Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

تحليل مشيه للإعاقات الحركية تعتمد على سن في الفئران مع نيوروديجينيريشن

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

في هذه الدراسة، ونحن تثبت استخدام تحليل مشيه الحركية استناداً إلى التصوير البطني الطائرة لرصد التغييرات الطفيفة في التنسيق الحركي، فضلا عن تطور نيوروديجينيريشن مع التقدم في السن في نماذج الماوس (مثلاً، اندوفيلين المسخ خطوط الماوس).

Abstract

اختبارات السلوك الحركي تستخدم عادة لتحديد مدى صلة وظيفية نموذج القوارض واختبار حديثا تطوير علاجات في هذه الحيوانات. على وجه التحديد، يتيح تحليل مشيه استئثارها المرض تعمل ذات الصلة التي لوحظت في المرضى البشرية، لا سيما في أمراض الأعصاب التي تؤثر على قدراتهم الحركية مثل مرض باركنسون (PD)، مرض الزهايمر (AD)، الجانبي الضموري التصلب الجانبي (المرض)، وغيرها. في أوائل الدراسات على طول هذا الخط، تم قياس بارامترات مشيه شاقة ويتوقف على العوامل التي كان من الصعب التحكم (مثلاً، تشغيل السرعة، مستمر على التوالي). تطوير أنظمة الطائرة البطني (VPI) التصوير جعلت ممكناً القيام بتحليل مشيه على نطاق واسع، مما يجعل هذا الأسلوب أداة مفيدة لتقييم السلوك الحركي في القوارض. نقدم هنا، بروتوكولا متعمقة لكيفية استخدام تحليل مشيه الحركية لدراسة تطور تعتمد على سن العجز الحركي في نماذج الماوس من نيوروديجينيريشن؛ وتستخدم خطوط الماوس مع انخفاض مستويات اندوفيلين، التي تلف الأعصاب يزيد تدريجيا مع التقدم في السن، كمثال.

Introduction

أمراض الأعصاب تشكل عبئا كبيرا على المرضى والأسر والمجتمع، وسوف تصبح من قلق أكبر كلما زاد متوسط العمر المتوقع، وما زال سكان العالم العمر. أحد الأعراض الأكثر شيوعاً من أمراض الأعصاب مشاكل التوازن والتنقل. وهكذا، وصف السلوك الحركي في الشيخوخة الثدييات (مثلاً، مكافحة القوارض) نماذج، و/أو نماذج عرض تعمل الأعصاب، أداة قيمة إثبات الأهمية في فيفو من نماذج حيوانية معينة، أو العلاجية العلاجات التي تهدف إلى تحسين أعراض المرض. تقريبا كل نهج لعلاج أمراض الأعصاب في نهاية المطاف يتطلب اختبار نموذج حيوان قبل الشروع في تجربة سريرية في البشر. ولذلك، من الأهمية بمكان أن يكون السلوك موثوقة واستنساخه بالاختبارات التي يمكن استخدامها لقياس استمرار الأمراض ذات الصلة تعمل على طول العمر التقدم، بغية ضمان أن دواء مرشح، الذي أظهر المحتملة في نموذج في المختبر ، ويمكن تحسين النمط الظاهري في الحيوانات حية فعالية.

واحد جوانب تقييم السلوك الحركي في القوارض هو تحليل مشيه الحركية، التي يمكن أن يؤديها VPI (أيضا يسمى البطني الطائرة بالفيديو)1،2. هذه الطريقة المتبعة تستفيد من التسجيل المستمر للجانب السفلي القوارض المشي فوق مطحنة شفافة ويجهز حزام1،2،،من34. تحليل الفيديو تغذية البيانات ينشئ "يطبع مخلب الرقمية" من جميع أطرافه الأربعة أن الخص بشكل حيوي وموثوق بها نمط المشي للقوارض، كما وصفت أصلاً اللفت et al. 2 وأميندي et al. 3.

مبدأ التحليل القائم على تصوير مشيه قياس منطقة مخلب على اتصال بحزام المطحنة على مر الزمن، لكل مخلب الفردية. ويمثل موقف كل زيادة في منطقة باو (في مرحلة الكبح) وانخفاضا في منطقة باو (في مرحلة الدفع). ويعقب هذا المرحلة البديل الذي يتم الكشف عن لا إشارة. وتشكل خطوة سوينغ وموقف معا. بالإضافة إلى مشيه ديناميات المعلمات، ويمكن أيضا استخراج المعلمات الموقف من أشرطة الفيديو المسجلة. معلمات المثالية وتعريفها وترد في الجدول 1 وتشمل عرض موقف (SW؛ المسافة مجتمعة من الكفوف الصدارة أو هند إلى المحور الآنف والذيل)، خطوة طول (SL؛ ومتوسط المسافة بين خطوات اثنين من مخلب نفسه)، أو مخلب التنسيب الزاوية (زاوية مخلب للمحور الآنف والذيل). تسمح البيانات ديناميات الموقف ومشية استخلاص النتائج على توازن الحيوان (بواسطة معلمات الموقف وتغيراتها عبر عدة خطوات) والتنسيق (بواسطة مشيه ديناميات المعلمات). معلمات أخرى، مثل معامل ترنح (SL تباين حسبتها [(كحد أقصى. SL−min. SL)/يعني م])، أطرافهم هند يشاطر موقف (وقت كل أطرافه هند هي على اتصال بالحزام)، أو اسحب مخلب (المساحة الإجمالية مخلب على الحزام من موقف كامل مخلب زنتها) يمكن أيضا استخراج، وقد أبلغت إلى تغيير في مختلف الأعصاب دي نماذج سيسي5،6،،من78 (انظر الجدول 1).

المعلمة وحدة تعريف
الوقت البديل مرض التصلب العصبي المتعدد مدة الزمن مخلب ليست على اتصال حزام
الوقت موقف مرض التصلب العصبي المتعدد مدة الزمن مخلب على اتصال حزام
الفرامل % % لوقت الموقف النسبة المئوية للوقت موقف الكفوف في طور الفرامل
دفع % % لوقت الموقف النسبة المئوية للوقت موقف الكفوف في مرحلة الدفع
عرض موقف سم مسافة مجتمعة من السطح أو هند الكفوف إلى المحور الآنف والذيل
طول برايد سم متوسط المسافة بين خطوات اثنين من مخلب نفس
تردد واسعة خطوات/s عدد خطوات كاملة في الثانية
مخلب موضع الزاوية درجة زاوية مخلب فيما يتعلق بمحور الآنف والذيل في الحيوان
معامل ترنح a.u. تقلب SL حسبتها [(max SL-min SL)/يعني م]
موقف مشترك % % من الموقف الوقت موقف أطرافهم هند المشتركة؛ الوقت الذي يتم كل أطرافه هند على اتصال بالحزام في نفس الوقت
اسحب مخلب مم2 تبلغ المساحة الإجمالية مخلب على الحزام من موقف كامل مخلب زنتها
تحميل أطرافهم سم2 ماكس دا/dT؛ أقصى معدل تغير منطقة مخلب في مرحلة الانهيار
تقلب زاوية الخطوة درجة الانحراف المعياري للزاوية بين هند الكفوف كدالة SL وسويسري

الجدول 1. تعريف معلمات مشيه الرئيسية التي يمكن اختبارها بتصوير الطائرة البطني.

يمكن أن يكون تحديا تقييم سلوك القوارض نماذج لأمراض الأعصاب الحركية اعتماداً على شدة النمط الظاهري لنموذج محدد في سن معينة. عدة الأمراض، أبرزها PD، إظهار سلوك القوى الحركية (الحركة) العجز، سواء في المرضى أو في نماذج حيوانية. هو أحد الأعراض الرئيسية الأربعة في PD bradykinesia، التي تقدم مع الشيخوخة، وتتجلى في ضعف مشيه شديدة الفعل في المراحل المبكرة من PD9. الدراسات نموذج PD الحادة، والقوارض تعامل مع 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP)، قد استخدمت بالفعل VPI مشيه تحليل10،،من1112. ومع ذلك، نظراً للطابع الحاد لهذا النموذج، هذه الدراسات لا تتناول تطور العجز الحركية المرتبطة بالسن. وقد أجرى عدة دراسات أجريت مؤخرا تحليل مشيه في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين التغييرات الأعصاب، على سبيل المثال13،،من1415، وإذ تشدد على أهمية فهم تطور المرض مع التقدم في السن .

بالإضافة إلى حالات العجز الحركي، نماذج حيوانية من أمراض الأعصاب غالباً صعوبات مع التركيز على مهام الفحص وإظهار العاهات المعرفية البارزين، لا سيما مع التقدم في السن. يمكن أن يؤثر هذا النمط الظاهري نتيجة لاختبارات السلوك الحركي. هي واحدة من الاختبارات الأكثر استخداماً لفحص السيارات العجز، اختبار روتارود16، تعتمد على الإدراك والاهتمام، والإجهاد17،18. أثناء الاستعداد للسير في حلقة مفرغة يجهز يعتمد أيضا على هذه العوامل، قيد القراءة مسجل، الذي هو سمة من سمات أكثر توحيدا والآن أقل تتأثر بتغير الإدراك. آثار الإجهاد والاهتمام قد تكون مرئية في معلمات محددة، مثل الوقت البديل/موقف للإجهاد، و SL للاهتمام19،20، ولكن ليس في القدرة على تشغيل الشاملة.

ويوفر نهج تحليل مشيه الحركية كذلك ميزة وجود خيارات لضبط التحدي لنماذج القوارض. يسمح المطحنة مع زاوية قابلة للتعديل وسرعة المشي بسرعة من 0.1-99.9 سم/s، حيث أن القوارض المصابين بضعف شديد في المشي قد تكون لا تزال قادرة على تشغيل بسرعة بطيئة (~ 10 سم/ثانية). عدم إعاقة الحيوانات يمكن أن يقاس في تشغيل أسرع بسرعة (30-40 سم/ثانية). توفر مراقبة أم لا قادرة على تشغيل بسرعة بعض الحيوانات المختبرة نتيجة بحد ذاتها. علاوة على ذلك، يمكن الطعن في القوارض بالإضافة إلى ذلك للتشغيل المنحدر، أو لأسفل انخفاضا، عن إمالة المطحنة إلى زاوية المطلوب مع المساعدة من جونيوميتير، أو عن طريق إرفاق زلاجات مرجحة لأطرافه هند الفأر أو الجرذ.

بالإضافة إلى العديد من الدراسات واحدة من البروتينات التي هي تحور في المرضى، هناك وعي متزايد مؤخرا الصلات بين الالتقام عيب العملية ونيوروديجينيريشن13،،من2122، 23،24،،من2526،،من2728. الفأر نماذج مع انخفاض مستويات اندوفيلين-أ (اندوفيلين من الآن فصاعدا)، دوراً رئيسيا في كلا كلاثرين بوساطة الالتقام21،13،29،،من3031 , 32 , 33 , تم العثور على 45 و34من الالتقام كلاثرين مستقلة، لإظهار نيوروديجينيريشن والعاهات تعتمد على العمر في النشاط الحركي13،21. ترميز الجينات ثلاثة أسرة البروتينات اندوفيلين: اندوفيلين 1، اندوفيلين 2، واندوفيلين 3. جدير بالذكر أن النمط الظاهري الناجمة عن نضوب البروتينات اندوفيلين تختلف إلى حد كبير تبعاً للعدد المفقودين اندوفيلين الجينات13،21. بينما ثلاثية المغلوب (كو) لجميع اندوفيلين الجينات القاتلة ساعات قليلة بعد الولادة، والفئران دون كلا اندوفيلين 1 و 2 لا تزدهر ولا يموت في غضون 3 أسابيع بعد الولادة، كو واحد لأي من اندوفيلينس الثلاثة يظهر لا النمط الظاهري الواضح لاختبار 21من شروط. إظهار انخفاض عمر الوراثية المسخ الأخرى اندوفيلين وتطوير الإعاقات الحركية مع زيادة العمر13. على سبيل المثال، اندوفيلين 1KO-2HT-3KO الفئران عرض التعديلات المشي ومشاكل التنسيق الحركية (كاختبار تحليل مشيه الحركية وروتارود) بالفعل في 3 أشهر عمر، بينما على ليتيرماتيس، اندوفيلين 1KO-2WT-3KO الحيوانات، عرض كبير تخفيض التنسيق الحركي فقط في 15 شهرا من العمر13. نظراً للتنوع الواسع لتعمل في هذه النماذج، من الضروري تحديد وتطبيق اختبار التي يمكن أن تدمج مجموعة متنوعة من التحديات المرافقة للسيارات للحيوان وقدرات الإدراك، فضلا عن السن. هنا، نحن بالتفصيل الإجراءات التجريبية التي تستفيد من تحليل مشيه الحركية لتقييم ظهور وتطور من العاهات الحركية في نموذج ماوس تظهر التغييرات الأعصاب (أي طفرات اندوفيلين). وهذا يشمل قياس البارامترات مشيه في مختلف الإعمار ومختلف الحدة من ضعف في الحركة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وتجري جميع التجارب على الحيوانات ذكرت هنا وفقا للمبادئ "التوجيهية الأوروبية" للرفق بالحيوان (2010/63/الاتحاد الأوروبي) مع موافقة لانديسامت Niedersächsisches für فيربراوتشيرشوتز und لبينسميتيلسيتشيرهيت (لافيس)، رقم التسجيل 14/ 1701.

1-دراسة التصميم

  1. كما عمل سلوك الحيوانات يتطلب تخطيطاً دقيقا، تنظر المعلمات التالية أثناء تصميم التجربة.
    1. عدد من الحيوانات بحاجة كل مجموعة.
      1. استخدام برمجيات إحصائية (مثل تمرير، إيدا، أو GPower) لحساب حجم المجموعة المطلوبة.
        ملاحظة: يعتمد حجم المجموعة عن الاختلاف بين الحيوانات وشدة النمط الظاهري. لتحليل مشيه الحركية، عدد الفئران هو عادة 10-20 كل مجموعة.
    2. الجنس الحيوانات التجريبية.
      1. النظر في تأثير مستويات الإستروجين على التجربة، اعتماداً على سلالة حيوانية.
        ملاحظة: دراسات السلوك كثيرة تركز على الذكور من أجل تجنب تأثير مستويات الإستروجين في التجربة. هذه التأثيرات قوية أكثر أو أقل اعتماداً على سلالة حيوانية الخلفية.
      2. إذا كان سيتم استخدام كلا الجنسين، اختبار تأثير الجنس وتقييم بين الجنسين بشكل مستقل عند الضرورة.
    3. عمر الحيوانات التجريبية.
      1. استخدام الحيوانات الكبار (2 أشهر من العمر، أو أكثر) إلا إذا كان هناك حاجة إلى نقطة مرة واحدة.
      2. حدد العديد من النقاط الزمنية عند دراسة التغير في السلوك الحركي مع التقدم في السن. أقرب وقت ممكن النقطة شهر واحد، بعد أن يتم الفطام الفئران من أمهاتهم. اختبار الحيوانات في فترات منتظمة، مثلاً كل 1 أو 2 أو 3 أشهر.
  2. تقديم طلب للحصول على إذن من السلطات المحلية لإجراء اختبار سلوك الحيوانات.
  3. وضع خطط لشراء الحيوانات الاختبار.
    1. جعل خطة تربية أو اتصل موزع حيوان في الوقت مناسب حتى تصبح متوفرة كافية الحيوانات التجريبية في اليوم عندما تبدأ التجارب.
    2. السماح للحيوانات إلى روض لمدة أسبوع واحد إذا كان يتم الاحتفاظ بها في غرفة/إعداد جديد خلال التجارب.

2-تسجيل فيديو

ملاحظة: لتوضيح كيفية استخدام تحليل مشيه الحركية، هنا نظام تصوير متاحة تجارياً مع تصوير المصاحبة وبرمجيات التحليل (انظر الجدول للمواد) وتستخدم.

  1. بدء تشغيل الكمبيوتر وجهاز تصوير البرنامج.
  2. تحديد الحالة الصحية ورفاه كل حيوان بملاحظة أنه في قفصة المنزل، ووزنها على توازن.
  3. عند الحاجة، بلطف تطبيق الطلاء إصبع أحمر لآثار أقدام الحيوان بفرشاة. السماح الطلاء ليجف لدقيقة ~ 5 في قفص نظيف قطع غيار.
    ملاحظة: تجنب اللوحة البطن للحيوان كما يستخدم الطلاء لتعزيز التباين بين الكفوف والجسم. ومفيد لطلاء الإصبع الأسود مفيد للتصويبات. هذه الخطوة ضروري للحيوانات ذات الفراء البنى، أو في حالة قد تم وشم الكفوف لتحديد الهوية. إذا اختارت أن ترسم آثار أقدام حيوان واحد، يلزم جميع الحيوانات في نفس المجموعة وفريق مراقبة رسمها كذلك.
  4. تعيين سرعة المطحنة في أعلى اللوحة اليمنى للجهاز؛ إذا كان سيتم تطبيق سرعة تشغيل واحد أو أكثر، تبدأ مع أبطأ سرعة أولاً.
  5. ضع الحيوانات في غرفة الاختبار (تجنب لقط الذيل أو الكفوف عند إغلاق الدائرة). تغطية الدائرة بقطعة قماش داكن والسماح لكل الحيوانات ضبط ل 1-2 دقيقة.
  6. تشغيل الضوء في غرفة الاختبار بتحويل المطحنة الدوارة ضوء التحول إلى الوضع "on". تشغيل تبديل المطحنة الدوارة "الأمام" لبدء حلقة مفرغة، ثم انقر فوق الزر "تسجيل" في تصوير البرنامج.
    ملاحظة: أثناء تشغيل المطحنة، من المهم مراقبة أداء الحيوان بعناية واستمرار: وقف حلقة مفرغة فورا إذا كان الحيوان لا يمكن مواكبة سرعة المطحنة، أو تظهر أعراض ثانوية غير المتصلة بالحركة (مثلاً، نوبات الصرع). شروط الاختبار قد تحتاج إلى تعديل.
  7. عند تشغيل هذا الحيوان ستابلي (لا الهروب السريع إلى الجانبين، الأمامي أو الخلفي)، سجل على الأقل 5 s قبل إيقاف حلقة مفرغة. إيقاف التسجيل بواسطة النقر فوق "إيقاف" في تصوير البرنامج، وتشغيل التبديل الروتاري المطحنة مرة أخرى إلى موضع "إيقاف".
    ملاحظة: لتجنب تشغيل غير مستقرة من الحيوانات يمكن تكون مفيدة للسماح لهم بتشغيل لعدة ثوان، أو السماح لهم بتشغيل في الاتجاه الآخر (عن طريق تحويل المطحنة الدوارة التبديل إلى "عكس" بدلاً من "الأمام").
  8. انقر فوق الزر "تجهيز" في برنامج تصوير لفتح قائمة التي يمكن تعيينها في البداية ونقطة النهاية لمقطع الفيديو (لاستخدامها في التحليل). للقيام بذلك، استخدم شريط التمرير في الجزء السفلي من الشاشة للتنقل من خلال الفيديو.
  9. لتحديد نقطة الوقت الحالي كتاريخ البدء أو نقطة النهاية، انقر فوق "من الإطار #" و"إلى"، على التوالي. تأكد من أن المقطع يحتوي على مالا يقل عن 7 خطوات/مخلب (الخطوات 14 في المجموع) من الحيوان يعمل ستابلي بسرعة ثابتة.
  10. أدخل تعريف الحيوانات، وتاريخ الميلاد، والوزن، والجنس. حفظ البيانات في موقع المطلوب على الكمبيوتر أو الخادم. انقر فوق "الكاميرا" للعودة إلى واجهة تسجيل.
  11. إذا كانت سرعة تشغيل متعددة تحتاج إلى تسجيل، كرر الخطوات من 2.6-2.10 مع سرعات التشغيل المطلوب. قبل تسجيل الفيديو التالي، تأكد من أن الدهان الأحمر لا تزال موجودة على مخلب، خلاف كرر الخطوة 2، 3.
  12. بعد التسجيل، إطلاق سراح هذا الحيوان إلى قفصة المنزل. بعد إزالة حيوان، تنظيف الحزام المطحنة جيدا بالماء والصابون متبوعاً بمطهر لإعداده للحيوانات التجريبية المقبلة.

3-الفيديو تجهيز

  1. ابدأ تشغيل برنامج تحليل وانقر فوق "تحديد مجلد دراسة" لتحديد المجلد مع أشرطة الفيديو المسجلة.
  2. حدد فيديو واحد أو العديد من أشرطة الفيديو التي يمكن معالجتها بشكل متتابع، وانقر فوق "الانتقال".
  3. استخدم الدالة "رسم" لتحديد منطقة حيث يتم تشغيل الماوس؛ ينبغي أن يتضمن هذا القسم فقط بالماوس وخلفية بيضاء.
  4. إذا كان يستخدم الدالة المطحنة "عكس"، اختر "التحقق مما إذا كان الآنف هذا الموضوع بحقك >>>" مرآة الفيديو حيث صمم هذا البرنامج لتحليل الحيوانات إلى اليسار فقط. انقر فوق "قبول" المضي قدما.
  5. استخدم الدالة "تحديث" لرؤية القناع الافتراضي ومخلب طباعة يقوم بالكشف عن البرامج.
    ملاحظة: يتم عرض الفيديو الأصلي على اليسار، وصورة أبيض وأسود يطبع مخلب المقترح على الحق.
  6. قم بإدخال قيم في مربعات "الطول" و "العرض" لتغيير القناع التي تستثني منطقة حمراء حول الآنف للحيوان للتحليل؛ كما أن اللون مماثل للكفوف، عدم إخفاء هذا المجال يمكن أن يؤدي في البرنامج عن طريق الخطأ في تصنيف منطقة الآنف مخلب.
  7. ضبط منزلقات "تصفية الضوضاء" و "تصفية الفراء وبقع داكنة" لتحسين طباعة مخلب أبيض وأسود. تعيين مربع التمرير "تصفية الضوضاء" ~ 800-950 للحيوانات الأسود و ~ 700-800 للحيوانات البنى أو الأبيض، اعتماداً على لون الفراء الدقيق للحيوان. حدد "موافق" عندما تكون الإعدادات مرضية.
    ملاحظة: يعتمد مربع التمرير "تصفية الفراء وبقع داكنة" على كيف "الحمراء" مخلب هو. لطلاء الكفوف، والقيمة عادة حوالي 100-120، ورسمت بغير آثار أقدام أفضل قيمة حوالي 50-100. هذه الإعدادات تعتمد على الظلال لون الفراء والكفوف، وتحتاج إلى أن يكون الأمثل لكل الحيوانات. وينبغي أن يكون مخلب أبيض وأسود الطباعة تمثيلات واضحة للكفوف مع ضجيج الخلفية قليلاً قدر الإمكان.
  8. حدد واحد أو عدة من أشرطة الفيديو التي تم تمريرها التسوية الأولى (المسمى مع "@ @" قبل اسم الفيديو) وقم بتحديد الدالة "انتقال" لبدء تحليل أشرطة الفيديو هذه.
    ملاحظة: يأخذ التحليل 2-5 دقائق كل فيديو. فمن الممكن لتشغيل تحليل العديد من أشرطة الفيديو بين عشية وضحاها حيث تتطلب هذه الخطوة أي إدخال من المجرب.
  9. حدد شريط فيديو تم تحليلها على (المسمى بواسطة "@ @ @")، وانقر فوق "الانتقال". علما بأنه يمكن الآن رؤية منطقة مخلب (في سم2) على اتصال بالحزام على مر الزمن (مشيه dynamics) لكل مخلب منفصلة. مقارنة شريط الفيديو الأصلي ومخلب المحسوبة الطباعة لمنطقة محددة، استخدم الدالة "تشغيل الفيديو".
  10. استخدم الأدوات التالية (ثلاث) تصحيح الأخطاء الصغيرة التي أدلى بها البرنامج.
    1. استخدم الخيار "الصحيح" لحذف إشارة خاطئة، مثلاً، عندما البرنامج السجلات إشارة على الرغم من مخلب المقابلة ليست على اتصال بالحزام. انقر مرة واحدة للتكبير في المجال ذي الصلة، ووضع علامة على الحد الأيسر للكائن لإزالة مع انقر فوق الثاني والحد الأيمن مع فوق الثالث.
    2. استخدم خيار "الاتصال" للجمع بين إشارتين، مثلاً، عندما يتم تسجيل أي إشارة لإطارات قليلة حتى ولو مخلب على اتصال بالحزام. انقر مرة واحدة للتكبير في المجال ذي الصلة، وانقر نقراً مزدوجاً فوق في وسط الكائنين في الجمع بين.
    3. استخدم الخيار "حذف" لإزالة النقاط الزمنية من التحليل بشكل كامل. استخدم هذا الخيار فقط إذا كان لا يمكن إصلاح الخطأ مع "الصحيح" أو الدالة "الاتصال"، مثلاً، عندما يتم تسجيل إشارة من مخلب فوريليمب اليسرى بطريق الخطأ مخلب اليسار هند أطرافهم. انقر مرة واحدة للتكبير إلى المنطقة ذات الصلة، ووضع علامة الحد الأيسر للمنطقة لإزالة مع انقر فوق الثاني والحد الأيمن مع فوق الثالث.
      ملاحظة: قد لا يمكن استخدام الأدوات لتصحيح الأخطاء الصغيرة؛ لا يمكن تصحيح إخفاقات منهجية (مثلاً، إذا كانت الإشارة من مخلب واحد كان ضعيفا للغاية): الفيديو ينبغي أن تستبعد من تحليل وتسجيل الحيوان كل تكرار، عندما يكون ذلك ممكناً. علما أن الخيار "تشغيل الفيديو" لم يعد متوفراً بعد "الصحيحة"، استخدمت "الاتصال" أو الخيار "حذف"، والنقر فوق الزر "تراجع" إلى إعادة تعيين كافة 3 أدوات التحرير.
  11. حدد "التالي أطرافهم" المضي قدما من خلال أطرافه 4؛ عند النقر فوق "التالي أطرافهم" بعد مخلب آخر، البرنامج يكمل التحليل ويبين النتائج لهذا الحيوان على شاشات 4.

4. تحليل مشيه

  1. عندما يتم تحليل جميع أشرطة الفيديو من تجربة واحدة، حدد كافة ملفات الفيديو، ثم انقر فوق "إعادة تنظيم النتائج" لتصدير النتائج (قائمة المعلمات في ملفات جداول البيانات).
  2. فتح الملف بإنهاء "reorganized_stride_info" وإضافة المعلومات التي لم يتم تضمينها في جدول البيانات هذا: المجموعة المعلومات (مثل النمط الوراثي، والعلاج)، والعمر، والقياسات من الحيوان الطول والعرض التي يتم حفظها في مكان آخر ملف جدول البيانات مع انتهاء "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info".
  3. تطبيع المعلمات مشيه للحيوان للعرض أو الطول عند الاقتضاء، مثلاً، SL طول الحيوان وسويسري لعرض الحيوانات.
  4. فرز النتائج حسب المجموعة، والعمر، وسرعة التشغيل: تحليل جميع هذه الشروط بشكل مستقل.
    ملاحظة: إعمار مختلفة أو تشغيل بسرعة لا يمكن ضم ضمن مجموعة ذاتها.
  5. حساب قيم المتوسط (الوسط) والانحراف المعياري، والخطأ المعياري للوسط لكل معلمة لجميع الظروف التجريبية.
  6. إجراء التحليل الإحصائي وفقا للتصميم التجريبي، مثلاً، استخدام الذيل 2 ر-اختبار لمقارنة المسخ/تعامل الحيوانات البرية-نوع (WT)/عنصر التحكم أو ANOVA لمقارنة عدة مجموعات مستقلة.
  7. نظرة على الإطلاق قياس المعلمات: أنها مفيدة لرسم كل معلمة لتصور أفضل النتائج. إذا كان هناك اختلافات إحصائية في معلمة معينة، تحقق من حالة تغيير معلمات أخرى تعتمد في المقابل.
    ملاحظة: على سبيل المثال، إذا SL يتناقص إلى حد كبير في مجموعة اختبار معينة، كما سيتسبب أعلى تردد برايد (نظراً لسرعة التشغيل هو نفسه) وقد تؤدي سويسري زيادة (من أجل الحفاظ على استقرار الموقف).
  8. حدد المعلمات التي هي الأكثر ملاءمة لنموذج، و/أو قابلة للمقارنة للملاحظات في الأمراض البشرية. لعرض تقديمي، إنشاء ملفات الفيديو التمثيلي لكل مجموعة وتكملتها بالرسوم البيانية عرض قراءات للمعلمات ذات الصلة، منذ التغييرات مشيه خفية غالباً ما لا تكون واضحة من أشرطة الفيديو.

5-استكشاف الأخطاء وإصلاحها

ملاحظة: قد يكون بعض الحيوانات، وخاصة نماذج الماوس النمط الظاهري قلق، صعوبات لأداء مهمة بسيطة حتى مثل تشغيل في حلقة مفرغة. فيما يلي الخطوات التي يمكن اتخاذها لخفض مستويات القلق وتشجيع التشغيل.

  1. التعود وإنفاذ إيجابية.
    1. في 2-3 أيام قبل الاختبار الأول، ضع الماوس في غرفة الاختبار وتغطية ذلك بقطعة قماش داكنة، واترك الضوء إيقاف تشغيل. واسمحوا الماوس التكيف مع البيئة الجديدة لدقيقة ~ 5 تشو إضافة أو الشوكولاته/زبدة (مثل نوتيلا) إلى غرفة الاختبار حتى يجوز تكوين ارتباط إيجابي.
  2. السلبية الإنفاذ بالهواء نفث/خلف الحدود.
    1. الفئران لا تحب نفث الهواء أو حركة وراءها، وسيتم تشغيل بعيداً عن الاضطرابات. تحفيزهم على التوالي، استخدم نفث الهواء معتدل، أو الإيقاعي حركة شريط مرن الذي يشكل الحدود الخلفية لقاعة الاختبار، لتشجيع الماوس لتشغيل نحو الجزء الأمامي من قاعة الاختبار.
  3. بداية بطيئة.
    1. عند اختبار سرعة تشغيل بسرعة، تبدأ حلقة مفرغة بسرعة أقل، وثم ببطء زيادة سرعة المطحنة نحو حالة الاختبار المطلوب.
  4. التقليل إلى أدنى حد من حرية الحركة.
    1. طول غرفة اختبار محدد بواسطة شريطين قابل للتعديل في الأمام والخلف. إذا كان حيوان اختبار مواكبة سرعة التشغيل، لكن لا يتم تشغيل اطراد، تحد من طول الدائرة أن يؤدي تشغيل أكثر ثابت.
  5. إذا كانت القياسات المذكورة أعلاه غير ناجح، سجل تشغيل في اليوم التالي. إذا كانت لا تزال ترفض الحيوان لتشغيل بعد الاختبار على ثلاثة أيام، سجل هذا الاستنتاج، واستبعاد الحيوان من إجراء مزيد من التجارب.
    ملاحظة: تعتمد نتائج تحليل مشيه على تسجيل الفيديو عالية الجودة. لا يوجد أي سبب لاستبعاد ملفات الفيديو أثناء التحليل إذا تم تسجيل أشرطة الفيديو بعناية. وإذا كانت جودة الفيديو غير كافية، ستصبح واضحة خلال الخطوة 3.6 عندما يتم يتم تعيين المعلمات لإنشاء طباعة مخلب الرقمية. إذا كان أي جزء آخر من الجسم ما عدا آثار أقدام وانف يظهر الأحمر (مثلاً بسبب الفراء مفقودة حول الأعضاء التناسلية أو الإصبع الطلاء سبرينكلينجس في البطن)، النوعية تنخفض إلى حد كبير. تسمح بإجراء التعديلات في الخطوة 3، 6 تصحيح المسائل الصغيرة فقط، وإذا كان هذا لا يمكن أن يجلب الفيديو نسبة مقبولة إشارة/ضوضاء، يحتاج الفيديو إلى استبعادها من التحليل، والتسجيل بحاجة إلى تكرار. وهكذا، من المستحسن تحليل أشرطة الفيديو قريبا بعد يتم إجراء التسجيلات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لتوضيح كيفية استخدام تحليل مشيه الحركية، نحن أدوا تحليل مشيه على الفئران WT C57BL/6J مع التقدم في السن، فضلا عن عدة خطوط متحولة اندوفيلين، باستخدام الأدوات المتاحة تجارياً والبرمجيات (يرجى الرجوع إلى الجدول من المواد). في هذا الإعداد، تسجل كاميرا عالية السرعة ضمن حلقة مفرغة شفافة تشغيل ماوس (الشكل 1A). يتعرف البرنامج ثم التناقض بين الكفوف اللون الأحمر والفراء الأبيض أو الأسود. منذ كان لدينا الحيوانات التجريبية لون الفراء بني داكن، ونحن قد رسمت آثار أقدام لجميع المواضيع بالدهان الأحمر الإصبع. لدينا اختبار الحيوانات التجريبية سرعات تشغيل مختلفة: المشي (10 سم/ثانية) وتشغيل (20 سم/ثانية)، وتشغيل سريع (30 سم/ثانية). وقيست في مجال الاتصال، والوقت الكفوف كانت في حلقة مفرغة وفي الهواء. من خلال هذه المعلومات، كانت المعلمات أن الخص إيقاع مشيه (مثلاً، سوينغ/موقف الوقت، والفرامل/الدفع) أو الموقف (مثلاً، زاوية مخلب، جنوب غرب) يحسب (الشكل 1B).

أجرينا تحليل مشيه كجزء من بطارية للعديد من اختبارات السلوك الحركي. قمنا بتقييم قوة قبضة (ع), أطرافهم هند قبض (HLC)، مشيه، وأداء روتارود المعجل (ARR). أن السلوك الحركي ليس كما تتأثر بالخبرات السابقة واختبارات تجريبية ك، فعلى سبيل المثال، الإدراك، المهم لا يزال خضوع كل الحيوانات البطارية نفس الاختبارات في نفس الترتيب وفي نفس السن. يجب أن تذهب بأمر من الصعوبة على ارتفاع منخفض للحيوان إلى أدنى حد من التأثيرات من التجارب السابقة في الاختبار الحالي.

لقد اخترنا طفرات اندوفيلين لهذه الدراسة منذ ذلك الحين، اعتماداً على كم من الثلاثة الآليلات اندوفيلين مفقودة، ويختلف النمط الظاهري الناتج من لا النمط الظاهري في كوس واحد إلى النمط الظاهري الأعصاب معتدل في اندوفيلين الشباب 1KO-2HT-3KO الفئران التي تقدم مع الشيخوخة. ولهذا السبب، تقدم هذه الخطوط الحيوان نموذج ملائم لدراسة التغييرات الطفيفة التي تضع فقط كالسن الحيوانات. نظراً لأن معظم اندوفيلين طفرات إظهار عمر مخفضة، وقد درسنا السلوك الحركي من طفرات اندوفيلين على مدى 18 شهرا (النقطة الزمنية 18 شهرا كان المحدد منذ حتى الفئران في خط 1KO-2HT-3KO اندوفيلين الذي يعرض أقوى النمط الظاهري، لا تملك الشلل). وأجرى تحليل مشيه في ثماني نقاط زمنية على مدى فترة 18 شهرا (الشكل 1). في 18 شهرا عمر، euthanized الحيوانات، والحفاظ عليها لتحليل الكيمياء الحيوية و/أو النسيجي.

صيانة مستعمرة الماوس:

وأبلغ الفئران متخالف ومتماثل الآليلات اندوفيلين 1 و 2 و 3 أصلاً في ميلوسيفيتش وآخرون. واستخدمت الفئران C57BL/6J 21 بالإضافة إلى الفئران ليتيرماتي كعناصر تحكم في جميع أنحاء. تم إيواء الفئران في أقفاص مفتوحة مع إعلانية libitum الوصول إلى الغذاء والماء في مجموعات كحد أقصى 5 الحيوانات، في دائرة الضوء/الظلام 12-ح. واستخدمت في هذه الدراسة الفئران الذكور فقط استبعاد آثار التغيرات تعتمد على دورة في الإناث.

التنميط اندوفيلين A1 و A2 A3 الماوس نماذج:

كان يؤديها الوراثي للفئران متحولة اندوفيلين بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد) التضخيم باستخدام الحمض النووي المستخرج من اللكمات الذيل أو الإذن. تقارير إتمام المشروعات لثلاثة اندوفيلين من جينات أجريت مع الإشعال كل منهما: اندوفيلين-A1: الأمام التمهيدي 5 'CCACGAACGAACGACTCCCAC3' وعكس كبسولة تفجير 5 '-كجكاككتجكاكجكجكككتاكك-3' لوزن، 5 '-تكاتاجككجاتاجككتكتكك-3' كو؛ اندوفيلين-A2: إعادة توجيه كبسولة تفجير 5 '-كتكتجككتجكتجككتككتا-3' للوزن؛ 5-ككتاجججكتججتج-تجاتجاجت-3 'كو وعكس كبسولة تفجير 5'-جككككاكاككتكتكجكتجاك-3 'لوزن، 5'-كجتاتجكاجككجككجكاتجكاتك-3 ' كو؛ اندوفيلين-A3: الأمام التمهيدي 5 '-كتككككاتجتجااجتككاتك-3' وعكس كبسولة تفجير 5 '-تجتجاكاجتجتجاككاكاج-3' لوزن، 5-'كاكجاكاجاكجاجاج-المداري-3' كو. تم تشغيل منتجات PCR الناتجة عن 1% [اغروس] هلام، مما أسفر عن أحجام الآليلات WT وكو الفرقة المميزة: اندوفيلين-A1 WT ~ 384 bps، كو bps ~ 950؛ اندوفيلين-A2 WT bps ~ 1,280، كو bps ~ 1,000؛ اندوفيلين-A3 WT ~ 325 bps، كو ~ 465 bps. منتجات PCR مع العصابات WT وكو تدل حيوان (HT) متخالف.

النتائج:

وصف مشيه والموقف في الفئران WT مع التقدم في السن، وقد أجرينا تحليل مشيه الحركية في هذه الحيوانات (الشكل 2؛ فيلم 1). بينما بعض المعلمات، على سبيل المثال SW (متوسط المسافة بين الصدارة أو أطرافهم هند تطبيع لعرض الحيوانات؛ وانظر أيضا الجدول 1)، لم تتغير في وزن الحيوانات مع التقدم في السن، وتغيير معلمات أخرى تدريجيا (الشكل 2A– ج). على سبيل المثال، دعم مزدوجة أطرافهم هند (الوقت بالنسبة إلى مدة موقف كل أطرافه هند هي على اتصال مع الأرض في نفس الوقت) يزيد من 38 في المائة إلى 55 في المائة من شهر 1 إلى 18 شهرا (الشكل 2). وكثيراً ما يرتبط هذه المعلمة مع عدم استقرار الموقف35. وعلاوة على ذلك، تحميل أطرافهم (معدل تغير مجال مخلب في مرحلة كسر القصوى) يزيد من 38 سم2/ق إلى 59 سم/ق2من الشهر 1 إلى 18 شهرا (الشكل 2). يمكن أن تفسر تباطؤ سريع كمؤشر لقوة العضلات المخفضة. لا تتأثر قدرة التشغيل الإجمالية في وزن الحيوانات (94% وقادرة على تشغيل 30 سم/ث في 18 شهرا، الشكل 3 ألف). بالإضافة إلى وصف مشيه والموقف من المعلمات التي تبقى غير متأثرة، أو تغيير تدريجيا مع التقدم في السن في الفئران WT، لدينا موثقة أن تحليل مشيه الحركية استخدام VPI طريقة مناسبة لدراسة التعديلات المتعلقة بالسن معتدل في مشيه والموقف.

بينما لا تتأثر قدرة التشغيل الإجمالية في وزن الحيوانات، عدة خطوط متحولة اندوفيلين إظهار تغيير القدرة على المشي أو الجري في حلقة مفرغة مزودة بمحركات (الشكل 3 ألف)، كما ورد في مردوخ et al. 13 على مجموعة بيانات أصغر. جدير بالذكر أن بينما خلال شهر واحد من العمر جميع الفئران 1KO-2HT-3KO اندوفيلين كلها قادرة على تشغيل 30 سم/ث، في غضون 18 شهرا عمر 81% الحيوانات نفسها ليست قادرة على تشغيل (الشكل 3 ألف، علما أن حللت أفواج أكبر من تلك التي ذكرت سابقا في 13). من المثير للاهتمام، وتتأثر أيضا طفرات اندوفيلين التي تفتقر إلى أقل اندوفيلين الآليلات (أي، اندوفيلين 1KO-2HT-3WT)، ولكن بدرجة أقل (الشكل 3A).

على الرغم من أن تظهر طفرات 1KO-2HT-3KO اندوفيلين العاهات الحركية الشديدة مع تقدم العمر13، العديد من المعلمات مشيه لا تتغير بالمقارنة مع التحكم بالوزن، أيضا في سن 18 شهرا. على سبيل المثال، يظل خطوة زاوية التباين (الانحراف المعياري من زاوية الخطوة) دون تغيير (الشكل 3B). جدير بالذكر أن العديد من المعلمات الأخرى، على سبيل المثال دفع الوقت (النسبة المئوية للوقت موقف الكفوف هي في مرحلة الدفع)، لا تختلف في شهر واحد من العمر، ولكن تدريجيا تصبح أسوأ مع الشيخوخة (الشكل 3؛ انظر أيضا 2 الفيلم). وهذا يوضح أنه يمكن دراسة كل المعلمات تعتمد على العمر، فضلا عن المتغيرات الخاصة بالمسخ الأعصاب مع نهج لتحليل مشيه حركية.

Figure 1
رقم 1. إعداد تصوير الطائرة البطني والمبدأ- (أ) الصورة والتخطيطي الرسم لإعداد تحليل مشيه. (ب) تحليل البرمجيات مبدأ: من الجانب السفلي مسجل بالماوس تشغيل في حلقة مفرغة شفافة، يحسب البرنامج يطبع مخلب الرقمية. يتم قياس ديناميتها أثناء التشغيل كما مخلب حجم المنطقة على مر الزمن، وهذا هو استخدامها كأساس لحساب إيقاع مشيه والموقف المعلمات. (ج) إجراء دورة وقت التجربة تحليل مشيه على طفرات اندوفيلين. تم تقييم الحركة ومشية في 1، 2، 3، 6، 9، 12، 15، و 18 شهرا. وتظهر صور الماوس 1KO-2HT-3KO اندوفيلين في 2 و 12 و 18 شهرا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2. مشيه التحليل في الفئران البرية من نوع مع التقدم في السن. تم تقييم الحركة ومشية في الفئران WT (C57BL/6J) 1، 2، 3، 6، 9، 12، 15، و 18 شهرا. العرض (A) الموقف تطبيع لعرض الحيوانات من وزن الحيوانات لا تتغير مع التقدم في السن. (ب) دعم مزدوجة أطرافهم هند يزيد مع التقدم في السن في وزن الحيوانات. ويبين الرسم البياني نسبة الوقت موقف كل أطرافه هند هي على أرض الواقع وفي الوقت نفسه. وتعكس زيادة في هذه المعلمة مشيه عدم الاستقرار. (ج) أطرافهم تحميل (معدل التغير من منطقة مخلب في مرحلة كسر القصوى) يزيد مع التقدم في السن في وزن الحيوانات. قد يكون أكثر سرعة التباطؤ مؤشرا لقوة العضلات المخفضة. كل الرسومات البيانية تمثل القيمة يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ تم حساب قيم p من الذيل 2 ر-الاختبارات مقابل WT 1-الشهر القديمة، والتي يتم تمثيلها ك * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. مشيه التحليل في طفرات اندوفيلين مع التقدم في السن. (أ) سرعة تشغيل طفرات اندوفيلين في 1 و 12 و 18 شهرا، محسوبة من dataset موسعة بالمقارنة مع مردوخ et al. 13 شريط ألوان تعكس النسبة المئوية للحيوانات قادرة على تشغيل في 30 (أزرق داكن)، 20 (الأزرق)، أو 10 سم/s (أزرق فاتح) في حلقة مفرغة مزودة بمحركات، أو يرفض تشغيلها على برنامج الإعداد (رمادي). بينما يمكن تشغيل جميع الحيوانات المختبرة في 30 م/ث خلال شهر واحد، تطوير طفرات اندوفيلين عجز مع تقدمهم في السن. (ب–ج) زاوية تقلب الخطوة ودفع الوقت في وزن (أسود)، اندوفيلين 1KO-2WT-3WT (تورقويس)، اندوفيلين 1KO-2HT-3WT (أزرق داكن) والفئران (براون) 1KO-2HT-3KO اندوفيلين. يظهر تباين زاوية خطوة لا فرق في الشيخوخة وزن الحيوانات، أو بين طفرات WT واندوفيلين. وقت دفع (كنسبة مئوية موقف) لا يتغير إلى حد كبير بين الطفرات اندوفيلين ووزن خلال شهر واحد، ولكن يتناقص في طفرات اندوفيلين كسن الفئران. كل الرسومات البيانية تمثل القيمة يعني ± ووزارة شؤون المرأة؛ تم حساب قيم p من الذيل 2 ر-الاختبارات مقابل WT مطابقة العمر، والتي يتم تمثيلها ك * ف < 0.05، * * ف < 0.01، * * * ف < 0.001 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Movie 1
فيلم 1. مشيه التحليل في البرية من نوع الماوس (C57BL/6J) 3 (يسار) و 18 شهرا من العمر (يمين)- الفيديو الأصلي (أعلى) ترجمت إلى شريط فيديو "طباعة مخلب رقمية" (أسفل). وقد تباطأت سرعة الفيديو 5 مرات حيث أن التفاصيل يمكن أن يكون موضع تقدير أفضل. في هذه النقطة الزمنية 18 شهرا، لاحظ تردد مخلب حق هند (الأحمر في مخلب الرقمية الطباعة) في ~ 2 s، ومخلب الأمامي الأيمن (اللون الأزرق في مخلب الرقمية الطباعة) في ~ 4 s. وقد تباطأت سرعة الفيديو بنسبة 10. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Movie 2
فيلم 2. مشيه التحليل في اندوفيلين 1KO-2WT-3WT (المراقبة؛ واليسار) مقابل اندوفيلين 1KO-2HT-3KO الفئران (يمين) في غضون 18 شهرا عمر. سرعة الفيديو قد تباطأ بمعامل 5 حتى يمكن تقدير تفاصيل أفضل. الماوس 1KO-2HT-3KO اندوفيلين يعرض مشيه التعديلات التي يمكن أن ينظر إليه الأقل استقرارا تشغيل الحيوان. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

دراسة تنسيق السيارات هو نهج مفيد في وصف نماذج أمراض الأعصاب، خاصة بالنسبة للأمراض مثل PD الذي هو التنسيق الحركي تأثرا شديدا. مع المساعدة من بالانزيم تحليل مشيه الحركية الوظيفية، علينا تحديد بعض التغييرات الطفيفة في مشيه الحيوانات في بداية مشاكل الحركة، أو في نماذج مع نيوروديجينيريشن ضعيفة ومتواضعة نسبيا ومن ثم النمط الظاهري. ونظرا لمجموعة واسعة من تعمل في نماذج مختلفة من أمراض الأعصاب الذي يشمل الشذوذ مشيه الصغيرة وضعف في حركة شديدة، هذا الأسلوب مناسب تماما لتقييم المعلمات مشيه على أساس سن الحيوان والقدرة على التحرك. يمكن تسجيل الحيوانات ضعف شديد المشي بسرعة منخفضة على المطحنة الطائرة، بينما يمكن أن تسجل أقل نماذج البصر تشغيل صعودا أو هبوطاً بسرعة عالية. وهذا يمكن أن تكشف عن مشيه الاختلافات بين النموذج الأعصاب وسيطرتها ليتيرماتي دون الانهاك الحيوانات.

مع أحكام هذا البروتوكول، علينا أن نظهر أديكواتينيس الأسلوب VPI لرصد تطور الإعاقات الحركية مع الشيخوخة في الفئران. اختبار وزن الفئران في نقاط زمنية متعددة كما تقدم بهم العمر سمحت لنا بتحديد شذوذ مشيه تعتمد على العمر، وتصف كيف أنها تقدم مع الشيخوخة. وبالإضافة إلى ذلك، عند التعامل مع نماذج الماوس نيوروديجينيريشن، هي مسألة كثيرا ما يعرض أنه نظراً للأعراض لا تتصل بالسلوك الحركي (مثل القلق، واللامبالاة، صعوبات في التعلم)، استعداد الحيوان لأداء حتى بسيطة المهمة مثل تشغيل المحرك، وهو انخفاض. هنا، فإننا نقترح تعديل أسلوب وأدوات تحفيزية لتشجيع تشغيل في حلقة مفرغة يجهز المضيئة التي يمكن أن تكون مفيدة لنجاح تطبيق تحليل مشيه الحركية للشيخوخة خطوط الماوس مع التغييرات الأعصاب. علاوة على ذلك، نحن نستخدم خدعة بسيطة لتطبيق الطلاء الإصبع لآثار أقدام الحيوان وتبين أنه يمكن أن يساعد إلى حد كبير في تحسين نوعية البيانات المسجلة. الحصول على تسجيلات الفيديو جيدة هي الخطوة الأكثر أهمية لتحليل مشيه: يعتمد نجاح التحليل، مثل كل تحليل التلقائية أو شبه التلقائية للصور أو ملفات الفيديو، على نوعية البيانات الخام. فيديو منخفض الجودة لا يمكن تحسينها في الخطوات اللاحقة في التحليل، وعادة ما يكون لاستبعادها من عملية التحليل.

أثناء الدراسة بانتظام مشيه والموقف من وزن والعديد من خطوط متحولة اندوفيلين على مدى 18 شهرا، وقد لاحظنا أن وزن الفئران والفئران مع أي قضايا واضحة الحركة/التشغيل (أي، اندوفيلين 1KO-WT-WT)، حتى تظهر التعديلات في العديد من المعلمات مشيه والموقف مع التقدم في السن بطريقة تدريجية (الشكل 2 و الشكل 3 ألف). من المثير للاهتمام، وقد لاحظنا أيضا أنه بينما شذوذ في العديد من المعلمات مشيه والموقف التي لوحظت في الشيخوخة طفرات اندوفيلين وضع في نفس الاتجاه والمنحدر كما هو الحال في الحيوانات WT/المراقبة، البعض الآخر لا (الشكل 3). وأخيراً، من المهم أن نلاحظ أن حتى إذا لم يعرض WT الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران والشباب طفرات اندوفيلين أي تحرك واضح ومشية وعيوب الموقف عندما يلاحظ بالعين المجردة، يمكن اكتشاف التغيرات في معلمات مشيه والموقف الانتقائي مع هذا النهج.

اختبار سلوك الماوس السيارات واحدة من الطرق الأكثر شمولاً لتوضيح أن نموذج ماوس يظهر الجوانب الرئيسية لحالة الإنسان. كنتيجة لذلك، وضعت عددا من الاختبارات لتقييم الجوانب المختلفة للسلوك الحركي. هذه الاختبارات تشمل اختبار حقل مفتوح (النشاط الحركي العام)، روتارود (التنسيق الحركي، ترنح)، وقبضة القوة (قوة العضلات)، تشغيل عجلة (النشاط)، معلقة أسلاك اختبار (التحمل)، سلم شعاع المشي المهمة (التنسيق الحركية الدقيقة، مهارة حسي حركي)، مشيه التحليل (الحركة، والتنسيق أطرافهم)، وغيرهم (الملخصة في والستين36). الاختبارات المختلفة محددة مزايا وعيوب وما read-outs تقتصر عادة على الجانب (أو الجوانب) للسلوك الحركي أنها صممت لمعالجة. لهذا السبب، أصبح من الممارسات الشائعة لأداء بطارية اختبارات السلوك الحركي لتغطي الجوانب الرئيسية لهذا المجال.

تحليل مشيه غالباً ما لم يدرج في هذه البطاريات، جزئيا بسبب تقرير قبل غويلوت آخرون 37، التي وجدت أن تحليل مشيه لم يكشف العجز الحركي في نماذج حيوانية PD والمرض، وجزئياً بسبب طريقة شاقة والإخراج محدودة. ومع ذلك، غويلوت وآخرون. قد طعنت التقرير البحوث التي تتناول العديد من القيود في تصميم الدراسة38. وقد ثبت جدوى هذا الأسلوب في تحليل مشيه في نماذج الماوس مع نيوروديجينيريشن عدد من الأخيرة منشورات10،،من1112،39،40 ،41،،من4243، أيضا بما في ذلك العمل لدينا13.

تسجيلات VPI تأتي مع العديد من المزايا على الأسلوب التقليدي لطلاء الكفوف مع الحبر وترك الماوس تشغيل على ورقة بيضاء من الورق44. الأكثر وضوحاً هو حقيقة أن يتم التحكم بحلقة مفرغة مزودة بمحركات، سرعة تشغيل الحيوان، الذي له تأثير قوي على عدة مشيه المعلمات1. وبالإضافة إلى ذلك، بعض التشوهات مشيه تصبح قابلة للاكتشاف فقط عند تشغيل الحيوان في سرعة عالية تطلبا و/أو المنحدر/انخفاض، الذي إلا ينظر في إدارة التبرعات. وعلاوة على ذلك، يتم استبدال تحليل وضع يد بتحليل شبه الآلي، والفائق. ولهذا السبب، يمكن زيادة عدد الحيوانات التي اختبرت في كل مجموعة، الذي بدوره يقلل التأثير الناجم عن التقلبات التي لا مفر منها في الحيوانات الحية. وباختصار، نوصي بأن يتم تضمين الإصدار المعدل من تحليل مشيه VPI في بطاريات اختبار المحركات القياسية لاستكمال تحليل الإعاقات الحركية في نماذج القوارض من نيوروديجينيريشن و/أو الشيخوخة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

ونشكر أولياء الحيوان في مرفق العيني الحيوان للمساعدة في تربية، والدكتور نونو رايموندو لتعليقات مفيدة على المخطوطة. الدردشة معتمد بواسطة المنح من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG) من خلال مركز البحوث التعاونية SFB-889 (مشروع A8) و SFB-1190 (مشروع P02)، وجائزة إيمي نويثر الشباب محقق (1702/1). C.M.R. معتمد من قبل الزمالة، من مدرسة الدراسات العليا غوتنغن لعلوم الأعصاب والفيزياء الحيوية والعلوم البيولوجية الجزيئية (جنب).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clarke, K. A., Still, lJ. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
  2. Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol's effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
  3. Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
  4. Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
  5. Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
  6. Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
  7. Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson's Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
  8. Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
  9. Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A. Jr, Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson's disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
  10. Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson's disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
  11. Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
  12. Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson's disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
  13. Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
  14. Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
  15. Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice - implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
  16. Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
  17. Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
  18. Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Behavior. (1-2), 79-84 (2002).
  19. Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
  20. Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson's disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
  21. Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
  22. Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
  23. Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
  24. Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
  25. Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
  26. Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
  27. Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
  28. Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
  29. Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
  30. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
  31. Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
  32. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
  33. Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  34. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
  35. Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), Article in Japanese 1193-1202 (2010).
  36. Wahlsten, D. Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , Academic Press. (2010).
  37. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson's Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
  38. Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
  39. Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
  40. Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
  41. Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
  42. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
  43. Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
  44. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8: Unit 8.12 (2001).
  45. Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 136، الشيخوخة، مشيه التحليل، الحركة، نيوروديجينيريشن، الالتقام، اندوفيلين، والسلوك الحركي، واختبار المحركات والبطاريات، وتصوير الطائرة البطني
تحليل مشيه للإعاقات الحركية تعتمد على سن في الفئران مع نيوروديجينيريشن
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait… More

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (136), e57752, doi:10.3791/57752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter