Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57750
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2,3
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer tilgange til biofysiske og strukturel karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin fold af biolayer interferometri, isotermisk titrering kalorimetri og uorganisk kemi.

Abstract

Glykoproteiner på overfladen af celler spiller en kritisk rolle i cellefunktion, herunder signalering, vedhæftning og transport. På leukocytter, flere af disse glykoproteiner besidder immunglobulin (Ig) folder og er centrale for immun anerkendelse og regulering. Vi præsenterer her, en platform for design, udtryk og Biofysisk karakterisering af den ekstracellulære domæne af humane B-celle receptoren CD22. Vi foreslår, at disse metoder er stort set gælder for karakterisering af pattedyr glycoprotein ectodomains indeholdende Ig domæner. To suspension menneskelige embryonale nyre (HEK) cellelinjer, HEK293F og HEK293S, der bruges til at udtrykke glykoproteiner huser komplekse og high-mannose glycans, henholdsvis. Disse rekombinante glykoproteiner med forskellige glycoforms giver mulighed for at undersøge effekten af glycan størrelse og sammensætning på ligand bindende. Vi diskutere protokoller for at studere kinetik og termodynamik af glycoprotein binding til biologisk relevante ligander og terapeutiske antistof kandidater. Rekombinant glykoproteiner produceret i HEK293S celler er indstillet til at krystallisering glycan homogenitet, nedsat fleksibilitet og modtagelighed for endoglycosidase H behandling. Vi præsentere metoder til iblødsætning glycoprotein krystaller med tunge atomer og små molekyler til fase bestemmelse og analyse af ligand bindende, henholdsvis. De eksperimentelle protokoller diskuteret hold her løfte til karakterisering af pattedyr glykoproteiner at give indsigt i deres funktion og undersøge om therapeutics virkningsmekanisme.

Introduction

Overflade proteiner spiller en kritisk rolle i cellulære funktion. Gennem deres ekstracellulære domæner, kan disse Membranproteiner modulere celle-celle interaktioner, vedhæftning, transport og signalering1,2. Den ekstracellulære lokalisering af disse proteiner gør dem attraktive mål for udvikling af lægemidler til behandling af en lang række sygdomme, herunder kræft og autoimmune sygdomme3,4,5 , 6 , 7. en af de mest almindelige folder af menneskelige membran protein ectodomains er immunglobulin-lignende (Ig) fold, som er dannet ved syv eller flere β-tråde arrangeret i to β-sheets8,9. Ig-holdige glykoproteiner er typisk multi-domæne strukturer med Ig domæner sekventielt arrangeret på den ekstracellulære del af membran protein10. Posttranslationelle modifikationer af disse celle-overflade proteiner, især N - og O-linked glykosylering, har vist sig at spille vigtige roller i deres forordning, foldning, sekretion og funktion11. For at forbedre vores forståelse af deres funktion og bedre design therapeutics, der kan målrette dem, teknikker er påkrævet at gøre det muligt for deres detaljerede Molekylær karakterisering. Vi præsenterer her, en kombination af teknikker, der giver mulighed for den biofysiske (biolayer interferometri (BLI) og isotermisk titrering kalorimetri (ITC)) og strukturfondene (røntgenkrystallografi) karakterisering af ekstracellulære domæne Ig-holdige membran glykoproteiner, alene og i kompleks med deres biologisk relevante ligander og terapeutiske molekyler (figur 1).

N-linked glykosylering er en af de mest almindelige post oversættelse ændringer på pattedyr proteiner, og der opstår under protein modning i det endoplasmatiske reticulum og Golgi12,13. Cellelinjer, såsom menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, er blevet udviklet for rekombinante udtryk for store mængder af glykosyleret pattedyr proteiner14,15. Denne cellelinje er blevet udviklet i en suspension format, som giver mulighed for at lette optrapning protein produktion til større mængder i forhold til vedhængende cellelinjer. Her, vi udnytte to HEK293 cellelinjer: HEK293F og HEK293 Gnt jeg- / - (HEK293S), som adskiller sig ved fravær af N-acetylglucosaminyl-transferase (Gnt jeg) i sidstnævnte. Til gengæld produktion af komplekse glycans (som ses i HEK293F) er ikke mulig og i stedet høj mannose-type glycans (overvejende mand5GlcNAc2) bor på N-linked glycan websteder18,19,20 . Ved hjælp af disse to cellelinjer parallelt giver mulighed for at studere effekten af glycan størrelse og kompleksitet på biologiske funktion og terapeutiske målretning. Faktisk vil glykoproteiner produceret i HEK293F celler have større, mere komplekse glycans i forhold til den samme glycoprotein produceret i HEK293S celler. Glycoproteiner produceret i HEK293S celler er mere åbne over for krystallisering, på grund af den reducerede kemiske og konformationelle heterogenitet af deres N-knyttet glycans. Yderligere at forbedre crystallizability, glykoproteiner produceret i HEK293S (men ikke HEK293F) celler kan blive behandlet med enzym endoglycosidase Hansen (Endo Hansen), hvilket resulterer i kløvningen af høj mannose glycans sådan at kun en enkelt N-acetylglukosamin (GlcNAc) gruppe forbliver på hvert N-linked glykosylering site21,22. Andre metoder kan også bruges til at begrænse N-glycan behandling inden for cellerne, såsom tilføjelsen af glycosyltransferase hæmmere under glycoprotein udtryk, herunder kifunensine23. Alternative tilgange involverer udtryk for indfødte glycoproteiner (i HEK293F celler) efterfulgt af enzymatisk deglycosylation ved hjælp af peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Dog har deglycosylation med PNGaseF vist sig at være mindre effektiv under indfødte betingelser og øger sammenlægning i nogle proteiner; i tilfælde når proteinet forbliver vandopløseligt efter behandling, får det negative afgifter på dens overflade på grund af Deamidering af asparagin rest til aspartinsyre24, som kan være skadelige for dets krystallisation. Forudsagte N-glykosylering websteder kan også være muteret, oftest for alanin eller glutamin rester, at forhindre N-linked glykosylering på disse websteder og generere glycoprotein prøver af høj ensartethed. Alternativt, glykoproteiner kan fremstilles i andre eukaryote cellekulturer, herunder gær, insekt, og plante systemer eller andre pattedyr cellelinjer som kinesisk hamster ovarie (CHO) celler16,17.

Mange pattedyr udtryk vektorer, herunder pHLsec, tillader sekretion af rekombinant glycoprotein ectodomains i celle medium25. Sekretion af glykoproteiner fra HEK293 celler giver mulighed for hurtig og nem rensning uden behov for celle lysering. Tilsætning af rensning tags (f.eks. hans-tag, Strep-tag, Flag-tag, Myc-tag, HA-tag) til målet N eller C endestation glycoprotein tillader rensning af en trinvis affinitet kromatografi. Efterfølgende kan størrelse udstødelse kromatografi bruges til at give en monodisperse prøve for biofysiske og strukturel karakterisering.

En meget ren og homogen glycoprotein prøve under passende betingelser kan resultere i godt diffracting krystaller. Når en fuld røntgen diffraktion datasæt er opnået fra sådanne krystaller, skal indledende faser være fast besluttet på at beregne elektron tætheden af glycoprotein. Takket være et stadigt stigende antal strukturer i Protein Data Bank (FBF) blevet den mest anvendte metode til gradvis langt molekylære udskiftning (MR), som bruger en relaterede protein struktur til at opnå indledende faser26. Men når hr. ikke løse fase, som det undertiden har været tilfældet for multi-Ig-domæne glykoproteiner27,28,29, alternative metoder er nødvendige. I denne artikel detalje vi en metode til at suge krystaller med tunge atomer (HA) for udfasning, der var nødvendige for at løse strukturen af CD22 ectodomain28. At identificere ret HA for udfasning er en iterativ proces, der afhænger af HA reaktivitet, tilgængelige atomer i glycoprotein i en given krystalgitter og krystallisering løsning30,31. Alternativt, naturlig svovl atomer i cystein og methionin rester kan bruges til udfasning hvis stede ved en høj nok forholdet til andre atomer i glykoprotein, og røntgen diffraktion data kan indsamles med høj nok redundans32, 33.

Den biologiske funktion af membran glykoproteiner er ofte medieret af protein-protein interaktioner eller protein-ligand interaktioner, såsom med kulhydrater. Når liganden er lille nok til at diffuse fra løsningen til glycoprotein bindingssted i krystalgitter, kan iblødsætning forsøg lykkes at få et glykoprotein-ligand Co krystalstruktur for bedre at forstå ligand anerkendelse.

De protokoller, der præsenteres her, er også relevant for at forstå samspillet mellem overflade glykoproteiner med syntetisk terapeutiske ligander34,35 og antistof therapeutics36,37. Når det kombineres med strukturelle oplysninger, kan bindende kinetik og termodynamik være stærk til at forstå og forbedre deres virkningsmekanismer. En teknik, der giver mulighed for kinetic analyse af terapeutiske antistoffer binder til et glykoprotein er BLI38,39. BLI bruger biosensorer med et immobiliseret ligand til at måle association og dissociation kinetik med en bindende partner, i sidste ende bestemme en ligevægt dissociationskonstant (KD). BLI er en attraktiv tilgang, fordi små mængder af glykoproteiner er påkrævet (< 100 µg), eksperiment tiden er hurtigt (~ 10-15 min. pr. run), og det kan automatiseres. ITC er også nyttigt for at studere tilhørsforhold mellem glykoproteiner og bindende partnere40,41,42,43. Mens ITC er mere tid og reagens intensiv, kan værdifulde oplysninger indhentes vedrørende termodynamik i interaktionen (ΔG, ΔH, ΔS og støkiometrisk). ITC er også meget nyttigt for at studere svage interaktioner, der er ofte forbundet med forbigående bindingen af overflade glykoproteiner til ligander. Desuden, disse teknikker kan bruges sammen til at evaluere bindingen af forskellige konstruktioner og vurdere effekten af forskellige N-knyttet glycoforms fremstillet af udtrykker glycoprotein i forskellige cellelinier. Udfører BLI og ITC med glycoproteiner produceret i HEK293F, HEK293S og behandlet med Endo H kan give en grundig opfattelse af glycans rolle i biologiske aktivitet og terapeutiske engagement.

Vi anvendt med succes disse protokoller for at karakterisere den ekstracellulære domæne (ECD) af menneskelige CD2228, et glykoprotein medlem af familien sialic syre-bindende Ig-lignende lektiner (Siglecs) der er afgørende for at opretholde B-celle homøostase44 . Vi udført dybtgående konstruktion design at lette krystallisering og gradvis X-ray datasæt af HA iblødsætning med Hg. Vi også gennemblødt CD22 krystaller med dets ligand sialic syre (en2-6 sialyllactose) at opnå en struktur af immun receptor-ligand kompleks og således fastsatte struktur-styrede udformningen af glycan mimetics45,46blueprints. Derudover vi genereret fragment antigen bindende (Fab) af anti-CD22 terapeutiske antistof epratuzumab - en terapeutisk kandidat i øjeblikket i fase III kliniske forsøg for non-Hodgkins lymfom47- for at bestemme dets bindende affinitet af BLI og ITC til varierende glykosyleret CD22 ECD konstruktioner. Disse undersøgelser afslørede en afgørende rolle for N-linked glykosylering i epratuzumab engagement, med potentielle konsekvenser for CD22 anerkendelse på dysfunktionelle B-celler.

Protocol

1. konstruktion Design for Glycoprotein ECD

  1. Evaluere aminosyresekvens af menneskelige CD22 (Uniprot) ved hjælp af InterPro og Phyre2-servere til at identificere forudsagte domæne elementer og grænser ligger inden for protein48,49.
  2. Klone sekvensen af menneskelige CD22, mangler signal peptid, transmembrane og cytosole domæner (rester 20-687, herefter CD22 ekstracellulære domæne, CD22 ECD) i pHLsec pattedyr udtryk vektor25 ved hjælp af restriktionsenzymer AgeI og KpnI ( Figur 2 A) 50.
    Bemærk: PHLsec vektor er optimeret til overekspression af opløselige, udskilles proteiner i pattedyrceller25. Denne vektor indeholder en sekretion signal at give mulighed for den ekstracellulære sekretion af opløselige glykoproteiner. pHLsec indeholder et C-terminal (hans)6 x tag for at lette affinitet rensning fra celle analysere immobiliseret metal affinitet kromatografi metoder.
  3. Klon afkortet konstruktioner af CD22 ECD med sekventiel sletninger af C-terminale Ig domæner: domæner 1-6 (rester 20-687), domæner 1-5 (rester 20-592), 1-4 (restprodukter fra 20-504) domæner og domæner 1-3 (restprodukter fra 20-330) (tal 2B og 2 C)50 .
  4. Evaluere den primære sekvens af CD22 ECD ved hjælp af NetNGlyc serveren til at identificere forudsagte N-linked glykosylering websteder i konstruere51.
  5. Bruger site-directed mutagenese, standardprotokoller52 eller overlappende PCR53, mutere hvert forudsagte N-linked glykosylering websted (Asn til Localisation og/eller Asn til Ala) for at oprette konstruktioner af CD22 ECD, der indeholder enten en enkelt eller flere N-linked glykosylering mutationer.
  6. Efter sekvens kontrol af klonede konstruktioner, omdanne kompetente E. coli DH5α celler54 og maxi-prep DNA (ifølge fabrikantens anvisninger) for at forberede Transfektion.

2. HEK293F og HEK293S cellecenter

Bemærk: Alle manipulation af HEK293F eller HEK293S celler med nødvendige reagenser og udstyr skal udføres i en biosikkerhed niveau 2 facilitet i en egnet biosikkerhed kabinet. Den ydre overflade af alle elementer skal være steriliseret med 70% ethanol opløsning eller tilsvarende reagens.

  1. Få HEK293F og HEK293S suspension celler (Se Tabel af materialer) og opbevares ved-80 ° C indtil klar til brug.
  2. Varm media (Se Tabel af materialer) i 1 time i et 37 ° C vandbad. Overføre 24 mL varmede medier til en 125 mL forbløffet celle kultur kolbe med en ventileret cap.
  3. Få 1 mL celle alikvot fra-80 ° C og overførsel til is.
  4. Inkuber celler i et 37 ° C vandbad til ca. 1 min., for at delvist tø cellerne. Overføres 1 mL af celler fra hætteglasset til 125 mL forbløffet celle kultur kolbe indeholdende medierne.
  5. Luk celle kultur kolbe med ventileret hætte og sted kolbe i en shaker sat til 37 ° C, 130 rpm, 70% fugtighed og 8% CO2.

3. HEK293 Celle vedligeholdelse

Bemærk: Celle tæthed og levedygtighed af celler skal være tjekket ca 24 timer efter optøning. Dette trin sikrer, at celler er at inddrive efter podning; indledende levedygtighed skal være > 80%.

  1. Forsigtigt fjerne 10 µL af celler fra 125 mL kolbe indeholdende frisk suspension celler og overføre det til en sterile 1,5 mL microtube. Kolben lukkes og returnere det til rugemaskine.
  2. Afpipetteres 10 µL af Trypan blå løsning i 1,5 mL microtube som indeholder cellerne, blandes grundigt og overføre 10 µL til kammer af diasset optælling.
  3. Sætte det tælle dias i en automatisk celle counter og få værdier for celle tæthed (i enheder af celler mL-1) og cellernes levedygtighed (i procent).
  4. Beregne omfanget af celler, der skal podes en frisk 200 mL kultur på en endelige tæthed af ~0.8 x 106 celler mL-1 ved hjælp af følgende ligninger:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
    Bemærk: Det kan tage ~ 5 d at opnå en passende celle tæthed til podning til en 200 mL kultur.
  5. Når cellen tæthed er tilstrækkelig til podning af en 200 mL kultur, warm-up medier for 1 h i et 37 ° C vand bad og overføre den varmede medier til biosikkerhed kabinet.
  6. Den krævede mængde af medier (som beregnet i ligning 2) bruger en serologisk pipette, omhyggeligt overføres til en 500 mL forbløffet celle kultur målekolbe med en ventileret cap.
  7. Ved hjælp af en serologisk pipette, overføres den krævede mængde af suspension celler (beregnet i ligning 1) til 500 mL forbløffet celle kultur målekolbe indeholdende medierne.
  8. Cap de nye 200 mL vedligeholdelse stock og returnere det til rugemaskine. Vokse celler til en massefylde på ca 3 x 106 celler mL-1. Passage celler med en tæthed på 0,8 x 106 celler mL-1 hver 2-3 d til at opretholde en stabil kultur af celler (som beskrevet i afsnit 3.4-3.7). Tillad ikke cellerne til at overskride en tæthed af ~ 4 x 106 celler mL-1.

4. Transfektion af HEK293 celler for Glycoprotein udtryk

  1. Beregne omfanget af celler og media, der kræves til en 200 mL kultur for Transfektion på 0,8 x 106 celler mL-1 (ved hjælp af ligninger 1 og 2 fra afsnit 3.4).
    Bemærk: Antallet af 200 mL transfections, der kan udføres afhænger celle tætheden af vedligeholdelse lager.
  2. Overføre den krævede volumen af medier og celler for Transfektion ind i en ny 500 mL celle kultur kolben med en ventileret cap og returnere celle stock til rugemaskine.
  3. Inkuber celler til 1 time før Transfektion tillade celler til at akklimatisere følgende opdeling.
  4. Overføre 50 µg af DNA i en steril 50 mL konisk slange og fortynd med 5 mL af medier. Vakuum filtrere den fortyndede DNA ved hjælp af et 0,22 µm filtreringssystem til et andet sterile rør.
  5. Blandingen fortyndes, filtreret DNA i forholdet 1:1 masse: volumen med Transfektion reagens. Forsigtigt swirl DNA: Transfektion reagens løsning for at blandes og inkuberes løsning ved stuetemperatur i 10 min.
  6. Tilføje DNA: Transfektion reagens løsning direkte til cellerne. Inkubér transfekteret celler ved 37 ° C, 130 rpm, 70% fugtighed og 8% CO2 i en shaker til 5-7 d.

5. optimering af celle Transfektion betingelser

Bemærk: For at optimere celle Transfektion betingelser for maksimal glycoprotein udbytte, transfect celler på en række indledende celle tætheder og vurdere protein afkast over tid (fig. 3A). Transfect celler som beskrevet i afsnit 4, ved første celle tætheder spænder fra 0,5 x 106 2 x 106 celler mL-1 55. Retssag transfections kan skaleres til 25 mL samlede volumen (i 125 mL forbløffet celle kultur kolbe) med 6 µg DNA til at spare plads og reagenser. Mængden af DNA kan også være optimeret55.

  1. Hver dag efter Transfektion (dage 1-7), overføre en 500 µL alikvot fra cellekultur i sterile 1,5 mL microtube (i biosikkerhed kabinet).
  2. Spin aliquoted celler på 12.000 x g i 5 min i en microcentrifuge umiddelbart efter opsamlingen. Overføre supernatanten til en ny 1,5 mL microtube og opbevares ved 4 ° C, indtil alle prøver er opnået.
  3. Kvantificere udskilles glycoprotein af densitometri
    1. Når alle prøver er opnået, alikvot 20 µL af hver prøve ind i en ny 1,5 mL microtube og bland med 6 µL af ikke-reducerende 4 x Laemmli prøvebuffer.
    2. Kog prøver for 5 min. ved 95 ° C i en thermo-blok. Spin prøver for 1 min på 12.000 x g i en microcentrifuge.
    3. Indlæse 20 µL af hver prøve pr. brønd i en 10-well 4-15% gradient SDS-PAGE gel. Omfatte én vognbane for protein størrelse markører. Kør gelen på 250 V i 20 min. i en buffer, glycin-Tris-SDS.
    4. Efter køre afslutningen, overføre gel til Coomassie pletten (Se Tabel af materialer) i 20 min. de plette gel i ddH2O i 20 min. billede gel.
    5. Udføre densitometri med ImageJ, efter standardprotokoller57,58.
    6. Kompilere og afbilde data med 'dage efter Transfektion' på x-aksen og densitometri værdier på y-aksen (fig. 3A).
      Bemærk: Alternativt hvis protein udtryk er utilstrækkelig til visualisering af SDS-PAGE, teknikker såsom Western blotting kan være brugt56.
  4. Kvantificere udskilles glycoprotein af BLI
    1. Brug af Ni-NTA biosensorer, kvantificere mængden af udskilles glycoprotein ved hjælp af BLI59.
    2. Kompilere og afbilde data med 'dage efter Transfektion' på x-aksen og "protein koncentrationen (µg/mL)' på y-aksen (fig. 3A).

6. rensning af vandopløseligt Glycoprotein fra HEK293 supernatanten

  1. Høste celler ved centrifugering ved 6,371 x g i 20 min. ved 4 ° C. Bevare supernatanten indeholdende udskilles CD22 ECD og filtrere ved hjælp af et 0,22 µm filter.
  2. Indlæse supernatanten på 4 mL min-1 på en pre afbalancerede (20 mM Tris pH 9,0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol) Ni-NTA kolonne (5 mL volumen) ved hjælp af en benchtop kromatografi system.
    Bemærk: Andre affinitet-baserede rensning teknikker kan bruges, baseret på affinitet tags inkluderet i konstruktion design i afsnit 1.
  3. Efter supernatanten lastning, vaske kolonnen affinitet med 3-4 kolonne diskenheder (CV) af vaskebuffer (20 mM Tris pH 9,0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazol).
  4. Elueres renset glycoprotein fra kolonnen ved hjælp af en 4-100% gradient (4 CVs) eluering buffer (20 mM Tris pH 9,0, 150 mM NaCl, 500 mM imidazol) mens indsamling fraktioner (fig. 3B).
  5. Pool fraktioner der indeholder de eluted peak i en centrifugal filtrering enhed med en 10 kDa nominelle Molekylær vægt limit (NMWL) og koncentrat ved centrifugering på 4.000 x g ved 4 ° C i 15 min, eller indtil prøven når et volumen på 500 µL.
  6. Tilføre en 500 µL prøve loop og belastning på 0,5 mL min-1 på en pre afbalancerede (20 mM Tris, pH 9,0, 150 mM NaCl) koncentreret glycoprotein højtydende størrelse udstødelse kolonne (ca 24 mL volumen) på en hurtig protein væskekromatografi (FPLC) system ved 4 ° C mens indsamling fraktioner (figur 3C).
  7. Køre SDS-PAGE gel af elueret fraktioner til at identificere fraktioner der indeholder glykoprotein, og pool tilsvarende fraktioner. SDS-PAGE gel kan køres som beskrevet i afsnit 560.

7. Deglycosylation af renset Glycoprotein

  1. Måler koncentrationen af oprenset protein efter størrelse udstødelse kromatografi ved hjælp af absorbans på 280 nm divideret med udslettelse koefficient (fx 1.418 M-1 cm-1 for CD22 ECD).
    Bemærk: Den teoretiske extinction koefficient af proteiner af interesse kan beregnes ved hjælp af servere såsom ExPASy ProtParam61.
  2. Inkuber oprenset protein med Endo H i 1 timer ved 37 ° C, ved en ratio på 1 mg renset protein til 10 µL af kommercielle enzym i 1 X Endo H buffer (ifølge fabrikantens anvisninger).
    Bemærk: Endo H kløver høj mannose glycans produceret i HEK293S forlader en enkelt GlcNAc gruppe på hver glykosylering site21. Endo H ikke kløver glycans på proteiner fremstillet i HEK293F celler22, men andre enzymer kan bruges til dette formål (f.eks.PNGaseF24).
  3. Koncentrere deglycosylated ECD til 500 µL og køre gel filtrering kromatografi på en højtydende størrelse udstødelse kolonne (ca 24 mL volumen) på 0,5 mL min-1 på en FPLC til at fjerne Endo H og adskille nogen resulterende aggregater.
  4. Gemme deglycosylated protein ved 4 ° C indtil brug i downstream eksperimenter.

8. krystallisering af glykoproteiner

Bemærk: Udføre krystallisering forsøg ved hjælp af kommercielt tilgængelige skærme og konfigurere sidder drop eksperimenter ved hjælp af en krystallisering robot.

  1. Koncentrat ren, deglycosylated ECD til 10 mg mL-1 bruger en centrifugal filtrering enhed med 10 kDa NMWL på 4.000 x g (4 ° C), indtil den ønskede koncentration opnås.
  2. Bestemme proteinkoncentration ved hjælp af absorbans på 280 nm og dividere med koefficienten, extinction.
  3. Centrifuge prøve på 12.000 x g i 5 min. ved 4 ° C forud for krystallisering forsøg at fjerne uønsket støv eller andre forurenende stoffer fra prøven.
  4. Fylde beholderen wells af 96-godt møde drop krystallisering plader med 80 µL af krystallisering løsning fra en kommerciel krystallisering skærm.
    Bemærk: Vi bruger sparse-matrix kommercielle skærme, der er blevet designet baseret på de mest succesfulde krystallisering betingelser med hensyn til strukturer deponeret i det foreløbige budgetforslag.
  5. Ved hjælp af en krystallisering robot, dispensere dråber i brønden af krystallisering plade med en total drop volumen af 200 nL i oprenset protein: krystallisering løsning 1:1 forholdet.
  6. Når hele pladen har været udleveret, forsegle pladen med tape og sted i en plade imager for inspektion af synlige og ultraviolette lys.
  7. Inspicere krystallisering plader umiddelbart efter installationen, og i de følgende uger, ved hjælp af både synlige og ultraviolette lys til at identificere vilkår, der giver første glycoprotein krystal hits.
  8. Yderligere optimere krystaller opnået fra indledende krystallisering hits ved hjælp af fine skærme baseret på betingelse af krystal hit eller tilfældige matrix mikro-seeding metoder62,63,64,65.
  9. Cryo-beskytte enhver krystaller mangler tilstrækkelig cryo-protectant inden for betingelsen krystallisering af iblødsætning krystal i mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol løsning (eller tilsvarende cryo-protectant, såsom ethylenglycol eller polyethylenglycol 400).
  10. Mount krystaller i cryoloops og flash fryse dem i flydende nitrogen forud for indsamling af data på en hjem kilde diffractometer eller ved hjælp af synkrotron stråling.

9. udfasning, ved hjælp af tunge Atom forædling

Bemærk: Før enhver manipulation af HA forbindelser, sikkerhedsmæssige aspekter skal tages i betragtning. HA forbindelser, der anvendes i Proteinkrystallografi er valgt for deres stærke affinitet til biologiske molekyler og udgøre en risiko for menneskers sundhed fra langvarig udsættelse. Træffe passende sikkerheds foranstaltninger for HA forbindelser som nævnt i deres sikkerhedsdatablade.

  1. For at teste forskellige HA stoffer, reproducere koncentrationer og inkuberingstider, godt diffracting krystaller opnået i afsnit 8 i en 24-godt krystallisering plade ved hjælp af hængende-drop damptryk diffusion metode66.
  2. Bestemme hvilket HA vil blive anvendt til crystal forædling. Servere (f.eks. Heavy-atom databasesystemet67) kan hjælpe med at HA sammensatte udvalg, at sikre, at de er egnede til protein og krystallisering betingelsen.
    Bemærk: HA skærme er også kommercielt tilgængelige for nem screening af mest effektive HA forbindelser for udfasningen. Et sæt af "magic seven" HA forbindelser har tidligere beskrevet for at have høj sandsynlighed for succes for HA forædling68.
  3. Oprette arbejdsstation til HA iblødsætning (figur 4A). Ved hjælp af en cryoloop, hurtigt overføre krystaller til en 0,2 µL slip på en 22 mm dække slip indeholdende HA løsning fortyndet i krystallisering tilstand, således at den endelige koncentration af HA spænder fra 1-20 mM. Forsegle drop og Inkuber i forskellige længder af tid (fig. 4B). Et godt udgangspunkt er 5, 10, 60 og 90 min. og overnatning.
  4. Inspicér visuelt krystaller med en let mikroskop til at identificere eventuelle revner eller ændringer i farve, hvilket kan indikere bivirkninger til glycoprotein krystal eller krystal forædling.
  5. Montere krystaller i cryoloops og tilbage-sættetid krystaller til 30 s i tre på hinanden følgende 0.2 µL dråber indeholdende mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol (eller alternativ cryo-protectant)69. Back-iblødsætning krystallerne fjerner HA sammensat, var ikke-specifikt bundet og reducerer delvis belægning forårsaget af svage HA bindende. Flash fryse krystaller i flydende kvælstof (fig. 4B).
  6. For dataindsamling bruge forarbejdning, struktur løsning og raffinement, tidligere beskrevet protokoller26,70,71,72.

10. iblødsætning Glycoprotein krystaller med dets Ligand

  1. Reproducere godt diffracting krystaller opnået i afsnit 8 i en 24-godt krystallisering plade ved hjælp af metoden hængende-drop vapor diffusion.
  2. Forberede en stamopløsning i 50 mM ligand i 20 mM Tris, pH 9,0, 150 mM NaCl.
    Bemærk: Liganden koncentration skal være tilberedt efter affinitet til sin glycoprotein. Hvis affinitet er ukendt, kan det være forpligtet til at bruge en metode som ITC (afsnit 12.2) til at bestemme samfølelse før begyndelsen iblødsætning eksperimenter. Sikre at liganden er opløseligt i den ønskede koncentration i den krævede buffer.
  3. Tilføje varierende koncentrationer af liganden til drop indeholdende ECD krystaller og forsegle drop for inkubation ved tid længder mellem 5 min til 5 d.
  4. Visuelt spore krystaller med en let mikroskop til at identificere mulige ændringer i morfologi.
  5. Montere krystaller i cryoloops og cryo-beskytte dem i mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol (eller andre cryo-protectant ethylenglycol eller lav Molekylær vægt polyethylenglycol 400)69.
  6. For indsamling, forarbejdning, struktur løsning og raffinement, bruge tidligere beskrevet protokoller73,74,75.

11. produktion af Fragment Antigen bindende (Fab)

  1. Subclone gener, der svarer til Fab tunge kæde (HC) og lys kæde (LC) sekvenser af anti-ECD antistoffer, fxepratuzumab.
    Bemærk: Alternativt IgG kan kløves af enzymet papain at generere Fab fragmenter76.
  2. Transfect celler, som beskrevet i afsnit 4, med følgende ændringer:
    1. Bruge en samlet masse af DNA til Transfektion af Fab fragmenter af 90 µg pr. 200 mL af kultur.
    2. Transfect HC og LC plasmider i forholdet 2:1 at reducere mængden af LC dimer dannelse.
  3. Efter 7 d inkubation, høste celler, bevare supernatanten og filtrere med en 0,22 µm vakuum-drevet filtrering enhed.
  4. Reagensglasset anti-LC (kappa eller lambda) affinitet kolonner i PBS buffer ved hjælp af en benchtop kromatografi system.
    Bemærk: Hvis LC dimer dannelse er et problem under rensningen, Protein G affinitet kromatografi kan bruges som et alternativ til kappa/lambda LC affinitet rensning.
  5. Indlæse supernatanten på affinitet kolonne på 4 mL min-1. Efter prøven lastning, vaske kolonnen med 3-4 CVs af PBS.
  6. Elueres protein fra kolonne ved hjælp af en isocratic eluering med 100 mM glycin, pH 2.2, straks neutralisere de eluted brøker med 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9,0 i hver fraktion.
    Bemærk: Eluted Fab kan blive yderligere renset ved ionbytning kromatografi og/eller størrelse udstødelse kromatografi ved hjælp af en FPLC ved 4 ° C.

12. karakterisering af Fab og lille molekyle Binding til Glycoprotein

  1. Biolayer interferometri
    1. Forberede 50 mL af 1 x kinetik buffer (1 x PBS, 0,002% (v/v) Tween-20, 0,01% (w/v) BSA).
    2. Hydrat seks Ni-NTA biosensorer i 200 µL 1 x kinetik buffer for 10 min i en tørstofmængden plade.
    3. Fortynd hans markeret ECD i 1 mL af 1 x kinetik buffer i en endelig koncentration på 25 ng µL-1. Afpipetteres serielle fortyndinger af renset Fab i 200 µL 1 x kinetik buffer, med en høj koncentration af 500 nM, og efterfølgende serielle fortyndinger af 250 nM, 125 nM og 62,5 nM.
    4. Alikvot reagenser i sort flad bund polypropylen 96-brønd mikrotiterplade som vist i figur 5A, hvor hver godt indeholder 200 µL af den angivne løsning.
    5. Indsamle data ved hjælp af kinetik Assays i datafangst software, som tidligere beskrevet38,39,77 (figur 5A).
      1. Kort, overføre biosensorer i brønd indeholder 1 x kinetik buffer til baseline for 60 s før pålæsning 25 ng µL-1 for glycoprotein for 240 s (eller indtil en tærskel på 1,0 nm nås) ved 1000 rpm.
      2. Efter en anden baseline 60 s i 1 x kinetik buffer, overføre biosensorer til brønde indeholdende seriel fortynding af Fab. 180 Sørensen association fase er senere efterfulgt af en 180 s dissociation skridt i 1 x kinetik buffer.
        Bemærk: Biosensorer kan genbruges hvis den ovennævnte protokol er efterfulgt af en regenerering skridt, som består af tre cyklusser af vask biosensorer i stripping buffer (PBS med 500 mM imidazol) til 5 s efterfulgt af 5 s i 1 x kinetik buffer for neutralisering. Biosensorer kan genbruges op til ~ 10-20 gange i løbet af samme dag, eller indtil fattige data kvalitet er observeret.
    6. Analysere data ved hjælp af analysesoftwaren (figur 5A):
      1. Under fanen 1, import og vælge data.
      2. Under fanen 2, trin 1: Markerede Data, Vælg Sensor udvælgelse og Fremhæv reference brønde (rækker E og F, figur 5A), lige falde i hak og indstillet til at henvise til godt. Under trin 2: Subtraktion, Vælg Reference brønde. Under trin 3: Tilpasse y-aksen, skal du vælge 'Baseline' fra klokkeslætsområdet for 0,1 til 59.8 s. Under trin 4: Inter trin korrektion, Vælg 'Juster til dissociation.' Under trin 5: Processen, Vælg Savitzky-Golay filtrering og presse procesdata.
      3. Under fanen 3, Vælg 'Association og Dissociation' under trin på analyser med en 1:1 model. Vælg 'Globale montering' og 'Gruppe af farve'. Højreklik på kurver, Vælg 'Change farve', sæt alle kurver til farven på dine valg. Vælg 'Fit kurver'. Hvis data er godt udstyret, kan blive eksporteret en rapport ved at vælge 'Gem rapport'.
    7. Gentag forsøget med glycoprotein produceret i HEK293F og HEK293S celler (afsnit 5) og efter Endo H behandling (afsnit 7) til at vurdere, hvilken virkning, hvis nogen, af forskellige glycoforms på Fab anerkendelse. Derudover Gentag eksperimentet med ECD udeladelser at give indsigt i domæne(r) bundet af Fab.
  2. Isotermisk titrering kalorimetri Fab-glycoprotein interaktion
    Bemærk: ITC eksperimenter beskrevet her udføres ved hjælp af en automatiseret ITC instrument. Eksperimenter er udført i en 1 mL rund bund 96-brønd blok.
    1. Dialyze ECD og Fab i en enkelt 4 L bægerglas på 20 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl ved 4 ° C natten over med en røre bar.
    2. Koncentrere dialysebehandling ECD og Fab 5 µM og 50 µM, henholdsvis, ved hjælp af en centrifugal filter med 10 kDa NMWL, at sikre at vaske koncentrator membraner tre gange med 5 mL af dialyse buffer på 4.000 x g for 5 min. ved 4 ° C før brug.
      Bemærk: Enhver uoverensstemmelse i buffer mellem prøver i celle og sprøjte kan forårsage uønsket varme til at blive frigivet i løbet af ITC eksperiment og resultere i data af dårlig kvalitet.
    3. For eksperiment 1: tilføje 400 µL af ECD til A1 skal indlæses i cellen, og 120 µL af Fab til godt A2 indlæses i sprøjten. Godt A3 er efterladt tomme tilbage blandet prøve følgende eksperiment afslutning. Hver efterfølgende eksperiment kan føjes til pladen i samme rækkefølge (dvs. eksperiment 2: celle - A4, sprøjte - A5, Tom godt - A6; Figur 5 B).
      Bemærk: Omfatter buffer i bufferen kontrolelementer (for at bekræfte instrumentet opfører sig godt) i begyndelsen og slutningen af hver run samt ligand (i sprøjten) i buffer (i celle) kontrolelementer til at beregne heat af fortynding til prøven i sprøjten. Dette beregnede varme af fortynding skal derefter trækkes fra rå eksperimentelle data under dataanalyse (figur 5B).
    4. Løbe i alt 16 injektioner med et volumen på 2,5 μL for hver injektion. Injektion varighed er 5 s, med 180 s afstanden mellem injektioner. Indstil celle temperaturen til 25 ° C, med en omrøring hastighed på 750 rpm og et filter periode af 5 s.
      Bemærk: Baseret på affinitet og termodynamik af ECD:Fab interaktion, kan det være nødvendigt at ændre den prøve koncentration, antal injektioner eller prøverummets temperatur.
    5. Analysere data med den analyse software, som tidligere beskrevet40,41,43 (figur 5B).
    6. Gentage forsøget i det mindste i dubletter, beregning af gennemsnitlig KD værdier og standardfejl. Gentag forsøget med ECD af forskellige glycoforms (afsnit 5 og 6) til at vurdere, hvilken virkning, hvis nogen, af glycoforms på termodynamik af Fab: glycoprotein interaktion.
  3. Isotermisk titrering kalorimetri ligand-glycoprotein interaktioner, at angive ITC eksperiment som beskrevet i afsnit 12.2, med følgende ændringer:
    1. Dialyze ECD i 4 L i dialyse buffer natten over. Opløse ligand ved hjælp af dialyse buffer efter afslutningen af dialyse.
    2. Udføre ITC eksperimenter ved betydeligt højere koncentrationer at opdage lav-affinitet interaktioner. For ECD og ligand interaktionen, udføre ITC eksperimenter i koncentrationer på 100 µM af ECD i celle og 1 mM af ligand i sprøjten.

Representative Results

Flere konstruktioner af CD22 ECD blev klonet i pHLsec udtryk vektor og overexpressed i pattedyr HEK293F og HEK293S cellelinjer (figur 2 og 3A). Alle konstruktioner blev renset til størrelse homogenitet af størrelse udstødelse kromatografi og givet en meget ren prøve for krystallisering undersøgelser (figur 3B og 3 C). Den CD22 konstruktion, der førte til godt diffracting krystaller var d1-d3 trunkering (rester 20-330), med fem af seks forudsagte N-linked glykosylering websteder muteret fra Asn til Ala (N67A, N112A, N135A, N164A og N231A), produceret i HEK293S celler, sådan at kun webstedet glykosylering på position N101 blev bevaret (denne konstruktion er opkaldt CD2220-330, 5A). Krystaller blev fremstillet i flere betingelser på skærmbilledet MCSG-1 sparse-matrix, men de bedste krystaller var fra en betingelse, der indeholder 30% (w/v) polyethylenglycol 4000, 0,2 M lithium chlorid og 0,1 M Tris, pH 8,5. Disse indfødte krystaller diffrakteres 2.1 Å resolution; ved hjælp af kendte strukturer af Ig domæner af relaterede Siglec proteiner ikke give nogen løsninger i hr. søgninger.

For at erhverve phasing oplysninger, gennemblødt vi indfødte krystaller med et panel af HA forbindelser, der omfattede Hg, Pt, Os, Ta og Br i koncentrationer fra 1-20 mM ha stof til en inkubationstiden fra 5 min-1 d (figur 4). Vi overvågede krystaller til ændringer i morfologi, og fandt at krystaller gennemblødt med HA sammensatte på 20 mM resulteret i den hurtige krakning og opløsning af krystal. Vi frøs ialt 63 krystaller, der beholdt deres form efter sæt inkuberingstider, der var gennemblødt med tantal bromid klynge, platin chlorid, mercurisulfat acetat og kviksølvklorid. Krystaller gennemblødt med 7 mM af kviksølvklorid i 30 min. viste unormal signal på et fluorescens scanning på canadiske Light Source (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) og tilladt for multi bølgelængde anormal dispersion X-ray dataindsamling på en enkelt krystal. Disse datasæt tillod os at løse kviksølv underkonstruktion af CD2220-330, 5A, som afslørede en enkelt kviksølv atom bundet til en gratis cysteine på position C308 og i sidste ende tillod os at bygge strukturen i CD2220-330, 5A i den trinvise Electron density kort ved hjælp af AutoBuild78.

Når unliganded strukturen blev løst, var vi interesseret i at løse strukturen af CD22 bundet til dets ligand, en2-6 siallylactose. Vi først beregnet CD22 affinitet mod en2-6 sialyllactose ved hjælp af ITC for at karakterisere bindende termodynamik i samspillet. Vi observerede en affinitet for ~ 280 µM og bruges disse oplysninger til at identificere en begyndelseskoncentration (~ 100 x KD) af ligand bruge til iblødsætning af vores indfødte CD2220-330, 5A krystaller. Vi gennemblødt CD2220-330, 5A krystaller med 25 mM siallylactose for 5 min, 2 h, 14 h, 40 h og 5 d og overvåges for ændringer i crystal morfologi. ~ 75 krystaller alt var frosset fra forskellige tidspunkter og sendt til CLS synkrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Canada) for remote dataindsamling. I alt seks X-ray datasæt blev indsamlet fra godt diffracting krystaller. Struktur fra hver X-ray datasæt blev løst af hr. ved hjælp af unliganded CD2220-330, 5A struktur som en indledende søgning model. Den resulterende electron density for alle datasæt blev derefter inspiceret for positive tæthed i Fo-Fc kortet, der ville svare til bundne en2-6 sialyllactose inden for bindingssted for CD22. Bemærkelsesværdigt, alle datasæt indsamlet, selv dem fra krystaller gennemblødt efter kun 5 min af inkubationstiden, indeholdt positive tæthed svarende til ligand i bindingssted. Overordnede strukturer af unliganded og liganded CD22 var meget ens med minimal konformationelle ændringer, som kan forklare succesen af iblødsætning eksperimenter med en2-6 sialyllactose.

Vi kendetegnet næste antigene overfladen af CD22 anerkendt af terapeutiske antistof epratuzumab i BLI og ITC eksperimenter (figur 5). Kinetik og termodynamik profiler af epratuzumab Fab binding til CD22 konstruktioner med forskellige glycoforms afslørede et stigende affinitet til CD22 med reduceret N-linked glycan størrelse, med op til en 14-fold forbedring i affinitet for mindre glycans (327 nM vs 24 nM i BLI; 188 nM vs 58 nM i ITC). CD22 N-linked glycan begrænser adgangen af antistof mod sin epitop blev identificeret af BLI ved hjælp af single-point mutanter af CD22 og ved at løse epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 Co krystal struktur28.

Figure 1
Figur 1 . Oversigt over glycoprotein karakterisering fra konstruktion design til biofysiske og strukturel karakterisering. (1) primære Sekvensanalyse af repræsentative glycoprotein. I grå, den ekstracellulære domæne (ECD); i green, den transmembrane (TM) segment; og i blå, glycoprotein cytosole domæne. Forudsagte N-knyttet glycans er mærket. (2) kloning af ECD konstruktioner. (3) udtryk for ECD constructs i pattedyrsceller. (4) glykoprotein oprensning. Mens proteiner udtrykt i HEK293F vil indeholde komplekse glycans, vil proteiner udtrykt i HEK293S have høje mannose glycans. Enzymatisk behandling af glykoproteiner produceret i HEK293S celler med Endo H resultater i glykoproteiner med kun GlcNAc gruppe på N-linked glykosylering websteder. (5a) glykoproteiner er testet for deres binding til antistoffer af biolayer interferometri (BLI) og isotermisk titrering kalorimetri (ITC). Affinitet til små ligander kan også måles ved ITC. (5b) krystallisering forsøg af glykoproteiner med homogene N-knyttet glycans, som udtrykt i HEK293S og deglycosylated med Endo H. (6) i nogle tilfælde mutation af N-linked glykosylering websteder er nødvendig for at opnå krystaller. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Design af CD22 ectodomain DNA konstruktioner til udtryk i pattedyrsceller. A) repræsentation af det pHLsec plasmid brugt til forbigående Transfektion af CD22 ECD konstruktioner. AgeI og KpnI steder, der anvendes til kloning angives med røde bokse. B) The CD22 ECD indeholder syv Ig domæner (d1-d7) og 12 forudsagte N-linked glykosylering websteder (i blåt). Fire konstruktioner var designet fra CD22 ECD. C) 1% agarosegel viser PCR-amplikoner af CD22 ECD konstruktioner for kloning til pHLsec pattedyr udtryk vektor. Første lane indeholder 1 kb DNA markør. Venligst klik her for at se en større version af dette tal. 

Figure 3
Figur 3 . Proteinekspression og -oprensning af glykoproteiner. A) effekt af celle tæthed på udtryk udbytter. Glycoprotein udtryk i små 25 mL kultur af HEK293F suspension celler transfekteret ved hjælp af tre forskellige start tætheder af celler (0,5 x 106 celler mL-1, 1,0 x 106 celler mL-1og 1.5 x 106 celler mL -1). Kvantificering foretages ved densitometri fra SDS-PAGE i venstre panel og kvantitative BLI i højre panel. Værdier er repræsentative for et glykoprotein forberedelse. B) kromatogram af det første rensning skridt for konstruere CD2220-330, 5A fra 600 mL af supernatanten ved hjælp af en Ni-NTA affinitet kolonne. Glycoprotein blev elueret med en gradient af imidazol (grå linie), hvor 100% svarer til eluering buffer, som indeholder 500 mM imidazol. Poolede fraktioner er afbildet med lodrette streger. C) størrelse-udelukkelse kromatogram til konstruere CD2220-330, 5A ved hjælp af en high-performance gel filtrering kolonne. Poolede fraktioner fra eluering peak er afbildet med lodrette streger. Indsatser: Coomassie farvede SDS-PAGE gel viser renheden af glycoprotein. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . Krystal iblødsætning med tunge atomer. A) prøve arbejdsstation til iblødsætning indfødte krystaller med HA forbindelser. Alle nødvendige værktøjer er mærket. B) fremgangsmåde følges for at suge krystaller af konstruere CD2220-330, 5A med HA forbindelser. Trin 1, åbne godt indeholdende krystaller og overførsel krystaller ved hjælp af en løkke til en 0.2 µL dråbe på et cover slip indeholdende HA løsning fortyndet i krystallisering tilstand, således at den endelige koncentration af HA spænder fra 1-10 mM. Trin 2, forsegle drop i krystallisering plade og inkuberes krystaller med HA sammensatte i forskellige perioder. Trin 3, montere gennemblødt krystal i loop og back-blød til 30 s i tre på hinanden følgende 0.2 µl dråber indeholdende mor liquor løsning suppleres med 20% (v/v) glycerol udleveres på en cover slip. Trin 4, flash fryse krystal monteret på en løkke med flydende kvælstof og placere det i en puck til forsendelse til synkrotron beamline. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Biolayer interferometri og isotermiske titrering kalorimetri målinger. A) repræsentant BLI eksperiment. Øverste panel: eksempel på plade setup for en kinetik eksperiment, hvor følgende er mærket: 1 x kinetik buffer (B), hans6 x-mærket glycoprotein indlæsning (L), repræsentative Fab koncentrationer (500, 250, 125, 62,5 nM), PBS + 500 mM regenerering buffer (R), og 1 x kinetik neutralisering buffer (B). Hver indeholder godt 200 µL af løsning. Trin nummer for kinetik eksperiment er angivet øverst på pladen. Midten panel: Repræsentative rådata BLI eksperiment udføres ved hjælp af Ni-NTA biosensorer og pladen beskrevet i toppanelet. Trin tal svarer til baseline (1), hans6 x glycoprotein indlæsning (2), baseline (3), association i seriel fortynding af Fab (4) og dissociation (5). Regenerering trin er ikke repræsenteret (skridt 6-7). Nederste panel: Repræsentative analyserede data viser rå association og dissociation (blå linje) med den tilsvarende 1:1 passer (rød linje). B) øverste panel: repræsentative plade setup for en enkelt ITC køre på en automatiseret ITC instrument med syv eksperimenter i en 96-brønd runde nederste blok. Hvert eksperiment består af tre brønde. Den første brønd (rød) svarer til prøven for cellen (400 µL), den anden godt (grøn) svarer til prøven for sprøjten (120 µL). Tredje godt er efterladt tomme, og de blandet prøver vil blive returneret til denne godt efter eksperimentet gennemført. Forsøg 1, 2 og 7 er buffer i bufferen kontrolelementer. Forsøg 3-5 repræsenterer tredobbelt eksperimenter med glykoprotein (P) i celle og Fab eller ligand (L) i sprøjten. Eksperiment 6 repræsenterer en ligand varme af fortyndingsluftens og bør trækkes fra forsøg 3-5 i dataanalyse. Nederste panel: Repræsentative rå (øverst) og forarbejdede (nederst) ITC data viser Fab (epratuzumab) binding til CD22 ECD produceret i HEK293F celler. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Membran-forankrede glykoproteiner er vigtige for cellefunktion og attraktive terapeutiske mål. Her præsenterer vi en protokol for de strukturelle og Biofysisk karakterisering af ECD af membran glykoproteiner, både alene og i kompleks med lille molekyle ligander og Fab fragmenter. Vi har med succes brugt denne protokol til at bestemme krystalstruktur af de tre N-terminal-de fleste Ig domæner i den ekstracellulære del af menneskelige CD2228, et kritisk samarbejde receptor på B-celler involveret i at holde humorale immunitet i check79. Vi har også kendetegnet bindingssted af CD22 med dens naturlige ligand en2-6 sialyllactose og defineret tilstand af anerkendelse af et terapeutisk antistof mod human CD22. Disse resultater giver indsigt i struktur-funktion relationer af et centralt medlem af familien Siglecs, der har begrænset udtryk på B-celler og en molekylær køreplan for udviklingen af nye CD22 målrettet små molekyle og antistof-baseret Therapeutics. Mens denne protokol blev brugt med succes til en Ig-holdige B-celle receptoren, foreslår vi, at vores tilgang kan anvendes for de strukturelle og Biofysisk karakterisering af enhver membran glycoprotein med et særskilt domæne organisation. I sådanne tilfælde, konstruere design og kombinatorisk N-linked glycan mutationer (enten til Localisation eller Ala) kan evalueres for at finde en konstruktion velegnet til crystal vækst og høj opløsning diffraktion.

At opnå en homogen og ren glycoprotein prøve er af kritisk betydning for crystal vækst og røntgen diffraktion samt for downstream biofysiske karakterisering. N-knyttet glycans til stede på glykoproteiner er i sagens natur heterogen, og kan forårsage konformationelle og kemiske forskelle inden for den glykoprotein, der kan afskrække krystal formation. For at reducere denne mikro-heterogenitet, kan strategier, der indfører punktmutationer for at fjerne Asn rester forudsagt for at havnen N-knyttet glycans, eller ved hjælp af mutant cellelinjer (f.eks HEK293S) efterfulgt af behandling med endoglycosidases (såsom EndoH) betydeligt forbedre krystallisering succes15,21,22. I denne protokol diskutere vi rensning af opløselige glykoproteiner og funktionelle luftrumsblokke, der er udskilt i cellen supernatanten. Glycoprotein sekretion giver en relativt simpel rute mod renhed, uden behov for celle lysis eller tilsætning af barske kemikalier eller rengøringsmidler. Den celle supernatanten, indhenter følgende celle høst er derefter køre direkte over en kolonne, der har affinitet for protein af interesse (f.eks. Ni-NTA for hans markeret glykoproteiner eller LC affinitet for Fab fragmenter). Dog afhængig af kolonnen i brug og betingelserne i cellen supernatanten (fx pH), kan den bindende evne til protein af interesse for kolonnen blive påvirket. Hvis dette er tilfældet, kan det være nødvendigt at koncentrere sig og buffer exchange cellen supernatanten for at forbedre binding til kolonnen. Derudover anbefales det, at kvalitetskontrollen trin under rensningen være ansat til at hjælpe med at vurdere protein renhed. Kører en SDS-PAGE gel eller vestlige skamplet af alle prøver (før, under og efter rensning trin) kan give indsigt i hvorvidt den foreslåede rensning ordning er velegnet til protein af interesse. Hvis kontaminerende bands er synlige på SDS-PAGE, eller hvis flere arter er opnået under rensning (f.eks. flere toppe på størrelse udelukkelse), yderligere rensning foranstaltninger bør overvejes, fx ionbytning kromatografi, at få i renhed og øge chancerne for downstream krystallisering80.

For makromolekylære krystallisering er det ofte afgørende for at opnå høje udbytter af protein af interesse at tillade screening af et stort antal potentielle krystallisering betingelser ved høje protein koncentrationer at finde egnet krystal hits. Generelt, de HEK293 cellelinjer drøftet her (HEK293F og HEK293S) er robust udtryk systemer, og let kan skaleres til at producere mere prøve efter behov. Det er imidlertid muligt, at protein af interesse ikke kan udtrykke tilstrækkeligt inden for disse cellelinjer. I disse tilfælde, andre cellelinjer, såsom Expi293 celler81,82, er blevet fundet for at vise overlegne niveau af protein udtryk og bør betragtes som et alternativ.

Hvis velordnet, diffracting krystaller ikke er fremstillet efter afprøvning af flere konstruktioner af protein om interesse trods høj renhed, kan det være nødvendigt at udvide krystallisering teknikker for at fremme krystal formation. Det har vist sig at Fab fragmenter af antistoffer og nanobodies kan være fremragende krystallisering smagsforstærkere, og fremme velordnet krystal pakning83,84,85. Disse fragmenter kan udtrykt og renset til homogenitet og anvendes i et kompleks med protein af interesse for at fremme krystallisering. Vigtigere, kan Fab fragmenter produceret som beskrevet i afsnit 10 have en tendens til at danne ikke-funktionelle LC dimerer86. Disse dimerer er forurenende stoffer og bør fjernes under rensningen. Vores erfaring, LC dimerer ofte har en anden opbevaring volumen på størrelse udstødelse, eller elueres som en særskilt peak på ionbytning kromatografi, og dermed kan blive fjernet fra Fab rensning - men det ikke er altid tilfældet. Hvis disse teknikker er utilstrækkelige til at fjerne LC dimerer fra Fab rensning, kan yderligere rensning metoder, såsom Protein G affinitet rensning, anvendes til at forbedre renhed.

Alternativ til co-kompleks med Fab fragmenter, veldokumenterede teknikker såsom random matrix microseeding kan forbedre chancerne for at få ordnet krystaller63,70. Denne metode omfatter tilføjelse af små mængder af knust, suboptimal krystaller i den krystallisering tilstand, giver en krystal nucleate at fremme crystal vækst. Dette kan udføres ved hjælp af krystaller af protein af interesse, eller dem med lignende domæne arkitektur og tertiære struktur. Derudover kan random matrix microseeding udføres i forsøg på at krystallisere protein alene eller i kompleks med en Fab fragmentet eller lille molekyle af interesse. De seneste fremskridt i kryo-elektronmikroskopi også gøre denne teknik et attraktivt alternativ til røntgenkrystallografi for at opnå høj opløsning strukturelle oplysninger for molekyler med passende funktioner87,88, 89,90,91.

Når udfasning af røntgen diffraktion datasæt mislykkes ved hr., kan HA iblødsætning være nødvendigt at løse fase af unormale spredning eller isomorphous udskiftning. Inspektion af aminosyresekvens af protein kan give et fingerpeg om strategien for HA forædling, herunder optimale pH for bindende. Uparret cysteines inden for proteinet kan navnlig specifikt binde HA forbindelser, der indeholder kviksølv. Iblødsætning indfødte krystaller med HA forbindelser er en iterativ proces til at bestemme identiteten af den optimale HA sammensatte, sin koncentration og den krævede inkubationstiden. Hvis første iblødsætning forsøg ikke give godt diffracting krystaller indeholdende en HA egnet til udfasning, kan det være nødvendigt at indføre aminosyre udskiftninger for at forbedre sandsynligheden for HA bindende og forbedre unormal signal. Eksempler kan nævnes mutationer for at medtage en gratis cystein rest effektivt binder Hg, Au, Pt eller Pb. angivelse af proteiner for anomale indfasningen seleno-methionin suppleret medier i E. coli er flittigt brugt til anormale afvikling, men en tilsvarende system, der pålideligt inkorporerer seleno-methionin er ikke let tilgængelige for mammale celler i suspension92,93, og er et område af fremtidige udvikling.

Når unliganded strukturen af glycoprotein af interesse er opnået, kan iblødsætning krystaller med lille molekyle ligander udføres for at opnå en struktur af immun receptor-ligand kompleks. Disse data giver en blueprint for den rationelt design af mere specifikke og høj-affinitet ligander, der kan bruges som små-molekyle therapeutics samt giver høj opløsning indsigt i den biologiske funktion af glycoprotein. Når du forsøger at suge glycoprotein krystaller med lille molekyle ligander af interesse, kan inspektion af unliganded krystalstruktur indikere om iblødsætning skal være muligt. Hvis tæt krystal-pakning kontakter er fundet omkring den liganden bindingssted eller omkring regioner forventes at gennemgå konformationelle ændringer på ligand bindende, iblødsætning vil sandsynligvis være problematisk. I dette tilfælde skal andre metoder såsom Co krystallisering af protein-ligand komplekset udføres.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Røntgen diffraktion eksperimenter beskrevet i denne hvidbog blev udført ved hjælp af beamlines, 08-ID og 08-BM på den canadiske lyskilde, som støttes af Canada Foundation for Innovation, naturvidenskab og Engineering Research Council of Canada, den Universitetet i Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, vestlige økonomiske diversificering Canada, Canadas National Research Rådets og de canadiske institutter for sundhedsforskning. Vi vil gerne anerkende den strukturelle & biofysiske Core facilitet, Hospital for syge børn, for adgang til instrumenterne, ITC og BLI. J.E.O. blev støttet af Banting postdoc stipendium BPF-144483 fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. T.S. er en modtager af en Canada Graduate stipendium Master's Award og en Vanier Canada Graduate stipendium fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. Dette arbejde blev støttet af opererer grant PJT-148811 (J.-P.J.) fra den canadiske institutter for sundhedsforskning. Denne forskning blev gennemført, til dels takket være støtte fra Canada forskning stole program (J.-P.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Steritop filter EMD Millipore SCGPS02RE
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel Bio-Rad 4561084
10x glycobuffer 3 New England Biolabs P0702S Comes with Endo H reagent
10x Kinetics Buffer PALL FortéBio 18-1092
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad 1610732
1 mL round bottom 96 well block ThermoFisher 260251
22 mm cover slip Hampton research HR3-231
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
96-3 well INTELLIPLATE  low volume reservior Art Robbins Instruments 102-0001-03
AgeI New England Biolabs R0552S
ÄKTA Pure GE Healthcare
ÄKTA Start  GE Healthcare
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC901008
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC801008
Auto-iTC200 Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes Fisher Scientific MCT150C
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm Hampton research HR4-945
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm Hampton research HR4-947
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm Hampton research HR4-970
Digital Dry Bath Bio-Rad 1660562EDU
E. coli DH5α Invitrogen 18258012
Endo H New England Biolabs P0702S
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP TriForest Labware FBC05000S
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap VWR 89095-258
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL Greiner Bio-One 607180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL Greiner Bio-One 760180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL Greiner Bio-One 606180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL Greiner Bio-One 768180
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus VWR 10118-842
Freestyle 293F cells Thermo Fisher Scientific R79007
Freestyle Expression medium Thermo Fisher Scientific 12338001
Heavy Atom Screens Au Hampton research HR2-444
Heavy Atom Screens Hg Hampton research HR2-446
Heavy Atom Screens M1 Hampton research HR2-448
Heavy Atom Screens M2 Hampton research HR2-450
Heavy Atom Screens Pt Hampton research HR2-442
HEK 293S ATCC ATCC CRL-3022
HisTrap Affinity Column GE Healthcare 17525501
HiTrap KappaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17545811
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17548211
KpnI New England Biolabs R0142S
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-1
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-2
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-3
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-4
Mercuric chloride Sigma 1044170100
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black  Greiner Bio-One 655209
Minstrel DT UV Formulatrix
Multitron Pro shaker Infors HT MP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nanosep 3K Omega centrifugal device PALL Life Science OD003C33
Ni-NTA biosensors PALL FortéBio 18-5102
Octet RED96 PALL ForteBio
Oryx 4 crystallizaiton robot Douglas Instrument ORY-4/1
Platinum chloride Sigma 520632-1g
Precision Plus Protein Standard Bio-Rad 161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Quick Coomassie Stain Protein Ark GEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express EMD Millipore SCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17517201
Tantalum bromide cluster Jena bioscience PK-103
Top96 Crystallization Screen Rigaku Reagents 1009846
Tryphan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
VDX 24-well with sealant Hampton research HR3-172
α2-6 sialyllactose Sigma Aldrich A8556-1mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, J. N., Engelman, D. M. Introduction to the membrane protein reviews: The interplay of structure, dynamics, and environment in membrane protein function. Annu Rev Biochem. 75 (1), 707-712 (2006).
  2. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. J Membr Biol. 248 (4), 611-640 (2015).
  3. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. J Clin Invest. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  4. Hyde, C. A. C., et al. Targeting extracellular domains D4 and D7 of vascular endothelial growth factor receptor 2 reveals allosteric receptor regulatory sites. Mol Cell Biol. 32 (19), 3802-3813 (2012).
  5. Tai, W., Mahato, R., Cheng, K. The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery. J Control Release. 146 (3), 264-275 (2010).
  6. Zarei, O., Benvenuti, S., Ustun-Alkan, F., Hamzeh-Mivehroud, M., Dastmalchi, S. Strategies of targeting the extracellular domain of RON tyrosine kinase receptor for cancer therapy and drug delivery. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (12), 2429-2446 (2016).
  7. Rosman, Z., Shoenfeld, Y., Zandman-Goddard, G. Biologic therapy for autoimmune diseases: an update. BMC Med. 11 (1), 88 (2013).
  8. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  9. Barclay, A. N. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - A master superfamily of interaction molecules. Semin Immunol. 15 (4), 215-223 (2003).
  10. Barclay, A. N. Ig-like domains: evolution from simple interaction molecules to sophisticated antigen recognition. Proc Natl Acad Sci. 96 (26), 14672-14674 (1999).
  11. Aebi, M. N-linked protein glycosylation in the ER. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1833 (11), 2430-2437 (2013).
  12. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  13. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S., Al, E. Glycosylation in the ER and Golgi complex. Mol Cell Biol. (4), Section 17.7 (2000).
  14. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  15. Lee, J. E., Fusco, M. L., Ollmann Saphire, E. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nat Protoc. 4 (4), 592-604 (2009).
  16. Betenbaugh, M. J., Tomiya, N., Narang, S., Hsu, J. T. A., Lee, Y. C. Biosynthesis of human-type N-glycans in heterologous systems. Curr Opin Struct Biol. 14 (5), 601-606 (2004).
  17. Yang, Z., et al. Engineered CHO cells for production of diverse, homogeneous glycoproteins. Nat Biotechnol. 33 (8), 842-844 (2015).
  18. Bláha, J., Kalousková, B., Skořepa, O., Pažický, S., Novák, P., Vaněk, O. High-level expression and purification of soluble form of human natural killer cell receptor NKR-P1 in HEK293S GnTI-cells. Protein Expr Purif. 140, 36-43 (2017).
  19. Bláha, J., Pachl, P., Novák, P., Vaněk, O. Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through high-density transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr Purif. 109, 7-13 (2015).
  20. Chaudhary, S., Pak, J. E., Gruswitz, F., Sharma, V., Stroud, R. M. Overexpressing human membrane proteins in stably transfected and clonal human embryonic kidney 293S cells. Nat Protoc. 7 (3), 453-466 (2012).
  21. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: Solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  22. Davis, S. J., Crispin, M. Solutions to the glycosylation problem for low- and high-throughput structural glycoproteomics. Funct Struct Proteomics Glycoproteins. , 127-158 (2011).
  23. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  24. Zheng, K., Bantog, C., Bayer, R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs. 3 (6), 568-576 (2011).
  25. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 62 (10), 1243-1250 (2006).
  26. Adams, P. D., et al. The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 55 (1), 94-106 (2011).
  27. May, A. P., Robinson, R. C., Vinson, M., Crocker, P. R., Jones, E. Y. Crystal structure of the N-terminal domain of sialoadhesin in complex with 3' sialyllactose at 1.85 Å resolution. Mol Cell. 1 (5), 719-728 (1998).
  28. Ereño-Orbea, J., et al. Molecular basis of human CD22 function and therapeutic targeting. Nat Commun. 8 (1), 764 (2017).
  29. Yu, X. -L., et al. Crystal structure of HAb18G/CD147: implications for immunoglobulin superfamily homophilic adhesion. J Biol Chem. 283 (26), 18056-18065 (2008).
  30. Garman, E., Murray, J. W. Heavy-atom derivatization. Acta Crystallogr - Sect D Biol Crystallogr. 59 (11), 1903-1913 (2003).
  31. Agniswamy, J., Joyce, M. G., Hammer, C. H., Sun, P. D. Towards a rational approach for heavy-atom derivative screening in protein crystallography. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (4), 354-367 (2008).
  32. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (20), 431-440 (2015).
  33. Olieric, V., et al. Data-collection strategy for challenging native SAD phasing. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 421-429 (2016).
  34. Rillahan, C. D., et al. Disubstituted sialic acid ligands targeting Siglecs CD33 and CD22 associated with myeloid leukaemias and B cell lymphomas. Chem Sci. 5 (6), 2398-2406 (2014).
  35. Mesch, S., et al. From a library of MAG antagonists to nanomolar CD22 ligands. ChemMedChem. 7 (1), 134-143 (2012).
  36. Chiu, M. L., Gilliland, G. L. Engineering antibody therapeutics. Curr Opin Struct Biol. 38, 163-173 (2016).
  37. Elgundi, Z., Reslan, M., Cruz, E., Sifniotis, V., Kayser, V. The state-of-play and future of antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 122 (2016), 2-19 (2017).
  38. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms. J Vis Exp. (122), e55659 (2017).
  39. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  40. Brautigam, C. A., Zhao, H., Vargas, C., Keller, S., Schuck, P. Integration and global analysis of isothermal titration calorimetry data for studying macromolecular interactions. Nat Protoc. 11 (5), 882-894 (2016).
  41. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J Vis Exp. (55), e2796 (2011).
  42. Livingstone, J. R. Antibody characterization by isothermal titration calorimetry. Nature. 384 (6608), 491-492 (1996).
  43. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  44. Macauley, M. S., Crocker, P. R., Paulson, J. C. Siglec-mediated regulation of immune cell function in disease. Nat Rev Immunol. 14 (10), 653-666 (2014).
  45. Zaccai, N. R., et al. Structure-guided design of sialic acid-based Siglec inhibitors and crystallographic analysis in complex with sialoadhesin. Structure. 11 (5), 557-567 (2003).
  46. Pantophlet, R., et al. Bacterially derived synthetic mimetics of mammalian oligomannose prime antibody responses that neutralize HIV infectivity. Nat Commun. 8 (1), 1601 (2017).
  47. Leonard, J. P., et al. Epratuzumab, a humanized anti-CD22 antibody, in aggressive non-Hodgkin's lymphoma: phase I/II clinical trial results. Clin Cancer Res. 10 (16), 5327-5334 (2004).
  48. Finn, R. D., et al. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations. Nucleic Acids Res. 45, 190-199 (2017).
  49. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  50. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  51. Gupta, R., Jung, E., Brunak, S. NetNGlyc: Prediction of N-glycosylation sites in human proteins. , (2004).
  52. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
  53. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  54. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  55. Akula, I., Julien, J. -P. Optimization of glycoprotein expression by transient transfection in HEK293 F/S suspension cells. , Available from: https://www.polyplus-transfection.com/wp-content/uploads/2015/09/FectoPRO-Technical-Note-031716.pdf (2015).
  56. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  57. Tan, H. Y., Ng, T. W. Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Opt Commun. 281 (10), 3013-3017 (2008).
  58. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  59. Jonnalgadda, K., Markley, L., Estes, S., Prajapati, S., Takkar, R., Kumaraswamy, S. Rapid, reliable quantitation of Fc-fusion protein in cell culture supernatants. , Available from: https://www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_13.pdf (2018).
  60. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology: Separating protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2018).
  61. Wilkins, M. R., et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 112, 531-552 (1999).
  62. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. J Vis Exp. (78), e50548 (2013).
  63. Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R., Gilliland, G. L. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (8), 927-933 (2010).
  64. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallogr Sect F, Struct Biol Commun. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  65. Luft, J. R., et al. Efficient optimization of crystallization conditions by manipulation of drop volume ratio and temperature. Protein Sci. 16 (4), 715-722 (2007).
  66. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), e2285 (2011).
  67. Sugahara, M., Asada, Y., Ayama, H., Ukawa, H., Taka, H., Kunishima, N. Heavy-atom Database System: A tool for the preparation of heavy-atom derivatives of protein crystals based on amino-acid sequence and crystallization conditions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (9), 1302-1305 (2005).
  68. Boggon, T. J., Shapiro, L. Screening for phasing atoms in protein crystallography. Structure. 8 (7), 143-149 (2000).
  69. Vera, L., Stura, E. A. Strategies for protein cryocrystallography. Cryst Growth Des. 14 (2), 427-435 (2014).
  70. Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, crystallization and structure determination of C. difficile PPEP-1 via microseeding and Zinc-SAD. J Vis Exp. (118), e55022 (2016).
  71. Leslie, A. G. W., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  72. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 303-318 (2016).
  73. Cooper, D. R., Porebski, P. J., Chruszcz, M., Minor, W. X-ray crystallography: Assessment and validation of protein-small molecule complexes for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (8), 771-782 (2011).
  74. Hassell, A. M., et al. Crystallization of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 63 (1), 72-79 (2006).
  75. Muller, I., et al. Guidelines for the successful generation of protein-ligand complex crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 73 (2), 79-92 (2017).
  76. Zhao, Y., et al. Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells. Protein Expr Purif. 67 (2), 182-189 (2009).
  77. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383 (2014).
  78. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (1), 61-69 (2008).
  79. Walker, J. A., Smith, K. G. C. CD22: An inhibitory enigma. Immunology. 123 (3), 314-325 (2008).
  80. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  81. Jain, N. K., et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293. Protein Expr Purif. 134, 38-46 (2017).
  82. Fang, X. T., Sehlin, D., Lannfelt, L., Syvänen, S., Hultqvist, G. Efficient and inexpensive transient expression of multispecific multivalent antibodies in Expi293 cells. Biol Proced Online. 19 (1), 11 (2017).
  83. Löw, C., et al. Nanobody mediated crystallization of an archeal mechanosensitive channel. PLoS One. 8 (10), 77984 (2013).
  84. Hunte, C., Michel, H. Crystallization of membrane proteins mediated by antibody fragments. Curr Opin Struct Biol. 12 (4), 503-508 (2002).
  85. Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Carson, J., Hermans, P., Julien, J. -P. Structural basis of enhanced crystallizability induced by a molecular chaperone for antibody antigen-binding fragments. J Mol Biol. 430 (3), 322-336 (2018).
  86. Spooner, J., et al. Evaluation of strategies to control Fab light chain dimer during mammalian expression and purification: A universal one-step process for purification of correctly assembled Fab. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1472-1477 (2015).
  87. Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: The nuts and bolts. Curr Opin Struct Biol. 46, 1-6 (2017).
  88. Merk, A., et al. Breaking cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  89. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  90. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  91. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  92. Hendrickson, W. a, Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  93. Walden, H. Selenium incorporation using recombinant techniques. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (4), 352-357 (2010).

Tags

Biokemi sag 137 glykoproteiner N-linked glykosylering krystallisering biolayer interferometri isotermisk titrering kalorimetri crystal iblødsætning fragment antigen bindende.
Karakterisering af glykoproteiner med immunglobulin Fold af røntgenkrystallografi og biofysiske metoder
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ereño-Orbea, J., Sicard, T.,… More

Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Akula, I., Julien, J. P. Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques. J. Vis. Exp. (137), e57750, doi:10.3791/57750 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter