Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57750
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2,3
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterar strategier för biofysiska och strukturella karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan genom biolayer interferometri, isotermiska titrering kalorimetri och röntgenkristallografi.

Abstract

Glykoproteiner på ytan av celler spelar avgörande roller i cellulär funktion, inklusive signalering, vidhäftning och transport. På leukocyter, flera av dessa glykoproteiner äger immunglobulin (Ig) veck och är central för immun erkännande och förordning. Här presenterar vi en plattform för design, uttryck och biofysiska karakterisering av det extracellulära området av mänsklig B cell receptor CD22. Vi föreslår att dessa metoder är generellt tillämpliga på karakterisering av däggdjur glykoprotein ectodomains innehållande Ig domäner. Två suspension mänskliga embryonala njurar (HEK) cellinjer, HEK293F och HEK293S, används för att uttrycka glykoproteiner hysande komplexa och hög-mannos glycans, respektive. Dessa rekombinanta glykoproteiner med olika glycoforms att undersöka effekten av glycan storlek och sammansättning på ligand bindande. Vi diskutera protokoll för att studera kinetik och termodynamik av glykoprotein bindningen till biologiskt relevanta ligander och terapeutiska antikroppar kandidater. Rekombinanta glykoproteiner produceras i HEK293S celler är mottagliga för kristallisering på grund av glycan homogenitet, minskad flexibilitet och känslighet för endoglycosidase H behandling. Vi presenterar metoder för blötläggning glykoprotein kristaller med tunga atomer och små molekyler för fas bestämning och analys av liganden bindande, respektive. De experimentella protokoll som diskuteras håll här löftet för karakterisering av däggdjur glykoproteiner att ge inblick i deras funktion och undersöka verkningsmekanismen av therapeutics.

Introduction

Ytproteiner spelar avgörande roller i cellulär funktion. Genom sin extracellulära domäner, kan dessa membranproteiner modulera cell-cell interaktioner, vidhäftning, transport och signalering1,2. Extracellulära lokaliseringen av dessa proteiner gör dem attraktiva mål för utveckling av läkemedel för behandling av ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive cancer och autoimmuna sjukdomar3,4,5 , 6 , 7. en av de vanligaste veck av mänskliga membran protein ectodomains är immunglobulin-liknande (Ig) luckan, som bildas av sju eller fler β-trådar ordnad in i två β-ark8,9. Ig-innehållande glykoproteiner är vanligtvis multi-domän strukturer med Ig domäner sekventiellt ordnade på den extracellulära delen av membran protein10. Post-translationella modifieringar av dessa cellytan proteiner, särskilt N - och O-länkade glycosylation, har visat att spela avgörande roller i deras reglering, vikning, sekretion och funktion11. För att förbättra vår förståelse av deras funktion och bättre design therapeutics som kan rikta dem, krävs tekniker som möjliggör deras detaljerade molekylär karakterisering. Här presenterar vi en kombination av tekniker som möjliggör de biofysiska (biolayer interferometry (BLI) och isotermiska titrering calorimetry (ITC)) och strukturella (röntgenkristallografi) karakterisering av det extracellulära området av Ig-innehållande membranet glykoproteiner, ensamma och i komplex med sin biologiskt relevanta ligander och terapeutiska molekyler (figur 1).

N-länkade glycosylation är en av de vanligaste efter översättning ändringarna på protein från däggdjur, och uppstår under protein mognad inom endoplasmatiska retiklet och Golgi12,13. Cellinjer, såsom mänskliga embryonala (HEK) 293 njurceller, har utvecklats av rekombinant uttryck för stora mängder glykosylerat protein från däggdjur14,15. Denna cellinje har utvecklats i en suspension-format, vilket möjliggör enkel skala upp proteinproduktion till större mängder jämfört med vidhäftande cellinjer. Här, vi använder två HEK293 cellinjer: HEK293F och HEK293 Gnt jag- / - (HEK293S), som skiljer sig genom avsaknad av N-acetylglucosaminyl transferas jag (Gnt jag) i det senare. I sin produktion av komplexa glycans (som ses i HEK293F) är inte möjligt och istället hög mannos-typ glycans (huvudsakligen Man5GlcNAc2) bosatt i N-länkade glycan platser18,19,20 . När du använder dessa två cellinjer parallellt kan studera effekten av glycan storlek och komplexitet på biologisk funktion och terapeutisk inriktning. Faktiskt, glykoproteiner som produceras i HEK293F celler kommer att ha större och mer komplexa glycans jämfört med den samma glykoprotein som produceras i HEK293S celler. Glykoproteiner som produceras i HEK293S celler är mer mottagliga för kristallisering, på grund av sin N-länkade glycans minskade kemiska och konfirmerande heterogenitet. För att ytterligare förbättra crystallizability, glykoproteiner som produceras i HEK293S (men inte HEK293F) celler kan behandlas med det enzym endoglycosidase H (Endo H), vilket resulterar i klyvning av hög mannos glycans sådan att endast en enda N-acetylglukosamin (GlcNAc) biexponentiellt förblir varje N-länkade glycosylation webbplats21,22. Andra metoder kan också användas för att begränsa N-glycan bearbetning i cellerna, till exempel tillägg av glycosyltransferase-hämmare under glykoprotein uttryck, inklusive kifunensine23. Alternativa metoder innebär uttrycket av infödda glykoproteiner (i HEK293F celler) följt av enzymatisk deglycosylation med peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Dock har deglycosylation med PNGaseF visat sig vara mindre effektivt under inhemska förhållanden och ökar aggregation i vissa proteiner; i fall när proteinet förblir vattenlöslig efter behandling, förvärvar det negativa laddningar på ytan på grund av deamidation av aminosyran asparagin restmängd till asparaginsyra24, som kan vara till nackdel för dess kristallisering. Förutspådda N-glycosylation platser kan också vara muterade, oftast till alanin eller glutamin rester, att förhindra N-länkade glycosylation på dessa platser och att generera glykoprotein prover av hög homogenitet. Alternativt kan glykoproteiner produceras i andra eukaryota cellkulturer, inklusive jäst, insekt, och växt-system eller andra däggdjursceller linjer såsom kinesisk hamster cystor (CHO) celler16,17.

Många däggdjur uttryck vektorer, inklusive pHLsec, möjliggöra utsöndringen av rekombinant glykoprotein ectodomains in i cellen medium25. Utsöndringen av glykoproteiner från HEK293 celler möjliggör snabb och enkel rening utan behov av cellys. Tillägg av rening Taggar (t.ex. hans-tag, Strep-tag, flagg-tagg, Myc-tagg, HA-tag) till N eller C slutstationen för målet glykoprotein möjliggör rening av en enda steg affinitetskromatografi. Därefter kan storlek utslagning kromatografi användas för att ge en monodisperse prov för biofysiska och strukturell karaktärisering.

En mycket ren och homogen glykoprotein prov under lämpliga förhållanden kan resultera i väl diffracting kristaller. När en full röntgendiffraktion datamängd har erhållits från dessa kristaller, måste inledande faserna fastställas att beräkna elektrontätheten av glykoprotein. Tack vare ett ständigt ökande antal strukturer i Protein Data Bank (PDB) blivit den vanligaste metoden för att fasa överlägset molekylär ersättning (MR), som använder en relaterade proteinstruktur för att få inledande faserna26. När herr misslyckas på fas problemet, som ibland har varit fallet för multi-Ig domän glykoproteiner27,28,29, krävs dock alternativa metoder. I denna artikel detalj vi en metod att suga kristaller med tunga atomer (HA) för avvecklingen, som krävdes för att lösa strukturen CD22 ectodomain28. Identifiera rätt HA för utfasning är en iterativ process som beror på HA reaktivitet, tillgängliga atomer i glykoprotein i en given kristallgitter och kristallisering lösning30,31. Alternativt, naturligt svavel atomer i cystein och metionin restprodukter kan användas för att fasa om närvarande vid en tillräckligt hög i förhållande till andra atomer i glykoprotein och röntgendiffraktion kan samlas med tillräckligt hög redundans32, 33.

Den biologiska funktionen av membran glykoproteiner är ofta medieras av protein-protein interaktioner eller protein-ligand interaktioner, såsom med kolhydrater. När liganden är tillräckligt liten för att sprida lösningen till glykoprotein bindningsstället i det crystal gallret, kan blötläggning experiment lyckas att få ett glykoprotein-ligand samtidig kristallen strukturerar för att bättre förstå ligand erkännande.

De protokoll som presenteras här är också relevant för att förstå samspelet mellan surface glykoproteiner med syntetiska terapeutiska ligander34,35 och antikropp therapeutics36,37. Kombination med strukturell information, kan bindande kinetik och termodynamik vara kraftfulla att förstå och förbättra deras verkningsmekanismer. En teknik som möjliggör den kinetiska analysen av terapeutiska antikroppar som binder till ett glykoprotein är BLI38,39. BLI använder biosensorer med en orörlig ligand för att mäta association och dissociation kinetik med en bindande partner, att slutligen bestämma en jämvikt dissociationskonstant (KD). BLI är en attraktiv metod eftersom små mängder av glykoproteiner krävs (< 100 µg), experiment tid är snabb (~ 10-15 min per körning), och det kan vara automatiserad. ITC är också användbart för att studera släktskap mellan glykoproteiner och bindande partner40,41,42,43. ITC är mer tid och reagens intensiv, kan värdefull information erhållas om termodynamik vid interaktionen (ΔG, ΔH, ΔS och stökiometri). ITC är också mycket användbart för att studera svaga interaktioner som ofta förknippas med övergående bindningen av surface glykoproteiner till ligander. Dessa tekniker kan dessutom användas i samband att utvärdera bindningen av olika konstruktioner och bedöma effekten av olika N-länkade glycoforms erhålls från att uttrycka glykoprotein i olika cellinjer. Utför BLI och ITC med glykoproteiner produceras i HEK293F, HEK293S och behandlade med Endo H kan ge en fördjupad bild av glycans roll i biologiska aktivitet och terapeutiska engagemang.

Vi tillämpat framgångsrikt dessa protokoll för att karakterisera den extracellulära domänen (ECD) av mänskliga CD2228, ett glykoprotein medlem av familjen sialic acid-bindande Ig-liknande lektiner (Siglecs) som är nödvändig för att upprätthålla B-cell homeostas44 . Vi utförde djupgående konstruktion konstruktion att underlätta kristallisation och fasas röntgen datamängden av HA blötläggning med Hg. Vi också indränkt CD22 kristaller med dess ligand sialic acid (α2-6 sialyllactose) att få en struktur av immun receptor-ligand komplexet och därmed enligt ritningarna struktur-guidad utformningen av glycan mimetika45,46. Dessutom genererade vi fragment antigen bindningen (Fab) av den anti-CD22 terapeutiska antikroppar epratuzumab - terapeutiska kandidat för närvarande i kliniska fas III-prövningar för non-Hodgkins lymfom47- för att avgöra dess affinitet av BLI och ITC till differentially glykosylerat CD22 ECD konstruktioner. Dessa studier visade en avgörande roll för N-länkade glycosylation i epratuzumab engagemang, med potentiella konsekvenser för CD22 erkännande på dysfunktionella B-celler.

Protocol

1. konstruera Design för glykoprotein ECD

  1. Utvärdera den amino syra ordnar av mänskliga CD22 (Uniprot) med hjälp av InterPro och Phyre2 servrar för att identifiera förutspådda domän element och gränserna ligger inom de protein48,49.
  2. Klona sekvensen av mänskliga CD22, saknande signal peptiden, transmembrana och cytosoliska domäner (rester 20-687, härefter CD22 extracellulär domän, CD22 ECD) in i pHLsec däggdjur uttryck vektor25 med restriktionsenzym AgeI och KpnI ( Figur 2 A) 50.
    Obs: PHLsec vektorn är optimerad för överuttryck av lösliga, utsöndras proteinerna i däggdjursceller25. Den här vektorn innehåller en sekretion signal att möjliggöra extracellulära utsöndringen av lösliga glykoproteiner. pHLsec innehåller en C-terminal (hans)6 x tagg för att underlätta affinitet rening från cell supernatanterna med immobiliserade metall affinitet kromatografiska metoder.
  3. Klona trunkerade konstruktioner av CD22 ECD med sekventiell borttagningar C-terminal Ig domäner: domäner 1-6 (rester 20-687), domäner 1-5 (rester 20-592), domäner 1-4 (rester 20-504) och domäner 1-3 (rester 20-330) (siffror 2B och 2 C)50 .
  4. Utvärdera den primära sekvensen av CD22 ECD använder NetNGlyc servern för att identifiera förutspådda N-länkade glycosylation platser finns i konstruera51.
  5. Använda webbplats riktad mutagenes, genom standardprotokollen52 eller överlappande PCR-53, mutera varje förutspådda N-länkade glycosylation plats (Asn till Gln eller Asn ALA) för att skapa konstruktioner av CD22 ECD som innehåller antingen ett enda eller flera N-länkade glycosylation mutationer.
  6. Efter sekvensen kontroll av klonade konstruktioner, omvandla till behöriga E. coli DH5α celler54 och maxi-prep DNA (enligt tillverkarens instruktioner) för att förbereda för transfection.

2. HEK293F och HEK293S Cell etablering

Obs: Alla manipulation av HEK293F eller HEK293S celler med nödvändigt reagens och utrustning måste utföras i en biosäkerhet nivå 2 anläggning i en lämplig biosäkerhet skåp. Den yttre ytan av alla objekt måste steriliseras med 70% etanol lösning eller motsvarande reagens.

  1. Få HEK293F och HEK293S suspension celler (se Tabell av material) och förvaras vid-80 ° C tills klar för användning.
  2. Varm media (se Tabell för material) för 1 h i 37 ° C vattenbad. Överföra 24 mL värmde media till en 125 mL förbryllad cell kultur kolv med en ventilerad cap.
  3. Få 1 mL cell delmängd från-80 ° C och överföring till is.
  4. Inkubera cellerna i 37 ° C vattenbad i ca 1 min, för att delvis Tina cellerna. Över 1 mL av celler från injektionsflaskan till 125 mL förbryllad cell kultur kolven som innehåller media.
  5. Stäng cellen kultur kolven med det ventilerade locket och plats kolven i en shaker inställd på 37 ° C, 130 rpm, 70% luftfuktighet och 8% CO2.

3. HEK293 Cell underhåll

Observera: Cell densiteten och viabiliteten hos celler skall kontrolleras cirka 24 h efter upptining. Det här steget säkerställer att celler återhämtar sig efter inympningen; inledande genomförbarhet bör vara > 80%.

  1. Försiktigt bort 10 µL av celler från den 125 mL mätkolv som innehåller färska suspension celler och överför det till en steril 1,5 mL mikrorör. Tillslut kolven och returnera den till inkubatorn.
  2. Pipettera 10 µL Trypan blå lösning i en 1,5 mL mikrorör som innehåller celler, blanda omsorgsfullt och överför 10 µL till kammaren av räknande bilden.
  3. Sätta i räknande bilden i en automatisk cell räknare och erhålla värden för cell densiteten (i enheter av celler mL-1) och cellernas viabilitet (i procent).
  4. Beräkna volymen av celler som skulle krävas för att Inokulera en färsk 200 mL kultur på en slutlig densitet ~0.8 x 106 celler mL-1 med hjälp av följande ekvationer:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
    Obs: Det kan ta ~ 5 d att erhålla en lämplig cell densiteten för inympning till en 200 mL-kultur.
  5. När cell densiteten är tillräcklig för inokulering av en 200 mL-kultur, uppvärmning media för 1 h i en 37 ° C vatten bad och överför värmde media till biosäkerhet skåp.
  6. Med serologiska pipett noggrant och över volymen som krävs av media (som beräknas enligt ekvation 2) till en 500 mL förbryllad cell kultur med en ventilerad cap.
  7. Med serologisk pipett över volymen som krävs av suspension celler (beräknat i ekvation 1) till 500 mL förbryllad cell kultur kolven som innehåller media.
  8. Mössa ny 200 mL underhåll materiel och returnera den till inkubatorn. Odla cellerna till en densitet på ca 3 x 106 celler mL-1. Passagen celler med en täthet 0.8 x 106 celler mL-1 varje 2-3 d att upprätthålla en stabil kultur av celler (som beskrivs i avsnitt 3.4-3.7). Tillåt inte cellerna att överskrida en densitet på ~ 4 x 106 celler mL-1.

4. transfection av HEK293 celler för glykoprotein uttryck

  1. Beräkna volymen av celler och media som krävs för en 200 mL kultur för transfection 0,8 x 106 celler mL-1 (med ekvationerna 1 och 2 från avsnitt 3.4).
    Anmärkning: Antalet 200 mL transfections som kan utföras beror på cell densiteten av underhåll beståndet.
  2. Överför volymen som krävs av media och celler för transfection till en ny 500 mL cell kultur kolv med en ventilerad mössa och återgå cell beståndet till inkubatorn.
  3. Inkubera cellerna för 1 h före transfection att tillåta celler acklimatisera sig efter klyvning.
  4. Överför 50 µg DNA i ett sterilt 50 mL koniska rör och späd med 5 mL av media. Vakuum filtrera utspädda DNA med en 0,22 µm filtreringssystem till ett annat sterilt rör.
  5. Blanda utspädd, filtrerad DNA i förhållandet 1:1 massa: volym med transfection reagens. Snurra försiktigt DNA: transfection reagenslösningen för att blanda och inkubera lösningen i rumstemperatur i 10 min.
  6. Lägga till DNA: transfection reagenslösningen direkt i cellerna. Inkubera transfekterade celler vid 37 ° C, 130 rpm, 70% luftfuktighet och 8% CO2 i en shaker för 5-7 d.

5. optimering av Cell Transfection villkor

Obs: För att optimera cell transfection villkoren för maximal glykoprotein avkastning, transfect celler på en mängd inledande cell tätheter och bedöma protein avkastning över tiden (figur 3A). Transfect celler som beskrivs i avsnitt 4,6 till 2 x 106 celler vid första cellen tätheter alltifrån 0,5 x 10 mL-1 55. Prov transfections kan skalas till 25 mL totalvolym (125 mL förbryllad cell kultur kolv) med 6 µg av DNA för att spara utrymme och reagenser. Mängden DNA kan också vara optimerad55.

  1. Varje dag efter transfection (dagar 1-7), överföra en 500 µL alikvot från cellkulturen i en steril 1,5 mL mikrorör (i det biosäkerhet skåpet).
  2. Spin aliquoted celler vid 12 000 x g för 5 min i en mikrocentrifug omedelbart efter uppsamlingen. Överför supernatanten till en ny 1,5 mL mikrorör och förvaras vid 4 ° C tills alla prover tas.
  3. Kvantifiera utsöndrade glykoprotein av densitometry
    1. När alla prover tas, alikvotens 20 µL av varje prova in en ny 1,5 mL mikrorör och blanda med 6 µL av icke-reducerande 4 x Laemmli prov buffert.
    2. Koka prover för 5 min vid 95 ° C i en thermo-block. Spinna prover för 1 min på 12 000 x g i en mikrocentrifug.
    3. Ladda 20 µL av varje prov per brunn i en 10-väl 4-15% lutning SDS-PAGE gel. Inkludera ett körfält för protein storlek markörer. Kör gelen vid 250 V för 20 min i en Tris/glycin/SDS buffert.
    4. Efter kör slutförd, överföra gel till Coomassie fläcken (se Tabell för material) för 20 min. de stain gel i ddH2O för 20 min. bild gel.
    5. Utföra densitometry med ImageJ, efter standardprotokoll57,58.
    6. Sammanställa och kartlägga data med 'dagar efter transfection' på x-axeln och 'densitometry värderingar ”på y-axeln (figur 3A).
      Obs: Alternativt om proteinuttryck är otillräcklig för visualisering av SDS-PAGE, tekniker såsom Western blotting kan vara begagnade56.
  4. Kvantifiera utsöndrade glykoprotein av BLI
    1. Använder Ni-NTA biosensorer, kvantifiera mängden utsöndrade glykoprotein använder BLI59.
    2. Sammanställa och kartlägga data med 'dagar efter transfection' på x-axeln och 'proteinkoncentration (µg/mL)' på y-axeln (figur 3A).

6. rening av lösligt glykoprotein från HEK293 supernatanten

  1. Skörda celler genom centrifugering vid 6,371 x g i 20 min vid 4 ° C. Behålla supernatanten innehållande utsöndrade CD22 ECD och filtrera med hjälp av ett 0,22 µm filter.
  2. Ladda supernatanten vid 4 mL min-1 på en pre skakad (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM Imidazol) Ni-NTA kolumn (5 mL volym) använder en bänkmonterade kromatografisystemet.
    Obs: Andra affinitet-baserade rening tekniker kan användas, baserat på affinitet taggarna ingår i konstruera design i avsnitt 1.
  3. Efter supernatant lastning, tvätta kolumnen affinitet med 3-4 kolumn volymer (CV) av tvättbuffert (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM Imidazol).
  4. Eluera renat glykoprotein från kolumnen använda 4-100% lutning (4 CVs) eluering buffert (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 500 mM Imidazol) medan samla fraktioner (figur 3B).
  5. Pool fraktioner som innehåller den eluerade toppen i en centrifugal filtreringsanordning med 10 kDa nominella molekylvikt gräns (NMWL) och koncentrat av centrifugering vid 4000 x g vid 4 ° C i 15 min eller tills provet når en volym av 500 µL.
  6. Injicera koncentrerad glykoprotein i en 500 µL prov ögla och belastning vid 0,5 mL min-1 på en pre skakad (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl) högpresterande storlek utslagning kolumn (cirka 24 mL volym) på ett snabbt protein vätskekromatografi (FPLC) systemet vid 4 ° C medan samla fraktioner (figur 3C).
  7. Kör SDS-PAGE gel av eluerade fraktioner att identifiera fraktioner som innehåller glykoprotein och pool motsvarande fraktioner. SDS-PAGE gelen kan köras som beskrivs i avsnitt 560.

7. Deglycosylation av renat glykoprotein

  1. Mätning av koncentrationen av renat protein efter storlek utslagning kromatografi med hjälp av absorbansen vid 280 nm dividerat med extinktionskoefficient (t.ex. 1,418 M-1 cm-1 för CD22 ECD).
    Obs: Den teoretiska extinktionskoefficient av proteiner av intresse kan beräknas använda servrar såsom ExPASy ProtParam61.
  2. Inkubera renat protein med Endo H för 1 h vid 37 ° C, i ett förhållande av 1 mg av renat protein till 10 µL av kommersiella enzym i 1 X Endo H buffert (enligt tillverkarens instruktioner).
    Obs: Endo H klyver hög mannos glycans produceras i HEK293S lämnar en enda GlcNAc biexponentiellt varje glycosylation webbplats21. Endo H inte klyva glycans på proteiner som produceras i HEK293F celler22, men andra enzymer kan användas för detta ändamål (t.ex.PNGaseF24).
  3. Koncentrera sig deglycosylated ECD till 500 µL och köra gel filtrering kromatografi på en högpresterande utslagning i kolumnen storlek (cirka 24 mL volym) på 0,5 mL min-1 på en FPLC ta bort Endo H och separera varje resulterande aggregat.
  4. Lagra deglycosylated proteinet vid 4 ° C fram till användning i nedströms experiment.

8. kristallisering av glykoproteiner

Obs: Utföra kristallisering prövningar med hjälp av kommersiellt tillgängliga skärmar och ställa in sitter droppe experiment med en kristallisering robot.

  1. Koncentrat ren, deglycosylated ECD till 10 mg mL-1 med en centrifugal filtreringsanordning med 10 kDa NMWL vid 4000 x g (4 ° C) tills önskad koncentration.
  2. För att bestämma proteinkoncentration med hjälp av absorbansen vid 280 nm och dividera med extinktionskoefficient.
  3. Centrifugera provet vid 12 000 x g i 5 minuter vid 4 ° C före kristallisering försök att ta bort oönskade damm eller andra föroreningar från provet.
  4. Fyll behållaren brunnar i 96-väl sittande släppa kristallisering plattor med 80 µL kristallisering lösning från en kommersiell kristallisering skärm.
    Obs: Vi använder sparse-matrix kommersiella skärmar som har utformats utifrån de mest framgångsrika kristallisering villkor med avseende på strukturer som deponeras i det preliminära budgetförslaget.
  5. Använda en kristallisering robot, fördela droppar i brunnen av kristallisering plattan med en total nedgång volym 200 nL i förhållandet 1:1 lösning på renat protein: kristallisering.
  6. När hela plattan har hällts, täta plattan med tejp och placera in en platta imager för inspektion av synliga och ultraviolett ljus.
  7. Inspektera kristallisering plattor omedelbart efter installationen, och de följande veckorna, för att identifiera förhållanden som ger inledande glykoprotein crystal hits med både synliga och ultravioletta ljus.
  8. Ytterligare optimera kristaller erhålls från inledande kristallisering hits med fina skärmar baserat på villkora av den crystal hit eller Astro slumpmässiga matrix mikro-sådd metoder62,63,64,65.
  9. Cryo-skydda eventuella kristaller som saknar tillräcklig cryo-protectant inom villkoret kristallisering av blötläggning kristallen i mor starksprit lösning kompletteras med 20% (v/v) glycerol lösning (eller motsvarande cryo-protectant, såsom etylenglykol eller polyetylenglykol 400).
  10. Mount kristaller i cryoloops och flash frysa dem i flytande kväve innan datainsamling på en hem källa diffractometer eller använder synkrotronstrålning.

9. fasa med tung Atom derivatisering

Obs: Innan någon manipulation av HA föreningar, säkerhetsaspekter måste beaktas. HA föreningar i röntgenkristallografi är utvalda för sin stark affinitet till biologiska molekyler och medföra risker för människors hälsa efter långvarig exponering. Vidta lämpliga säkerhet åtgärder för HA föreningar som nämns i deras säkerhetsdatablad.

  1. För att testa olika HA föreningar, reproducera koncentrationer, och inkubationstider, väl diffracting kristaller som erhållits i avsnitt 8 i en 24-väl kristallisering tallrik med den hängande släpper ånga diffusion metod66.
  2. Avgöra vilken HA kommer att användas för crystal derivatisering. Servrar (t.ex. tunga-Atomen databassystemet67) kan hjälpa till med HA sammansatta urval, se till att de är lämpliga för villkoret protein och kristallisering.
    Obs: HA skärmar är också kommersiellt tillgängliga för enkel screening av mest effektiva HA föreningar för utfasning. En uppsättning av ”magic seven” HA föreningar har tidigare beskrivits för att ha hög sannolikhet för framgång för HA derivatisering68.
  3. Konfigurera arbetsstation för HA blötläggning (figur 4A). Använda en cryoloop, snabbt överföra kristaller till en 0,2 µL släppa på en 22 mm täckglas innehållande HA lösning utspädd i villkoret kristallisering sådan att HA slutliga koncentration varierar från 1-20 mM. Försegla drop och Inkubera under olika lång tid (figur 4B). En bra utgångspunkt är 5, 10, 60 och 90 min och övernattning.
  4. Inspektera visuellt kristaller med ett ljusmikroskop att identifiera förändringar i färg, vilket kan indikera biverkningar till glykoprotein crystal eller crystal derivatisering eller sprickbildning.
  5. Montera kristaller i cryoloops och tillbaka-Blötlägg kristaller för 30 s i tre på varandra följande 0.2 µL droppar innehållande mor sprit lösning kompletteras med 20% (v/v) glycerol (eller alternativa cryo-protectant)69. Back-blötläggning kristallerna tar bort HA förening som var icke-specifikt bunden och minskar partiella beläggningen orsakad av svag HA bindande. Blixt frysa kristaller i flytande kväve (figur 4B).
  6. För datainsamling Använd bearbetning, struktur lösning och förfining, tidigare beskrivna protokoll26,70,71,72.

10. blötläggning glykoprotein kristaller med dess Ligand

  1. Reproducera väl diffracting kristaller som erhållits i avsnitt 8 i en 24-väl kristallisering tallrik med metoden hängande släpper vapor diffusion.
  2. Förbereda en stamlösning av 50 mM ligand i 20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl.
    Obs: Koncentrationen av liganden bör förberedas enligt affinitet till dess glykoprotein. Om affiniteten är okänd, kan det krävas att använda en metod som ITC (avsnitt 12.2) för att fastställa affinitet före början blötläggning experiment. Säkerställa att liganden är lösliga i önskad koncentration i krävs bufferten.
  3. Lägga till varierande koncentrationer av liganden droppe innehållande ECD kristallerna och försegla nedrullningsbara för inkubation vid tiden längder mellan 5 min till 5 d.
  4. Visuellt spåra kristaller med ett ljusmikroskop att identifiera möjliga förändringar i morfologi.
  5. Montera kristaller i cryoloops och cryo-skydda dem i mor sprit lösning kompletteras med 20% (v/v) glycerol (eller andra cryo-protectant såsom etylenglykol eller lågmolekylära polyetylenglykol 400)69.
  6. För datainsamling, bearbetning, struktur lösning och förfining, använda tidigare beskrivna protokoll73,74,75.

11. produktion av Fragment Antigen bindande (Fab)

  1. Subclone gener som motsvarar Fab tung kedja (HC) och lätt kedja (LC) sekvenser av anti-ECD antikroppar, t.ex.,epratuzumab.
    Obs: Alternativt IgG kan vara klyvs av det enzymet papain att generera Fab fragment76.
  2. Transfect celler som beskrivs i avsnitt 4, med följande ändringar:
    1. Använda en slutsumma samlas av DNA för transfection Fab fragment på 90 µg per 200 mL av kulturen.
    2. Transfect HC och LC plasmider i förhållandet 2:1 till att minska mängden LC dimer bildas.
  3. Efter 7 d inkubation, skörda celler, behålla supernatanten och filtrera med en 0,22 µm vakuum-driven filtreringsanordning.
  4. Temperera anti-LC (kappa eller lambda) affinitet kolumner i PBS-bufferten bänkmonterade kromatografi system med.
    Obs: Om LC dimer bildandet är ett problem under reningen, Protein G affinitetskromatografi kan användas som ett alternativ till kappa/lambda LC affinitet rening.
  5. Ladda supernatanten på affinitet kolumn på 4 mL min-1. Efter provet lastning, Tvätta kolonnen med 3-4 CVs av PBS.
  6. Eluera protein från kolumn med en Isokratisk eluering med 100 mM glycin, pH 2.2, omedelbart neutralisera de eluerade fraktionerna med 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9,0 i respektive fraktion.
    Obs: Eluerade Fab kan ytterligare renas genom jonbyteskromatografi och/eller storlek utslagning kromatografi använder en FPLC vid 4 ° C.

12. karakterisering av Fab och liten molekyl binder till glykoprotein

  1. Biolayer interferometri
    1. Förbereda 50 mL 1 x kinetik buffert (1 x PBS, 0,002% (v/v) Tween-20, 0,01% (w/v) BSA).
    2. Hydrate sex Ni-NTA biosensorer i 200 µL 1 x kinetik buffert i 10 min i en pre vätning tallrik.
    3. Späd hans-taggade ECD i 1 mL 1 x kinetik buffert på en slutlig koncentration av 25 ng µL-1. Pipettera seriespädningar av renat Fab in 200 µL 1 x kinetik buffert, med en hög koncentration av 500 nM och efterföljande seriespädningar av 250 nM, 125 nM och 62,5 nM.
    4. Alikvotens reagenser i svart platt botten polypropylen 96 brunnar mikroplattan som visas i figur 5A, där varje väl innehåller 200 µL av den angivna lösningen.
    5. Samla data med hjälp av kinetik analyserna i programvaran datainsamling, som tidigare beskrivits38,39,77 (figur 5A).
      1. Kort, överföra biosensorer i brunnar som innehåller 1 x kinetik buffert till baslinjen för 60 s innan du fyller 25 ng µL-1 av glykoprotein för 240 s (eller tills en tröskel på 1,0 nm nås) vid 1000 rpm.
      2. Efter en andra baslinje på 60 s i 1 x kinetik buffert, överföra biosensorer i brunnar som innehåller seriell utspädning av Fab. Den 180 s association fasen följs därefter av en 180 s dissociation steg 1 x kinetik buffert.
        Obs: Biosensorer kan återanvändas om protokollet ovan följs av en regenerering steg, som består av tre cykler av tvätt av biosensorer i strippning buffert (PBS med 500 mM Imidazol) för 5 s följt av 5 s 1 x kinetik buffert för neutralisering. Biosensorer kan återanvändas upp till ~ 10-20 gånger under samma dag, eller tills dålig data kvalitet observeras.
    6. Analysera data med hjälp av analys programvara (figur 5A):
      1. Under fliken 1, importera och välj data.
      2. Under fliken 2, steg 1: Dataurval, Välj 'Sensor urval' och markera referens wells (rader E och F, figur 5A), rätt klick och sätta för att referera väl. Under steg 2: Subtraktion, Välj 'referens Wells'. Under steg 3: Anpassa y-axeln, Välj 'Baslinje' från tidsintervallet för 0,1 till 59,8 s. Under steg 4: Inter steg korrigering, Välj ”Justera till dissociation.' Under steg 5: Process, Välj 'Savitzky-Golay filtrering' och tryck processdata.
      3. Under fliken 3, Välj 'Association och Dissociation' under steg på analysera med en 1:1 modell. Välj 'Global passande' och 'Grupp av färg'. Högerklicka på kurvor, Välj 'Ändra färg', ange alla kurvor till färgen som du väljer. Välj 'Passa kurvor'. Om data är väl försedda, kan en rapport exporteras genom att välja 'Spara rapport'.
    7. Upprepa experimentet med glykoprotein framställt i HEK293F och HEK293S celler (avsnitt 5) och efter Endo H behandling (avsnitt 7) bedöma effekten, om någon, av olika glycoforms på Fab erkännande. Dessutom upprepa experimentet med ECD truncations att ge insikt i domän(er) bunden av Fab.
  2. Isotermiska titrering kalorimetri Fab-glykoprotein interaktioner
    Obs: ITC-experiment som beskrivs här utförs med hjälp av ett automatiserat ITC-instrument. Experimenten utförs i en 1 mL rund botten 96 brunnar blockera.
    1. Dialyze de ECD och Fab i en enda 4 L bägare 20 mm Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl vid 4 ° C över natten med en uppståndelse bar.
    2. Koncentrera sig dialyseras ECD och Fab 5 µM och 50 µM, respektive, med en centrifugal filter med 10 kDa NMWL, säkerställa att tvätta koncentrator membran tre gånger med 5 mL av dialys buffert vid 4000 x g i 5 min vid 4 ° C före användning.
      Obs: Någon obalans i buffert mellan prover i cellen och spruta kan orsaka oönskad värme att släppas under ITC experiment och resultat i data av dålig kvalitet.
    3. För experiment 1: lägga till 400 µL av ECD till A1 ska läsas in i cellen och 120 µL av Fab väl a2 ska läsas in i sprutan. Väl A3 lämnas tom att återvända blandat prov följande experimentera slutförande. Varje efterföljande experiment kan läggas till plattan i samma ordning (dvs. experimentera 2: cell - A4, spruta - A5, Tom brunn - A6; Figur 5 ( B).
      Obs: Inkludera buffert i buffert kontroller (för att bekräfta instrumentet beter sig väl) i början och slutet av varje kör som ligand (i spruta) i buffert (i cell) kontroller att beräkna värmen av utspädning för provet i sprutan. Den här beräknade värme av utspädning bör sedan subtraheras från experimentell rådata under dataanalys (figur 5B).
    4. Kör totalt 16 injektioner med en volym på 2,5 μl för varje injektion. Injektion varar 5 s, med 180 s avstånd mellan injektionerna. Ställa in cell temperatur till 25 ° C, med en omrörningsanordning hastighet på 750 rpm och filter under 5 s.
      Obs: Baserade på affinitet och termodynamik ECD:Fab samspelet, kan det vara nödvändigt att ändra urvalet koncentrationen, antal injektioner eller cell temperatur.
    5. Analysera data med analys programvara, som tidigare beskrivits40,41,43 (figur 5B).
    6. Upprepa experimentet minst i dubbletter, beräkna medelvärdet KD värden och standardfel. Upprepa experimentet med ECD av olika glycoforms (avsnitt 5 och 6) bedöma effekten, om någon, av glycoforms på termodynamiken av Fab: glykoprotein interaktionen.
  3. För isotermiska titrering kalorimetri ligand-glykoprotein interaktioner, ställa in ITC experimentet som beskrivs i avsnitt 12.2, med följande ändringar:
    1. Dialyze ECD i 4 L av dialys buffert över natten. Lös upp liganden med dialys bufferten efter avslutad dialys.
    2. Utföra ITC experiment vid betydligt högre koncentrationer för att kunna upptäcka låg affinitet interaktioner. För ECD och ligand interaktion, utföra ITC experiment i koncentrationer på 100 µM av ECD i cellen och 1 mM av liganden i sprutan.

Representative Results

Flera konstruktioner av CD22 ECD var framgångsrikt klonade in pHLsec uttryck vektorn och i ökad utsträckning hos däggdjur HEK293F och HEK293S cellinjer (figur 2 och 3A). Alla konstruktioner var renas till storlek homogenitet av storlek utslagning kromatografi och gav ett högt rena prov för kristallisering studier (figur 3B och 3 C). Den CD22-konstruktion som ledde till väl diffracting kristaller var d1-d3 trunkering (rester 20-330), med fem av de sex förutspådda N-länkade glycosylation webbplatser muterat från Asn ALA (N67A, N112A, N135A, N164A och N231A), som produceras i HEK293S celler, så att endast webbplatsen glycosylation på position N101 behölls (denna konstruktion heter CD2220-330, 5A). Kristaller erhölls i flera villkor på skärmen MCSG-1 gles matris, men bästa kristallerna var från ett villkor som innehåller 30% (w/v) polyetylenglykol 4000, 0,2 M litium klorid och 0,1 M Tris, pH 8.5. Dessa infödda kristaller bombarderas 2.1 Å resolution; med hjälp av kända strukturer av Ig domänerna i relaterade Siglec proteiner ger inte några lösningar i herr sökningar.

För att förvärva fasa information, indränkt vi infödda kristaller med en panel av HA föreningar som inkluderade Hg, Pt, Os, Ta och Br vid koncentrationer från 1-20 mM ha förening för en inkubationstid från 5 min till 1 d (figur 4). Vi övervakas kristaller för ändringar i morfologi, och fann att kristaller indränkt med HA förening vid 20 mM resulterade i snabb sprickbildning och upplösning av kristallen. Vi frös sammanlagt 63 kristaller som behållit sin form efter set inkubationstider som var genomdränkt med tantal bromid kluster, platina klorid, kvicksilver acetat och Kvicksilverklorid. Kristaller indränkt med 7 mM av merkuriklorid i 30 min visade avvikande signal på en fluorescens scan på den kanadensiska ljus källa (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Kanada) och tillåtet för flera våglängder avvikande dispersion röntgen datainsamling på en enda Crystal. Dessa datamängder tillät oss att lösa kvicksilver underkonstruktionen i CD2220-330, 5A, som avslöjade en enda kvicksilver atom bunden till en gratis cystein vid position C308 och slutligen tillät oss att bygga struktur CD2220-330, 5A i den stegvis elektronen täthet kartan med AutoBuild78.

När unliganded struktur var löst, var vi intresserade av att lösa strukturen på CD22 bunden till dess ligand, α2-6 siallylactose. Vi beräknas först CD22 affinitet mot α2-6 sialyllactose med ITC för att karakterisera bindande termodynamiken av interaktionen. Vi observerade en affinitet ~ 280 µm och används denna information för att identifiera en initial koncentration (~ 100 x KD) av ligand ska användas för blötläggning av våra infödda CD2220-330, 5A kristaller. Vi indränkt CD2220-330, 5A kristallerna med 25 mM siallylactose för 5 min, 5 d, 40 h, 2 h och 14 h och övervakas för ändringar i crystal morfologi. Sammanlagt ~ 75 kristaller var fryst från olika tidpunkter och sände till CLS synkrotron beamline 08-ID (Saskatoon, Kanada) för remote data collection. Sammanlagt sex röntgen datamängder samlades in från väl diffracting kristaller. Strukturen från varje röntgen datamängd löstes genom herr med unliganded CD2220-330, 5A struktur som en första sökning modell. Resulterande elektrontätheten för alla datamängder inspekterades sedan för positiva densitet i Fo-Fc kartan som skulle motsvara bunden α2-6 sialyllactose inom bindningsstället på CD22. Anmärkningsvärt, alla datamängder samlas in, även de från kristaller indränkt efter endast 5 min av inkubationstiden, innehöll positiva täthet motsvarande liganden i bindningsstället. Övergripande strukturer av unliganded och liganded CD22 var mycket likartade med minimal konfirmerande förändringar, som kan förklara framgången för blötläggning experiment med α2-6 sialyllactose.

Vi kännetecknas nästa antigena ytan av CD22 erkända av terapeutiska antikroppar epratuzumab i BLI och ITC experiment (figur 5). Kinetik och termodynamik profiler av epratuzumab Fab bindningen till CD22 konstruktioner med olika glycoforms visade en ökande affinitet till CD22 med reducerad N-länkade glycan storlek, med upp till en 14-faldigt förbättring i affinitet för mindre glycans (327 nM vs 24 nM i BLI; 188 nM vs 58 nM i ITC). CD22 N-länkade glycan begränsa tillgång av antikropp till dess epitop identifierades genom BLI använda enpunkts-mutanter av CD22 och lösa epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 samtidig kristall struktur28.

Figure 1
Figur 1 . Översikt över glykoprotein karakterisering från construct design till biofysiska och strukturell karaktärisering. (1) primär sekvensanalys av representativa glykoprotein. I grått, den extracellulära domänen (ECD); i grönt, det transmembrana (TM)-segmentet; och i blått, cytosoliska domänen för glykoprotein. Förutspådda N-länkade glycans är märkta. (2) kloning ECD konstruktioner. (3) uttrycket av ECD konstruktioner i däggdjursceller. (4) glykoprotein rening. Medan proteiner som uttrycks i HEK293F kommer att innehålla komplexa glycans, har proteiner som uttrycks i HEK293S hög mannos glycans. Enzymatisk behandling av glykoproteiner producerade i HEK293S celler med Endo H resulterar i glykoproteiner med endast en GlcNAc del på N-länkade glycosylation platser. (5a) glykoproteiner testas för deras bindning till antikroppar av biolayer interferometry (BLI) och isotermiska titrering calorimetry (ITC). Affinitet till små ligander kan också mätas med ITC. (5b) kristallisation prövningar av glykoproteiner med homogena N-länkade glycans, såsom de uttrycks i HEK293S och deglycosylated med Endo H. (6) i vissa fall mutation av N-länkade glycosylation platser är nödvändigt att få kristaller. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 . Utformningen av CD22 ectodomain DNA konstruerar för uttryck i däggdjursceller. A) Representation av pHLsec plasmiden används för övergående transfection CD22 ECD konstruktioner. AgeI och KpnI webbplatser som används för kloning indikeras med röda rutor. B) The CD22 ECD innehåller sju Ig domäner (d1-d7) och 12 förutspådda N-länkade glycosylation platser (i blått). Fyra konstruktioner utformades från den CD22 ECD. C) 1% agarosgel visar PCR-amplikoner av CD22 ECD konstruerar för kloning i pHLsec däggdjur uttryck vektorn. Första lane innehåller 1 kb DNA-markör. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 

Figure 3
Figur 3 . Uttryck och rening av glykoproteiner. (A) effekten av cell densiteten på uttrycket avkastning. Glykoprotein uttryck i småskaliga 25 mL kultur av HEK293F suspension celler transfekterade med tre olika start tätheter av cellerna (0,5 x 106 celler mL-1, 1,0 x 106 celler mL-1och 1,5 x 106 celler mL -1). Kvantifiering utförs genom densitometry från SDS-PAGE i vänstra panelen och kvantitativa BLI i högra panelen. Värdena är representativa för ett glykoprotein preparat. B) kromatogrammet för den första reningssteg för konstruera CD2220-330, 5A från 600 mL av supernatanten med en Ni-NTA affinitet kolonn. Glykoprotein var elueras med en gradient av Imidazol (grå linje), där 100% motsvarar eluering bufferten, vilket innehåller 500 mM Imidazol. Poolade fraktionerna skildras med vertikala linjer. C) storlek-utslagning kromatogrammet för konstruera CD2220-330, 5A med en högpresterande gel filtrering kolumn. Poolade fraktioner från eluering toppen skildras med vertikala linjer. Infällt: Coomassie-färgade SDS-PAGE gel visar renheten av glykoprotein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 . Crystal blötläggning med tunga atomer. (A) prov arbetsstation för blötläggning infödda kristaller med HA föreningar. Alla erforderliga verktyg är märkta. (B) steg följde för att suga kristaller av konstruera CD2220-330, 5A med HA föreningar. Steg 1, öppen brunn innehållande kristaller och överföring kristaller med en slinga till en 0,2 µL droppe på ett täckglas som innehåller HA lösning utspädd i villkoret kristallisering sådan att HA slutliga koncentration varierar från 1-10 mM. Steg 2, förseglar nedgången i kristallisering plattan och inkubera kristaller med HA förening för olika tidsperioder. Steg 3, montera blötläggas kristallen i slingan och back-blöt i 30 s i tre på varandra följande 0.2 µl droppar som innehåller mor sprit lösningen kompletteras med 20% (v/v) glycerol expedieras på ett täckglas. Steg4, flash frysa kristall monterad på en slinga med flytande kväve och placera den i en puck för leverans till den synkrotron beamline. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 . Biolayer interferometri och isotermiska titrering kalorimetri mätningar. (A) företrädare BLI experiment. Övre panelen: exempel på plattan setup för en kinetik experiment, där följande är märkta: 1 x kinetik buffert (B), hans6 x-märkta glykoprotein lastning (L), representativa Fab koncentrationer (62,5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 mM regenerering buffert (R) och 1 x kinetik neutralisering buffert (B). Varje innehåller väl 200 µL lösning. Steg nummer för kinetik experimentet indikeras överst på plattan. Mitten panel: Representativa rådata BLI experiment utförs med Ni-NTA biosensorer och plattan beskrivs i övre panelen. Steg nummer motsvarar baslinjen (1),6 x glykoprotein lastning (2), baslinje (3), hans association i seriell utspädning av Fab (4) och dissociation (5). Regenerering steg är inte representerade (steg 6-7). Nedre panelen: Representativa analyserade data visar raw association och dissociation (blå linje) med motsvarande 1:1 passar (röda linjen). B) övre panelen: representativa plattan setup för en enda ITC kör på ett automatiserat ITC instrument med sju experiment i en 96-väl rund botten blockera. Varje experiment består av tre brunnar. Den första brunnen (röd) motsvarar prov för cellen (400 µL), den andra brunnen (grön) motsvarar till prov för sprutan (120 µL). Tredje lämnas väl Tom och blandat proverna kommer tillbaka till detta väl efter experimentet. Experiment 1, 2 och 7 är buffert i buffert kontroller. Experiment 3-5 representerar tre exemplar experiment med glykoprotein (P) i den cellen och Fab eller ligand (L) i sprutan. Experiment 6 representerar en ligand värme av utspädning kontroll och bör dras från experiment 3-5 under dataanalys. Nedre panelen: Representativa raw (överst) och bearbetade (nederst) ITC data visar Fab (epratuzumab) binder till CD22 ECD tillverkas i HEK293F celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Membran-förankrade glykoproteiner är avgörande för cellens funktion och attraktiva terapeutiska mål. Här presenterar vi ett protokoll för strukturella och biofysiska karakterisering av direktivet om elektronisk handel av membran glykoproteiner, både ensam och i komplex med liten molekyl ligander och Fab fragment. Vi har framgångsrikt använt detta protokoll för att bestämma kristallstrukturen av de tre N-terminal-mest Ig domänerna i den extracellulära delen av mänskliga CD2228, en kritisk samtidig receptor på B-celler som är involverade i att hålla humorala immuniteten i kontrollera79. Vi har också kännetecknas bindande platsen för CD22 med dess naturliga ligand α2-6 sialyllactose och definitionen av erkännande terapeutiska antikroppar mot mänskliga CD22. Dessa resultat ger insikter om relationen struktur och funktion av en viktig medlem av familjen Siglecs som har begränsat uttryck på B-celler och en molekylär färdplan för utvecklingen av nya CD22 riktade liten molekyl och antikroppsbaserade Therapeutics. Medan detta protokoll användes framgångsrikt för en Ig-innehållande B-cells receptor, föreslår vi att vår strategi kan tillämpas för strukturella och biofysiska karakterisering av någon membran glykoprotein med en distinkt domän organisation. I sådana fall konstruera design och kombinatoriska N-länkade glycan mutationer (antingen till Gln eller Ala) kan utvärderas för att hitta en konstruktion passar crystal tillväxt och högupplösta diffraktion.

Att erhålla en homogen och ren glykoprotein prov är av avgörande betydelse för crystal tillväxt och röntgendiffraktion, liksom för nedströms biofysiska karakterisering. N-länkade glycans närvarande på glykoproteiner är till sin natur heterogen och kan orsaka konfirmerande och kemiska heterogenitet inom den glykoprotein som kan avskräcka crystal bildandet. För att minska denna mikro-heterogenitet, kan strategier som införa punktmutationer ta bort Asn rester förutspådde för att hysa N-länkade glycans, eller använda muterade cellinjer (såsom HEK293S) följt av behandling med endoglycosidases (till exempel EndoH) avsevärt förbättra kristallisering framgång15,21,22. I detta protokoll diskuterar vi rening av lösliga glykoproteiner och Folkesson som utsöndras in i cellen supernatant. Glykoprotein sekretion ger en relativt enkel rutt mot renhet, utan behovet av cellys eller tillägg av starka kemikalier eller rengöringsmedel. Cell supernatanten, erhåller följande cell skörd körs sedan direkt över en kolumn som har affinitet för proteinet av intresse (t.ex., Ni-NTA för hans-taggade glykoproteiner eller LC affinitet för Fab fragment). Dock beroende på kolumnen i användning och cellens supernatant (t.ex. pH), kan bindande förmåga av proteinet av intresse för kolumnen påverkas. Om så är fallet, kan det vara nödvändigt att koncentrera sig och buffert exchange cellen supernatanten för att förbättra bindning till kolumnen. Dessutom rekommenderas att kvalitetskontroll steg under reningen användas för att bedöma protein renhet. Kör en SDS-PAGE gel eller Western blot av alla prover (före, under och efter reningssteg) kan ge insikter om föreslagna rening systemet är lämpligt för proteinet av intresse. Om kontaminerande band syns på SDS-PAGE, eller om flera arter erhålls under reningen (t.ex. flera toppar på storlek utslagning), ytterligare reningssteg bör övervägas, t.ex., jonbyteskromatografi, att få i renhet och öka chanserna för nedströms kristallisering80.

För makromolekylära kristallisering är det ofta avgörande för att få hög avkastning av proteinet av intresse att tillåta för screening av ett stort antal potentiella kristallisering villkor vid hög proteinhalt koncentrationer att hitta lämplig crystal hits. Generellt, de HEK293 cellinjer diskuteras här (HEK293F och HEK293S) är robust uttryck system, och kan skalas enkelt för att producera fler prov som behövs. Det är dock möjligt att proteinet av intresse inte kan uttrycka tillräckligt inom dessa cellinjer. I dessa fall andra cellinjer, såsom Expi293 celler81,82, har befunnits Visa överlägsna nivåer av proteinuttryck och bör betraktas som ett alternativ.

Om välordnade, diffracting kristaller inte erhålls efter provning av flera konstruktioner av proteinet av intresse trots hög renhet, kan det vara nödvändigt att utöka kristallisering tekniker för att främja crystal bildandet. Det har visat att Fab fragment av antikroppar och nanobodies kan vara utmärkta kristallisering smakförstärkare och främja välordnad crystal packning83,84,85. Dessa fragment kan vara uttryckt renas till homogenitet och används i ett komplex med proteinet av intresse för att främja kristallisering. Ännu viktigare, kan Fab fragment producerade som beskrivs i avsnitt 10 ha en tendens att bilda icke-funktionella LC dimerer86. Dessa dimerer föroreningar och bör tas bort under reningen. I vår erfarenhet, LC dimerer ofta har en annan lagring volym på storlek utslagning, eller eluera som en distinkt topp på jonbyteskromatografi och således kan tas bort från Fab rening - men detta inte är alltid fallet. Om dessa metoder är otillräckliga för att ta bort LC dimerer från Fab rening, kan ytterligare reningsmetoder, såsom Protein G affinitet rening, användas för att förbättra branschrenheten.

Alternativ till co-komplexering med Fab fragment, väldokumenterade tekniker såsom slumpmässiga matrix microseeding kan förbättra chanserna att få välordnad kristaller63,70. Denna metod innebär tillsats av små mängder av krossade, suboptimal kristaller till kristallisation villkoret, som ger en kristall nucleate att främja crystal tillväxt. Detta kan utföras med kristaller av proteinet av intresse, eller de med liknande domän arkitektur och tertiär struktur. Dessutom kan slumpmässiga matrix microseeding utföras i försök att kristallisera proteinet ensam eller i komplex med en Fab-fragment eller liten molekyl av intresse. Senaste framstegen inom cryo-elektronmikroskopi gör också denna teknik ett attraktivt alternativ till röntgenkristallografi för att erhålla högupplöst strukturell information för molekyler med lämpliga funktioner87,88, 89,90,91.

När utfasningen av röntgendiffraktion datamängder misslyckas av herr, kan HA blötläggning behövas på fas problemet genom avvikande spridning eller isomorft utbyte. Inspektion av den amino syra ordnar av protein kan ge ledtrådar om strategin för HA derivatisering, inklusive optimalt pH för bindning. I synnerhet kan oparade cysteines inom proteinet specifikt binda HA föreningar som innehåller kvicksilver. Blötläggning infödda kristaller med HA föreningar är en iterativ process för att fastställa identiteten för optimal HA föreningen, dess koncentration och krävs inkubationstiden. Om inledande blötläggning försök inte ger väl diffracting kristaller innehållande en HA lämplig för avveckling, kan det nödvändigt att införa aminosyra substitutioner för att förbättra sannolikheten att HA bindande och förbättra avvikande signal. Exempel är mutationer för att inkludera en gratis cysteinrest för att effektivt binda Hg, Au, Pt eller Pb. redovisning av proteiner för avvikande fasa i en seleno-metionin kompletteras media i E. coli används flitigt för att avvikande fasa, men en likvärdigt system som på ett tillförlitligt sätt innehåller seleno-metionin är inte lätt tillgängliga för däggdjursceller i suspension92,93, och är ett område för framtida utveckling.

När den unliganded strukturen i glykoprotein sevärdheter erhålls, kan blötläggning kristallerna med liten molekyl ligander utföras för att erhålla en struktur av immun receptor-ligand komplexet. Dessa data ger en blåkopia för rationell utformning av mer specifika och hög affinitet ligander som kan användas som småmolekylär therapeutics samt ger hög upplösning insikter i den biologiska funktionen av glykoprotein. När du försöker att suga glykoprotein kristaller med liten molekyl ligander sevärdheter, kan inspektion av unliganded kristallstrukturen indikera om blötläggning ska vara möjligt. Om nära crystal-packning kontakter finns runt ligand-bindningsstället eller runt regioner förväntas genomgå konfirmerande förändringar vid ligand bindande, blötläggning kommer troligen vara problematiskt. I det här fallet, bör andra metoder såsom samtidig kristallisation av protein-ligand anläggningen utföras.

Disclosures

Författarna förklarar inget konkurrerande intressen.

Acknowledgments

Röntgendiffraktion experiment som beskrivs i denna uppsats utfördes med linjer 08-ID och 08-BM på den kanadensiska ljuskällan, som stöds av stiftelsen Kanada för Innovation, naturliga vetenskaper och Engineering Research Council of Canada, den University of Saskatchewan, regeringen i Saskatchewan, västra ekonomisk diversifiering Kanada, Kanadas National Research rådets och de kanadensiska instituten av hälsoforskning. Vi skulle vilja erkänna de strukturella & biofysiska Core Facility, sjukhuset för sjuka barn, för tillgång till instrument som ITC och BLI. J.E.O. stöddes av Banting postdoc Fellowship BPF-144483 av kanadensiska institut för hälsa forskning. T.S. är mottagare av en Kanada Graduate stipendium Master Award och Vanier Kanada Graduate stipendium av kanadensiska institut för hälsa forskning. Detta arbete stöds av löpande bidrag PJT-148811 (J.-P.J.) av kanadensiska institut för hälsa forskning. Denna forskning utfördes, delvis tack vare finansiering från programmet Kanada forskning stolar (J.-P.J.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Steritop filter EMD Millipore SCGPS02RE
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel Bio-Rad 4561084
10x glycobuffer 3 New England Biolabs P0702S Comes with Endo H reagent
10x Kinetics Buffer PALL FortéBio 18-1092
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad 1610732
1 mL round bottom 96 well block ThermoFisher 260251
22 mm cover slip Hampton research HR3-231
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
96-3 well INTELLIPLATE  low volume reservior Art Robbins Instruments 102-0001-03
AgeI New England Biolabs R0552S
ÄKTA Pure GE Healthcare
ÄKTA Start  GE Healthcare
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC901008
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC801008
Auto-iTC200 Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes Fisher Scientific MCT150C
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm Hampton research HR4-945
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm Hampton research HR4-947
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm Hampton research HR4-970
Digital Dry Bath Bio-Rad 1660562EDU
E. coli DH5α Invitrogen 18258012
Endo H New England Biolabs P0702S
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP TriForest Labware FBC05000S
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap VWR 89095-258
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL Greiner Bio-One 607180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL Greiner Bio-One 760180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL Greiner Bio-One 606180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL Greiner Bio-One 768180
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus VWR 10118-842
Freestyle 293F cells Thermo Fisher Scientific R79007
Freestyle Expression medium Thermo Fisher Scientific 12338001
Heavy Atom Screens Au Hampton research HR2-444
Heavy Atom Screens Hg Hampton research HR2-446
Heavy Atom Screens M1 Hampton research HR2-448
Heavy Atom Screens M2 Hampton research HR2-450
Heavy Atom Screens Pt Hampton research HR2-442
HEK 293S ATCC ATCC CRL-3022
HisTrap Affinity Column GE Healthcare 17525501
HiTrap KappaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17545811
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17548211
KpnI New England Biolabs R0142S
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-1
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-2
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-3
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-4
Mercuric chloride Sigma 1044170100
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black  Greiner Bio-One 655209
Minstrel DT UV Formulatrix
Multitron Pro shaker Infors HT MP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nanosep 3K Omega centrifugal device PALL Life Science OD003C33
Ni-NTA biosensors PALL FortéBio 18-5102
Octet RED96 PALL ForteBio
Oryx 4 crystallizaiton robot Douglas Instrument ORY-4/1
Platinum chloride Sigma 520632-1g
Precision Plus Protein Standard Bio-Rad 161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Quick Coomassie Stain Protein Ark GEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express EMD Millipore SCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17517201
Tantalum bromide cluster Jena bioscience PK-103
Top96 Crystallization Screen Rigaku Reagents 1009846
Tryphan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
VDX 24-well with sealant Hampton research HR3-172
α2-6 sialyllactose Sigma Aldrich A8556-1mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, J. N., Engelman, D. M. Introduction to the membrane protein reviews: The interplay of structure, dynamics, and environment in membrane protein function. Annu Rev Biochem. 75 (1), 707-712 (2006).
  2. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. J Membr Biol. 248 (4), 611-640 (2015).
  3. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. J Clin Invest. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  4. Hyde, C. A. C., et al. Targeting extracellular domains D4 and D7 of vascular endothelial growth factor receptor 2 reveals allosteric receptor regulatory sites. Mol Cell Biol. 32 (19), 3802-3813 (2012).
  5. Tai, W., Mahato, R., Cheng, K. The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery. J Control Release. 146 (3), 264-275 (2010).
  6. Zarei, O., Benvenuti, S., Ustun-Alkan, F., Hamzeh-Mivehroud, M., Dastmalchi, S. Strategies of targeting the extracellular domain of RON tyrosine kinase receptor for cancer therapy and drug delivery. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (12), 2429-2446 (2016).
  7. Rosman, Z., Shoenfeld, Y., Zandman-Goddard, G. Biologic therapy for autoimmune diseases: an update. BMC Med. 11 (1), 88 (2013).
  8. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  9. Barclay, A. N. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - A master superfamily of interaction molecules. Semin Immunol. 15 (4), 215-223 (2003).
  10. Barclay, A. N. Ig-like domains: evolution from simple interaction molecules to sophisticated antigen recognition. Proc Natl Acad Sci. 96 (26), 14672-14674 (1999).
  11. Aebi, M. N-linked protein glycosylation in the ER. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1833 (11), 2430-2437 (2013).
  12. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  13. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S., Al, E. Glycosylation in the ER and Golgi complex. Mol Cell Biol. (4), Section 17.7 (2000).
  14. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  15. Lee, J. E., Fusco, M. L., Ollmann Saphire, E. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nat Protoc. 4 (4), 592-604 (2009).
  16. Betenbaugh, M. J., Tomiya, N., Narang, S., Hsu, J. T. A., Lee, Y. C. Biosynthesis of human-type N-glycans in heterologous systems. Curr Opin Struct Biol. 14 (5), 601-606 (2004).
  17. Yang, Z., et al. Engineered CHO cells for production of diverse, homogeneous glycoproteins. Nat Biotechnol. 33 (8), 842-844 (2015).
  18. Bláha, J., Kalousková, B., Skořepa, O., Pažický, S., Novák, P., Vaněk, O. High-level expression and purification of soluble form of human natural killer cell receptor NKR-P1 in HEK293S GnTI-cells. Protein Expr Purif. 140, 36-43 (2017).
  19. Bláha, J., Pachl, P., Novák, P., Vaněk, O. Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through high-density transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr Purif. 109, 7-13 (2015).
  20. Chaudhary, S., Pak, J. E., Gruswitz, F., Sharma, V., Stroud, R. M. Overexpressing human membrane proteins in stably transfected and clonal human embryonic kidney 293S cells. Nat Protoc. 7 (3), 453-466 (2012).
  21. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: Solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  22. Davis, S. J., Crispin, M. Solutions to the glycosylation problem for low- and high-throughput structural glycoproteomics. Funct Struct Proteomics Glycoproteins. , 127-158 (2011).
  23. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  24. Zheng, K., Bantog, C., Bayer, R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs. 3 (6), 568-576 (2011).
  25. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 62 (10), 1243-1250 (2006).
  26. Adams, P. D., et al. The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 55 (1), 94-106 (2011).
  27. May, A. P., Robinson, R. C., Vinson, M., Crocker, P. R., Jones, E. Y. Crystal structure of the N-terminal domain of sialoadhesin in complex with 3' sialyllactose at 1.85 Å resolution. Mol Cell. 1 (5), 719-728 (1998).
  28. Ereño-Orbea, J., et al. Molecular basis of human CD22 function and therapeutic targeting. Nat Commun. 8 (1), 764 (2017).
  29. Yu, X. -L., et al. Crystal structure of HAb18G/CD147: implications for immunoglobulin superfamily homophilic adhesion. J Biol Chem. 283 (26), 18056-18065 (2008).
  30. Garman, E., Murray, J. W. Heavy-atom derivatization. Acta Crystallogr - Sect D Biol Crystallogr. 59 (11), 1903-1913 (2003).
  31. Agniswamy, J., Joyce, M. G., Hammer, C. H., Sun, P. D. Towards a rational approach for heavy-atom derivative screening in protein crystallography. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (4), 354-367 (2008).
  32. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (20), 431-440 (2015).
  33. Olieric, V., et al. Data-collection strategy for challenging native SAD phasing. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 421-429 (2016).
  34. Rillahan, C. D., et al. Disubstituted sialic acid ligands targeting Siglecs CD33 and CD22 associated with myeloid leukaemias and B cell lymphomas. Chem Sci. 5 (6), 2398-2406 (2014).
  35. Mesch, S., et al. From a library of MAG antagonists to nanomolar CD22 ligands. ChemMedChem. 7 (1), 134-143 (2012).
  36. Chiu, M. L., Gilliland, G. L. Engineering antibody therapeutics. Curr Opin Struct Biol. 38, 163-173 (2016).
  37. Elgundi, Z., Reslan, M., Cruz, E., Sifniotis, V., Kayser, V. The state-of-play and future of antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 122 (2016), 2-19 (2017).
  38. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms. J Vis Exp. (122), e55659 (2017).
  39. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  40. Brautigam, C. A., Zhao, H., Vargas, C., Keller, S., Schuck, P. Integration and global analysis of isothermal titration calorimetry data for studying macromolecular interactions. Nat Protoc. 11 (5), 882-894 (2016).
  41. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J Vis Exp. (55), e2796 (2011).
  42. Livingstone, J. R. Antibody characterization by isothermal titration calorimetry. Nature. 384 (6608), 491-492 (1996).
  43. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  44. Macauley, M. S., Crocker, P. R., Paulson, J. C. Siglec-mediated regulation of immune cell function in disease. Nat Rev Immunol. 14 (10), 653-666 (2014).
  45. Zaccai, N. R., et al. Structure-guided design of sialic acid-based Siglec inhibitors and crystallographic analysis in complex with sialoadhesin. Structure. 11 (5), 557-567 (2003).
  46. Pantophlet, R., et al. Bacterially derived synthetic mimetics of mammalian oligomannose prime antibody responses that neutralize HIV infectivity. Nat Commun. 8 (1), 1601 (2017).
  47. Leonard, J. P., et al. Epratuzumab, a humanized anti-CD22 antibody, in aggressive non-Hodgkin's lymphoma: phase I/II clinical trial results. Clin Cancer Res. 10 (16), 5327-5334 (2004).
  48. Finn, R. D., et al. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations. Nucleic Acids Res. 45, 190-199 (2017).
  49. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  50. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  51. Gupta, R., Jung, E., Brunak, S. NetNGlyc: Prediction of N-glycosylation sites in human proteins. , (2004).
  52. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
  53. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  54. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  55. Akula, I., Julien, J. -P. Optimization of glycoprotein expression by transient transfection in HEK293 F/S suspension cells. , Available from: https://www.polyplus-transfection.com/wp-content/uploads/2015/09/FectoPRO-Technical-Note-031716.pdf (2015).
  56. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  57. Tan, H. Y., Ng, T. W. Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Opt Commun. 281 (10), 3013-3017 (2008).
  58. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  59. Jonnalgadda, K., Markley, L., Estes, S., Prajapati, S., Takkar, R., Kumaraswamy, S. Rapid, reliable quantitation of Fc-fusion protein in cell culture supernatants. , Available from: https://www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_13.pdf (2018).
  60. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology: Separating protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2018).
  61. Wilkins, M. R., et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 112, 531-552 (1999).
  62. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. J Vis Exp. (78), e50548 (2013).
  63. Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R., Gilliland, G. L. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (8), 927-933 (2010).
  64. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallogr Sect F, Struct Biol Commun. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  65. Luft, J. R., et al. Efficient optimization of crystallization conditions by manipulation of drop volume ratio and temperature. Protein Sci. 16 (4), 715-722 (2007).
  66. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), e2285 (2011).
  67. Sugahara, M., Asada, Y., Ayama, H., Ukawa, H., Taka, H., Kunishima, N. Heavy-atom Database System: A tool for the preparation of heavy-atom derivatives of protein crystals based on amino-acid sequence and crystallization conditions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (9), 1302-1305 (2005).
  68. Boggon, T. J., Shapiro, L. Screening for phasing atoms in protein crystallography. Structure. 8 (7), 143-149 (2000).
  69. Vera, L., Stura, E. A. Strategies for protein cryocrystallography. Cryst Growth Des. 14 (2), 427-435 (2014).
  70. Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, crystallization and structure determination of C. difficile PPEP-1 via microseeding and Zinc-SAD. J Vis Exp. (118), e55022 (2016).
  71. Leslie, A. G. W., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  72. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 303-318 (2016).
  73. Cooper, D. R., Porebski, P. J., Chruszcz, M., Minor, W. X-ray crystallography: Assessment and validation of protein-small molecule complexes for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (8), 771-782 (2011).
  74. Hassell, A. M., et al. Crystallization of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 63 (1), 72-79 (2006).
  75. Muller, I., et al. Guidelines for the successful generation of protein-ligand complex crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 73 (2), 79-92 (2017).
  76. Zhao, Y., et al. Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells. Protein Expr Purif. 67 (2), 182-189 (2009).
  77. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383 (2014).
  78. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (1), 61-69 (2008).
  79. Walker, J. A., Smith, K. G. C. CD22: An inhibitory enigma. Immunology. 123 (3), 314-325 (2008).
  80. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  81. Jain, N. K., et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293. Protein Expr Purif. 134, 38-46 (2017).
  82. Fang, X. T., Sehlin, D., Lannfelt, L., Syvänen, S., Hultqvist, G. Efficient and inexpensive transient expression of multispecific multivalent antibodies in Expi293 cells. Biol Proced Online. 19 (1), 11 (2017).
  83. Löw, C., et al. Nanobody mediated crystallization of an archeal mechanosensitive channel. PLoS One. 8 (10), 77984 (2013).
  84. Hunte, C., Michel, H. Crystallization of membrane proteins mediated by antibody fragments. Curr Opin Struct Biol. 12 (4), 503-508 (2002).
  85. Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Carson, J., Hermans, P., Julien, J. -P. Structural basis of enhanced crystallizability induced by a molecular chaperone for antibody antigen-binding fragments. J Mol Biol. 430 (3), 322-336 (2018).
  86. Spooner, J., et al. Evaluation of strategies to control Fab light chain dimer during mammalian expression and purification: A universal one-step process for purification of correctly assembled Fab. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1472-1477 (2015).
  87. Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: The nuts and bolts. Curr Opin Struct Biol. 46, 1-6 (2017).
  88. Merk, A., et al. Breaking cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  89. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  90. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  91. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  92. Hendrickson, W. a, Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  93. Walden, H. Selenium incorporation using recombinant techniques. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (4), 352-357 (2010).

Tags

Biokemi fråga 137 glykoproteiner N-länkade glycosylation kristallisering biolayer interferometri isotermiska titrering calorimetry crystal blötläggning fragment antigen bindande.
Karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin luckan av röntgenkristallografi och biofysiska tekniker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ereño-Orbea, J., Sicard, T.,… More

Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Akula, I., Julien, J. P. Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques. J. Vis. Exp. (137), e57750, doi:10.3791/57750 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter