Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker

Published: July 5, 2018 doi: 10.3791/57750
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1, 1,2,3
1Program in Molecular Medicine, The Hospital for Sick Children Research Institute, 2Department of Biochemistry, University of Toronto, 3Department of Immunology, University of Toronto
* These authors contributed equally

Summary

Ved biolayer interferometry, isotermiske titrering calorimetry og Røntgenkrystallografi presenterer vi tilnærminger for Biofysiske og strukturelle karakterisering av glykoproteiner med immunglobulin fold.

Abstract

Glykoproteiner på overflaten av cellene spille viktige roller i cellulære funksjoner, inkludert signalisere, vedheft og transport. På leukocytter, flere av disse glykoproteiner har immunglobulin (Ig) folder og er sentralt immun anerkjennelse og regulering. Her presenterer vi en plattform for design, uttrykk og Biofysiske karakteristikk av den ekstracellulære domenet av menneskelig B celle reseptor CD22. Vi foreslår at disse tilnærmingene lag gjelder karakterisering av pattedyr glykoprotein ectodomains som inneholder Ig domener. To suspensjon menneskelige embryonale nyre (HEK) cellelinjer, HEK293F og HEK293S, brukes til å uttrykke glykoproteiner harbouring komplekse og høy-mannose glykaner, henholdsvis. Disse rekombinant glykoproteiner med forskjellige glycoforms kan undersøke effekten av glycan størrelse og sammensetning ligand bindingen. Vi diskutere protokoller for studere kinetics og termodynamikk av glykoprotein binding til biologisk relevante ligander og terapeutiske antistoff kandidater. Rekombinant glykoproteiner produsert i HEK293S celler er mottakelig for krystallisering glycan homogenitet, redusert fleksibilitet og mottakelighet for endoglycosidase H behandling. Vi presenterer metoder for bløtlegging glykoprotein krystaller med tunge atomer og små molekyler for fase besluttsomhet og analyse av ligand binding, henholdsvis. Eksperimentell protokollene diskutert avholde her Love for karakterisering av pattedyr glykoproteiner å gi innsikt i deres funksjon og undersøke virkningsmekanismen av therapeutics.

Introduction

Overflaten proteiner spille viktige roller i cellulære funksjoner. Gjennom det ekstracellulære domenen, kan disse membran proteiner modulerer celle-celle interaksjoner, vedheft, transport og signalisere1,2. Den ekstracellulære lokaliseringen av disse proteinene gjør dem attraktive mål for utviklingen av therapeutics for behandling av en rekke sykdommer, inkludert kreft og autoimmune sykdommer3,4,5 , 6 , 7. en av menneskelig membran proteiner ectodomains vanligste folder er immunglobulin-lignende (Ig) flippen, formet av sju eller flere β-tråder ordnet i to β-ark8,9. Ig-inneholder glykoproteiner er vanligvis flere domener strukturer med Ig domener sekvensielt arrangert på den ekstracellulære delen av membran protein10. Post-translasjonell modifikasjoner av disse celle-overflate proteiner, særlig N - og O-tilknyttet glykosylering, vist seg å spille viktige roller i deres regulering, folding, sekresjon og funksjonen11. For å forbedre vår forståelse av deres funksjon og bedre design legemiddelselskap som kan målrette dem, teknikker er nødvendig som gir mulighet for sine detaljerte molekylær karakterisering. Her presenterer vi en kombinasjon av teknikker som tillater for den Biofysiske (biolayer interferometry (BLI) og isotermiske titrering calorimetry (ITC)) og strukturelle (Røntgenkrystallografi) karakterisering av ekstracellulære domenet Ig inneholder membran glykoproteiner, alene og i kompleks med biologisk relevante ligander og terapeutiske molekyler (figur 1).

N-tilknyttet glykosylering er en av de vanligste post oversettelse modifikasjonene på pattedyr proteiner, og oppstår under protein modning endoplasmatiske retikulum og Golgi12,13. Linjer, som menneskelige embryonale nyre (HEK) 293 celler, er utviklet for rekombinant uttrykk for store mengder glycosylated pattedyr proteiner14,15. Denne cellen linjen har blitt utviklet i suspensjon format, som tillater enkel skalere opp protein produksjon til større mengder i forhold til tilhenger linjer. Her vi benytter to HEK293 linjer: HEK293F og HEK293 Gnt jeg- / - (HEK293S), som forskjellig ved fravær av N-acetylglucosaminyl transferase jeg (Gnt jeg) i det siste. Igjen produksjon av komplekse glykaner (som sett i HEK293F) er ikke mulig og i stedet høy mannose-type glykaner (hovedsakelig mann5GlcNAc2) bor på N-koblede glycan nettsteder18,19,20 . Hvis du bruker disse to linjer i parallell kan studere effekten av glycan størrelsen og kompleksiteten på biologisk funksjon og terapeutiske mål. Faktisk har glykoproteiner produsert i HEK293F celler større, mer komplekse glykaner sammenlignet med den samme glykoprotein produsert i HEK293S celler. Glykoproteiner produsert i HEK293S celler er mer mottakelig for krystallisering, redusert kjemiske og conformational mangfold i sin N-tilknyttet glykaner. For ytterligere å forbedre crystallizability, glykoproteiner produsert i HEK293S (men ikke HEK293F) celler kan behandles med enzymet endoglycosidase H (Endo H), som resulterer i i spalting av høy mannose glykaner slik at bare en enkelt N-acetylglucosamine (GlcNAc) moiety forblir på hver N-tilknyttet glykosylering området21,22. Andre metoder kan også brukes til å begrense N-glycan behandling i cellene, som tillegg av glycosyltransferase hemmere under glykoprotein uttrykk, inkludert kifunensine23. Alternative tilnærminger involvere uttrykket av innfødte glykoproteiner (i HEK293F celler), etterfulgt av enzymatisk deglycosylation bruker peptid N-glycosidase F (PNGaseF). Men har deglycosylation med PNGaseF vist seg å være mindre effektive under innfødt forhold og øker samling i noen proteiner; i tilfeller når protein er løselig etter behandling, får den negative avgifter på overflaten på grunn av deamidation av asparagine rester aspartic syre24, som kan være skadelig for sin krystallisering. Anslått N-glykosylering områder kan også være muterte, oftest til alanin eller glutamin rester, å forhindre N-tilknyttet glykosylering på disse stedene og generere glykoprotein prøver av høy homogenitet. Alternativt kan glykoproteiner produseres i andre eukaryote cellekulturer, inkludert gjær, insekt, og plante systemer eller andre pattedyr linjer som kinesiske hamster eggstokkene (CHO) celler16,17.

Mange pattedyr uttrykk vektorer, inkludert pHLsec, tillate utskillelsen av rekombinant glykoprotein ectodomains i celle middels25. Utskillelsen av glykoproteiner fra HEK293 cellene gir rask og enkel rensing uten behov for cellen lysis. Tillegg av rensing tags (f.eks hans-tag, Strep-tag, flagg-tag, Myc-tag, HA-tag) til N eller C endestasjonen til målet glykoprotein renser av en enkeltsteg affinitet kromatografi. Deretter kan størrelse utelukkelse kromatografi brukes til å gi et monodisperse eksempel for Biofysiske og strukturelle karakterisering.

Et svært rent og homogen glykoprotein utvalg under riktige forhold kan medføre godt diffracting krystaller. Når full X-ray Diffraksjon dataset er innhentet fra slike krystaller, må innledende fasene å beregne elektron tetthet av glykoprotein. Takket være et stadig økende antall strukturer i Protein databank (PDB) blitt langt den mest brukte metoden for innfasing molekylær erstatning (MR), som bruker en relaterte proteinstruktur for å få innledende fasene26. Men når MR ikke løse fase problemet, som noen ganger har vært tilfelle for multi-Ig domenet glykoproteiner27,28,29, er alternative metoder nødvendig. I denne artikkelen detalj vi en metode å suge krystaller med tunge atomer (HA) for innfasing, som var nødvendig for å løse strukturen i CD22 ectodomain28. Identifisere høyre HA for innfasing er en iterativ prosess avhengig HA reaktivitet, tilgjengelig atomer i glykoprotein i en gitt krystall gitter og krystallisering løsning30,31. Alternativt, naturlig svovel atomer i cystein og metionin rester kan brukes for innfasing hvis tilstede i høy nok forholdet til andre atomer i glykoprotein og X-ray Diffraksjon data kan hentes med høy nok redundans32, 33.

Biologiske funksjonen av membran glykoproteiner er ofte formidlet av protein-protein interaksjoner eller protein-ligand interaksjoner, som karbohydrater. Når ligand er liten nok å spre fra løsningen til glykoprotein bindende nettsted i crystal gitteret, kan soaking eksperimenter være vellykket å få en glykoprotein-ligand co krystallstruktur å forstå ligand anerkjennelse.

Protokollene som presenteres her er også relevant for å forstå samspillet av overflate glykoproteiner med syntetisk terapeutiske ligander34,35 og antistoff therapeutics36,37. Kombinert med strukturinformasjon, kan bindende kinetics og termodynamikk være kraftig til å forstå og forbedre deres virkningsmekanismer. En teknikk som gir kinetisk analyse av terapeutiske antistoffer binding til en glykoprotein er BLI38,39. BLI bruker biosensors med en immobilisert ligand for å måle association og dissosiasjon kinetics med bindende partner, til slutt å avgjøre en likevekt dissosiasjon konstant (KD). BLI er en attraktiv fordi små mengder glykoproteiner kreves (< 100 µg), eksperimentet er rask (~ 10-15 minutter per kjørt), og det kan automatiseres. ITC er også nyttig for å studere slektskap mellom glykoproteiner og bindende, partnere,40,,41,,42,,43. Mens ITC er mer tid og reagens intensiv, kan verdifull informasjon fås om termodynamikken for samhandlingen (ΔG, ΔH, ΔS og støkiometri). ITC er også svært nyttig for å studere svake interaksjoner som er ofte forbundet med forbigående binding av overflate glykoproteiner til ligander. Videre kan disse teknikkene brukes sammen til å evaluere binding av ulike konstruksjoner og evaluere effekten av ulike N-tilknyttet glycoforms innhentet fra uttrykke glykoprotein i forskjellige linjer. Utføre BLI og ITC med glykoproteiner produsert i HEK293F, HEK293S og behandlet med Endo H, gir en detaljert visning av rollen glykaner i biologiske aktivitet og terapeutiske engasjement.

Vi brukt har disse protokollene betegner den ekstracellulære domenet (ECD) til menneskelig CD2228medlem glykoprotein Noctuinae sialic acid-bindende Ig-lignende lectins (Siglecs) som er nødvendig for å opprettholde B-celle homeostase44 . Vi utført detaljert konstruere design for å lette krystallisering og faset X-ray datasettet av HA soaking med Hg. Vi også gjennomvåt CD22 krystaller med sin ligand sialic syre (α2-6 sialyllactose) å få en struktur av immun reseptor-ligand komplekset og dermed gitt blåkopier for struktur-guidede utformingen av glycan mimetics45,46. I tillegg vi generert fragment antigen binding (Fab) av anti-CD22 terapeutiske antistoff epratuzumab - en terapeutisk kandidat i fase III kliniske studier for non-Hodgkins lymfom47- for å finne sin forpliktende tilhørighet av BLI og ITC til ulikt glycosylated CD22 ECD lager. Disse studiene viste en avgjørende rolle for N-tilknyttet glykosylering i epratuzumab engasjement, med mulige konsekvenser for CD22 anerkjennelse på dysfunksjonelle B celler.

Protocol

1. bygge Design for glykoprotein ECD

  1. Evaluere aminosyresekvens av menneskelig CD22 (Uniprot) bruker InterPro og Phyre2 servere for å identifisere spådd domene elementer og grenser ligger de protein48,49.
  2. Klone sekvensen av menneskelig CD22, mangler signal-peptid transmembrane og cytosolic domener (rester 20 – 687, heretter CD22 ekstracellulære domenet, CD22 ECD) i pHLsec pattedyr uttrykk vektor25 begrensning enzymer AgeI og KpnI ( Figur 2 A) 50.
    Merk: PHLsec vektoren er optimalisert for overuttrykte av løselig, utskilles proteiner i pattedyrceller25. Denne vektoren inneholder et sekret signal å tillate ekstracellulære utskillelsen av løselig glykoproteiner. pHLsec inneholder en C-terminalen (hans)6 x kode for å lette affinitet rensing fra cellen supernatants bruke immobilisert metall affinitet kromatografi metoder.
  3. Klone avkortet konstruksjoner av CD22 ECD med sekvensiell slettinger av C-terminalen Ig domener: domener 1-6 (rester 20 – 687), domener 1-5 (rester 20-592), 1-4 (rester 20-504)-domener og domener 1-3 (rester 20-330) (tall 2B og 2 C)50 .
  4. Evaluere primære sekvensen av CD22 ECD bruker NetNGlyc serveren identifisere spådd N-tilknyttet glykosylering områder i konstruere51.
  5. Bruker nettstedet-rettet mutagenese, standardprotokoller52 eller overlappende PCR53, mutere hvert spådd N-tilknyttet glykosylering område (Asn til Gln og/eller Asn til Ala) for å opprette konstruksjoner av CD22 ECD som inneholder enten én eller flere N-tilknyttet glykosylering mutasjoner.
  6. Etter sekvens av klonet konstruerer forvandle kompetent E. coli DH5α celler54 og maxi-prep DNA (i henhold til produsentens instruksjoner) for å forberede transfection.

2. HEK293F og HEK293S celle etablering

Merk: Alle manipulasjon av HEK293F eller HEK293S celler med nødvendig reagenser og utstyr må utføres i en biosafety nivå 2 anlegget i en egnet biosafety kabinett. Den ytre overflaten av alle elementer må steriliseres med 70% etanol løsning eller tilsvarende reagens.

  1. Få HEK293F og HEK293S suspensjon celler (se Tabell for materiale) og lagre-80 ° c til du er klar for bruk.
  2. Varm media (se Tabell for materiale) 1t i et 37 ° C vannbad. Overføre 24 mL varmet medier til en 125 mL forbløffet celle kultur kolbe med en ventilerte cap.
  3. Få 1 mL celle aliquot fra-80 ° C og overføre til is.
  4. Inkuber celler i et 37 ° C vannbad for ca 1 min, delvis Tin cellene. Overføre 1 mL av celler fra ampullen til 125 mL forbløffet celle kultur kolbe som inneholder mediefilen.
  5. Lukke celle kultur flasken ventilerte lokket og sted kolbe i en shaker satt til 37 ° C, 130 rpm, 70% fuktighet og 8% CO2.

3. HEK293 Celle vedlikehold

Merk: Cellen tetthet og levedyktigheten til cellene må være sjekket ca 24 timer etter tining. Dette trinnet sikrer at cellene er utvinne etter vaksinering; første levedyktighet skal > 80%.

  1. Nøye fjerne 10 µL av celler fra 125 mL kolbe som inneholder ferske suspensjon cellene og overføre den til en bakteriefri 1.5 mL microtube. Lukk flasken og gå tilbake til inkubator.
  2. Pipetter 10 µL Trypan blå løsning i 1,5 mL microtube som inneholder cellene, bland godt og Overfør 10 µL til kammeret av gjeldende lysbilde.
  3. Sett telling lysbildet i en automatisk celle teller og hente verdier for cellen tetthet (i antall celler mL-1) og celle levedyktighet (i prosent).
  4. Beregne volumet av celler som kreves for å vaksinere en fersk 200 mL kultur på en siste tetthet av ~0.8 x 106 celler mL-1 ved hjelp av følgende formler:
    Equation 1(1)
    Equation 2(2)
    Merk: Det kan ta ~ 5 d hente en egnet cellen tetthet for vaksinering til en 200 mL kultur.
  5. Når cellen tetthet er tilstrekkelig for vaksinasjon av en 200 mL kultur, oppvarming media 1t i en 37 ° C vann bad og overføre varmet media til biosikkerhet kabinett.
  6. Bruker en serologisk pipette, nøye Overfør nødvendig volumet av media (som beregnet ligning 2) til en 500 mL forbløffet celle kultur kolbe med en ventilerte cap.
  7. Bruke en serologisk pipette, overføre et bestemt volum av suspensjon celler (beregnet i Formel 1) i 500 mL forbløffet celle kultur flasken med media.
  8. Cap nye 200 mL vedlikehold bestanden og tilbake til inkubator. Vokse cellene til en tetthet av ca 3 x 106 celler mL-1. Passasje cellene på en tetthet på 0.8 x 106 celler mL-1 hver 2-3-d for å opprettholde en stabil kultur celler (som beskrevet i del 3.4-3,7). Tillat ikke cellene overskrider en tetthet av ~ 4 x 106 celler mL-1.

4. hva HEK293 celler glykoprotein uttrykk

  1. Beregne volumet av celler og media som kreves for en 200 mL kultur for transfection på 0,8 x 106 celler mL-1 (med formler 1 og 2 fra avsnitt 3.4).
    Merk: Antall 200 mL transfections som kan utføres, avhenger av cellen tettheten av vedlikehold aksjen.
  2. Overføre et bestemt volum av media og celler for transfection til en ny 500 mL celle kultur kolbe med en ventilerte cap og returnerer celle aksjen til inkubator.
  3. Inkuber celler 1t før transfection tillate celler til acclimatize etter deling.
  4. Overføre 50 µg DNA i et sterilt 50 mL konisk rør og fortynn med 5 mL av media. Vakuum filtrere utvannet DNA bruker 0.22 µm filtreringssystem i en annen sterilt rør.
  5. Mix utvannet, filtrert DNA i et 1:1 masse: volum forhold med transfection reagens. Forsiktig swirl DNA: hva reagens løsningen for å mikse og ruge løsningen ved romtemperatur for 10 min.
  6. Legge til DNA: hva reagens løsning direkte i cellene. Inkuber transfekterte cellene på 37 ° C, 130 rpm, 70% fuktighet og 8% CO2 i en shaker for 5-7 d.

5. optimalisering av cellen Transfection forhold

Merk: For å optimalisere celle transfection vilkår for maksimal glykoprotein avkastning, transfect cellene på en rekke første celle tettheter og vurdere protein avkastning over tid (Figur 3A). Transfect celler som beskrevet i del 4, på første celle tettheter fra 0,5 x 106 2 x 106 celler mL-1 55. Prøve transfections kan skaleres til 25 mL totalvolum (i 125 mL forbløffet celle kultur kolbe) med 6 µg DNA å spare plass og reagenser. Mengden av DNA kan også være optimalisert55.

  1. Hver dag etter transfection (dager 1-7), overføre en 500 µL aliquot fra cellekultur i en bakteriefri 1.5 mL microtube (i biosikkerhet kabinett).
  2. Spinn aliquoted celler 12 000 x g i 5 min i en microcentrifuge umiddelbart etter samlingen. Overføre nedbryting nye 1,5 mL microtube og butikk på 4 ° C til alle prøvene er oppnådd.
  3. Quantitate utskilles glykoprotein av densitometry
    1. Når alle prøver er oppnådd, aliquot 20 µL av hver smak i en ny 1,5 mL microtube og bland med 6 µL av ikke-reduserende 4 x Laemmli eksempel buffer.
    2. Kok prøver for 5 min på 95 ° C i en thermo-blokk. Spinne prøver for 1 min på 12.000 x g i en microcentrifuge.
    3. Laste 20 µL av hvert utvalg per brønn i en 10-og 4-15% gradient SDS side gel. Inkluder ett kjørefelt for protein størrelse markører. Kjør gel på 250 V for 20 min i en Tris/glysin/SDS buffer.
    4. Etter kjøre at, overføre gel til Coomassie flekk (se Tabell for materiale) i 20 min. de flekken gel i ddH2O i 20 min. bilde gel.
    5. Utføre densitometry med ImageJ, etter standardprotokoller57,58.
    6. Kompilere og plotte dataene med 'dager etter hva' på x-aksen og 'densitometry verdier på y-aksen (Figur 3A).
      Merk: Alternativt hvis protein uttrykk er utilstrekkelig for visualisering av SDS side teknikker som vestlige blotting være brukt56.
  4. Quantitate utskilles glykoprotein av BLI
    1. Bruker Ni-NTA biosensors, quantitate mengden utskilles glykoprotein bruker BLI59.
    2. Kompilere og plotte dataene med 'dager etter hva' på x-aksen og "protein konsentrasjon (µg/mL)' på y-aksen (Figur 3A).

6. rensing av vannløselig glykoprotein fra HEK293 nedbryting

  1. Høste celler med sentrifugering 6,371 x g for 20 min på 4 ° C. Beholde nedbryting inneholder utskilles CD22 ECD og filtrere bruke filtere 0.22 µm.
  2. Laste nedbryting på 4 mL min-1 på en pre equilibrated (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole) Ni-NTA kolonne (5 mL volum) bruker Borstemmaskin kromatografi system.
    Merk: Andre affinitet-baserte rensing teknikker kan brukes, basert på affinitet kodene i konstruksjonen design i del 1.
  3. Etter supernatant lasting, vaske kolonnen affinitet med 3-4 kolonne volum (CV) av vaskebuffer (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 5 mM imidazole).
  4. Elute renset glykoprotein fra kolonnen med en 4-100% gradient (4 CVs) elueringsbufferen (20 mM Tris pH 9.0, 150 mM NaCl, 500 mM imidazole) mens samle brøker (Figur 3B).
  5. Bassenget brøker som inneholder eluted toppen i en sentrifugal filtrering enhet med 10 kDa nominell molekylvekt grense (NMWL) og konsentrere ved sentrifugering 4000 x g på 4 ° C i 15 min eller til prøven når et volum på 500 µL.
  6. Injisere konsentrert glykoprotein i et 500 µL prøve loop og belastning på 0,5 mL min-1 på en pre equilibrated (20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl) høy ytelse størrelse utelukkelse kolonnen (ca 24 mL volum) en rask protein flytende kromatografi (FPLC) system på 4 ° C mens samle brøker (Figur 3C).
  7. Kjør SDS side gel av elut fraksjoner å identifisere brøker som inneholder glykoprotein og basseng tilsvarende fraksjoner. SDS side gel kan kjøres som beskrevet i seksjon 560.

7. Deglycosylation av renset glykoprotein

  1. Måle konsentrasjonen av renset protein etter størrelse utelukkelse kromatografi ved hjelp absorbansen ved 280 nm delt utryddelse koeffisient (f.eks 1.418 M-1 cm-1 for CD22 ECD).
    Merk: Teoretisk utryddelse koeffisient proteiner rundt kan beregnes ved hjelp av servere som ExPASy ProtParam61.
  2. Inkuber renset protein med Endo H 1t ved 37 ° C, i forholdet 1 mg renset protein 10 µL av kommersielle enzym i 1 X Endo H buffer (i henhold til produsentens instruksjoner).
    Merk: Endo H kløyver høy mannose glykaner produsert i HEK293S slik at en enkelt GlcNAc moiety på hver glykosylering området21. Endo H ikke cleave glykaner på proteiner produsert i HEK293F celler22, men andre enzymer kan brukes til dette formålet (f.eksPNGaseF24).
  3. Konsentrere deglycosylated ECD til 500 µL og kjøre gel filtrering Ture på en høy ytelse størrelse utelukkelse kolonne (ca 24 mL volum) på 0,5 mL min-1 på en FPLC å fjerne Endo H og skille alle resulterende aggregat.
  4. Lagre deglycosylated protein på 4 ° C før bruk i nedstrøms eksperimenter.

8. krystallisering av glykoproteiner

Merk: Utføre krystallisering forsøk bruke kommersielt tilgjengelige skjermer og definere sitter slipp eksperimenter ved hjelp av en krystallisering robot.

  1. Konsentrat rene deglycosylated ECD til 10 mg mL-1 bruker en sentrifugal filtrering enhet med 10 kDa NMWL 4000 x g (4 ° C) til ønsket konsentrasjonen er oppnådd.
  2. Bestemme protein konsentrasjonen ved hjelp absorbansen ved 280 nm og dele utryddelse koeffisient.
  3. Sentrifuger eksempel på 12.000 x g i 5 min på 4 ° C før krystallisering forsøk å fjerne uønsket støv eller andre forurensninger fra utvalg.
  4. Fyll tanken brønner 96-brønns sitter plater krystallisering med 80 µL krystallisering løsning fra kommersielle krystallisering skjerm.
    Merk: Vi bruker spredt matrise kommersielle skjermene som er laget basert på de mest vellykkede krystallisering forhold til strukturer avsatt får tilgang til pdb.
  5. Bruke en krystallisering robot, dispensere drops inn i brønnen av krystallisering plate med totalt slipp volum 200 nL i forholdet renset protein: krystallisering løsning på 1:1.
  6. Når hele platen har blitt utlevert, sel platen med tape og Legg i en plate imager for inspeksjon av synlig og ultrafiolett lys.
  7. Inspisere krystallisering plater umiddelbart etter installasjonen, og i de følgende ukene, bruker både synlige og ultrafiolett lys til å identifisere tilstanden som gir første glykoprotein krystall treff.
  8. Videre optimere krystaller fra første krystallisering treff med fine skjermer basert på betingelsen av krystall hit eller tilfeldige matriser mikro-såing metoder62,63,64,65.
  9. Cryo-beskytte noen krystaller mangler tilstrekkelig cryo-protectant i betingelsen krystallisering av soaking krystall i mor brennevin løsning med 20% (v/v) glyserol løsning (eller tilsvarende cryo-protectant, som etylenglykol eller polyethylene glycol 400).
  10. Mount krystaller i cryoloops og flash fryse dem i flytende nitrogen før datainnsamlingen på et hjem kilde diffractometer eller bruke synchrotron stråling.

9. fase med tunge Atom Derivatization

Merk: Før manipulering av HA forbindelser, sikkerhetsaspekter må vurderes. HA forbindelser som brukes i protein krystallografi er valgt for deres sterke slektskap biologiske molekyler og utgjør en risiko for menneskers helse fra langvarig eksponering. Ta nødvendige sikkerhets skritt for HA forbindelser som nevnt i deres HMS-Datablad.

  1. For å teste ulike HA forbindelser, reprodusere konsentrasjoner, og inkubasjon ganger, godt diffracting krystaller innhentet i punkt 8 i en 24-vel krystallisering tallerken med hengende slipp damp diffusjon metoden66.
  2. Bestemme hvilke HA blir brukt for crystal derivatization. Servere (f.eks Heavy-atom databasesystem67) kan hjelpe med HA sammensatt utvalg, de er passende for betingelsen protein og krystallisering.
    Merk: HA skjermer er også kommersielt tilgjengelige for enkel screening av mest effektive HA forbindelser for innfasing. Et sett med "magic syv" HA forbindelser har vært beskrevet tidligere for å ha høy sannsynlighet for suksess for HA derivatization68.
  3. Definere arbeidsstasjon for HA soaking (Figur 4A). Bruker en cryoloop, raskt overføre krystaller til en 0,2 µL slipp på en 22 mm cover slip som inneholder HA løsning utvannet krystallisering tilstanden slik at den endelige konsentrasjonen av HA varierer fra 1-20 mM. Seal drop og ruge for forskjellige lengder tid (Figur 4B). Et godt utgangspunkt er 5, 10, 60 og 90 min og overnatting.
  4. Visuelt inspisere krystaller med en lys mikroskop for å identifisere mulige sprekker eller endringer i fargen, som kan angi bivirkninger glykoprotein krystall eller krystall derivatization.
  5. Krystaller i cryoloops og tilbake-suge krystaller for 30 s i tre påfølgende 0,2 µL drops inneholder mor brennevin løsning med 20% (v/v) glyserol (eller alternative cryo-protectant)69. Tilbake-soaking krystallene fjerner HA sammensatte som var nonspecifically bundet og reduserer delvis bruk forårsaket av svak HA bindende. Flash fryser krystallene i flytende nitrogen (Figur 4B).
  6. Innsamling, behandling, struktur løsning og raffinement, bruke beskrevet tidligere protokoller26,70,71,72.

10. soaking glykoprotein krystaller med sin Ligand

  1. Reprodusere godt diffracting krystaller innhentet i punkt 8 i en 24-vel krystallisering plate med metoden hengende slipp damp spredning.
  2. Forberede en lager løsning av 50 mM ligand i 20 mM Tris, pH 9.0, 150 mM NaCl.
    Merk: Konsentrasjonen av ligand skal tilberedes affinitet til sin glykoprotein. Hvis affinitet er ukjent, kan det være nødvendig å bruke en metode som ITC (delen 12.2) til å fastslå affinitet før begynnelsen soaking eksperimenter. Kontroller at ligand er løselig på ønsket konsentrasjonen i nødvendig bufferen.
  3. Legge til ulike konsentrasjoner av ligand drop inneholder ECD krystaller og forsegle slipp for inkubasjon på tidspunktet-lengder mellom 5 min 5 d.
  4. Visuelt spor krystaller med en lys mikroskop for å identifisere mulige endringer i morfologi.
  5. Montere krystaller i cryoloops og cryo-beskytte dem i mor brennevin løsning med 20% (v/v) glyserol (eller andre cryo-protectant som etylenglykol eller lav molekylvekt polyetylen polypropylenglykol 400)69.
  6. Bruk beskrevet tidligere protokoller73,74,75for innsamling, behandling, struktur løsning og raffinement.

11. produksjon av Fragment Antigen bindende (Fab)

  1. Subclone gener som tilsvarer Fab tunge kjede (HC) og lys kjeden (Langbane) sekvenser av anti-ECD antistoffer, f.eksepratuzumab.
    Merk: Alternativt IgG kan være kløyvde av enzymet papain generere Fab fragmenter76.
  2. Transfect celler som beskrevet i del 4, med følgende endringer:
    1. Bruke en totale masse DNA transfection av Fab fragmenter av 90 µg per 200 mL kultur.
    2. Transfect HC og LC plasmider i forholdet 2:1 å redusere mengden av LC dimer formasjon.
  3. Etter 7 d med inkubering, høste celler, beholde nedbryting og filtrere en 0.22 µm vakuum-drevet filtrering enhet.
  4. Equilibrate anti-LC (kappa eller lambda) affinitet kolonner i PBS buffer bruker Borstemmaskin kromatografi system.
    Merk: Hvis LC dimer formasjon er et problem under renselsen, Protein G affinitet kromatografi kan brukes som et alternativ til kappa/lambda LC affinitet rensing.
  5. Last nedbryting affinitet kolonne på 4 mL min-1. Følgende eksempel lasting, vask kolonne med 3-4 CVs på PBS.
  6. Elute protein fra kolonne ved hjelp av en isocratic elueringsrør med 100 mM glysin, pH 2.2, umiddelbart nøytralisere eluted fraksjoner med 10% (v/v) 1 M Tris, pH 9.0 i hver fraksjon.
    Merk: Det eluted Fab kan bli ytterligere renset ionebytte kromatografi og/eller størrelse utelukkelse kromatografi bruker en FPLC på 4 ° C.

12. karakterisering av Fab og små molekyl Binding til glykoprotein

  1. Biolayer interferometry
    1. Forberede 50 mL 1 x kinetics buffer (1 x PBS, 0,002% (v/v) Tween-20, 0,01% (w/v) BSA).
    2. Hydrat seks Ni-NTA biosensors i 200 µL 1 x kinetics bufferen i 10 minutter i en pre wetting plate.
    3. Fortynne hans-merket ECD i 1 mL 1 x kinetics bufferen i en siste konsentrasjon av 25 ng µL-1. Pipetter føljetong fortynninger av renset Fab i 200 µL av 1 x kinetics buffer, med en høy konsentrasjon av 500 nM og påfølgende føljetong fortynninger av 250 nM, 125 nM og 62,5 nM.
    4. Aliquot reagenser i svart flat bunn polypropylen 96-brønnen microplate som vist i figur 5A, der hver også inneholder 200 µL av angitte løsningen.
    5. Samle inn data ved hjelp av Kinetics analyser i datainnsamling programvaren, som beskrevet tidligere38,39,77 (figur 5et).
      1. Kort, overføre biosensors i brønner som inneholder 1 x kinetics buffer opprinnelige 60 før lasting 25 ng µL-1 av glykoprotein for 240 s (eller til en terskel 1,0 nm nås) på 1000 rpm.
      2. Etter en andre opprinnelig plan 60 s i 1 x kinetics buffer, overføringshastighet på biosensors i brønner som inneholder den serielle fortynning av Fab. Den 180 s association fasen er deretter etterfulgt av et 180 s dissosiasjon trinn i 1 x kinetics buffer.
        Merk: Biosensors kan brukes på nytt hvis over protokollen etterfølges av et gjenfødelse skritt, som består av tre sykluser av vaske biosensors i stripping buffer (PBS med 500 mM imidazole) 5 s etterfulgt av 5 s i 1 x kinetics bufferen for nøytralisering. Biosensors kan gjenbrukes opp til ~ 10-20 ganger under samme dag eller før dårlig data kvalitet er observert.
    6. Analysere dataene med analyseprogramvare (figur 5et):
      1. Under kategorien 1, import og velg.
      2. Under fanen 2, trinn 1: Datautvalget, velg 'Sensor utvalg' og høydepunkt referanse brønner (rader E og F, figur 5et), høyreklikk og angitt til å referere godt. Under trinn 2: Subtraksjon, velg "referanse brønner". Under trinn 3: Justere y-aksen, velg 'Opprinnelig' tidsområdet 0,1 til 59,8 s. Under trinn 4: Mellom trinn korreksjon, velg "Lås til dissosiasjon." Under trinn 5: Prosessen, velg "Savitzky-Golay filtrering" og trykk prosessdata.
      3. Under kategorien 3, velger du 'Association og dissosiasjon' under trinn analyser med en 1:1. Velg 'Global passende' og 'Gruppe farge'. Høyreklikk kurver, velg "Endre farge", setter alle kurver til fargen du velger. Velg "Passer kurver". Hvis dataene er godt utstyrt, kan en rapport eksporteres ved å velge "Lagre rapport".
    7. Gjenta eksperimentet med glykoprotein produsert i HEK293F og HEK293S celler (del 5) og følge Endo H behandling (del 7) å vurdere effekt, om noen, av forskjellige glycoforms på Fab anerkjennelse. Videre gjenta eksperimentet med ECD truncations å gi innsikt i domenene bundet av Fab.
  2. Isotermiske titrering calorimetry Fab-glykoprotein interaksjon
    Merk: ITC eksperimenter beskrevet her utføres ved hjelp av et automatisert ITC instrument. Eksperimenter er gjennomført i en 1 mL rundt bunnen 96-brønns blokk.
    1. Dialyze ECD og Fab i en enkelt 4 liters kanne 20 mm Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl på 4 ° C over natten med rør bar.
    2. Konsentrere seg dialyzed ECD og Fab 5 µM og 50 µM, henholdsvis, bruker en sentrifugal filter med 10 kDa NMWL, sikre å vaske konsentrator membraner tre ganger med 5 mL dialyse buffer på 4000 x g i 5 min på 4 ° C før bruk.
      Merk: Alle mismatch i buffer mellom prøvene i cellen og sprøyte kan forårsake uønsket varme frigis under ITC eksperiment og resultatet i data av dårlig kvalitet.
    3. For eksperiment 1: legge til 400 µL av ECD til A1 lastes i cellen og 120 µL av Fab til godt A2 lastes i sprøyten. Vel A3 er tomt tilbake blandet prøve følgende eksperimentere ferdigstillelse. Hver påfølgende eksperiment kan legges til platen i samme rekkefølge (dvs. forsøk 2: cell - A4, sprøyte - A5, tom vel - A6; Figur 5 B).
      Merk: Inkluderer buffer i bufferen kontroller (for å bekrefte maskinen oppfører seg bra) på begynnelsen og slutten av hvert løpe, samt ligand (i sprøyten) i bufferen (i celle) kontroller beregne varmen av fortynning for prøven i sprøyten. Dette beregnede varmen av fortynning skal deretter trekkes fra experimental rådata under dataanalyse (figur 5B).
    4. Kjør totalt 16 injeksjoner med et volum på 2,5 μL for hver injeksjon. Injeksjon varigheten er 5 s, med 180 s avstanden mellom injeksjoner. Angi cellen temperaturen 25 ° c, med en omrøring hastigheten på 750 rpm og en filter periode 5 s.
      Merk: Basert på affinitet og termodynamikk av ECD:Fab interaksjon, kan det være nødvendig å endre utvalg konsentrasjonen, antall injeksjoner eller cellen temperatur.
    5. Analysere data med analyseprogramvare, som beskrevet tidligere40,41,43 (figur 5B).
    6. Gjenta eksperimentet minst i duplikater, mener KD verdier og standardfeil. Gjenta eksperimentet med ECD av ulike glycoforms (deler 5 og 6) til å vurdere effekt, om noen, av glycoforms på termodynamikken for Fab: glykoprotein samhandlingen.
  3. For isotermiske titrering calorimetry ligand-glykoprotein samhandlinger, definere ITC eksperimentet som beskrevet i delen 12,2, med følgende endringer:
    1. Dialyze ECD 4 l dialyse bufferen over natten. Oppløse ligand bruker dialyse bufferen etter dialyse.
    2. Utføre ITC eksperimenter ved betydelig høyere konsentrasjoner kunne oppdage lav-affinitet interaksjoner. ECD og ligand samhandling, utføre ITC eksperimenter i konsentrasjoner på 100 µM av ECD i cellen og 1 mM av ligand i sprøyten.

Representative Results

Flere konstruksjoner av CD22 ECD var vellykket klonet i pHLsec uttrykk vektor og overexpressed i pattedyr HEK293F og HEK293S linjer (figur 2 og 3A). Alle konstruksjoner var renset til størrelse homogenitet av størrelse utelukkelse kromatografi og gitt en svært ren prøve for krystallisering studier (figur 3B og 3 C). Den CD22 konstruksjonen som førte til godt diffracting krystaller var d1-d3 trunkering (rester 20-330), med fem av seks spådd N-tilknyttet glykosylering nettsteder mutert fra Asn til Ala (N67A, N112A, N135A, N164A og N231A), produsert i HEK293S celler, slik at bare webområdet glykosylering posisjonen N101 ble beholdt (denne konstruksjonen er oppkalt CD2220-330, 5A). Krystaller ble oppnådd i flere forhold av MCSG-1 spredt matrise skjermen, men de beste krystallene var fra en tilstand med 30% (w/v) polyetylenglykol 4000 og 0,2 M litium klorid 0.1 M Tris, pH 8.5. Disse innfødt krystaller diffracted 2.1 Å oppløsning; bruke kjente strukturer av Ig domener av relaterte Siglec proteiner ikke gi noen løsninger i MR søk.

For å erverve innfasing informasjon, gjennomvåt vi innfødte krystaller med en HA forbindelser som inkludert Hg, Pt, Os, Ta og Br konsentrasjonene varierer fra 1-20 mM HA sammensatte i inkubasjon tid fra 5 min 1 d (Figur 4). Vi overvåket krystaller for endringer i morfologi, og fant at krystaller fuktet med HA ved 20 mM resulterte i rask sprengning og oppløsning av krystall. Vi frøs totalt 63 krystaller som beholdt sin form etter angi inkubasjon ganger var dynket med Tantal bromide klynge, platina klorid, kvikksølvsalter acetate og mercuric chloride. Krystaller fuktet med 7 mM mercuric chloride i 30 min viste uregelrett signal på en fluorescens skanning på den kanadiske lys kilde (CLS) 08-BM beamline (Saskatoon, Canada) og tillatt for flere bølgelengde uregelrett spredning X-ray datainnsamling på en enkelt krystall. Disse datasett tillatt oss å løse kvikksølv underkonstruksjonen av CD2220-330, 5A, som viste en enkelt kvikksølv atom bundet til en gratis cystein posisjonen C308 og til slutt tillatt oss å bygge strukturen i CD2220-330, 5A i den gradvis elektron tetthet kart benytter AutoBuild78.

Når unliganded strukturen ble løst, var vi interessert i å løse strukturen til CD22 bundet til sin ligand, α2-6 siallylactose. Vi først beregnes slektskap av CD22 mot α2-6 sialyllactose med ITC for å karakterisere bindende termodynamikken for samhandlingen. Vi observerte en affinitet av ~ 280 µM og brukte denne informasjonen til å identifisere en innledende konsentrasjon (~ 100 x KD) av ligand til bruk for dryppende av våre innfødte CD2220-330, 5A krystaller. Vi gjennomvåt CD2220-330, 5A krystaller med 25 mM siallylactose for 5 min, 2 timer, 14 h, 40 h og 5 d og overvåkes for endringer i crystal morfologi. Totalt ~ 75 krystaller var frosset fra ulike tidspunkt og sendte CLS synchrotron beamline 08-IDen (Saskatoon, Canada) for ekstern datainnsamling. Totalt seks X-ray datasett ble Hentet fra godt diffracting krystaller. Strukturen fra hver X-ray datasett ble løst av MR bruker unliganded CD2220-330, 5A struktur som en første søket modell. Den resulterende elektron tettheten for alle datasett ble deretter inspisert for positiv tetthet i Fo-Fc kartet som ville svarer bundne α2-6 sialyllactose innen området binding av CD22. Bemerkelsesverdig, alle datasett samlet, selv de fra krystaller gjennomvåt etter bare 5 min incubation tid, inneholdt positiv tetthet tilsvarer ligand binding området. Generelle strukturer av unliganded og liganded CD22 var svært lik med minimal conformational endringer, som kan forklare suksessen til soaking eksperimenter med α2-6 sialyllactose.

Vi neste preget antigen overflaten av CD22 anerkjent av terapeutiske antistoff epratuzumab BLI og ITC eksperimenter (figur 5). Kinetics og termodynamikk profiler av epratuzumab Fab binding til CD22 konstruksjoner med forskjellige glycoforms viste en økende affinitet til CD22 med redusert N knyttet glycan størrelse, med opp til en 14-fold forbedring i affinitet for mindre glykaner (327 nM vs 24 nM i BLI; 188 nM vs 58 nM i ITC). CD22 N-koblede glycan begrense tilgangen for antistoffer mot sin epitope ble identifisert ved å BLI med ett-punkts mutanter av CD22 og løse epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 co krystall struktur28.

Figure 1
Figur 1 . Oversikt over glykoprotein karakterisering fra konstruere design til Biofysiske og strukturelle karakterisering. (1) primære sekvens analyse av representant glykoprotein. Grå, den ekstracellulære domenet (ECD); i grønt, transmembrane (TM) segmentet; og i blått, glykoprotein cytosolic domenet. Anslått N-koblede glykaner er merket. (2) kloning av ECD konstruksjoner. (3) uttrykk for ECD konstruksjoner i pattedyrceller. (4) glykoprotein rensing. Mens proteiner i HEK293F vil inneholde komplekse glykaner, har proteiner i HEK293S høy mannose glykaner. Enzymatisk behandling av glykoproteiner produsert i HEK293S celler med Endo H gir glykoproteiner med bare GlcNAc moiety på N-tilknyttet glykosylering nettsteder. (5a) glykoproteiner er testet for sin binding til antistoffer av biolayer interferometry (BLI) og isotermiske titrering calorimetry (ITC). Affinitet til små ligander kan også måles ved ITC. (5b) krystallisering forsøk av glykoproteiner med homogen N-tilknyttet glykaner, som uttrykt i HEK293S og deglycosylated med Endo H. (6) i noen tilfeller mutasjon av N-tilknyttet glykosylering nettsteder er nødvendig for å oppnå krystaller. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Utformingen av CD22 ectodomain DNA konstruerer uttrykk i pattedyrceller. A) representasjon av pHLsec plasmider brukes til midlertidig transfection av CD22 ECD konstruksjoner. AgeI og KpnI områder brukes for kloning angis med røde bokser. B) The CD22 ECD inneholder syv Ig domener (d1-d7) og 12 spådd N-tilknyttet glykosylering steder (i blått). Fire konstruksjoner er utviklet CD22 ECD. C) 1% agarose gel viser PCR amplicons av CD22 ECD konstruerer for kloning i pHLsec pattedyr uttrykk vektor. Første lane inneholder 1 kb DNA markør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 

Figure 3
Figur 3 . Uttrykket og rensing av glykoproteiner. A) effekten av cellen tetthet på uttrykk gir. Glykoprotein uttrykk i småskala 25 mL kultur HEK293F suspensjon celler transfekterte bruker tre ulike Start tettheter av celler (0.5 x 106 celler mL-11.0 x 106 celler mL-1og 1,5 x 106 celler mL -1). Kvantifisering utført av densitometry fra SDS-side i informasjonsvinduet og kvantitative BLI i høyre panel. Verdiene er representant for en glykoprotein forberedelse. B) Chromatogram av første rensing skritt for konstruere CD2220-330, 5A fra 600 mL av nedbryting bruker en Ni-NTA affinitet kolonne. Glykoprotein var elut ved hjelp av en gradient imidazole (grå linje), der 100% tilsvarer elueringsbufferen, som inneholder 500 mM imidazole. Grupperte fraksjoner er avbildet med loddrette linjer. C) størrelse-utestenging chromatogram for konstruere CD2220-330, 5A bruker en høy-ytelse gel filtrering kolonnen. Grupperte fraksjoner elueringsrør toppen er avbildet med loddrette linjer. Innfelt: Coomassie-farget SDS side gel viser renheten av glykoprotein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Crystal soaking med tunge atomer. A) eksempel arbeidsstasjon for bløtlegging innfødt krystaller med HA forbindelser. Alle nødvendige verktøy er merket. B) trinn følges for å suge krystaller av konstruere CD2220-330, 5A med HA forbindelser. Trinn 1åpne godt som inneholder krystaller og overføre krystaller med en løkke til en 0,2 µL slipp på en cover slip som inneholder HA løsning utvannet krystallisering tilstanden slik at den endelige konsentrasjonen av HA varierer fra 1-10 mM. Trinn 2, seal fall i krystallisering platen og ruge krystaller med HA sammensatt for ulike perioder. Trinn 3, montere gjennomvåt krystall i ledd og rygg-suge for 30 s i tre påfølgende 0,2 µl dråper som inneholder mor brennevin løsningen med 20% (v/v) glyserol utlevert på en cover slip. Trinn 4, flash fryse krystall montert på en sløyfe med flytende nitrogen og plassere den i en puck for forsendelse til synchrotron beamline. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Biolayer interferometry og isotermiske titrering calorimetry målinger. A) representant BLI eksperiment. Toppanelet: eksempel på plate oppsett for et kinetics eksperiment, der følgende merket: 1 x kinetics buffer (B), hans6 x-merket glykoprotein lasting (L), representant Fab konsentrasjoner (500, 250, 125, 62,5 nM), PBS + 500 mM gjenfødelse buffer (R) og 1 x kinetics nøytralisering bufferen (B). Hvert inneholder også 200 µL av løsning. Trinnummeret for kinetics eksperimentet angis på toppen av platen. Midt-panelet: Representant rådata om BLI eksperiment utført ved hjelp av Ni-NTA biosensors og plate beskrevet i toppanelet. Trinn tallene tilsvarer planlagt (1), hans6 x glykoprotein lasting (2), planlagte (3), association i seriell fortynning av Fab (4) og dissosiasjon (5). Gjenfødelse trinnene er ikke representert (trinn 6-7). Nedre panelet: Representant analysert data som viser rå association og dissosiasjon (blå linje) med tilhørende 1:1 passer (rød linje). B) toppanelet: representant plate oppsettet for en enkelt ITC kjøre på en automatisert ITC instrument med syv eksperimenter i en 96-brønns rundt nederst-blokker. Hvert eksperiment består av tre brønner. Den første brønnen (rød) tilsvarer utvalg for cellen (400 µL), andre brønnen (grønn) tilsvarer utvalg for sprøyten (120 µL). Tredje også er tomt, og blandet prøvene vil bli returnert til dette godt etter fullførelse av eksperimentet. Eksperimenter 1, 2 og 7 er buffer i bufferen kontroller. Eksperimenter 3-5 representerer tre eksemplarer eksperimenter med glykoprotein (P) i cellen og Fab eller ligand (L) i sprøyten. Eksperimentet 6 representerer en ligand varme fortynning kontroll og skal trekkes fra eksperimenter 3-5 under dataanalyse. Nedre panelet: Representant rå (øverst) og behandlet (nederst) ITC data viser Fab (epratuzumab) binding til CD22 ECD produsert i HEK293F celler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Membranen-forankret glykoproteiner er viktig for celle funksjon og attraktive terapeutiske mål. Her presenterer vi en protokoll for strukturelle og Biofysiske karakterisering av ECD av membran glykoproteiner, både alene og i kompleks med små molekyl ligander og Fab fragmenter. Vi har brukt denne protokollen for å finne den krystall strukturen av tre N-terminal-mest Ig domener av den ekstracellulære delen av menneskelig CD2228, en kritisk co reseptor på B celler involvert i å holde humoral immunitet av79. Vi har også preget binding området av CD22 med sin naturlige ligand α2-6 sialyllactose og definert modus for anerkjennelse av en terapeutisk antistoff mot menneskelig CD22. Disse resultatene gi innsikt i struktur-funksjon forholdet mellom et sentralt medlem av den Siglecs familien som har begrenset uttrykk på B celler, og en molekylær veikart mot utviklingen av nye CD22 målrettet små molekyl og antistoff-basert Therapeutics. Mens denne protokollen ble brukt med hell i en Ig inneholder B-celle reseptor, foreslår vi at vår tilnærming kan brukes for strukturelle og Biofysiske karakterisering av en membran glykoprotein med en distinkt domene organisasjon. I slike tilfeller kan du lage design og kombinasjon N knyttet glycan mutasjoner (enten Gln eller Ala) kan vurderes for å finne en konstruksjon for krystall veksten og høy oppløsning Diffraksjon.

Å få en homogen og ren glykoprotein prøve er av avgjørende betydning for krystall veksten og X-ray Diffraksjon og nedstrøms Biofysiske karakterisering. N-koblede glykaner på glykoproteiner er iboende heterogene, og kan forårsake conformational og kjemiske heterogenitet i glykoprotein som kan avskrekke krystall-formasjonen. For å redusere denne mikro-heterogene, kan strategier som innføre punkt mutasjoner for å fjerne Asn rester spådd for å havn N-koblede glykaner eller bruke mutant linjer (for eksempel HEK293S) etterfulgt av behandling med endoglycosidases (for eksempel EndoH) betydelig forbedre krystallisering suksess15,21,22. I denne protokollen diskutere vi rensing av løselig glykoproteiner og produksjonslokaler både som utskilles i celle supernatant. Glykoprotein sekresjon gir en relativt enkel rute mot renhet, uten behovet for cellen lysis eller tillegg av sterke kjemikalier eller rengjøringsmidler. Kjør deretter cellen supernatant, fått følgende cellen høsting direkte over en kolonne som har affinitet for protein av interesse (f.eks Ni-NTA for hans-merket glykoproteiner eller LC affinitet for Fab fragmenter). Imidlertid avhengig av kolonnen og forholdene i cellen supernatant (f.eks pH) kan bindende evnen av protein av interesse for kolonnen påvirkes. Hvis dette er tilfelle, kan det være nødvendig å konsentrere seg og buffer exchange cellen supernatant for å forbedre binding til kolonnen. Videre er det sterkt anbefalt at kvalitetskontroll trinnene under renselsen brukes til å vurdere protein renhet. Kjører en SDS side gel eller Western blot av alle prøver (før, under og etter rensing skritt) kan gi innsikt i om foreslåtte rensing ordningen er egnet for protein av interesse. Hvis forurensende band vises på SDS-side, eller hvis flere arter er innhentet under renselsen (f.eks flere topper på størrelse utelukkelse), ekstra rensing trinnene bør vurderes, f.eks ionebytte Ture, å få i renhet og øke sjansene for nedstrøms krystallisering80.

For macromolecular krystallisering er det ofte avgjørende å få høy avkastning av protein av interesse å tillate screening av et stort antall potensielle krystallisering forhold ved høye protein konsentrasjoner å finne egnet krystall treff. Vanligvis HEK293 celle linjene diskutert her (HEK293F og HEK293S) er robust uttrykk systemer, og kan enkelt skaleres for å produsere flere eksempler som nødvendig. Det er imidlertid mulig at protein rundt ikke kan uttrykke tilstrekkelig i disse linjer. I disse tilfellene andre linjer, for eksempel Expi293 celler81,82, har blitt funnet for å vise overlegne nivåer av protein uttrykk og bør betraktes som et alternativ.

Hvis velorganisert, diffracting krystaller ikke får etter testing av flere konstruksjoner av protein av interesse til tross for høy renhet, kan det være nødvendig å utvide krystallisering teknikker for å fremme dannelse av krystaller. Det har vist at Fab fragmenter av antistoffer og nanobodies kan være utmerket krystallisering enhancers og fremme velordnet krystall pakking83,84,85. Disse fragmentene kan være uttrykt renset til homogenitet og brukt i et kompleks med protein av interesse for å fremme krystallisering. Viktigere, kan Fab fragmenter produsert som beskrevet i paragraf 10 ha en tendens til ikke-fungerende LC dimers86. Disse dimers er forurensning, og bør fjernes under renselsen. I vår erfaring, LC dimers ofte har forskjellige oppbevaring på størrelse eksklusjon, eller elute som en distinkt peak på ionebytte Ture, og dermed kan fjernes fra Fab rensing - men dette ikke er alltid tilfelle. Hvis disse teknikkene er ikke nok å fjerne LC dimers av Fab rensing, kan ekstra rensing metoder, for eksempel Protein G affinitet rensing, brukes til å forbedre renhet.

Alternativ til co-complexation med Fab fragmenter, veldokumenterte teknikker som tilfeldige matriser microseeding kan øke sjansene for å oppnå velordnet krystaller63,70. Denne metoden innebærer tillegg av små mengder knust, suboptimal krystaller i den krystallisering tilstanden, gir en krystall nucleate å fremme krystall veksten. Dette kan utføres med krystaller av proteinet severdigheter, eller de med lignende arkitektur og tertiær domenestruktur. Videre kan tilfeldige matriser microseeding utføres i forsøk på å utkrystallisere protein alene eller i kompleks med en Fab fragment eller små molekyl av interesse. Nylige fremskritt innen cryo-elektronmikroskop også gjøre denne teknikken et attraktivt alternativ til Røntgenkrystallografi for å oppnå høy oppløsning strukturell informasjon for molekyler med aktuelle funksjonene87,88, 89,90,91.

Når utfasing av X-ray Diffraksjon datasett mislykkes av MR, kan HA soaking være nødvendig å løse fase problemet av unormalt spredning eller isomorphous erstatning. Inspeksjon av aminosyresekvens av proteinet kan gi hint om strategien for HA derivatization, inkludert optimal pH for bindingen. Spesielt kan kortet cysteinene i protein spesielt binde HA forbindelser som inneholder kvikksølv. Soaking innfødt krystaller med HA forbindelser er en iterativ prosess til å fastslå identiteten til den optimale HA sammensatt, sin konsentrasjon og nødvendige inkubasjon tiden. Hvis første soaking forsøk ikke gir godt diffracting crystals inneholder en HA egnet for innfasing, kan det hende det nødvendig å innføre aminosyre erstatninger for å forbedre sannsynligheten for HA bindende og forbedre uregelrett signal. Eksempler inkluderer mutasjoner med en gratis cystein rester å effektivt binde Hg, Au, Pt eller Pb. uttrykk for proteiner for uregelrett fase i en seleno-metionin supplert medier i E. coli er mye brukt for uregelrett innfasing, men en tilsvarende system som inkorporerer pålitelig seleno-metionin er ikke lett tilgjengelig for pattedyrceller i suspensjon92,93, og er et område av fremtidig utvikling.

Når unliganded strukturen av glykoprotein rundt er oppnådd, kan soaking krystaller med små molekyl ligander utføres for å få en struktur av immun reseptor-ligand komplekset. Disse dataene gir en blåkopi for rasjonell design av mer spesifikke og høy affinitet ligander som kan brukes som små molekyl therapeutics, samt gir høy oppløsning innsikt i biologisk funksjon av glykoprotein. Når du prøver å suge glykoprotein krystaller med små molekyl ligander rundt, kan inspeksjon av unliganded krystall strukturen indikere om soaking skal være mulig. Hvis nær krystall-pakking kontakter finnes rundt området ligand-bindende eller rundt områder skal gjennomgå conformational endringer på ligand binding, soaking vil sannsynligvis være problematisk. I dette tilfellet skal andre metoder som co-krystallisering av protein-ligand komplekset utføres.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

X-ray Diffraksjon eksperimenter beskrevet i dette dokumentet ble utført med beamlines 08-ID og 08-BM på den kanadiske lyskilde, som støttes av Canada grunnlaget for innovasjon og naturvitenskap Engineering Research Council of Canada, den Universitetet i Saskatchewan, regjeringen i Saskatchewan, Vest økonomisk diversifisering Canada, National Research Council Canada og de kanadiske instituttene of Health Research. Vi ønsker å erkjenne den strukturelle og Biofysiske Core anlegget, The Hospital for syke barn for tilgang til ITC og BLI instrumenter. J.E.O. ble støttet av Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 fra kanadiske institutter for helseforskning. T.S. er en mottaker av en Canada Graduate Scholarship Master's Award og Vanier Canada Graduate stipend fra Canadian institutter for helseforskning. Dette arbeidet ble støttet av opererer stipend PJT-148811 (J.-PJ) fra den kanadiske institutter for helseforskning. Denne undersøkelsen ble foretatt, delvis takket være støtte fra Canada forskning stoler program (J.-PJ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm Steritop filter EMD Millipore SCGPS02RE
10 well 4-15% gradient SDS-PAGE gel Bio-Rad 4561084
10x glycobuffer 3 New England Biolabs P0702S Comes with Endo H reagent
10x Kinetics Buffer PALL FortéBio 18-1092
10x Tris/Glycine/SDS Buffer Bio-Rad 1610732
1 mL round bottom 96 well block ThermoFisher 260251
22 mm cover slip Hampton research HR3-231
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 1610747
96-3 well INTELLIPLATE  low volume reservior Art Robbins Instruments 102-0001-03
AgeI New England Biolabs R0552S
ÄKTA Pure GE Healthcare
ÄKTA Start  GE Healthcare
Amicon Ultra 15 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC901008
Amicon Ultra 4 centrifugal filtration device 10KDa MWCO Millipore UFC801008
Auto-iTC200 Malvern
Axygen MaxyClear Snaplock 1.5 mL microtubes Fisher Scientific MCT150C
Countess Cell Counting Chamber Slides Thermo Fisher Scientific C10228
CryoLoop 18 x 0.05-0.1 mm Hampton research HR4-945
CryoLoop 18 x 0.1-0.2 mm Hampton research HR4-947
CryoLoop 18 x 0.2-0.3 mm Hampton research HR4-970
Digital Dry Bath Bio-Rad 1660562EDU
E. coli DH5α Invitrogen 18258012
Endo H New England Biolabs P0702S
Erlenmeyer flask (baffled base), polycarbonate, sterile, 500 mL, DuoCAP TriForest Labware FBC05000S
Erlenmeyer flask 125 mL (baffled base), polycarbonate, sterile, 125 mL with vented cap VWR 89095-258
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 10 mL Greiner Bio-One 607180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 25 mL Greiner Bio-One 760180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 5 mL Greiner Bio-One 606180
Falcon Disposable sterile serological pipet, non-pyrogenic, 50 mL Greiner Bio-One 768180
FectoPRO DNA Transfection Reagent, Polyplus VWR 10118-842
Freestyle 293F cells Thermo Fisher Scientific R79007
Freestyle Expression medium Thermo Fisher Scientific 12338001
Heavy Atom Screens Au Hampton research HR2-444
Heavy Atom Screens Hg Hampton research HR2-446
Heavy Atom Screens M1 Hampton research HR2-448
Heavy Atom Screens M2 Hampton research HR2-450
Heavy Atom Screens Pt Hampton research HR2-442
HEK 293S ATCC ATCC CRL-3022
HisTrap Affinity Column GE Healthcare 17525501
HiTrap KappaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17545811
HiTrap LambdaSelect Affinity Columns GE Healthcare 17548211
KpnI New England Biolabs R0142S
MCSG-1 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-1
MCSG-2 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-2
MCSG-3 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-3
MCSG-4 Crystal Screen 1.7 mL block Anatrace MCSG-4
Mercuric chloride Sigma 1044170100
Microplate, 96 well, polypropelene, flat bottom, black  Greiner Bio-One 655209
Minstrel DT UV Formulatrix
Multitron Pro shaker Infors HT MP25-TA-CO2HB
Nanodrop 2000/2000c Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nanosep 3K Omega centrifugal device PALL Life Science OD003C33
Ni-NTA biosensors PALL FortéBio 18-5102
Octet RED96 PALL ForteBio
Oryx 4 crystallizaiton robot Douglas Instrument ORY-4/1
Platinum chloride Sigma 520632-1g
Precision Plus Protein Standard Bio-Rad 161-0374
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit Invitrogen K210006
Quick Coomassie Stain Protein Ark GEN-QC-STAIN-1L
Steriflip Sterile 50 mL Disposable Vacuum Filtration System 0.22 µm Millipore Express EMD Millipore SCGP00525
Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
Superose 6 10/300 GL GE Healthcare 17517201
Tantalum bromide cluster Jena bioscience PK-103
Top96 Crystallization Screen Rigaku Reagents 1009846
Tryphan Blue Thermo Fisher Scientific T10282
VDX 24-well with sealant Hampton research HR3-172
α2-6 sialyllactose Sigma Aldrich A8556-1mg

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sachs, J. N., Engelman, D. M. Introduction to the membrane protein reviews: The interplay of structure, dynamics, and environment in membrane protein function. Annu Rev Biochem. 75 (1), 707-712 (2006).
  2. Cournia, Z., et al. Membrane protein structure, function, and dynamics: A perspective from experiments and theory. J Membr Biol. 248 (4), 611-640 (2015).
  3. Macauley, M. S., et al. Antigenic liposomes displaying CD22 ligands induce antigen-specific B cell apoptosis. J Clin Invest. 123 (7), 3074-3083 (2013).
  4. Hyde, C. A. C., et al. Targeting extracellular domains D4 and D7 of vascular endothelial growth factor receptor 2 reveals allosteric receptor regulatory sites. Mol Cell Biol. 32 (19), 3802-3813 (2012).
  5. Tai, W., Mahato, R., Cheng, K. The role of HER2 in cancer therapy and targeted drug delivery. J Control Release. 146 (3), 264-275 (2010).
  6. Zarei, O., Benvenuti, S., Ustun-Alkan, F., Hamzeh-Mivehroud, M., Dastmalchi, S. Strategies of targeting the extracellular domain of RON tyrosine kinase receptor for cancer therapy and drug delivery. J Cancer Res Clin Oncol. 142 (12), 2429-2446 (2016).
  7. Rosman, Z., Shoenfeld, Y., Zandman-Goddard, G. Biologic therapy for autoimmune diseases: an update. BMC Med. 11 (1), 88 (2013).
  8. Lander, E. S., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome. Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).
  9. Barclay, A. N. Membrane proteins with immunoglobulin-like domains - A master superfamily of interaction molecules. Semin Immunol. 15 (4), 215-223 (2003).
  10. Barclay, A. N. Ig-like domains: evolution from simple interaction molecules to sophisticated antigen recognition. Proc Natl Acad Sci. 96 (26), 14672-14674 (1999).
  11. Aebi, M. N-linked protein glycosylation in the ER. Biochim Biophys Acta - Mol Cell Res. 1833 (11), 2430-2437 (2013).
  12. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
  13. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S., Al, E. Glycosylation in the ER and Golgi complex. Mol Cell Biol. (4), Section 17.7 (2000).
  14. Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. J Pharmacol Toxicol Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
  15. Lee, J. E., Fusco, M. L., Ollmann Saphire, E. An efficient platform for screening expression and crystallization of glycoproteins produced in human cells. Nat Protoc. 4 (4), 592-604 (2009).
  16. Betenbaugh, M. J., Tomiya, N., Narang, S., Hsu, J. T. A., Lee, Y. C. Biosynthesis of human-type N-glycans in heterologous systems. Curr Opin Struct Biol. 14 (5), 601-606 (2004).
  17. Yang, Z., et al. Engineered CHO cells for production of diverse, homogeneous glycoproteins. Nat Biotechnol. 33 (8), 842-844 (2015).
  18. Bláha, J., Kalousková, B., Skořepa, O., Pažický, S., Novák, P., Vaněk, O. High-level expression and purification of soluble form of human natural killer cell receptor NKR-P1 in HEK293S GnTI-cells. Protein Expr Purif. 140, 36-43 (2017).
  19. Bláha, J., Pachl, P., Novák, P., Vaněk, O. Expression and purification of soluble and stable ectodomain of natural killer cell receptor LLT1 through high-density transfection of suspension adapted HEK293S GnTI- cells. Protein Expr Purif. 109, 7-13 (2015).
  20. Chaudhary, S., Pak, J. E., Gruswitz, F., Sharma, V., Stroud, R. M. Overexpressing human membrane proteins in stably transfected and clonal human embryonic kidney 293S cells. Nat Protoc. 7 (3), 453-466 (2012).
  21. Chang, V. T., et al. Glycoprotein structural genomics: Solving the glycosylation problem. Structure. 15 (3), 267-273 (2007).
  22. Davis, S. J., Crispin, M. Solutions to the glycosylation problem for low- and high-throughput structural glycoproteomics. Funct Struct Proteomics Glycoproteins. , 127-158 (2011).
  23. Elbein, A. D., Tropea, J. E., Mitchell, M., Kaushal, G. P. Kifunensine, a potent inhibitor of the glycoprotein processing mannosidase I. J Biol Chem. 265 (26), 15599-15605 (1990).
  24. Zheng, K., Bantog, C., Bayer, R. The impact of glycosylation on monoclonal antibody conformation and stability. MAbs. 3 (6), 568-576 (2011).
  25. Aricescu, A. R., Lu, W., Jones, E. Y. A time- and cost-efficient system for high-level protein production in mammalian cells. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 62 (10), 1243-1250 (2006).
  26. Adams, P. D., et al. The Phenix software for automated determination of macromolecular structures. Methods. 55 (1), 94-106 (2011).
  27. May, A. P., Robinson, R. C., Vinson, M., Crocker, P. R., Jones, E. Y. Crystal structure of the N-terminal domain of sialoadhesin in complex with 3' sialyllactose at 1.85 Å resolution. Mol Cell. 1 (5), 719-728 (1998).
  28. Ereño-Orbea, J., et al. Molecular basis of human CD22 function and therapeutic targeting. Nat Commun. 8 (1), 764 (2017).
  29. Yu, X. -L., et al. Crystal structure of HAb18G/CD147: implications for immunoglobulin superfamily homophilic adhesion. J Biol Chem. 283 (26), 18056-18065 (2008).
  30. Garman, E., Murray, J. W. Heavy-atom derivatization. Acta Crystallogr - Sect D Biol Crystallogr. 59 (11), 1903-1913 (2003).
  31. Agniswamy, J., Joyce, M. G., Hammer, C. H., Sun, P. D. Towards a rational approach for heavy-atom derivative screening in protein crystallography. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (4), 354-367 (2008).
  32. Rose, J. P., Wang, B. C., Weiss, M. S. Native SAD is maturing. IUCrJ. 2 (20), 431-440 (2015).
  33. Olieric, V., et al. Data-collection strategy for challenging native SAD phasing. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 421-429 (2016).
  34. Rillahan, C. D., et al. Disubstituted sialic acid ligands targeting Siglecs CD33 and CD22 associated with myeloid leukaemias and B cell lymphomas. Chem Sci. 5 (6), 2398-2406 (2014).
  35. Mesch, S., et al. From a library of MAG antagonists to nanomolar CD22 ligands. ChemMedChem. 7 (1), 134-143 (2012).
  36. Chiu, M. L., Gilliland, G. L. Engineering antibody therapeutics. Curr Opin Struct Biol. 38, 163-173 (2016).
  37. Elgundi, Z., Reslan, M., Cruz, E., Sifniotis, V., Kayser, V. The state-of-play and future of antibody therapeutics. Adv Drug Deliv Rev. 122 (2016), 2-19 (2017).
  38. Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. Determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms. J Vis Exp. (122), e55659 (2017).
  39. Kamat, V., Rafique, A. Designing binding kinetic assay on the bio-layer interferometry (BLI) biosensor to characterize antibody-antigen interactions. Anal Biochem. 536, 16-31 (2017).
  40. Brautigam, C. A., Zhao, H., Vargas, C., Keller, S., Schuck, P. Integration and global analysis of isothermal titration calorimetry data for studying macromolecular interactions. Nat Protoc. 11 (5), 882-894 (2016).
  41. Duff, M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. J Vis Exp. (55), e2796 (2011).
  42. Livingstone, J. R. Antibody characterization by isothermal titration calorimetry. Nature. 384 (6608), 491-492 (1996).
  43. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: Experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods Cell Biol. 84, 79-113 (2008).
  44. Macauley, M. S., Crocker, P. R., Paulson, J. C. Siglec-mediated regulation of immune cell function in disease. Nat Rev Immunol. 14 (10), 653-666 (2014).
  45. Zaccai, N. R., et al. Structure-guided design of sialic acid-based Siglec inhibitors and crystallographic analysis in complex with sialoadhesin. Structure. 11 (5), 557-567 (2003).
  46. Pantophlet, R., et al. Bacterially derived synthetic mimetics of mammalian oligomannose prime antibody responses that neutralize HIV infectivity. Nat Commun. 8 (1), 1601 (2017).
  47. Leonard, J. P., et al. Epratuzumab, a humanized anti-CD22 antibody, in aggressive non-Hodgkin's lymphoma: phase I/II clinical trial results. Clin Cancer Res. 10 (16), 5327-5334 (2004).
  48. Finn, R. D., et al. InterPro in 2017-beyond protein family and domain annotations. Nucleic Acids Res. 45, 190-199 (2017).
  49. Kelley, L. A., Mezulis, S., Yates, C. M., Wass, M. N., Sternberg, M. J. E. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. 10 (6), 845-858 (2015).
  50. Lessard, J. C. Molecular cloning. Methods Enzymol. 529, 85-98 (2013).
  51. Gupta, R., Jung, E., Brunak, S. NetNGlyc: Prediction of N-glycosylation sites in human proteins. , (2004).
  52. Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
  53. Heckman, K. L., Pease, L. R. Gene splicing and mutagenesis by PCR-driven overlap extension. Nat Protoc. 2 (4), 924-932 (2007).
  54. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  55. Akula, I., Julien, J. -P. Optimization of glycoprotein expression by transient transfection in HEK293 F/S suspension cells. , Available from: https://www.polyplus-transfection.com/wp-content/uploads/2015/09/FectoPRO-Technical-Note-031716.pdf (2015).
  56. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  57. Tan, H. Y., Ng, T. W. Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Opt Commun. 281 (10), 3013-3017 (2008).
  58. Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. Quantifying Western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).
  59. Jonnalgadda, K., Markley, L., Estes, S., Prajapati, S., Takkar, R., Kumaraswamy, S. Rapid, reliable quantitation of Fc-fusion protein in cell culture supernatants. , Available from: https://www.fortebio.com/documents/ForteBio_App_Note_13.pdf (2018).
  60. JoVE Science Education Database. Basic methods in cellular and molecular biology: Separating protein with SDS-PAGE. J Vis Exp. , (2018).
  61. Wilkins, M. R., et al. Protein identification and analysis tools in the ExPASy server. Methods Mol Biol. 112, 531-552 (1999).
  62. Till, M., et al. Improving the success rate of protein crystallization by random microseed matrix screening. J Vis Exp. (78), e50548 (2013).
  63. Obmolova, G., Malia, T. J., Teplyakov, A., Sweet, R., Gilliland, G. L. Promoting crystallization of antibody-antigen complexes via microseed matrix screening. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (8), 927-933 (2010).
  64. D'Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallogr Sect F, Struct Biol Commun. 70 (9), 1117-1126 (2014).
  65. Luft, J. R., et al. Efficient optimization of crystallization conditions by manipulation of drop volume ratio and temperature. Protein Sci. 16 (4), 715-722 (2007).
  66. Dessau, M. A., Modis, Y. Protein crystallization for X-ray crystallography. J Vis Exp. (47), e2285 (2011).
  67. Sugahara, M., Asada, Y., Ayama, H., Ukawa, H., Taka, H., Kunishima, N. Heavy-atom Database System: A tool for the preparation of heavy-atom derivatives of protein crystals based on amino-acid sequence and crystallization conditions. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (9), 1302-1305 (2005).
  68. Boggon, T. J., Shapiro, L. Screening for phasing atoms in protein crystallography. Structure. 8 (7), 143-149 (2000).
  69. Vera, L., Stura, E. A. Strategies for protein cryocrystallography. Cryst Growth Des. 14 (2), 427-435 (2014).
  70. Pichlo, C., Montada, A. A., Schacherl, M., Baumann, U. Production, crystallization and structure determination of C. difficile PPEP-1 via microseeding and Zinc-SAD. J Vis Exp. (118), e55022 (2016).
  71. Leslie, A. G. W., et al. Automation of the collection and processing of X-ray diffraction data - a generic approach. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 58 (11), 1924-1928 (2002).
  72. Pike, A. C. W., Garman, E. F., Krojer, T., Von Delft, F., Carpenter, E. P. An overview of heavy-atom derivatization of protein crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 72 (3), 303-318 (2016).
  73. Cooper, D. R., Porebski, P. J., Chruszcz, M., Minor, W. X-ray crystallography: Assessment and validation of protein-small molecule complexes for drug discovery. Expert Opin Drug Discov. 6 (8), 771-782 (2011).
  74. Hassell, A. M., et al. Crystallization of protein-ligand complexes. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 63 (1), 72-79 (2006).
  75. Muller, I., et al. Guidelines for the successful generation of protein-ligand complex crystals. Acta Crystallogr Sect D Struct Biol. 73 (2), 79-92 (2017).
  76. Zhao, Y., et al. Two routes for production and purification of Fab fragments in biopharmaceutical discovery research: Papain digestion of mAb and transient expression in mammalian cells. Protein Expr Purif. 67 (2), 182-189 (2009).
  77. Shah, N. B., Duncan, T. M. Bio-layer interferometry for measuring kinetics of protein-protein interactions and allosteric ligand effects. J Vis Exp. (84), e51383 (2014).
  78. Terwilliger, T. C., et al. Iterative model building, structure refinement and density modification with the PHENIX AutoBuild wizard. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 64 (1), 61-69 (2008).
  79. Walker, J. A., Smith, K. G. C. CD22: An inhibitory enigma. Immunology. 123 (3), 314-325 (2008).
  80. Gräslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).
  81. Jain, N. K., et al. A high density CHO-S transient transfection system: Comparison of ExpiCHO and Expi293. Protein Expr Purif. 134, 38-46 (2017).
  82. Fang, X. T., Sehlin, D., Lannfelt, L., Syvänen, S., Hultqvist, G. Efficient and inexpensive transient expression of multispecific multivalent antibodies in Expi293 cells. Biol Proced Online. 19 (1), 11 (2017).
  83. Löw, C., et al. Nanobody mediated crystallization of an archeal mechanosensitive channel. PLoS One. 8 (10), 77984 (2013).
  84. Hunte, C., Michel, H. Crystallization of membrane proteins mediated by antibody fragments. Curr Opin Struct Biol. 12 (4), 503-508 (2002).
  85. Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Carson, J., Hermans, P., Julien, J. -P. Structural basis of enhanced crystallizability induced by a molecular chaperone for antibody antigen-binding fragments. J Mol Biol. 430 (3), 322-336 (2018).
  86. Spooner, J., et al. Evaluation of strategies to control Fab light chain dimer during mammalian expression and purification: A universal one-step process for purification of correctly assembled Fab. Biotechnol Bioeng. 112 (7), 1472-1477 (2015).
  87. Elmlund, D., Le, S. N., Elmlund, H. High-resolution cryo-EM: The nuts and bolts. Curr Opin Struct Biol. 46, 1-6 (2017).
  88. Merk, A., et al. Breaking cryo-EM resolution barriers to facilitate drug discovery. Cell. 165 (7), 1698-1707 (2016).
  89. Bai, X. C., McMullan, G., Scheres, S. H. W. How cryo-EM is revolutionizing structural biology. Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).
  90. Wlodawer, A., Li, M., Dauter, Z. High-resolution cryo-EM maps and models: A crystallographer's perspective. Structure. 25 (10), 1589-1597 (2017).
  91. Bartesaghi, A., et al. 2.2 Å resolution cryo-EM structure of β-galactosidase in complex with a cell-permeant inhibitor. Science. 348 (6239), 1147-1151 (2015).
  92. Hendrickson, W. a, Horton, J. R., LeMaster, D. M. Selenomethionyl proteins produced for analysis by multiwavelength anomalous diffraction (MAD): A vehicle for direct determination of three-dimensional structure. EMBO J. 9 (5), 1665-1672 (1990).
  93. Walden, H. Selenium incorporation using recombinant techniques. Acta Crystallogr Sect D Biol Crystallogr. 66 (4), 352-357 (2010).

Tags

Biokjemi problemet 137 glykoproteiner N-tilknyttet glykosylering krystallisering biolayer interferometry isotermiske titrering calorimetry crystal soaking fragmentere antigen bindende.
Karakteristikk av glykoproteiner med immunglobulin Fold av Røntgenkrystallografi og Biofysiske teknikker
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ereño-Orbea, J., Sicard, T.,… More

Ereño-Orbea, J., Sicard, T., Cui, H., Akula, I., Julien, J. P. Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques. J. Vis. Exp. (137), e57750, doi:10.3791/57750 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter