Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Gangart analyse af aldersbetinget Motor svækkelser i mus med Neurodegeneration

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

I denne undersøgelse demonstrere vi brugen af kinematiske gangart analyse baseret på ventrale flyet imaging for at overvåge de subtile ændringer i motoriske koordination samt progression af neurodegeneration med fremrykkende alder i musemodeller (f.eks. endophilin mutant mus linjer).

Abstract

Motor adfærd test er almindeligt anvendt til at bestemme den funktionelle relevansen af en gnaver model og for at teste nyligt udviklet behandlinger hos disse dyr. Specifikt, giver gangart analyse generobre sygdom relevante fænotyper, der er observeret i patienter, især i neurodegenerative sygdomme, der påvirker motoriske evner som Parkinsons sygdom (PD), Alzheimers sygdom (AD), amyotrofisk lateral sklerose (ALS), og andre. I tidlige undersøgelser langs denne linje, måling af gangart parametre var besværlige og af faktorer, der var svære at styre (fx kører hastighed, kontinuerlig kørende). Udviklingen af ventrale flyet imaging (VPI) systemer gjort det muligt at udføre ganganalyse på en stor skala, hvilket gør denne metode et nyttigt redskab til vurdering af motor adfærd i gnavere. Her præsenterer vi en grundig protokol af hvordan kinematiske gangart analyse til at undersøge aldersbetinget progression af motor underskud i musemodeller af neurodegeneration; mus linjer med nedsat niveau af endophilin, i, neurodegenerative skaden gradvis stiger med alderen, er brugt som eksempel.

Introduction

Neurodegenerative sygdomme være en betydelig byrde for patienter, familier og samfund, og vil blive af endnu større bekymring som levealder stiger, og verdensbefolkning fortsat alder. En af de mest almindelige symptomer på neurodegenerative sygdomme er balance og mobilitet problemer. Således karakterisering af motor adfærd i aging pattedyr (f.eks. gnavere) modeller, og/eller modeller viser neurodegenerative fænotyper, er et værdifuldt redskab til at demonstrere i vivo relevans af den specifikke animalske modeller, eller terapeutisk behandlinger, der har til formål at forbedre sygdomssymptomer. Næsten hver tilgang til behandling af neurodegenerative sygdomme i sidste ende kræver test i en dyremodel før indledningen af kliniske forsøg med mennesker. Derfor er det afgørende at have pålidelig og reproducerbar adfærd tests, der kan bruges til at kvantificere konsekvent sygdom-relevante fænotyper langs alder progression, for at sikre, at en kandidat stof, som viste potentiale i en in vitro- model, kan effektivt forbedre fænotype i et levende dyr.

Et aspekt af motor adfærd vurdering i gnavere er kinematiske gangart analyse, som kan udføres af VPI'EN (også kaldet ventrale flyet videography)1,2. Denne etableret metode udnytter kontinuerlig registrering af undersiden af gnavere omvandrende oven på en gennemsigtig og motoriseret løbebånd bælte1,2,3,4. Analyse af video feed data skaber "digital pote print" af alle fire lemmer, der dynamisk og pålideligt sammenfatte de gnaver omvandrende mønster, som oprindeligt beskrevet af grønkål et al. 2 og Amende et al. 3.

Princippet om imaging-baserede gangart analyse er at måle området pote i kontakt med løbebånd bælte over tid, for hver individuel pote. Hver stilling er repræsenteret ved en stigning i pote område (i fasen for bremsning) og et fald i pote område (i fasen for fremdriftssystem). Dette er efterfulgt af swing fase hvor intet signal er konstateret. Swing og holdning sammen danner en skridtlængde. Ud over gangart dynamics parametre udvindes kropsholdning parametre også fra de optagne videoer. Eksemplarisk parametre og deres definition er angivet i tabel 1 og omfatter holdning bredde (SW; kombineret afstanden fra de fore eller hind poter til snude-hale akse), skridtlængde længde (SL; gennemsnitlige afstand mellem to fremskridt af den samme pote) eller paw placering vinkel (vinklen på pote til snude-hale akse). Kropsholdning og gangart dynamics dataene tillade drage konklusioner på animalsk balance (af kropsholdning parametre og deres variation over flere trin) og koordination (efter gangart dynamics parametre). Andre parametre, såsom ataksi koefficient (SL variabiliteten beregnet af [(max. SL−min. SL) / mener SL]), hind lemmer delt holdning tid (tid, der begge bagben lemmer er i kontakt med bæltet), eller pote træk (samlede areal i paw på bælte fra fuld holdning til pote lift-off) kan også udvindes, og er blevet rapporteret til at være ændret i forskellige neurodegenerative di sease modeller5,6,7,8 (Se tabel 1).

Parameter Enhed Definition
swing time MS varighed af paw ikke er i kontakt med bælte
holdning tid MS varighed af paw er i kontakt med bælte
% bremse % holdning tid procentdel af holdning tid poterne er i fasen for bremse
% fremdrive % holdning tid procentdel af holdning tid poterne er i fasen for fremdriftssystem
holdning bredde cm kombinerede afstand fra forenden eller hind poter snude-hale akse
skridtlængde cm gennemsnitlige afstand mellem to fremskridt af den samme pote
skridtlængde frekvens fremskridt/s antallet af komplet fremskridt pr. sekund
Paw placering vinkel DEG vinkel af paw referenceaksen snude-halen af dyret
ataksi koefficient a.u. SL variabilitet beregnet ved [(max SL-min SL)/gennemsnit SL]
% fælles holdning % af holdning Hind lemmer delt holdning tid; gang begge bagben lemmer er i kontakt med selen på samme tid
Paw træk mm2 samlede areal i paw på bælte fra fuld holdning til pote lift-off
lemmer lastning cm2 MAX dA/dT; maksimal hastighed på ændring af pote område i fasen for at bryde
trin vinkel variabilitet DEG standardafvigelsen af vinklen mellem hind poter som en funktion af SL og SW

Tabel 1. Definition af centrale gangart parametre, der kan testes ved ventrale flyet billeddannelse.

Vurdering af motor funktionsmåden for gnavere modeller for neurodegenerative sygdomme kan være udfordrende afhængigt af sværhedsgraden af Fænotypen af en bestemt model i en given alder. Flere sygdomme, de mest fremtrædende PD, Vis stærk motor adfærd (bevægelse) underskud, både hos patienter og i dyremodeller. En af de fire vigtigste symptomer i PD er bradykinesi, som udvikler sig med aldring og manifesterer sig i alvorlige gangart funktionshæmninger allerede i tidlige stadier af PD9. Undersøgelser af akut PD model, rotter behandlet med 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), har allerede brugt VPI gangart analyse10,11,12. Dog behandler givet den akutte karakter af denne model, disse undersøgelser ikke de aldersrelaterede progression af motor underskud. Flere nyere undersøgelser har gennemført gangart analyse i alderen mus med neurodegenerative ændringer, for eksempel13,14,15, understreger relevansen af forståelse sygdomsprogression med fremrykkende alder .

Ud over motor underskud, Dyremodeller neurodegenerative sygdomme ofte har vanskeligheder med fokus på undersøgelse opgaver og Vis fremtrædende kognitive funktionsnedsættelser, især med fremrykkende alder. Sådan en fænotype kan påvirke resultatet af test, motor adfærd. Nemlig, en af de mest anvendte test til at undersøge motor underskud, rotarod test16, afhængig af kognition, opmærksomhed og stress17,18. Mens vilje til at gå på en motoriseret løbebånd afhænger også af disse faktorer, den registrerede udlæsning kører, som er en mere standardiseret funktion og langt mindre påvirket af ændrede kognition. Effekter af stress og opmærksomhed kan ses i specifikke parametre, som swing/holdning tid for stress, og SL for opmærksomhed19,20, men ikke i samlet kører evne.

Den kinematiske gangart analyse tilgang yderligere tilbyder fordelen at have muligheder for at justere udfordring for gnavere modeller. Løbebånd med justerbar vinkel og hastighed giver mulighed for gå hastigheder fra 0,1 - 99,9 cm/s, således at gnavere med svær omvandrende funktionsnedsættelser kan muligvis stadig køre en langsom hastighed (~ 10 cm/s). Non-nedsat dyr kan måles på hurtigere kører hastigheder (30 - 40 cm/s). Observation af eller ej de testede dyr er i stand til at køre på en bestemt hastighed giver et resultat af sig selv. Yderligere, gnaver kan desuden blive udfordret til at køre op en skråning eller ned en tilbagegang, ved at vippe løbebånd til en ønskede vinkel ved hjælp af en goniometer, eller ved at vedhæfte en vægtet slæde i mus eller rotte hind lemmer.

Ud over talrige undersøgelser af enkelt proteiner, der er muteret i patienter, er der en nylig øget bevidsthed om sammenhængen mellem defekte endocytose proces og neurodegeneration13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Mus modeller med reducerede niveauer af endophilin-A (herefter endophilin), en central aktør i begge clathrin-medieret endocytose13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 og clathrin-uafhængig endocytose34, blev fundet for at vise neurodegeneration og alder afhængige funktionsnedsættelse i bevægeapparatet aktivitet13,21. Tre gener indkode familie af endophilin proteiner: endophilin 1, endophilin 2, og endophilin 3. Navnlig fænotype som følge af nedbrydningen af proteiner, endophilin varierer meget afhængigt af antallet af mangler endophilin gener13,21. Mens tredobbelt knock-out (KO) af alle endophilin gener er dødbringende bare nogle få timer efter fødslen, og mus uden begge endophilin 1 og 2 ikke trives og dø inden 3 uger efter fødslen, viser enkelt KO for nogen af de tre endophilins ingen åbenlyse fænotype til testet betingelser21. Andre endophilin mutant genotyper Vis nedsat levetid og udvikle motoriske funktionsnedsættelser med stigende alder13. For eksempel, endophilin 1KO-2HT-3KO mus display omvandrende ombygninger og motor koordineringsproblemer (som testet af kinematiske gangart analyse og rotarod) allerede på 3 måneder, mens deres littermates, viser endophilin 1KO-2WT-3KO dyr, en betydelig reduktion i motor koordinering kun på 15 måneders alder13. Den store variation af fænotyper i disse modeller er det nødvendigt at identificere og anvende en test, der kan integrere en række udfordringer svarer til dyrets motor og kognition evner, samt alder. Her, detalje vi de eksperimentelle procedurer, at kapitalisere på den kinematiske ganganalyse at vurdere indsættende og progression af motoriske funktionsnedsættelser i en musemodel, der viser neurodegenerative ændringer (dvs. endophilin mutanter). Dette omfatter måling gangart parametre i forskellige aldre og forskellige alvorsgrader af locomotion funktionshæmninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøg rapporteret her er foretaget efter EU 's retningslinjer for dyrevelfærd (2010/63/EU) med godkendelse af Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), registreringsnummer 14 / 1701.

1. undersøgelsen Design

  1. Da dyreadfærd arbejde kræver omhyggelig planlægning, skal du overveje følgende parametre mens designe eksperimentet.
    1. Antallet af dyr for hver gruppe.
      1. Bruge en statistisk software (fx PASS, EDA eller bringe) til at beregne den krævede Gruppestørrelse.
        Bemærk: Gruppestørrelse afhænger variation mellem dyr og sværhedsgraden af Fænotypen. For den kinematiske ganganalyse er antallet af mus normalt 10-20 pr. gruppe.
    2. Sex i de eksperimentelle dyr.
      1. Overveje virkningen af østrogen niveauer af forsøget, afhængigt af den animalske stamme.
        Bemærk: Mange adfærd undersøgelser fokuserer på mænd for at undgå påvirkning af østrogen niveauer eksperimentet. Disse påvirkninger er mere eller mindre stærkt afhængigt af animalsk baggrund stammen.
      2. Hvis begge køn vil blive brugt, teste for sex indflydelse og evaluere de to køn uafhængigt, når det er nødvendigt.
    3. Alder af de eksperimentelle dyr.
      1. Bruge voksne dyr (2 måneder, eller ældre), hvis kun engangs punkt er nødvendigt.
      2. Vælg flere tidspunkter, når ændringen i motor adfærd med fremrykkende alder er skal undersøges. Det tidligst mulige tidspunkt er 1 måned, efter at musene er vænnet fra deres mødre. Forsøgsdyr i regelmæssige intervaller, fx hver 1, 2 eller 3 måneder.
  2. Ansøge om tilladelse fra de lokale myndigheder til at udføre dyreadfærd testing.
  3. Lave planer for fremskaffelse af forsøgsdyrene.
    1. Lave en avl plan eller kontakt en animalsk distributør i tide, så nok forsøgsdyr er tilgængelige på den dag, hvor forsøgene begynde.
    2. Tillade, at dyr skal habituate til én uge, hvis de holdes i en nye værelse/indstilling under forsøgene.

2. videooptagelse

Bemærk: For at illustrere brugen af kinematiske gangart analyse, her et kommercielt tilgængelige billedbehandlingssystem med ledsagende billedbehandling og analyse software (Se Tabel af materialer) er brugt.

  1. Starte computeren og imager software.
  2. Bestemme sundhedstilstand og velbefindende for hvert dyr ved at iagttage det i sit hjem bur, og vejer det på en balance.
  3. Når det er nødvendigt, forsigtigt anvende rød finger maling til dyrets poter med en børste. Gøre det muligt malingen til at tørre i ~ 5 min. i en ekstra ren bur.
    Bemærk: Undgå at male dyrets maven som malingen er anvendt til at forbedre kontrasten mellem ben og krop. Det er nyttigt at have sorte finger maling handy for korrektioner. Dette trin er nødvendige for dyr med brun pels, eller i tilfælde af poter har blevet tatoveret for identifikation. Hvis valgt at male poter af et dyr, skal alle dyr i den samme gruppe og kontrolgruppen skal males så godt.
  4. Indstille hastigheden på løbebåndet på den øverste højre panel i apparatet; Hvis mere end én hastighed vil blive anvendt, begynde med den langsomste hastighed først.
  5. Placere dyret i testkammeret (undgå fastspænding hale eller ben, når du lukker salen). Dække kammer med en mørk klud og give mulighed for hvert dyr at justere for 1-2 min.
  6. Tænde lys i testkammeret ved at dreje den løbebånd roterende lyskontakt til "on" position. Drej løbebånd drejekontakt at "Videresend" for at starte løbebånd, så klik på "record"-knappen i imager software.
    Bemærk: Mens løbebånd kører, det er vigtigt at observere dyr ydeevne omhyggeligt og konstant: stoppe løbebåndet straks, hvis dyret ikke kan holde med løbebånd hastighed, eller viser sekundære symptomer ikke relateret til bevægelse (f.eks. epileptiske anfald). Forsøgsbetingelser skal muligvis justeres.
  7. Når dyret kører stabilt (ingen hurtig undslipper til siderne, fronten eller bagsiden), registrere for mindst 5 s før stoppe løbebåndet. Stoppe optagelsen ved at klikke på "stop" på imager software, og drej løbebånd drejekontakt tilbage til positionen "off".
    Bemærk: For at undgå ustabile drift af dyr kan det være nyttigt at lade dem køre i flere sekunder, eller tillade dem at køre i anden retningen (ved at dreje løbebånd drejekontakt at "vende" i stedet for "forward").
  8. Klik på knappen "behandling" i imager software til at åbne en menu, hvor starten- og slutpunktet for den video sektion (skal bruges til analyse) kan indstilles. For at gøre dette, skal du bruge skyderen i bunden af skærmen til at navigere gennem videoen.
  9. Klik for at markere den aktuelle tidspunkt som start- eller slutpunkt, "fra stel #" og "til," henholdsvis. Kontroller afsnittet indeholder mindst 7 trin/pote (14 trin i alt) af dyret kører stabilt med en konstant hastighed.
  10. Angiv identifikation af dyr, fødselsdato, vægt og køn. Gemme data på en ønskede placering på computeren eller serveren. Klik på "kamera" at vende tilbage til optagelse interface.
  11. Hvis flere løbehastigheder skal registreres, skal du gentage trin 2,6-2,10 med de ønskede løbehastigheder. Før du optager den næste video, sikre at den røde maling er stadig til stede på pote, ellers Gentag trin 2.3.
  12. Efter optagelse, frigive dyr til sit hjem bur. Efter fjernelse af et dyr, ren løbebånd bælte grundigt med sæbevand efterfulgt af desinfektionsmiddel til at forberede den næste eksperimentelle dyr.

3. videobehandling

  1. Start analyse software og klik på "Vælg studere mappe" til at vælge mappen med de optagne videoer.
  2. Vælg en video, eller flere videoer, der kan behandles efter hinanden, og klik på "go".
  3. Brug funktionen "gentegning" til at vælge det område, hvor musen er ved at løbe; Dette afsnit bør kun indeholde mus og hvid baggrund.
  4. Hvis funktionen "reverse" løbebånd blev tidligere brugt, skal du vælge "Kontroller, om fagets næse er til højre >>>" hen til genspejle videoen, da softwaren er designet til kun analysere dyr kører til venstre. Klik på "Accepter" for at fortsætte.
  5. Brug funktionen "Opdater" at se standard maske og pote print, som softwaren registrerer.
    Bemærk: Den oprindelige video vises til venstre, og en sort og hvidt billede af de foreslåede befamle udskrifter er til højre.
  6. Indtast værdier i boksene "længde" og "bredde" til at ændre den maske, der udelukker det røde område omkring Snuden af dyr til analyse. som farven ligner poter, kunne ikke afmaske området resultere i softwaren ved et uheld klassificering området snude som en pote.
  7. Justere skyderne "filter støj" og "Filtrer pels og mørke pletter" til at optimere den sorte og hvide pote print. Sæt skyderen "filter støj" ~ 800-950 for sorte dyr og ~ 700-800 for brune eller hvide dyr, afhængigt af den nøjagtige pels farve af dyret. Vælg "ok", når indstillingerne er tilfredsstillende.
    Bemærk: "Filtrere pels og mørke pletter" skyderen afhænger af hvordan "røde" paw er. For malede poter, værdien er normalt omkring 100-120, og for ikke-malet poter den bedste værdi er omkring 50-100. Disse indstillinger afhænger af de farve nuancer af pels og poter, og skal optimeres for hvert dyr. Sort og hvid pote print bør have klare repræsentationer af poterne med som lille baggrundsstøj som muligt.
  8. Vælg en eller flere videoer, der passerede den første justering (mærket med "@@" før den video navn), og vælg funktionen "gå" til at starte analysen af disse videoer.
    Bemærk: Analysen tager 2-5 min pr. video. Det er muligt at køre analyse af flere videoer natten over, da dette trin kræver intet input fra eksperimentatoren.
  9. Vælg en analyseret video (mærket med "@@@") og klik på "go". Bemærk, at området pote (i cm2) kontakt med bælte over tid (gangart dynamics) for hver separat pote kan nu ses. Hvis du vil sammenligne den originale video og den beregnede pote print for et markeret område, skal du bruge funktionen "Afspil video".
  10. Brug de følgende (tre) værktøjer til at rette mindre fejl begået af softwaren.
    1. Brug indstillingen "rigtige" slette et forkert signal, f.eks., når softwaren registrerer et signal, selvom den tilsvarende pote ikke er i kontakt med bæltet. Klik én gang for at zoome ind på det relevante område, og markere objektet for at fjerne med det andet klik venstre kant og den højre kant med et tredje klik.
    2. Brug indstillingen "connect" til at kombinere to signaler, f.eks., når intet signal er registreret for et par frames selvom pote er i kontakt med bæltet. Klik én gang for at zoome ind på det relevante område og dobbeltklikke i midten af de to objekter til at kombinere.
    3. Brug indstillingen "Slet" til at fjerne tid point fra analysen helt. Brug denne indstilling, kun hvis fejlen ikke kan løses med den "rigtige" eller "connect" funktion, f.eks., når et signal fra venstre forelimb pote registreres ved et uheld for venstre bagben lemmer pote. Klik én gang for at zoome ind på det relevante område, og markere området for at fjerne med det andet klik venstre kant og den højre kant med et tredje klik.
      Bemærk: Værktøjerne kan kun bruges til at rette mindre fejl; systematiske fejl (f.eks., hvis signalet fra én pote var ekstremt svag) ikke kan rettes: videoen bør udelukkes fra analyse og registrering af det pågældende dyr gentages, når det er muligt. Bemærk at indstillingen "Afspil video" er ikke længere tilgængelig efter den "rigtige", "connect" eller "Slet" valgmulighed er blevet brugt, og klikke på knappen "Fortryd" vil nulstille alle 3 redigeringsværktøjer.
  11. Vælg "næste limb" til at fortsætte gennem de 4 lemmer; Når der klikkes på "næste lemmer" efter sidste pote, softwaren fuldender analyse og viser resultaterne for dette dyr på 4 skærme.

4. ganganalyse

  1. Når alle videoer fra et eksperiment er analyseret, vælge alle videoer og klik på "at reorganisere resultater" eksportere resultaterne (en liste over parametre i regnearksfiler).
  2. Åbn filen med den slutter "reorganized_stride_info" og tilføje oplysninger, der ikke er inkluderet i dette regneark: gruppere oplysninger (f.eks. genotype, behandling), alder og målinger af animalske længde og bredde, der er gemt i en anden regnearksfilen med den slutter "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info."
  3. Normalisere gangart parametre til animalsk bredde eller længde, om nødvendigt, fx SL til animalsk længde og SW til animalsk bredde.
  4. Sortere resultaterne efter gruppe, alder og hastighed: analysere alle disse betingelser uafhængigt.
    Bemærk: Forskellige aldre eller løbehastigheder kan ikke kombineres i en samme gruppe.
  5. Beregne gennemsnittet (middelværdien) værdier, standardafvigelse og standard fejl af middelværdien for hver parameter for alle forsøgsbetingelser.
  6. Statistisk analyse efter det eksperimentelle design, fx bruge en 2-sidede t-testen til at sammenligne mutant/behandlet dyr til en wild-type (WT) / kontrol, eller ANOVA at sammenligne flere uafhængige grupper.
  7. Kig på alle målte parametre: det er nyttigt at afbilde hver parameter for at bedre visualisere resultaterne. Hvis der er statistiske forskelle i en given parameter, check, hvis andre afhængige parametre ændre tilsvarende.
    Bemærk: For eksempel, hvis SL faldt betydeligt i en bestemt testgruppe, dette vil også medføre en højere skridtlængde frekvens (da den hastighed er det samme) og kan resultere i en øget SW (for at opretholde kropsholdning stabilitet).
  8. Vælg parametre, der er mest relevante for en model, og/eller kan sammenlignes med observationer i den menneskelige sygdom. For en præsentation, oprette repræsentative videoer for hver gruppe og supplere dem ved grafer viser udlæsning af de relevante parametre, da subtile gangart ændringer er ofte ikke klart af videoerne.

5. fejlfinding

Bemærk: Nogle dyr, især musemodeller med en angst fænotype, kan have svært ved at udføre endnu en simpel opgave som at løbe på et løbebånd. Følgende er skridt, der kan træffes til lavere angst niveauer og tilskynde kører.

  1. Tilvænning og positive håndhævelse.
    1. På 2-3 dage før den første test, placere musen i testkammeret, dække det med en mørk klud og lad lyset slukket. Lad musen justere til det nye miljø for ~ 5 min. Tilføj chow eller chokolade/møtrik smør (fx Nutella) til testkammeret, så en positiv association kan dannes.
  2. Negative håndhævelse af luft pust/bag grænsen.
    1. Mus kan lide ikke luft pust eller en bevægelse bag dem, og vil køre væk fra forstyrrelsen. For at motivere kører, bruge milde luft pust eller rytmisk bevægelse af fleksible bar, der danner den bageste grænse af testkammeret, tilskynde musen til at køre mod den forreste del af testkammeret.
  3. Langsom start.
    1. Når du tester hurtigt kører hastigheder, starter løbebånd med en lavere hastighed og derefter øge langsomt løbebånd hastighed mod den ønskede test tilstand.
  4. Minimere fri bevægelighed.
    1. Test kammer længde er begrænset af to justerbare stænger i for- og bagside. Hvis en test dyr holder med den hastighed, men ikke kører støt begrænse kammerets længde for at resultere i mere stabil drift.
  5. Hvis de ovennævnte målinger ikke er vellykket, optage kører på den næste dag. Hvis dyret stadig nægter at køre efter afprøvning på tre dage, optage dette som konstateringen, og udelukke dyret fra tillægsundersøgelse.
    Bemærk: Resultaterne af gangart analyse afhænger af god kvalitet video optagelse. Der er ingen grund til at udelukke videoer under analysen, hvis videoerne er blevet registreret omhyggeligt. Hvis den video kvalitet er utilstrækkelig, bliver det indlysende under trin 3.6 Når parametre til oprettelse af digital pote print angives. Hvis nogen anden del af kroppen undtagen poter og snude vises røde (f.eks. på grund af den manglende pels omkring kønsdelene eller finger maling sprinklings på maven), kvaliteten falder markant. Justeringer i trin 3.6 tillade korrigere kun små problemer, og hvis dette ikke kan bringe videoen til en acceptabel signal/støjforhold, videoen skal udelukkes fra analysen, og optagelse skal gentages. Således, det anbefales at analysere videoer, snart efter optagelser er udført.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For at illustrere brugen af kinematiske gangart analyse, vi har udført ganganalyse på WT C57BL/6J mus med fremrykkende alder, samt flere endophilin mutant linjer, ved hjælp af kommercielt tilgængelige instrumentering og software (der henvises til tabel af Materialer). I denne opsætning registrerer et højhastighedskamera under en gennemsigtig løbebånd kører musen (figur 1A). Softwaren genkender derefter kontrasten mellem de røde farvet poter og hvid eller sort pels. Da vores forsøgsdyr havde mørke brune pels farve, har vi malet poter af alle fag med rød finger maling. Vi har testet forsøgsdyr på forskellige løbehastigheder: walking (10 cm/s), kører (20 cm/s) og hurtigt kører (30 cm/s). Kontaktområdet og poterne var på løbebåndet og i luften blev målt. Fra denne information, de parametre, der sammenfatte gangart rytme (fx swing/holdning tid, bremse/fremdrift) eller arbejdsstillinger (fx pote vinkel, SW) blev beregnet (figur 1B).

Vi udførte gangart analyse som en del af et batteri af tests for flere motor adfærd. Vi vurderede gribestyrke (GS), hind lemmer knugede (HLC), gangart, og fremskyndet rotarod ydeevne (ARR). Mens motor opførsel er ikke så berørt af tidligere erfaringer og eksperimentelle undersøgelser som, for eksempel, kognition, det er stadig vigtigt, at hvert dyr underkastes den samme batteri af tests i samme rækkefølge og på samme alder. Rækkefølgen bør gå fra lav til høj sværhedsgrad for dyret at minimere påvirkninger fra tidligere forsøg på den aktuelle test.

Vi har valgt endophilin mutanter for denne undersøgelse siden, afhængigt af hvor mange af tre endophilin alleler er mangler, den resulterende fænotype varierer fra ingen fænotype i de enkelt KOs til en mild neurodegenerative fænotype i unge endophilin 1KO-2HT-3KO mus, der udvikler sig med aldring. Derfor præsentere disse dyrs linjer en passende model for at studere subtile ændringer, der udvikler kun som dyr alder. Eftersom de fleste endophilin mutanter Vis en reduceret levetid, har vi undersøgt endophilin mutanter motor adfærd i løbet af 18 måneder (18-måneders tidspunkt var valgt siden selv mus i linjen endophilin 1KO-2HT-3KO, der viser den stærkeste fænotype, har ikke lammelse). Gangart analyse blev udført ved otte tiden point over en periode på 18 måneder (figur 1 c). På 18 måneder, blev dyrene aflivet, og bevaret for biokemiske og/eller histologiske analyse.

Musen koloni vedligeholdelse:

Heterozygous og homozygot mus for endophilin 1, 2 og 3 alleler var oprindeligt rapporteret i Milosevic mfl. 21 C57BL/6J mus blev brugt ud over littermate mus som kontrol i hele. Mus har været opstaldet i åbne bure med ad libitum adgang til mad og vand i grupper af maksimalt 5 dyr, på en 12-h lys/mørke cyklus. Kun mandlige mus blev anvendt i denne undersøgelse for at udelukke virkningerne af cyklus-afhængige variationer i hunner.

Genotypebestemmelse af Endophilin A1, A2 og A3 musemodeller:

Genotypebestemmelse af endophilin mutant mus blev udført ved polymerase kæde reaktion (PCR) forstærkning ved hjælp af genomisk DNA ekstraheret fra hale eller øre slag. PCR'er for tre endophilin-A gener blev udført med respektive primere: endophilin-A1: videresende primer 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' og vende primere 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' til WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' til KO; endophilin-A2: videresende primere 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' til WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' til KO og omvendt primere 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' til WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' til KO; endophilin-A3: videresende primer 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' og vende primere 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' til WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATCC-3' til KO. De resulterende PCR produkter blev kørt på en 1% agarosegel, giver karakteristisk band størrelser for WT og KO alleler: endophilin-A1 WT ~ 384 bps, KO ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1,280 bps, KO ~ 1.000 bps; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bps. PCR produkter med både WT og KO bands angiver en heterozygous (HT) dyr.

Resultater:

For at karakterisere gangart og kropsholdning i WT mus med fremskredne alder, har vi udført kinematiske ganganalyse hos disse dyr (figur 2; Movie 1). Mens nogle parametre, for eksempel SW (gennemsnitlig afstand mellem fore eller hind lemmer normaliseret til animalsk bredde; Se også tabel 1), forbliver uændrede i WT dyr med fremskredne alder, andre parametre ændrer gradvis (figur 2A- C). For eksempel hind lemmer dobbelt støtte (tid i forhold til holdning varighed, der begge bagben lemmer er i kontakt med jorden på samme tid) stiger fra 38% til 55% fra 1 måned til 18 måneder (figur 2B). Denne parameter er ofte forbundet med kropsholdning ustabilitet35. Derudover øges lemmer lastning (maksimal satsen for ændring af området pote breaking fase) fra 38 cm2/s til 59 cm2/s fra 1 måned til 18 måneder (figur 2 c). Hurtig opbremsning kan fortolkes som en indikator for nedsat muskelstyrke. Den samlede kører evne påvirkes ikke i WT dyr (94% er i stand til at køre på 30 cm/s på 18 måneder, figur 3A). Ud over kendetegner gangart og kropsholdning parametre, at forblive upåvirket, eller ændre gradvist med stigende alder i WT mus, har vi dokumenteret, at den kinematiske gangart analyse ved hjælp af VPI er en velegnet metode til at studere de aldersrelaterede mild ændringer i gangart og kropsholdning.

Mens den samlede kører evnen ikke er berørt i WT dyr, viser flere endophilin mutant linjer ændrede evne til at gå eller løbe på den motoriserede løbebånd (figur 3A), som rapporteret i Murdoch et al. 13 på den mindre datasæt. Navnlig, mens på 1 måned gammel alle endophilin 1KO-2HT-3KO mus er alle i stand til at køre på 30 cm/s, på 18 måneder 81% af de samme dyr er ikke købedygtig opstille (figur 3A, Bemærk at større årgange blev analyseret end de rapporterede tidligere i 13). Interessant, de endophilin mutanter, der mangler færre endophilin alleler (dvs. endophilin 1KO-2HT-3WT) er også berørt, men til en lavere grad (figur 3A).

Selv om endophilin 1KO-2HT-3KO mutanter vise alvorlige motoriske funktionsnedsættelser med fremrykkende alder13, flere gangart parametre er ikke ændret i forhold til kontrolelementet WT også på 18 måneder. For eksempel, forbliver trin vinkel variation (trin vinkel standardafvigelse) uændret (figur 3B). Navnlig, mange andre parametre, for eksempel fremdrive tid (procentdel af holdning gang poterne er i fremdrift fase), er ikke anderledes på 1 måned gammel, men gradvis blive værre med aldring (figur 3 c; Se også Movie 2). Dette illustrerer, at både aldersbetinget parametre samt neurodegenerative mutant-specifikke variabler kan undersøges med en kinematisk gangart analyse tilgang.

Figure 1
Figur 1. Ventrale flyet imaging setup og princippet. (A) foto og skematiske tegning af en gangart analyse setup. (B) analyse software princippet: fra registrerede undersiden af en mus kører på en gennemsigtig løbebånd, softwaren beregner den digitale befamle udskrifter. Deres dynamik under drift er målt som paw område størrelse over tid, og dette anvendes som grundlag for at beregne gangart rytme og kropsholdning parametre. (C) tidsforløb af gangart analyse eksperiment udført på endophilin mutanter. Bevægelse og gangart blev vurderet på 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 og 18 måneder. Billederne viser endophilin 1KO-2HT-3KO musen på 2, 12 og 18 måneder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Gangart analyse i wild-type mus med fremrykkende alder. Bevægelse og gangart i WT (C57BL/6J) mus blev vurderet på 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 og 18 måneder. (A) holdningen bredde normaliseret til animalsk bredde af WT dyr ikke ændres med alderen. (B) hind lemmer dobbelt støtte stiger med alderen i WT dyr. Grafen viser procentdelen af holdning gang begge bagben lemmer er på jorden på samme tid. En stigning i denne parameter afspejler gangart ustabilitet. (C) lemmer indlæsning (maksimal satsen for ændring af området pote i fasen for breaking) stiger med alderen i WT dyr. Hurtigere deceleration kan være en indikator for nedsat muskelstyrke. Alle grafer repræsenterer middelværdien ± SEM; p værdier blev beregnet ud fra 2-sidede t-test versus den 1 - måneder gammel WT, og er repræsenteret som * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Gangart analyse i endophilin mutanter med fremrykkende alder. (A) den hastighed af endophilin mutanter på 1, 12 og 18 måneder, regnet fra en udvidet datasæt i forhold til Murdoch et al. 13 bar farver, afspejle procentdelen af dyrene kunne køre på 30 (mørkeblå), 20 (blå) eller 10 cm/s (lyseblå) på den motoriserede løbebånd, eller nægte kører på opsætningen (grå). Mens alle testede dyr kan køre på 30 m/s på 1 måned, udvikle endophilin mutanter, kører underskud, som de bliver ældre. (B-C) Trinnet vinkel variabilitet og fremdrive tid i WT (sort), endophilin 1KO-2WT-3WT (turkis), endophilin 1KO-2HT-3WT (mørkeblå) og endophilin 1KO-2HT-3KO (brun) mus. Trin vinkel variation viser ingen forskel i aging WT dyr eller mellem WT og endophilin mutanter. Propel tid (som procentdelen af holdning) er ikke væsentligt ændret mellem endophilin mutanter og WT på 1 måned, men aftager i endophilin mutanter mus alder. Alle grafer repræsenterer middelværdien ± SEM; p værdier blev beregnet ud fra 2-sidede t-test versus alder-matchede WT, og er repræsenteret som * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Movie 1. Gangart analyse i wild-type (C57BL/6J) mus på 3 (venstre) og 18 måneder (til højre). Den originale video (øverst) er oversat til en "digital pote print" video (nederst). Den video hastighed er blevet bremset ned 5 gange, således at oplysninger kan være bedre værdsat. For 18-måneders tidspunkt, Bemærk tøven i højre bagben pote (rød i digital pote print) på ~ 2 s, og af den højre front pote (blå i den digitale pote print) på ~ 4 s. Den video hastighed er blevet bremset med en faktor på 10. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Movie 2
Movie 2. Gangart analyse i endophilin 1KO-2WT-3WT (kontrol, venstre) versus endophilin 1KO-2HT-3KO (højre) mus på 18 måneder. Den video hastighed er blevet bremset med en faktor på 5 så oplysninger kan blive bedre værdsat. Endophilin 1KO-2HT-3KO musen viser gangart ændringer, der kan ses som mindst stabil drift af dyret. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Studerer de motoriske koordination er en nyttig tilgang i karakterisering af modeller for neurodegenerative sygdomme, især for sygdomme som PD i som motor koordinering er hårdt ramt. Med hjælp fra en kinematisk gangart analyse funktionel analyse, kan vi identificere subtile ændringer i gangart af dyr i starten af locomotion problemer eller i modeller med svag neurodegeneration og dermed relativt beskedne fænotype. Givet den brede vifte af fænotyper i forskellige modeller for neurodegenerative sygdomme, der omfatter små gangart misdannelser og alvorlig bevægelighed svækkelser, er denne metode velegnet til at vurdere gangart parametre baseret på dyrets alder og evne til at flytte. Alvorligt svækket dyr kan registreres gå på en lav hastighed på et fly løbebånd, mens mindre værdiforringet modeller kan registreres kører op ad bakke eller ned ad bakke på en høj hastighed. Dette kan afsløre gangart forskelle mellem neurodegenerative model og dens littermate kontrol uden overexerting dyrene.

Med denne protokol vise vi adequateness af VPI metode til at overvåge udviklingen af motoriske funktionsnedsættelser med aldring hos mus. Test WT mus på flere tidspunkter har som deres alder fremskridt tilladt os at identificere aldersbetinget gangart abnormiteter og karakterisere, hvordan de fremskridt med aldring. Derudover når du håndterer musemodeller for neurodegeneration, et problem, der ofte præsenterer skyldes at symptomerne ikke er relateret til motor adfærd (fx angst, apati, vanskeligheder med at lære), dyret villighed til at udføre selv en simpel motor opgave såsom løb, reduceres. Vi foreslår her, metode ændringer og motiverende værktøjer til at fremme kører på belyste motoriseret løbebånd, som kan være nyttige med succes anvende kinematiske ganganalyse på aging mus linjer med neurodegenerative ændringer. Derudover bruger vi et simpelt trick af finger maling til dyrets poter og viser, at det kan bidrage væsentligt til at forbedre registrerede data. At opnå god video optagelser er den mest kritiske trin af ganganalyse: analysen succes afhænger, som hver automatisk eller semi-automatiseret analyse af billeder eller videoer, for kvaliteten af de rå data. Lav kvalitet videoer ikke kan forbedres på senere trin i analysen, og normalt skal udelukkes fra analyse-processen.

Mens de systematisk studerer gangart og kropsholdning af både WT og flere endophilin mutant linjer over et tidsrum på 18 måneder, har vi bemærket, at selv WT mus og mus uden indlysende bevægelse/løb problemer (dvs. endophilin 1KO-WT-WT), Vis ændringer i flere gangart og kropsholdning parametre med fremrykkende alder i en progressiv måde (figur 2 og figur 3A). Interessant nok, har vi også bemærket, at mens abnormiteter i flere gangart og kropsholdning parametre observeret i aging endophilin mutanter udvikler sig i samme retning og hældning som WT/kontroldyr, andre ikke gør (figur 3). Endelig er det vigtigt at bemærke, at selv hvis alderen WT mus og unge endophilin mutanter ikke viser nogen indlysende locomotion, gangart og kropsholdning mangler når observeret af øjet, ændringer i selektiv gangart og kropsholdning parametre kan påvises med denne tilgang.

Test musen motor adfærd er en af de mest omfattende måder til at illustrere, at en musemodel manifesterer vigtige aspekter af et menneskets vilkår. Som et resultat, er blevet udviklet en række test for at vurdere forskellige aspekter af motor adfærd. Disse tests omfatter open field test (generelle bevægeapparatet aktivitet), rotarod (motor koordinering, ataksi), greb styrke (muskelstyrke), kører hjul (aktivitet), hængende wire test (udholdenhed), stigen beam walking opgave (fine motor koordinering, sensorimotor færdighed), gangart analyse (bevægelse, lemmer koordinering), og andre (sammenfattet i Wahlstein36). De forskellige test har specifikke fordele og ulemper og deres udlæsning er normalt begrænset til motor opførsel at de var designet til adresse aspekt (eller aspekter). Derfor er det blevet almindelig praksis at udføre et batteri af motor adfærd prøver at dække de vigtigste aspekter af dette område.

Ganganalyse ofte ikke er inkluderet i disse batterier, delvis på grund af en betænkning af Guillot på al. 37, der findes, gangart analyse ikke registrerer motor underskud i dyremodeller PD og ALS, og dels på grund af den besværlige metode og begrænset output. Dog Guillot mfl. betænkningen er blevet udfordret af forskning, der omhandler flere begrænsninger i undersøgelsen design38. Nytten af denne metode i analysen af gangart i musemodeller med neurodegeneration er bevist ved en række af de seneste publikationer10,11,12,39,40 ,41,42,43, herunder også vores arbejde13.

VPI optagelser kommer med flere fordele i forhold til den konventionelle metode til maleri poter med blæk og lade musen køre på et hvidt stykke papir44. Det mest oplagte er, at med motoriseret løbebånd, den hastighed af dyret er kontrolleret, som har en stærk indflydelse på flere gangart parametre1. Derudover blive nogle gangart abnormiteter påvises kun Hvornår dyret kører på en krævende høj hastighed og/eller en hældning/tilbagegang, som ikke ville kunne ses i frivillige kører. Desuden, den omfattende analyse af hånd er erstattet af en semi-automatiske, høj overførselshastighed analyse. Derfor, kan antallet, der er undersøgt i hver gruppe øges, hvilket igen nedsætter effekten skyldes den variation, der er uundgåelige i levende dyr. Sammenfattende anbefaler vi, at den ændrede version af VPI gangart analyse er inkluderet i standard motor test batterier til at supplere analysen af motor svækkelser i gnavere modeller af neurodegeneration og/eller ældning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ikke konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Vi takker animalske pedeller på den ENI Dyrefacilitet hjælp til avl, og Dr. Nuno Raimundo for nyttige kommentarer til manuskriptet. I.M. understøttes af tilskud fra tyske Research Foundation (DFG) gennem forskningssamarbejde center SFB-889 (projekt A8) og SFB-1190 (projekt P02) og Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. er støttet af stipendium fra Göttingen Graduate School for neurovidenskab, Biofysik og molekylær biovidenskab (GGNB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clarke, K. A., Still, lJ. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
  2. Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol's effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
  3. Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
  4. Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
  5. Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
  6. Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
  7. Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson's Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
  8. Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
  9. Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A. Jr, Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson's disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
  10. Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson's disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
  11. Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
  12. Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson's disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
  13. Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
  14. Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
  15. Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice - implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
  16. Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
  17. Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
  18. Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Behavior. (1-2), 79-84 (2002).
  19. Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
  20. Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson's disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
  21. Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
  22. Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
  23. Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
  24. Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
  25. Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
  26. Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
  27. Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
  28. Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
  29. Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
  30. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
  31. Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
  32. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
  33. Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  34. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
  35. Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), Article in Japanese 1193-1202 (2010).
  36. Wahlsten, D. Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , Academic Press. (2010).
  37. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson's Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
  38. Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
  39. Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
  40. Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
  41. Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
  42. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
  43. Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
  44. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8: Unit 8.12 (2001).
  45. Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 136 aldring gangart analyse locomotion neurodegeneration endocytose endophilin motor adfærd motor test batterier ventrale flyet imaging
Gangart analyse af aldersbetinget Motor svækkelser i mus med Neurodegeneration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait… More

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (136), e57752, doi:10.3791/57752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter