 3 h skal du tilføje et ekstra 3 μL af BtgZI til reaktion at sikre komplet foraskning af plasmidet. Fordøje for en yderligere 3 h, stadig følge producentens anvisninger for at sikre de korrekte reaktionsbetingelser.
- For at rense den fordøjede pMK-U6 fra reaktionen, skal du bruge en kolonne-baserede PCR oprydning kit ifølge producentens anvisninger.
- Adskille fordøjet DNA ved hjælp af en 0,7%-agarosegel og udtrække 4.200-basepar band.
-
Anneal oligos indeholdende gRNA sekvens.
- Rekonstruere den side-renset oligos til en koncentration på 100 μM bruger nukleasen-gratis vand.
- Kombiner 10 μL af hver oligo med 2,2 μl af 10 x buffer 2 (Se Tabel af materialer). Sikre at den samlede reaktion volumen er 22,2 μL.
- Køre gRNA udglødning program i en thermocycler: trin 1: 95 ° C, 10 min. trin 2: 95 ° C, 1 s, med en reduktion i temperatur på 0,6 ° C/cyklus; trin 3: gå til trin 2, 16 gange; trin 4: 85 ° C, 1 min; trin 5: 85 ° C, 1 s, med en reduktion i temperatur af 0,6 ° C/cyklus; trin 6: gå til trin 5, 16 gange; trin 7: 75 ° C, 1 min; trin 8: 75 ° C, 1 s, med en reduktion i temperatur på 0,6 ° C/cyklus; trin 9: gå til trin 8, 16 gange. Trin 10-21: Gentag den procedure, der anvendes i trin 4 – 9, indtil temperaturen når 25 ° C; trin 22:25 ° C, 1 min.
-
Indsæt udglødet gRNA oligos i BtgZI-fordøjet og gel-renset pMK-U6 plasmid.
- Kombiner 100 ng af fordøjet pMK-U6 med 1 μl af 10 x buffer 2.1 og 3 μL af udglødet gRNA oligos. Øge lydstyrken til 9,5 μL med nukleasen-gratis vand.
- Tilsæt 0,5 μL af T4 polymerase og inkuberes reaktion ved stuetemperatur til 2,5 min.
- Flytte reaktion på is og inkuberes i 10 min.
- Straks forvandle 5 μl af reaktion i kompetente E. coli efter bakterier leverandørens anvisninger. Plade bakterier på Lysogeny bouillon (LB) agar plader der indeholder 100 μg/mL Ampicillin.
- Tillad de transformerede bakterier til at vokse ved 37 ° C natten over, så vælg kolonier og udtrække DNA med en kommercielt tilgængelig plasmidet miniprep kit.
3. designe homologi regioner af skabelonen reparation
-
Design skjold mutationer i skabelonen homologi reparation at forhindre re opskæring af DNA, der er integreret i genomet.
Bemærk: Et skjold mutation består typisk af at indføre en tavs mutation for at ændre PAM, så Cas9 ikke vil fremkalde en pause i skabelonen reparation. PAM kræves for Cas9 anvendes i denne protokol er nucleotidsekvensen "NGG", hvor "N" er enhver nukleotid. Hvis det er muligt at ændre en af G nukleotider til en A, C eller T.- Hvis PAM ikke kan være lydløst muteret, indføre mindst 2 tavs mutationer i de 6 basepar støder direkte op til PAM7,8.
Bemærk: Disse mutationer vil forhindre anerkendelse af skabelonen reparation af gRNA og forhindre re opskæring af den reparerede locus af Cas9/gRNA komplekse. Skjold mutationer kan indføres i regionen homologi ved at forstærke DNA med primere, der indeholder mutationen.
- Hvis PAM ikke kan være lydløst muteret, indføre mindst 2 tavs mutationer i de 6 basepar støder direkte op til PAM7,8.
-
Forstærke ORF homologi region for skabelonen reparation.
- Ved hjælp af PCR, forstærke 800 basepar fra 3'-enden af target-genet ORF. Design primere, der skal bruges til at udelukke stop-codon fra denne amplikon.
- Design primere for indsættelse af denne amplikon i den pHA -glmS der har været fordøjes med SacII og AfeI gennem enten en DNA ligatur reaktion eller skive16.
-
Forstærke 3'-UTR homologi region for skabelonen reparation.
- Ved hjælp af PCR, forstærke de 800 basepar umiddelbart efter stop-codon af target-genet. Design primere for indsættelse af denne amplikon i den pHA -glmS der har været fordøjes med HindIII og NheI gennem enten en DNA ligatur reaktion eller skive16.
Bemærk: Højt på indholdet af P. falciparum genom kan gøre forstærkning i regioner såsom UTRs vanskelig. En alternativ fremgangsmåde til ved hjælp af PCR syntese homologi regioner.
- Ved hjælp af PCR, forstærke de 800 basepar umiddelbart efter stop-codon af target-genet. Design primere for indsættelse af denne amplikon i den pHA -glmS der har været fordøjes med HindIII og NheI gennem enten en DNA ligatur reaktion eller skive16.
4. kloning homologi regioner i reparation Plasmid
-
Indsæt pHA -glmSORF homologi region.
- Fordøje pHA -glmS med SacII og AfeI, ifølge enzym producentens anvisninger. Indsæt ORF homologi region PCR produkt i den fordøjede plasmid ved hjælp af skive16.
- Omdanne kompetente E. coli , som udføres i trin 2.3.4 og 2.3.5.
-
Indsætter en pHA-glmS plasmid, der allerede indeholder ORF homologi region 3'-UTR homologi region (Se trin 4.1).
- Fordøje plasmid med HindIII og NheI ifølge enzym producentens anvisninger. Sæt 3'-UTR homologi region amplikon i den fordøjede plasmid ved hjælp af skive16.
- Omdanne kompetente E. coli og udtrække plasmid DNA (trin 2.3.4 og 2.3.5).
5. fældningen DNA for Transfektion
- Tilføje 40 μg af pMK-U6, pUF1-Cas9 og pHA -glmS DNA (for i alt 120 μg DNA) ind i en sterile 1,5 mL microcentrifuge rør.
- Tilføj 1/10th volumen af DNA 3 M natriumacetat i vand (pH 5,2) til røret og bland det godt med en vortex (f.eks., Hvis diskenheden i trin 5.1 var 100 μL, tilføje 10 μL natriumacetat).
- Tilføje 2,5 gange volumen af 100% ethanol til røret og bland det godt ved hjælp af en vortex for mindst 30 s (f.eks., hvis mængden i 5.1 var 100 μL, tilføje 250 μL 100% ethanol).
- Røret anbringes på is eller ved-20 ° C i 30 min.
- Centrifugeres tube på 18,300 x g i 30 min. ved 4 ° C.
- Fjern forsigtigt supernatanten fra røret. Lave ikke forstyrre pelleten.
- Tilsæt 3 gange mængden af 70% ethanol til røret og bland det kort ved hjælp af en vortex (fx., hvis mængden i 5.1 var 100 μL, tilsættes 300 μl af 70% ethanol).
- Centrifugeres tube på 18,300 x g i 30 min. ved 4 ° C.
Bemærk: Dette trin skal udføres under sterile forhold i en biologisk sikkerhed kabinet. - Fjern forsigtigt supernatanten fra røret. Lave ikke forstyrre pelleten. Forlader røret åbent og tillade pellet blive tør til 15 min.
- Gemme de udfældede DNA ved-20 ° C, indtil det er nødvendigt for Transfektion.
6. isolering af humane roede blodlegemer fra fuldblod som forberedelse til Transfektion
- Alikvot frisk blod ind i sterile 50 mL konisk rør (ca. 25 mL pr tube).
- Der centrifugeres rør ved 1,088 x g i 12 min, med centrifuge bremser sat til 4.
- Opsug off supernatanten og buffy coat. Resuspenderes RBC med et lige saa stort volumen af ufuldstændig RPMI.
Bemærk: Ufuldstændige RPMI er forberedt ved at supplere RPMI 1640 med 10.32 μM thymidine, 110.2 μM hypoxanthine, 1 mM natrium pyruvat, 30 mM natriumbikarbonat, 5 mM HEPES, 11,1 mM glukose og 0,02% (v/v) gentamicin. - Gentag trin 6.2-6.3 to gange. Efter den sidste vask, resuspend de røde blodlegemer i et lige saa stort volumen af ufuldstændig RPMI og gemme rør ved 4 ° C.
7. transfecting røde blodlegemer med CRISPR/Cas9 plasmider (skal ske aseptisk)
Bemærk: P. falciparum kulturer vedligeholdes som beskrevet i andre rapporter17. Opretholde alle kulturer ved 37 ° C under 3% O2, 3% CO2og 94% N2 , medmindre andet er angivet. Når blod er brugt i denne protokol, henviser det til de rene røde blodlegemer forberedt i trin 6. Blodet anvendes bør ikke ældre end 6 uger, som der er typisk et fald i parasit spredning i ældre blod. De følgende trin beskriver pre lastning RBC med DNA og tilføje en parasit kultur til de transfected celler. Andre etablerede Transfektion protokoller er kompatible med transfecting disse konstruktioner18,19.
- Forberede en 1 x cytomix buffer i vand (120 mM KCl, 0,15 mM CaCl2, 2 mM EGTA, 5 mM MgCl2, 10 mM K2HPO4, 25 mM HEPES, pH 7,6). Filter-sterilisere bufferen ved hjælp af et 0,22 μm filter.
- Tilføje 380 μL 1 x cytomix til DNA udfældet i trin 5, og vortex at opløse. Tillad DNA til at opløses i 1 x cytomix i 10 minutter, vortexing alle 3 min til 10 s.
- I en steril 15 mL konisk slange, kombinere 300 μL af røde blodlegemer (50% hæmatokrit, fra trin 6) i den ufuldstændige RPMI med 4 mL af 1 x cytomix.
- Der centrifugeres RBC fra trin 7.3 på 870 x g i 3 min, og supernatanten fra RBC pellet.
- Resuspend RBC pellet med DNA/cytomix blanding fra trin 6.2 og overførsel til en 0,2 cm elektroporation kuvette.
- Electroporate de røde blodlegemer ved hjælp af følgende betingelser: 0,32 kV, 925 μF, kapacitans sat til "Høj Cap" og modstand sat til "Uendeligt".
- Efter elektroporation, overføre indholdet fra kuvette til en 15 mL konisk der indeholder 5 mL af komplet RPMI (cRPMI). Centrifugeres tube på 870 x g i 3 min. ved 20 ° C, og derefter dekanteres.
Bemærk: cRPMI er forberedt gennem den samme metode som ufuldstændige RPMI med tilsætning af 0,25% (w/v) lipid-rige bovint serumalbumin. - Resuspenderes i 4 mL af cRPMI og overførsel til en brønd i en 6-godt vævskultur plade. Tilsæt 400 μL af en høj-schizont kultur (7-10% schizont parasitemia er ideelt) til de transfected røde blodlegemer.
Bemærk: Parasitemia er defineret som procentdelen af parasit-inficerede RBC. - Den næste dag, vaske kultur med 4 mL af cRPMI. Centrifugeres kultur på 870 x g i 3 min og Opsug supernatanten. Resuspend kultur i 4 mL af cRPMI.
- 48 timer efter endt skridt 7,6, vaske kultur med 4 mL af cRPMI. Derefter resuspend kultur i cRPMI indeholdende 1 μM DSM1 at vælge for Cas9 plasmid.
-
Fortsætte med vask kulturer hver dag med cRPMI indtil parasitter er ikke længere synlige ved blod smear. Efter dette tidspunkt, erstatte næringssubstratet med friske cRPMI plus 1 μM DSM1 hver 48 timer.
- At gøre en blod, smøre, tilsæt 150 μl af kultur i en 0,6 mL-centrifugerør. Sammenpresse cellerne ved centrifugering ved 1.700 x g i 30 s.
- Opsug off supernatanten. Bruge en pipette til at overføre de pelleted celler til et glas dias. Ved hjælp af et andet glas dias afholdt i en 45° vinkel til det første dias, smøre blodet slipværktøjet. Pletten dias ved hjælp af en kommercielt tilgængelig farvning kit efter producentens protokol.
- Se parasitter ved hjælp af en 100 X oliebestandighedsobjektet.
- Begynder 5 dage efter Transfektion (skridt 7,6), fjerne 2 mL af kulturen med røde blodlegemer genopslemmes i dyrkningsmediet. Tilføje tilbage 2 mL frisk medium (cRPMI plus 1 μM DSM1) og blod på 2% hæmatokrit. Tilføj frisk blod på denne måde, når en uge indtil parasitter forsvundet, som bestemmes af tynde blodet smear (trin 7.11).
Bemærk: Hvis integration er vellykket, parasitter normalt igen i kulturen af en måned efter Transfektion. - Når parasitter reemerge, fjerne DSM1 drug pres. Alternativt, fjerne drug pres efter parasitter er blevet klonet ud.
8. kontrol parasitter for Integration af skabelonen reparation
- Når parasitter kan ses igen ved at tynde blodet smear, isolere DNA fra kultur ved hjælp af en passende kit.
-
Bruge PCR til at forstærke den modificerede region af genom til at bestemme hvis den målrettede locus er blevet ændret og den umodificerede vildtype locus (vejledende af vildtype parasitter) er påviselige.
- For at påvise parasitter, der har integreret reparation skabelon, brug en forward primer, der sidder i begyndelsen af ORF, uden for regionen klonede homologi. Brug en reverse primer, der sidder i 3'-UTR.
Bemærk: Da denne forstærkning omfatter sekvenser af HA tags og glmS ribozym, amplikoner fra integreret parasitter vil være længere end den samme region forstærkes i wild-type parasitter.
- For at påvise parasitter, der har integreret reparation skabelon, brug en forward primer, der sidder i begyndelsen af ORF, uden for regionen klonede homologi. Brug en reverse primer, der sidder i 3'-UTR.
9. kloning parasitter ved at begrænse fortynding
-
Udføre serielle fortyndinger af parasitten kultur fra trin 7.13 at opnå en endelig koncentration på 0,5 parasitter/200 μl. Tilføje 200 μl af de fortyndede kultur brønde i en 96-brønd vævskultur plade.
Bemærk: Fordi parasitemia defineres som procentdelen af inficerede RBC og hæmatokrit er også et defineret antal (2%), antallet af parasitter pr rumfang nemt udledes.- Forberede 1 mL af kultur i cRPMI på 5% parasitemia og 2% hæmatokrit (på disse parasitemia og hæmatokritværdi niveauer, kulturen indeholder 1 x 107 parasitter/mL).
- Fortynde denne kultur 1: 100 med cRPMI. Fortynd igen 1: 100 med cRPMI.
- Fortyndes 1: 400. Udføre denne fortynding ved at tilføje 62,5 μL af kultur til 25 mL cRPMI og 1 mL blod. Denne fortynding resultater i den ønskede koncentration af 0,5 parasitter/200 μl.
-
Vedligeholde kloning pladen indtil parasitter er påviselige i brøndene.
- Hver 48 h, erstatte medium i 96-brønd plade med friske medium.
- En gang om ugen, starter 5 dage efter starten på kloning pladen (trin 9.1), fjerne 100 μL fra hver brønd og tilføje tilbage 100 μL af frisk medium + blod (2% hæmatokrit).
-
Identificere eventuelle brønde, der indeholder parasitter.
- 96-brønd pladen anbringes i en 45° vinkel for ca 20 min, tillader blodet at bosætte sig i en vinkel i pladen.
- 96-brønd pladen anbringes på en lyskasse. Bemærk, at de brønde, der indeholder parasitter medie, som er gul i farven, sammenlignet med den pink media parasit-fri brønde, på grund af forsuring af medium af parasitter.
- Bruger en serologisk pipette, flytte indholdet af de parasit-holdige brønde til en 24-godt vævskultur plade til at give mulighed for udvidelse af parasitemia.
- Ved hjælp af PCR analyse som beskrevet i trin 8, Kontroller disse klonede parasit linjer for korrekt integration.
10. knockdown af Protein ved at behandle parasitter med Glucosamin og bekræftelse via Western Blot analyse
- Forberede en 0,5 M GlcN (glucosamin) stamopløsning, som kan opbevares ved-20 ° C.
- Føje GlcN til glmS parasit kulturer og tillade dem at vokse ved tilstedeværelse af GlcN.
NOTE: Den endelige koncentration og timing af GlcN behandling afhænger linjen eksperiment og parasit. GlcN kan påvirke parasit vækst, så forældrenes parasit stamme skal udsættes for en række af GlcN koncentrationer at fastslå dens følsomhed over for stoffet. En koncentration af 2.0-7,5 mM GlcN er ofte anvendte13,14,20. - Isolere protein prøver fra GlcN-behandlet parasitter13.
-
Bruge protein prøver til western blot analyse for at opdage reduktioner i protein13.
- Bruge en anti-HA antistof ifølge producentens anvisninger til at opdage den HA-glmS-mærkede protein. Sammenlign HA bandet til en loading kontrol, såsom PfEF1α.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En skematisk af plasmider brugt i denne metode samt et eksempel på et skjold mutation er vist i figur 1. Som et eksempel på hvordan man kan identificere mutant parasitter efter Transfektion er resultater fra PCR'er for at kontrollere integration af HA -glmS konstruktionen vist i figur 2. Et repræsentativt billede af en kloning plade er vist i figur 3 at demonstrere farveændring af medium tilstedeværelse af parasitter. Resultater fra en immunofluorescens assay og western blotting forsøg er vist i figur 4 at påvise funktionaliteten af HA tag og glmS-baseret reduktioner af proteiner i parasitter. Figur 5 viser manglende evne til korte homologi arme på PCR produkter at ændre parasit genomer og få levedygtigt mutanter.
Figur 1: oversigt over vores tre-plasmid tilgang til CRISPR/Cas9 og eksempler på en gRNA oligo og skjold mutation. (A) skemaer af Tom pHA-glmS og pMK-U6 er vist med de restriktion enzym steder anvendes til kloning. Også vist er pHA-glmS og pMK-U6 efter homologi arme og gRNA sekvenser er blevet klonet ind i dem, henholdsvis. Endelig, pUF1-Cas9 er vist. yDHOD = gær dihydrofolatreduktase, modstand markør til DSM1. (B) den fremadrettede oligo anvendes til kloning PfHsp70x gRNA sekvens i pMK-U6 er vist, med gRNA rækkefølgen, store bogstaver og pMK-U6 homologi arme nødvendige for kloning med små bogstaver (øverst). PfHsp70x gRNA genomisk målet er vist som den nedstrøms PAM, rød (i midten). Skjold mutation i PfHsp70x gRNA PAM er vist med rødt (nederst). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: skematisk af CRISPR/Cas9 genom ændring ved hjælp af pHA-glmS og en strategi for at bekræfte integration. (A) Cas9, guidet til en genomisk locus af en gRNA inducerer en dobbeltstrenget pause i DNA. Parasitten reparerer skader gennem dobbelt crossover homologe reparation, ved hjælp af pHA-glmS plasmid som en skabelon og at indføre HA-glmS sekvens i genomet. (B) en PCR test for at identificere korrekte integration af HA-glmS sekvens. Ved hjælp af primere P1 og P2, er 3' ORF af wild-type PfHsp70x og PfHsp70x -glmS mutanter forstærket13. Amplikon fra PfHsp70x-glmS er længere end wild-type på grund af indsættelse af HA-glmS sekvens. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: identifikation af brønde, der indeholder parasitter i en 96-brønd kloning plade. (A) 96-brønd pladen er sat i en 45 ° vinkel i ca 20 min. til at tillade blodet at bosætte sig i en vinkel i pladen. (B) nå til venstre indeholder en parasit kultur, anført af den gule farve af medium i forhold til den pink medium af parasit-gratis godt på højre. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: en immunofluorescens analyse viser den korrekte HA-mærkning af PfHsp70x, og Western blotting reduktion af PfHsp70x protein niveauer under behandling med glucosamin. (A) PfHsp70x -glmS parasitter blev fast og farves med DAPI (nucleus markør) og antistoffer til HA og MAHRP1 (membran forbundet histidin rige Protein 1, en markør af protein eksport til værten RBC)13. (B) PfHsp70x -glmS parasitter blev behandlet med 7.5 mM glucosamin, og hele-parasit lysates blev brugt til Western blotting analyse13. Membranen blev aftestede med antistoffer til HA og PfEF1α som en loading styre13. Som forventet, resulterede glucosamin behandling i en reduktion af protein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: ved hjælp af korte homologi sekvenser for reparation. (A) skematisk fremstilling viser knockout af normal god landbrugspraksis i B7 parasitter21. B7 parasitter er et derivat af 3D 7 hvor Plasmepsin II er blevet mærket med normal god landbrugspraksis. PCR produkter indeholdende 50, 75 eller 100 basepar af normal god landbrugspraksis homologi regioner flankerende en blasticidin S modstand kassette (mærket "markør"), sammen med pUF1-Cas9-eGFP-gRNA, et plasmid, udtrykker Cas9 og en normal god landbrugspraksis gRNA, var transfekteret i B7 parasitter. Hver Transfektion blev udført to gange. DSM1 drug pres blev anvendt 2 dage efter Transfektion. (B) vises her er PCR-test på DNA isoleret fra transfekteret parasitter 5 dage efter Transfektion og 2 måneder efter Transfektion. Primere, der anvendes til at teste integration af BSD modstand kassette vil give en 584-basepar produkt til B7 forældrenes parasitter og en 2020-basepar produkt for parasitter, der har integreret markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gennemførelsen af CRISPR/Cas9 i P. falciparum har både øget effektivitet og reduceret mængden af tid til at ændre den parasittens genom, i forhold til tidligere metoder til genetisk manipulation. Denne omfattende protokol skitserer de trin, der er nødvendige for at generere betinget mutanter bruger CRISPR/Cas9 i P. falciparum. Mens metoden her er tilpasset specielt til generation af HA -glmS mutanter, kan denne strategi være tilpasset til en række behov, herunder mærkning af gener, gen knockouts og indførelsen af punktmutationer.
Et kritisk første skridt i denne protokol er udvælgelsen af en gRNA sekvens. Når du vælger en gRNA, er der flere punkter at overveje, såsom hvor gRNA sidder, hvor effektivt det er, og hvorvidt det har potentiale til off-target effekter. GRNA sekvens skal være så tæt som muligt på stedet for ændring, ideelt inden for 200 basepar. Dette mindsker sandsynligheden for parasitter ved hjælp af skabelonen reparation for at fastsætte deres genom uden integrere tag. Værktøjet bruges her til at finde gRNA var en gratis, online service kaldet CHOPCHOP22. En anden online værktøj, eukaryote patogen CRISPR guide RNA/DNA designværktøj (EuPaGDT; http://grna.ctegd.uga.edu/), kan også være brugt23. EuPaGDT giver yderligere karakterisering af gRNA sekvenser, herunder forudsigelse af off-target hits og potentielle problemer, der kan forhindre transskription af gRNA. EuPaGDT har også værktøjer til batchafvikling af gRNAs til at målrette flere gener eller hele genomer. Den valgte gRNA bør være en, der sidder tættest til stedet for modifikation med højeste effektivitet og minimal off target hits. En vigtig begrænsning af CRISPR/Cas9 gen redigering, der kan opstå, er den manglende evne til at designe en passende gRNA at målrette gen af interesse. I sådanne tilfælde en trial-and-error tilgang kan være nødvendigt, ved hjælp af flere sub-optimale gRNA sekvenser, indtil den bedste løsning er fundet, og vellykket gen redigering er sket.
En anden vigtig faktor til at overveje når du genererer P. falciparum mutanter bruger CRISPR/Cas9 er længden af homologi regioner anvendes i skabelonen reparation. Denne protokol anbefaler at homologi regioner bør være cirka 800 basepar hver, men vi har også været en succes i at bruge mindre regioner nummerering 500 basepar3. Vellykket genom ændring ved hjælp af CRISPR/Cas9 og korte homologi arme på PCR-produkter er også blevet brugt i andre protozo parasitter såsom Toxoplasma gondii og Trichomonas vaginalis24,25. Vi har testet mulighederne for ved hjælp af mindre homologi arme på PCR produkter (50, 75 eller 100 basepar) ved at forsøge at knockout normal god landbrugspraksis i B7 parasitter ved hjælp af en blasticidin modstand kassette21. Vi så nogle integration af blasticidin modstand kassette på 5 dage post Transfektion; men disse parasitter aldrig genvundet fra Transfektion. For disse transfections, har vi valgt for at udtrykke Cas9 plasmid ved hjælp af DSM1. En anden udvælgelsesmetode, såsom behandling af transfekteret kulturer med blasticidin S, alene eller i kombination med DSM1, kan forbedre chancerne for parasitter vende tilbage når du bruger kortere homologi regioner til at reparere Cas9/gRNA-induceret pauserne. I dette tilfælde vi ikke vælge med blasticidin S, da vi ønskede at teste, hvis korte homologi arme kunne anvendes i tilfælde hvor en drug resistance kassette ikke er at blive integreret i genomet, som når et protein er at blive mærket.
Kernekomponenter af CRISPR/Cas9 gen redigering er drøftet Cas9 endonuklease, gRNA og reparation skabelon. Vi beskriver en tre-plasmid tilgang for at indføre disse komponenter i parasitter, hvor Cas9, gRNA og reparation skabelon findes i separat plasmider. Ud over denne fremgangsmåde er vores lab lykkedes ved hjælp af en to-plasmid tilgang, hvor Cas9 og gRNA udtryk er drevet af en enkelt plasmid og reparation skabelon er fundet i en anden plasmid3. Lignende to-plasmid tilgange har også været med succes ansat af andre laboratorier til at frembringe mutanter7,8,26,27,28,29. Derudover flere laboratorier ved hjælp af en stamme af Plasmodium (NF54attB) som constitutively udtrykker Cas9 og en T7-RNA polymerase at drive udtryk for gRNAs30. I dette tilfælde en enkelt plasmid som indeholder skabelonen reparation og gRNA er transfekteret i NF54attB parasitter31,32. Endelig, et plasmid-fri tilgang udnytter en renset Cas9-gRNA ribonucleoprotein komplekse er blevet brugt til at indsætte mutationer i genomet, som godt33. Succes i disse forskellige tilgange viser fleksibilitet af metoder, hvor forskerne kan indføre Cas9/gRNA komponenter i parasitten.
Endelig, kan valget af lægemiddel pres skal gælde transfekteret parasitter ændres, afhængigt af konstruktioner anvendes. Her viser vi succesrig generation af mutanter af forbigående at vælge for at udtrykke Cas9 plasmid ved hjælp af DSM1, indtil parasitter igen. For at generere PfHsp70x knockout parasitter, pfhsp70x blev erstattet med menneskets dihydrofolat reduktase gen, og parasitter blev derefter valgt ved hjælp af WR9921013. For nylig beskrevet TetR-PfDOZI knockdown systemet bygger på integration af et plasmid som indeholder et blasticidin S resistens gen, giver mulighed for valg af parasitter ved hjælp af blasticidin S15,31.
Samlet set CRISPR/Cas9 gen redigering af P. falciparum har vist sig for at være et effektivt redskab i malaria forskning, og protokollen her beskriver metoder til at generere betinget knockdown mutanter3,7,8 , 13 , 20 , 28. denne protokol er meget tilpasningsdygtige til individuel forskningsinteresser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takker Muthugapatti Kandasamy på University of Georgia (UGA) biomedicinsk mikroskopi kerne for teknisk bistand og Jose-Juan Lopez-Rubio til deling af pUF1-Cas9 og pL6 plasmider. Dette arbejde blev støttet af BUER Foundation awards D.W.C. og H.M.K., UGA start midler til V.M., tilskud fra marts Dimes Foundation (Basil O'Connor Starter Scholar Research Award) til V.M. og os National Institutes of Health tilskud (R00AI099156 og R01AI130139) til V.M. og (T32AI060546) til H.M.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 1652660 | |
| Gene Pulser Xcell Electroporator | Bio-Rad | 165-2086 | We buy the ones that are individually wrapped |
| Sodium Acetate | Sigma-Aldrich | S2889-250g | |
| DSM1 | Gift from Akhil Vaidya lab | Ganesan et al. Mol. Biochem. Parasitol. 2011 177:29-34 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92006 | |
| TPP 100 mm Tissue Culture Dishes (12 mL Plate) | MIDSCI | TP93100 | |
| TPP Tissue Culture 96 Well Plates | MIDSCI | TP92096 | |
| TPP Tissue Culture 24 Well Plates | MIDSCI | TP92024 | |
| NEBuffer 2 | New England Biolabs | #B7002S | |
| NEBuffer 2.1 | New England Biolabs | #B7202S | |
| BtgZI | New England Biolabs | #R0703L | |
| SacII | New England Biolabs | #R0157L | |
| HindIII-HF | New England Biolabs | #R3104S | |
| Afe1 | New England Biolabs | #R0652S | |
| Nhe1-HF | New England Biolabs | #R3131L | |
| T4 DNA Polymerase | New England Biolabs | #M0203S | |
| 500 mL Steritop bottle top filter unit | Millipore | SCGPU10RE | You can use any size that fits your needs |
| EGTA | Sigma | E4378-100G | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500g | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C7902-500g | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266-100g | |
| K2HPO4 | Fisher | P288-500 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-500g | |
| pMK-U6 | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pHA-glmS | Generated by the Muralidharan Lab | n/a | |
| pUF1-Cas9 | Gift from the Jose-Juan Lopez-Rubio Lab | Ghorbal et al. Nature Biotech 2014 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-1KG | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761-500G | |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280-100G | |
| Hypoxanthine | Sigma-Aldrich | H9636-25g | |
| Gentamicin Reagent | Gibco | 15710-064 | |
| Thymidine | Sigma-Aldrich | T1895-1G | |
| PL6-eGFP BSD | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| Puf1-cas9 eGFP gRNA | Generated by the Muralidharan Lab | ||
| NucleoSpin Gel and PCR Clean-up | Macherey-Nagel | 740609.250 | |
| Albumax I | Life Technologies | N/A | You will want to try a few batches to find out what the parasites will grow in best |
| Human Red Blood Cells | Interstate Blood Bank, Inc | Email or call them directly for ordering | We typically use O+ blood |
| 3D7 parasite line | Available upon request | N/A | |
| Lysogeny Broth (LB) | Fisher | BP1426-2 | You can make your own, it is not necessary to use exactly this |
| Ampicilin | Fisher | BP1760-25 | We make a 1000X stock at 100mg/ml in water and store in the -20C |
| Ampicilin | Clonetech | R050A | |
| Anti-EF1alpha | Dr. Daniel Goldberg's Lab | Washington University in St. Louis | You can use your preferred loading control for western blots. This is just the one we use in our laboratory |
| Rat Anti-HA Clone 3F10, monoclonal | Made by Roche, sold by Sigma | 11867423001 | You can use your preferred anti-HA antibody |
| 0.6 mL tubes | Fisher | AB0350 | |
| Fisher HealthCare* PROTOCOL* Hema 3* Manual Staining System (Fixative+Solution I and II) | Fisher | 22-122-911 | You can also use giemsa stain |
| Fisherfines Premium Frosted Microscope Slides - Size: 3 x 1 in. | Fisher | 12-544-3 |
References
- World Health Organization. World Malaria Report. , World Health Organization. Geneva. (2017).
- Miller, L. H., Baruch, D. I., Marsh, K., Doumbo, O. K. The pathogenic basis of malaria. Nature. 415 (6872), 673-679 (2002).
- Florentin, A., et al. PfClpC Is an Essential Clp Chaperone Required for Plastid Integrity and Clp Protease Stability in Plasmodium falciparum. Cell Reports. 21 (7), 1746-1756 (2017).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Pal, P., Lindquist, S., Goldberg, D. E. Plasmodium falciparum heat shock protein 110 stabilizes the asparagine repeat-rich parasite proteome during malarial fevers. Nature Communications. 3, 1310 (2012).
- Muralidharan, V., Oksman, A., Iwamoto, M., Wandless, T. J., Goldberg, D. E. Asparagine repeat function in a Plasmodium falciparum protein assessed via a regulatable fluorescent affinity tag. Proceedings of the National Academy of Sciences the USA. 108 (11), 4411-4416 (2011).
- Beck, J. R., Muralidharan, V., Oksman, A., Goldberg, D. E. PTEX component HSP101 mediates export of diverse malaria effectors into host erythrocytes. Nature. 511 (7511), 592-595 (2014).
- Ghorbal, M., et al. Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system. Nature Biotechnology. 32 (8), 819-821 (2014).
- Wagner, J. C., Platt, R. J., Goldfless, S. J., Zhang, F., Niles, J. C. Efficient CRISPR-Cas9-mediated genome editing in Plasmodium falciparum. Nature Methods. 11 (9), 915-918 (2014).
- Doudna, J. A., Charpentier, E. Genome editing. The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9. Science. 346 (6213), 1258096 (2014).
- Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and Beyond. Annual Review of Biochemistry. 85, 227-264 (2016).
- Kirkman, L. A., Deitsch, K. W. Antigenic variation and the generation of diversity in malaria parasites. Current Opinion in Microbiology. 15 (4), 456-462 (2012).
- Lee, A. H., Symington, L. S., Fidock, D. A. DNA Repair Mechanisms and Their Biological Roles in the Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 78 (3), 469-486 (2014).
- Cobb, D. W., et al. The Exported Chaperone PfHsp70x Is Dispensable for the Plasmodium falciparum Intraerythrocytic Life Cycle. mSphere. 2 (5), (2017).
- Prommana, P., et al. Inducible knockdown of Plasmodium gene expression using the glmS ribozyme. Public Library of Science One. 8 (8), e73783 (2013).
- Ganesan, S. M., Falla, A., Goldfless, S. J., Nasamu, A. S., Niles, J. C. Synthetic RNA-protein modules integrated with native translation mechanisms to control gene expression in malaria parasites. Nature Communications. 7, 10727 (2016).
- Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).
- Drew, M. E., et al. Plasmodium food vacuole plasmepsins are activated by falcipains. Journal of Biological Chemistry. 283 (19), 12870-12876 (2008).
- Wu, Y., Sifri, C. D., Lei, H. -H., Su, X. -Z., Wellems, T. E. Transfection of Plasmodium falciparum within human red blood cells. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 92, 973-977 (1995).
- Janse, C. J., et al. High efficiency transfection of Plasmodium berghei facilitates novel selection procedures. Molecular and Biochemical Parasitology. 145 (1), 60-70 (2006).
- Counihan, N. A., et al. Plasmodium falciparum parasites deploy RhopH2 into the host erythrocyte to obtain nutrients, grow and replicate. eLife. 6, (2017).
- Klemba, M., Beatty, W., Gluzman, I., Goldberg, D. E. Trafficking of plasmepsin II to the food vacuole of the malaria parasite Plasmodium falciparum. Journal of Cell Biology. 164 (1), 47-56 (2004).
- Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering. Nucleic Acids Resesarch. 44 (W1), W272-W276 (2016).
- Peng, D., Tarleton, R. EuPaGDT: a web tool tailored to design CRISPR guide RNAs for eukaryotic pathogens. Microbial Genomes. 1 (4), e000033 (2015).
- Shen, B., Brown, K. M., Lee, T. D., Sibley, L. D. Efficient Gene Disruption in Diverse Strains of Toxoplasma gondii Using CRISPR/CAS9. mBio. 5 (3), (2014).
- Janssen, B. D., et al. CRISPR/Cas9-mediated gene modification and gene knock out in the human-infective parasite Trichomonas vaginalis. Scientific Reports. 8 (1), 270 (2018).
- Spillman, N. J., Beck, J. R., Ganesan, S. M., Niles, J. C., Goldberg, D. E. The chaperonin TRiC forms an oligomeric complex in the malaria parasite cytosol. Cellular Microbiology. 19 (6), (2017).
- Brancucci, N. M. B., et al. Lysophosphatidylcholine Regulates Sexual Stage Differentiation in the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum. Cell. , (2017).
- Ng, C. L., et al. CRISPR-Cas9-modified pfmdr1 protects Plasmodium falciparum asexual blood stages and gametocytes against a class of piperazine-containing compounds but potentiates artemisinin-based combination therapy partner drugs. Molecular Microbiology. 101 (3), 381-393 (2016).
- Lim, M. Y., et al. UDP-galactose and acetyl-CoA transporters as Plasmodium multidrug resistance genes. Nature Microbiology. , (2016).
- Adjalley, S. H., et al. Quantitative assessment of Plasmodium falciparum sexual development reveals potent transmission blocking activity by methylene blue. Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 108 (47), E1214-E1223 (2011).
- Sidik, S. M., et al. A Genome-wide CRISPR Screen in Toxoplasma Identifies Essential Apicomplexan Genes. Cell. 166 (6), 1423-1435 (2016).
- Amberg-Johnson, K., et al. Small molecule inhibition of apicomplexan FtsH1 disrupts plastid biogenesis in human pathogens. elife. 6, (2017).
- Crawford, E. D., et al. Plasmid-free CRISPR/Cas9 genome editing in Plasmodium falciparum confirms mutations conferring resistance to the dihydroisoquinolone clinical candidate SJ733. Public Library of Science One. 12 (5), e0178163 (2017).
