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Developmental Biology

Démarche analyse des déficiences moteurs fonction de l’âge chez la souris avec la neurodégénérescence

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

Dans cette étude, nous montrons l’utilisation de l’analyse cinématique démarche basée sur plan ventral d’imagerie pour surveiller les changements subtils dans la coordination motrice ainsi que la progression de la neurodégénérescence avec l’âge dans des modèles murins (p. ex., endophiline mutant lignées de souris).

Abstract

Des tests de comportement moteur sont couramment utilisés pour déterminer la pertinence fonctionnelle d’un modèle de rongeur et pour tester nouvellement mis au point des traitements chez ces animaux. Plus précisément, analyse de la démarche permet de reconquérir la maladie des phénotypes pertinents qui sont observés chez des patients humains, en particulier dans les maladies neurodégénératives qui affectent des habiletés motrices comme la maladie de Parkinson (MP), la maladie d’Alzheimer (ma), amyotrophique latérale amyotrophique (SLA) et autres. Au début des études dans cette optique, la mesure des paramètres de la démarche a été laborieuse et dépendent de facteurs qui ont été difficiles à contrôler (par exemple, vitesse, fonctionnement continu). Le développement plan ventral systèmes d’imagerie (VPI) rend possible la démarche analyse à grande échelle, faisant de cette méthode un outil utile pour l’évaluation du comportement moteur chez les rongeurs. Nous présentons ici un protocole approfondi de l’utilisation de l’analyse cinématique démarche pour examiner la progression en fonction de l’âge des déficits moteurs dans des modèles murins de la neurodégénérescence ; lignées de souris avec une baisse des taux de l’endophiline, dans lequel les lésions neurodégénératives augmentent progressivement avec l’âge, sont utilisées à titre d’exemple.

Introduction

Imposent un lourd fardeau sur les patients, les familles et la société des maladies neurodégénératives et deviendront encore plus préoccupant que l’espérance de vie augmente et la population mondiale continue de vieillir. Un des symptômes plus courants des maladies neurodégénératives sont des problèmes d’équilibre et de la mobilité. Ainsi, la caractérisation du comportement moteur dans le vieillissement chez les mammifères (p. ex., un rongeur) des modèles ou des modèles montrant les phénotypes neurodégénératives, constitue un outil précieux pour démontrer la pertinence in vivo de la modèle animal spécifique (s), ou thérapeutique traitements qui visent à améliorer les symptômes de la maladie. Presque chaque approche pour traiter les maladies neurodégénératives nécessite finalement stable dans un modèle animal avant l’instauration d’un essai clinique chez l’homme. Par conséquent, il est crucial d’avoir des tests de comportement fiable et reproductible qui peuvent être utilisés pour quantifier systématiquement des phénotypes pertinents-maladie le long de la progression de l’âge, afin de s’assurer qu’un médicament candidat, qui a montré de potentiel dans un modèle in vitro , peut effectivement améliorer le phénotype chez un animal vivant.

Un des aspects de l’évaluation du comportement moteur chez les rongeurs sont l’analyse cinématique démarche, pouvant être exécutées par le VPI (également appelé plan ventral vidéographie)1,2. Cette méthode tire parti de l’enregistrement continu de la face inférieure des rongeurs marchant sur un tapis roulant transparent et motorisés ceinture1,2,3,4. Analyse le flux de données vidéo crée « patte digital prints » de quatre membres qui dynamiquement et de manière fiable récapitulent modèle marche du rongeur, initialement décrite par Kale et al. 2 et modifiée et al. 3.

Le principe de l’analyse de la démarche axée sur l’imagerie consiste à mesurer la patte en contact avec le tapis au fil du temps, pour chaque patte individuel. Chaque position est représentée par une augmentation dans la région de patte (en phase de freinage) et une diminution dans la région de la patte (en phase de propulsion). Elle est suivie de la phase pendulaire dans laquelle aucun signal n’est détecté. Swing et position ensemble forment une enjambée. En plus des paramètres de dynamique de marche, les paramètres de posture peuvent également être extraits des vidéos enregistrées. Paramètres exemplaires et leur définition sont répertoriés dans le tableau 1 et comprennent la largeur de la position (SW ; la distance combinée entre les pattes avant ou arrières et l’axe de la queue de museau), "Stridez" de longueur (SL ; distance moyenne entre deux enjambées de la patte même) ou patte de placement angle (l’angle de la patte à l’axe de la queue de museau). Les données de la posture et démarche dynamique permettent de tirer des conclusions sur l’équilibre animal (par les paramètres de position et leur variabilité au cours de plusieurs étapes) et de la coordination (par des paramètres de dynamique de marche). Autres paramètres, tels que le coefficient de l’ataxie (la variabilité SL calculé par [(max. SL−min. SL) / signifie SL]), membre postérieur partagé position (temps que les deux membres postérieurs sont en contact avec la ceinture), ou drag patte (superficie totale de la patte sur la ceinture de position complet pour la patte de Lift-off) peuvent également être extraits et ont été signalés à modifier dans divers neurodégénératives di Sease modèles5,6,7,8 (voir tableau 1).

Paramètre Unité Définition
Swing time MS durée de temps que la patte n’est pas en contact avec la courroie
temps de position MS durée de que la patte est en contact avec la courroie
frein de % % du temps de position pourcentage de temps de position que les pattes sont en phase de freinage
propulser % % du temps de position pourcentage de temps de posture, que les pattes sont en phase de propulsion
largeur de la position cm combiné de distance entre les pattes avant ou arrières et l’axe de la queue de museau
longueur de foulée cm distance moyenne entre deux enjambées de la patte de même
fréquence de la foulée progrès/s numéro complet foulées par seconde
angle de placement patte deg angle de la patte par rapport à l’axe de museau-queue de l’animal
coefficient d’ataxie a. u. La variabilité SL calculé par [(max SL-min SL)/moyenne SL]
position partagée % % de position temps de patte partagé de position ; temps que les deux membres postérieurs sont en contact avec la courroie en même temps
patte de drag mm2 superficie totale de la patte sur la ceinture de position complet pour la patte de Lift-off
chargement de la branche cm2 MAX dA/dT ; taux maximal de changement de zone de patte dans la phase de rupture
variabilité d’angle étape deg écart-type de l’angle entre la biche pattes en fonction de la SL et SW

Le tableau 1. Définition des paramètres de démarche clés qui peuvent être testés par imagerie plan ventral.

Évaluer le comportement moteur de modèles de rongeurs pour les maladies neurodégénératives peut être difficile selon la sévérité du phénotype d’un modèle spécifique à un âge donné. Plusieurs maladies, surtout de PD, spectacle comportement moteur solide (locomotion) déficits, tant chez les patients dans des modèles animaux. Un des quatre symptômes principaux dans PD est bradykinésie, qui progresse avec l’âge et se manifeste dans les handicaps graves démarche déjà dans les premiers stades de PD9. Études du modèle PD aiguë, rongeurs traités avec 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), ont déjà utilisé le VPI démarche analyse10,11,12. Toutefois, étant donné la nature aiguë de ce modèle, ces études ne traitent pas de la progression liée à l’âge des déficits moteurs. Plusieurs études récentes ont effectué l’analyse de la démarche chez les souris âgées avec changements neurodégénératives,13,14,, par exemple15, mettant l’accent sur l’importance de comprendre la progression de la maladie avec l’âge .

En plus des déficits moteurs, modèles animaux de maladies neurodégénératives, souvent, ont des difficultés à se concentrer sur les tâches d’examen et montrent des troubles cognitifs importants, en particulier avec l’âge. Tel un phénotype peut influer sur le résultat des tests de comportement moteur. À savoir, un des tests plus largement utilisés pour examiner des déficits moteurs, les rotarod test16, s’appuie sur la cognition, l’attention et stress17,18. Alors que la volonté de marcher sur un tapis roulant motorisé dépend également de ces facteurs, l’affichage enregistré est en cours d’exécution, qui est une caractéristique plus standardisée et beaucoup moins influencé par la cognition altérée. Effets du stress et de l’attention peuvent être visibles dans les paramètres spécifiques, comme la fois swing/position pour le stress et SL pour attention19,20, mais pas dans la capacité globale de course.

L’approche de l’analyse cinématique démarche plus offre l’avantage d’avoir des options pour ajuster le défi pour les modèles de rongeurs. Le tapis de course avec vitesse et angle réglable permet de vitesses de marche allant de 0,1 - 99,9 cm/s, alors que les rongeurs ayant une déficience sévère marche peuvent encore être en mesure de rouler à une vitesse lente (~ 10 cm/s). Animaux non-voyants peut être mesurés à des vitesses plus rapide en cours d’exécution (30 - 40 cm/s). L’observation de si oui ou non les animaux testés sont capables de fonctionner à une certaine vitesse fournit un résultat en soi. En outre, le rongeur peut être en outre contesté d’exécuter un plan incliné vers le haut ou le bas une baisse, en inclinant le tapis roulant à un angle désiré à l’aide d’un goniomètre, ou en attachant un traîneau pondéré à souris ou rat des membres postérieurs.

En plus de nombreuses études sur les protéines simples qui sont mutés chez les patients, il y a une récente prise de conscience croissante des liens entre l’endocytose défectueux processus et neurodégénérescence13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Modèles avec des niveaux réduits d’endophiline-a murins (désormais endophiline), un acteur clé dans les deux endocytose clathrine13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 et endocytose clathrine indépendant34, ont été trouvés pour montrer la neurodégénérescence et déficiences de la fonction de l’âge dans l’activité locomotrice13,21. Trois gènes codent pour la famille de protéines endophiline : endophiline 1, endophiline 2 et endophiline 3. Notamment, le phénotype résultant de l’appauvrissement de la couche de protéines endophiline varie grandement selon le nombre de disparus endophiline gènes13,21. Alors que triple knock out (KO) de tous les gènes de l’endophiline est létale quelques heures après la naissance et les souris sans les deux endophiline 1 et 2 ne parviennent pas à s’épanouir et de mourir dans les 3 semaines après la naissance, KO unique pour toutes les trois endophilins ne montre aucun phénotype évidente pour testés conditions21. Autres génotypes mutants endophiline Voir la durée de vie réduite et développent des déficiences moteurs avec l’augmentation de l’âge13. Par exemple, endophiline 1KO-2HT-3KO souris affichage marche altérations et des problèmes de coordination motrice (selon les essais par rotarod et analyse de la démarche cinématique) déjà à 3 mois d’âge, tandis que leurs frères, animaux de 1KO-2WT-3KO endophiline, afficher une importante réduction de coordination motrice qu’à 15 mois d’âge13. En raison de la vaste diversité des phénotypes dans ces modèles, il est nécessaire d’identifier et d’appliquer un critère qui peut intégrer une variété de défis correspondant aux capacités de cognition et moteur de l’animal, ainsi que l’âge. Ici, nous détaillons les procédures expérimentales qui capitalisent sur l’analyse cinématique démarche pour évaluer le début et la progression du handicap moteur dans un modèle de souris qui montre les changements neurodégénératives (c.-à-d. endophiline mutants). Cela inclut la mesure des paramètres de marche à différentes époques et différentes sévérités des déficiences de la locomotion.

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Protocol

Toutes les expériences sur des animaux présentés ici sont menées conformément aux directives européennes pour le bien-être animal (2010/63/UE) avec l’approbation de la Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit Lavesarchitecte (construction), numéro d’immatriculation 14 / 1701.

1. conception de l’étude

  1. Comme travail de comportement animal exige une planification minutieuse, examiner les paramètres suivants lors de la conception de l’expérience.
    1. Nombre d’animaux nécessaires par groupe.
      1. Utiliser un logiciel de statistique (p. ex., PASS, EDA ou GPower) pour calculer la taille de groupe requis.
        Remarque : La taille du groupe dépend de la variation entre les animaux et la sévérité du phénotype. Pour l’analyse de la démarche cinématique, le nombre de souris est généralement de 10 à 20 par groupe.
    2. Sexe des animaux expérimentaux.
      1. Examiner l’effet des oestrogènes sur l’expérience, selon les souches animales.
        NOTE : De nombreuses études de comportement se concentreront sur les hommes afin d’éviter l’influence des oestrogènes sur l’expérience. Ces influences sont plus ou moins fortes selon les souches animales de fond.
      2. Si les deux sexes seront utilisés, tester pour l’influence du sexe et d’évaluer les deux sexes séparément lorsque c’est nécessaire.
    3. Âge des animaux expérimentaux.
      1. Utiliser des animaux adultes (2 mois, ou plus) si un seul point unique est nécessaire.
      2. Sélectionnez plusieurs points dans le temps lorsque le changement de comportement moteur avec l’âge doit être étudié. Le point le plus rapproché possible de temps est de 1 mois, après que les souris sont sevrés de leur mère. Les animaux de laboratoire à intervalles réguliers, par exemple, tous les 1, 2 ou 3 mois.
  2. Solliciter une autorisation auprès des autorités locales pour effectuer des tests de comportement animal.
  3. Faire des plans pour se procurer les animaux testés.
    1. Faire un plan d’élevage ou contactez un distributeur animal en temps opportun afin que suffisamment les animaux de laboratoire sont disponibles le jour quand commencent les expériences.
    2. Que les animaux puissent s’habituer pendant une semaine, si elles sont conservées dans une nouvelle salle/au cours des expériences.

2. enregistrement vidéo

NOTE : Pour illustrer l’utilisation de l’analyse cinématique gait, ici un système d’imagerie disponible dans le commerce avec son accompagnement de l’imagerie et le logiciel d’analyse (voir la Table des matières) sont utilisés.

  1. Démarrez l’ordinateur et le logiciel de l’imageur.
  2. Déterminer l’état de santé et le bien-être de chaque animal en l’observant dans sa cage maison, elle pesée sur une balance.
  3. Si nécessaire, appliquer doucement le doigt rouge peinture aux pattes de l’animal avec une brosse. Laissez la peinture sécher pendant environ 5 min dans une cage propre de rechange.
    Remarque : Évitez de peindre le ventre de l’animal car la peinture est utilisée pour renforcer le contraste entre les pattes et le corps. Il est utile d’avoir la peinture de doigt noir très pratique pour les corrections. Cette étape est nécessaire pour les animaux à fourrure brune, ou dans les cas les pattes ont été tatoués pour identification. Si choisi de peindre les pattes d’un animal, tous les animaux dans le même groupe et le groupe témoin doivent être peints ainsi.
  4. Régler la vitesse du tapis roulant sur le panneau supérieur droit de l’appareil ; Si plus d’une vitesse de marche sera appliqué, commencez tout d’abord avec la vitesse la plus lente.
  5. Placer l’animal dans la chambre d’essai (évitez la queue ou les pattes de serrage lors de la fermeture de la chambre). Couvrir la chambre avec un tissu sombre et permettre à chaque animal tenir compte de 1-2 min.
  6. Allumez la lumière dans la chambre d’essai en tournant l’interrupteur rotatif tapis roulant à la position « on ». Tourner le commutateur rotatif de tapis de course de « transmettre » pour démarrer le tapis de course, puis cliquez sur le bouton « enregistrer » dans le logiciel de l’imageur.
    Remarque : Alors que le tapis roulant est en cours d’exécution, il est important d’observer le rendement des animaux avec soin et constamment : arrêter le tapis roulant immédiatement si l’animal ne peut pas faire face à la vitesse du tapis roulant, ou présente des symptômes secondaires non liés à la locomotion (par exemple, des crises d’épilepsie). Conditions d’essai peuvent nécessiter un réajustement.
  7. Lorsque l’animal s’exécute de manière stable (aucun évasions rapides pour les côtés, avant ou arrière), enregistrer pendant au moins 5 s avant d’arrêter le tapis roulant. Arrêter l’enregistrement en cliquant sur « stop » sur le logiciel imager et tourner le bouton rotatif de tapis roulant vers la position « off ».
    Remarque : Pour éviter un fonctionnement instable des animaux, il peut être utile de les laisser tourner pendant quelques secondes, ou pour leur permettre d’exécuter dans l’autre sens (en tournant le commutateur rotatif de tapis roulant pour « inverser » au lieu de « faire suivre »).
  8. Cliquez sur le bouton « transformation » dans le logiciel de l’imageur pour ouvrir un menu dans lequel le début et fin de la section vidéo (à utiliser pour l’analyse) peuvent être définies. Pour ce faire, utilisez le curseur en bas de l’écran pour naviguer dans la vidéo.
  9. Pour sélectionner le point à l’heure actuelle comme le début ou le point de terminaison, cliquez sur « du n° de l’image » et « to », respectivement. Assurez-vous que la section contient au moins 7 étapes/patte (14 étapes au total) de l’animal en exécutant de façon stable à une vitesse constante.
  10. Entrer l’identification de l’animal, date de naissance, poids et sexe. Enregistrer les données sur l’emplacement désiré sur l’ordinateur ou du serveur. Cliquez sur « caméra » pour revenir à l’interface d’enregistrement.
  11. Si plusieurs vitesses d’entraînement en cours d’exécution doivent être enregistrées, répétez les étapes 2.6-2.10 avec les vitesses de fonctionnement désirés. Avant d’enregistrer la vidéo suivante, assurez-vous que la peinture rouge est toujours présente sur la patte, sinon Répétez l’étape 2.3.
  12. Après l’enregistrement, libérer l’animal de sa cage maison. Après avoir retiré un animal, nettoyer le tapis avec de l’eau savonneuse suivie de désinfectant pour le préparer pour le prochain animal expérimental.

3. video Processing

  1. Démarrer le logiciel d’analyse, puis cliquez sur « select étudier le dossier » sélectionner le dossier avec les vidéos enregistrées.
  2. Sélectionnez une vidéo d’un ou plusieurs vidéos qui peuvent être traitées de façon consécutive, cliquez sur « go ».
  3. Utilisez la fonction de « rafraîchissement » pour sélectionner la zone où la souris est en cours d’exécution ; Cette section doit contenir uniquement la souris et le fond blanc.
  4. Si la fonction « inverse » tapis roulant a été utilisée précédemment, choisissez « vérifier si le nez du sujet est à votre droite >>> » mettre en miroir la vidéo puisque le logiciel est conçu pour analyser uniquement les animaux courir vers la gauche. Cliquez sur « J’accepte » pour continuer.
  5. Utilisez la fonction « rafraîchir » pour voir le masque par défaut et que le logiciel détecte empreinte de patte.
    Remarque : La vidéo d’origine est affichée sur la gauche, et une image noir et blanc des tirages proposés patte est sur la droite.
  6. Entrez des valeurs dans les cases « longueur » et « width » pour modifier le masque qui exclut la zone rouge autour du museau de l’animal pour l’analyse ; la couleur est semblable aux pattes, ne pas masquer cette zone pourrait entraîner le logiciel classement accidentellement le museau comme une patte.
  7. Réglez les curseurs « filtre bruit » et « filtrer les fourrures et les taches sombres » pour optimiser l’impression de patte noir et blanc. Réglez le curseur « filtre bruit » à ~ 800-950 pour animaux noir et à environ 700-800 pour animaux bruns ou blancs, selon la couleur exacte de fourrure de l’animal. Sélectionnez « OK » lorsque les réglages sont satisfaisants.
    Remarque : Le curseur « filtrer les fourrures et les taches sombres » dépend sur comment « rouge » la patte est. Pour pattes peintes, la valeur est habituellement d’environ 100-120 et pour les pattes non vernies la meilleure valeur est autour de 50-100. Ces paramètres dépendent les nuances de couleur de la fourrure et les pattes et doivent être optimisées pour chaque animal. La patte noir et blanche impression devrait avoir les représentations claires des pattes avec comme bruit de fond peu que possible.
  8. Sélectionnez une ou plusieurs vidéos qui ont passé le premier ajustement (marqués avec « @@ » avant le nom de la vidéo) et sélectionnez la fonction « imprimer » pour lancer l’analyse de ces vidéos.
    Remarque : L’analyse prend 2-5 min par vidéo. Il est possible d’exécuter l’analyse de plusieurs vidéos du jour au lendemain, car cette étape ne nécessite aucun apport de l’expérimentateur.
  9. Sélectionnez une vidéo analysée (marqués avec « @@@ ») et cliquez sur « go ». Notez que la patte zone (cm2) au contact de la ceinture au fil du temps (démarche dynamique) pour chaque patte distinct peut maintenant être vu. Pour comparer la vidéo originale et la patte calculée pour une zone sélectionnée, utilisez la fonction « jeu vidéo ».
  10. Utilisez les outils suivants (trois) pour corriger les petites erreurs commises par le logiciel.
    1. Utilisez l’option « correcte » pour supprimer un mauvais signal, par exemple, lorsque le logiciel enregistre un signal, même si la patte correspondante n’est pas en contact avec la courroie. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et marquer la bordure gauche de l’objet à supprimer avec le second clic et la bordure de droite avec le troisième clic.
    2. Utilisez l’option « se connecter » pour combiner deux signaux, par exemple, quand aucun signal n’est enregistré pour quelques images, même si la patte est en contact avec la courroie. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée, puis double-cliquez sur au milieu de deux objets à combiner.
    3. Utilisez l’option « Supprimer » pour supprimer complètement les points dans le temps de l’analyse. Utilisez cette option uniquement si l’erreur ne peut être fixée avec le « correct » ou « se connecter » fonction, par exemple, quand un signal de la patte de la patte avant gauche est accidentellement enregistré pour la patte de la patte gauche. Cliquez une fois pour zoomer sur la zone concernée et marquer la bordure gauche de la zone à enlever avec le second clic et la bordure de droite avec le troisième clic.
      Remarque : Les outils peuvent uniquement servir pour corriger les petites erreurs ; défaillances systématiques (par exemple, si le signal d’une patte était extrêmement faible) ne peuvent être corrigées : la vidéo devrait être exclue de l’analyse et l’enregistrement de l’animal respectif répété, lorsque cela est possible. Remarque que l’option « jeu vidéo » n’est plus disponible après le « bon », « se connecter » ou « supprimer » option a été utilisée, et en cliquant sur le bouton « Annuler » se réinitialisera toutes les 3 outils d’édition.
  11. Sélectionnez « ensuite l’intégrité physique » à aller de l’avant à travers les 4 membres ; Lorsque vous cliquez sur « prochain membre » après la dernière patte, le logiciel effectue l’analyse et affiche les résultats de cet animal sur 4 écrans.

4. analyse de la démarche

  1. Si toutes les vidéos d’une des expériences sont analysées, sélectionnez toutes les vidéos, cliquez sur « Réorganiser les résultats » pour exporter les résultats (une liste de paramètres dans les fichiers de feuille de calcul).
  2. Ouvrez le fichier avec la terminaison « reorganized_stride_info » et ajouter des informations ne figurant pas dans cette feuille de calcul : groupe d’information (p. ex., génotype, traitement), l’âge et les mesures de longueur de l’animal et la largeur qui sont enregistrés dans un autre fichier de feuille de calcul avec la terminaison « SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info ».
  3. Normaliser les paramètres démarche animale largeur ou longueur, si nécessaire, par exemple, SL à longueur de l’animal et SW à la largeur de l’animal.
  4. Trier les résultats par groupe, l’âge et vitesse de course : analyser toutes ces conditions de façon indépendante.
    NOTE : Les âges différents ou des vitesses en cours d’exécution ne peuvent être combinées au sein d’un même groupe.
  5. Calculer les valeurs de la moyenne (moyenne), écart-type et écart-type de la moyenne pour chaque paramètre pour toutes les conditions expérimentales.
  6. Effectuer une analyse statistique selon le protocole expérimental, par exemple, utiliser une queue 2 t-test pour comparer animal mutant/traités à un type sauvage (WT) / contrôle ou ANOVA pour comparer plusieurs groupes indépendants.
  7. Coup d’oeil mesurée à tous les paramètres : il est utile de tracer chaque paramètre pour mieux visualiser les résultats. S’il y a des différences statistiques dans un paramètre donné, vérifiez si les autres paramètres dépendants modifier corrélativement.
    Remarque : par exemple, si le SL est significativement diminué dans un certain groupe de test, ceci également entraînera une plus grande fréquence de foulée (puisque la vitesse de course est le même) et peut résulter en une augmentation SW (afin de maintenir la stabilité de la posture).
  8. Sélectionnez les paramètres qui sont les plus pertinents pour un modèle et/ou sont comparables aux observations dans la maladie humaine. Pour une présentation, créer des vidéos représentant pour chaque groupe et les compléter par des graphiques montrant la lecture pour les paramètres pertinents, étant donné que les changements d’allure subtile ne sont souvent pas évidents d’après les vidéos.

5. problèmes et solutions

Remarque : Certains animaux, notamment des modèles de souris avec un phénotype d’anxiété, peut-être avoir des difficultés à accomplir encore une tâche simple comme courir sur un tapis roulant. Voici les étapes qui peuvent être prises à des niveaux inférieurs d’anxiété et d’encourager en cours d’exécution.

  1. Accoutumance et application de la loi positive.
    1. À 2-3 jours avant le premier test, placez votre souris dans la chambre d’essai, couvrez-la avec un torchon foncé et laisser la lumière éteinte. Laissez la souris ajuster au nouvel environnement pendant environ 5 min. Ajouter chow ou beurre chocolat/noix (p. ex., Nutella) à la chambre d’essai pour une association positive peut-être se former.
  2. Application de la loi négative par limite de souffles/arrière d’air.
    1. Souris n’aiment pas les bouffées d’air ou un mouvement derrière eux et seront déroulera loin de la perturbation. Pour motiver en cours d’exécution, utilisez les choux à la masse d’air doux, ou un mouvement rythmique de la barre souple qui forme la limite arrière de la chambre d’essai, afin d’encourager la souris de courir vers la partie antérieure de la chambre d’essai.
  3. Slow-start.
    1. Lorsque vous testez des vitesses élevées en cours d’exécution, démarrez le tapis roulant à une vitesse inférieure et ensuite augmenter lentement la vitesse du tapis roulant vers la condition désirée à l’essai.
  4. Minimiser la libre circulation.
    1. La longueur de chambre de test est limitée par deux barres réglables à l’avant et l’arrière. Si un animal test tient à la vitesse de marche mais ne tourne pas régulièrement, limiter la longueur de la chambre pour une marche plus régulière.
  5. Si les mesures susmentionnées ne sont pas réussies, record en cours d’exécution sur le lendemain. Si l’animal refuse toujours à courir après l’essai sur trois jours, enregistrer ceci comme la conclusion et exclure l’animaux de tests supplémentaires.
    Remarque : Les résultats de l’analyse de la démarche dépendant d’enregistrement vidéo de bonne qualité. Il n’y a aucune raison d’exclure les vidéos lors de l’analyse si les vidéos ont été enregistrées avec soin. Si la qualité vidéo est insuffisante, il deviendra évident au cours de l’étape 3.6 lorsque les paramètres pour la création de l’impression numérique patte sont définies. Si aucune autre partie du corps sauf les pattes et le museau apparaît rouge (p. ex., en raison de la fourrure manquante autour des organes génitaux ou des jets de peinture de doigt sur l’abdomen), la qualité diminue considérablement. Les ajustements à l’étape 3.6 permettent de corriger les seuls petits problèmes et si cela ne peut pas apporter la vidéo à un rapport signal/bruit acceptable, la vidéo doit être exclue de l’analyse et enregistrement doit être répété. Ainsi, il est recommandé d’analyser des vidéos peu après que les enregistrements sont effectués.

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Representative Results

Pour illustrer l’utilisation de l’analyse cinématique démarche, nous avons effectué démarche analyse sur souris WT C57BL/6J avec l’âge, ainsi que plusieurs lignées mutantes endophiline, utilisant des instruments disponibles dans le commerce et les logiciels (veuillez vous référer à la Table de Matériaux). Dans cette configuration, une caméra haute vitesse sous un tapis roulant transparent enregistre le fonctionnement d’une souris (Figure 1 a). Le logiciel reconnaît ensuite le contraste entre les pattes de couleurs rouges et la fourrure blanche ou noire. Nos animaux de laboratoire ayant la couleur de fourrure brun foncé, nous avons peint les pattes de tous les sujets avec de la peinture rouge de doigt. Nous avons testé des animaux de laboratoire à des vitesses différentes en cours d’exécution : marche (10 cm/s), en cours d’exécution (20 cm/s) et course rapide (30 cm/s). La zone de contact et l’heure que les pattes étaient sur le tapis roulant et dans l’air ont été mesurées. De cette information, les paramètres qui récapitulent le rythme de la démarche (p. ex., les temps de swing/position, frein/propulsion) ou de la posture (par exemple, angle de la patte, SW) ont été calculés (Figure 1 b).

Nous avons effectué l’analyse de la démarche dans le cadre d’une batterie de plusieurs tests de comportement moteur. Nous avons évalué la force de préhension (GS), membre postérieur amplexicaule (HLC), allures et performances rotarod accélérée (ARR). Tandis que le comportement moteur n’est ne pas aussi touchés par l’expérience antérieure et les tests expérimentaux comme, par exemple, cognition, il est toujours important que tous les animaux subissent la même batterie de tests dans le même ordre et au même âge. L’ordre devrait passer de faible à haute Difficulté pour l’animal afin de minimiser les influences provenant des expériences antérieures sur le test actuel.

Nous avons sélectionné des mutants endophiline pour cette étude car, selon combien de trois allèles endophiline manquent, le phénotype résultant varie d’aucun phénotype dans le KOs unique à un phénotype neurodégénératives doux au jeune endophiline 1KO-2HT-3KO souris qui évolue avec l’âge. Pour cette raison, ces lignées animales présentent un modèle adéquat pour étudier les changements subtils qui se développent seulement comme l’âge des animaux. Étant donné que la plupart des mutants endophiline montrent une espérance de vie réduite, nous avons examiné le comportement moteur de mutants endophiline au cours des 18 mois (18 mois a été choisi le depuis même les souris dans la ligne de 1KO-2HT-3KO endophiline qui affiche le plus fort phénotype, n’ont pas de paralysie). L’analyse de la démarche s’est déroulée à huit points dans le temps sur une période de 18 mois (Figure 1). À l’âge de 18 mois, les animaux ont été euthanasiés et conservés pour analyse biochimique et/ou histologique.

Entretien de colonie de souris :

Souris hétérozygotes et homozygotes pour les allèles endophiline 1, 2 et 3 ont été signalés initialement à Milosevic et al. 21 souris C57BL/6J ont été utilisés en plus des souris de même portée sous forme de contrôles tout au long. Souris étaient logés dans des cages ouvertes avec un accès à la nourriture et l’eau dans les groupes d’un maximum de 5 animaux, ad libitum sur un cycle lumière/obscurité de 12 h. Seules les souris mâles ont été utilisées dans cette étude afin d’exclure les effets de variations de cycle-dépendant chez les femelles.

Génotypage de l’endophiline A1, A2 et A3 murin :

Génotypage des souris mutantes endophiline a été réalisée par amplification par la polymérase chain reaction (PCR) à l’aide de l’ADN génomique extrait de coups de queue ou des oreilles. RFT pour trois gènes endophiline-A ont été effectuées avec des amorces respectifs : endophiline-A1 : avant apprêt 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' et d’inverser les amorces 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' pour WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' pour KO ; endophiline-A2 : transmettre les amorces 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' pour WT ; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' KO et amorces inverse 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' pour WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' pour KO ; endophiline-A3 : transmettre l’apprêt 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' et inverser les amorces 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' pour WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-CIFA-3' pour KO. Les produits PCR obtenus ont été exécutés sur un gel d’agarose à 1 %, cédant tailles distinctif des allèles WT et KO : endophiline-A1 WT ~ 384 bits/s, KO ~ 950 bps ; endophiline-A2 WT ~ 1 280 bits/s, KO ~ 1 000 bits/s ; endophiline-A3 WT ~ 325/s, KO/s ~ 465. Produits PCR avec les WT KO bandes et indiquent un hétérozygote animal (HT).

Résultats :

Afin de caractériser la démarche et la posture chez les souris WT avec l’âge, nous avons effectué l’analyse cinématique démarche chez ces animaux (Figure 2; Film 1). Alors que certains paramètres, par exemple SW (moyenne distance entre fore ou membres postérieurs normalisés à largeur animale ; voir également tableau 1), reste inchangé chez les animaux de poids avec l’âge, d’autres paramètres changent progressivement (Figure 2 a– C). par exemple, le support double patte (heure par rapport à la durée de posture que les deux membres postérieurs sont en contact avec le sol en même temps) augmente de 38 % à 55 % de 1 mois à 18 mois (Figure 2 b). Ce paramètre est souvent associé avec la posture instabilité35. En outre, chargement limb (taux maximal de modification de la zone de la patte dans la phase de rupture) augmente de 38 cm2/s à 59 cm2/s de 1 mois à 18 mois (Figure 2). Décélération rapide peut être interprétée comme un indicateur de la force musculaire réduite. La capacité globale de la course n’est pas affectée chez les animaux WT (94 % sont capables de fonctionner à 30 cm/s à 18 mois, Figure 3 a). En plus de décrire la démarche et la posture des paramètres restent inchangée ou change progressivement avec l’âge chez les souris WT, nous avons documenté que l’analyse de la démarche cinématique utilisant le VPI est une méthode appropriée pour étudier les altérations légères liée à l’âge de démarche et la posture.

Alors que la capacité globale de la course n’est pas affectée chez les animaux de WT, plusieurs lignées mutantes endophiline Voir la capacité altérée de marcher ou courir sur le tapis de course motorisé (Figure 3 a), tel que rapporté dans Murdoch et al. 13 sur l’ensemble de données plus petit. Notamment, alors qu’à 1 mois d’âge, toutes les souris de 1KO-2HT-3KO endophiline sont tous capables de fonctionner à 30 cm/s, 18 mois, soit 81 % de ces mêmes animaux ne sont pas en mesure d’exécuter (Figure 3 a, note que plus grandes cohortes ont été analysées que celles rapportées antérieurement au 13). Fait intéressant, les mutants endophiline qui n’ont pas moins endophiline allèles (c.-à-d. endophiline 1KO-2HT-3WT) sont également touchés, mais à un degré inférieur (Figure 3 a).

Même si endophiline 1KO-2HT-3KO mutants montrent de graves déficiences moteurs avec l’âge13, plusieurs paramètres de la démarche ne sont pas modifiés par rapport à la commande WT, également à l’âge de 18 mois. Par exemple, étape angle variabilité (l’écart de l’angle de l’étape) reste inchangée (Figure 3 b). En particulier, de nombreux autres paramètres, pour propulser exemple temps (le pourcentage de temps de posture que les pattes sont en phase de propulsion), ne sont pas différentes à 1 mois d’âge, mais progressivement s’aggraver avec l’âge (Figure 3; Voir aussi le film 2). Ce qui montre que les paramètres de la fonction de l’âge ainsi que les variables spécifiques au mutant neurodégénératives peuvent être étudiées avec une approche d’analyse cinématique démarche.

Figure 1
Figure 1. Installation d’imagerie plan ventral et principe. (A) Photo et schéma d’une installation d’analyse de démarche. (B) principe de logiciel analyse : enregistré-dessous d’une souris courir sur un tapis roulant transparent, le logiciel calcule la patte numérique imprime. Leur dynamique lors de l’exécution est mesurée comme la taille de la zone de patte au fil du temps, et c’est utilisé comme base pour calculer le rythme de la démarche et la posture des paramètres. (C) décours temporel de l’expérience de l’analyse de démarche effectuée sur endophiline mutants. La locomotion et la démarche ont été évaluées à 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 et 18 mois. Les images montrent l’endophiline 1KO-2HT-3KO souris à 2, 12 et 18 mois. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2. La démarche d’analyse chez les souris de type sauvage avec l’âge. La locomotion et la démarche chez les souris WT (C57BL/6J) ont été évaluées à 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 et 18 mois. Largeur (A) la position normalisée à largeur animale des animaux WT ne change pas avec l’âge. (B) le support double patte augmente avec l’âge chez les animaux de WT. Le graphique montre le pourcentage de temps de position que les deux membres postérieurs sont sur le terrain en même temps. Une augmentation de ce paramètre reflète l’instabilité démarche. (C) la branche de chargement (le taux maximal de modification de la zone de la patte dans la phase de rupture) augmente avec l’âge chez les animaux de WT. Décélération plus rapide peut être un indicateur de la force musculaire réduite. Tous les graphiques représentent la valeur moyenne ± SEM ; p valeurs ont été calculées à partir de queue 2 t-teste contre le WT 1 - mois et sont représentés comme des * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3. La démarche d’analyse chez les mutants endophiline avec l’âge. (A), la vitesse de marche de mutants endophiline 1, 12 et 18 mois, calculés à partir d’un dataset élargi par rapport à Murdoch et al. 13 bar couleurs reflètent le pourcentage d’animaux capables de fonctionner à 30 (bleu foncé), 20 (bleu) ou 10 cm/s (bleu clair) sur le tapis de course motorisé, ou refuser en cours d’exécution sur le programme d’installation (gris). Alors que tous les animaux testés peuvent fonctionner à 30 m/s à 1 mois, les mutants endophiline développent des déficits en vieillissant. B–(C) L’étape d’angle variabilité et propulser fois en WT (noir), endophiline 1KO-2WT-3WT (turquois), endophiline 1KO-2HT-3WT (bleu foncé) et l’endophiline 1KO-2HT-3KO (brun) souris. La variabilité d’angle étape ne montre aucune différence au cours du vieillissement animaux WT ou entre mutants WT et endophiline. Le temps de propel (comme le pourcentage de position) n’est pas significativement modifié entre endophiline mutants et WT à 1 mois, mais chez les mutants endophiline diminue avec l’âge de la souris. Tous les graphiques représentent la valeur moyenne ± SEM ; p valeurs ont été calculées à partir de queue 2 t-teste contre WT appariés selon l’âge et sont représentés comme des * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Movie 1
Film de 1. La démarche d’analyse chez la souris (C57BL/6J) de type sauvage à 3 (à gauche) et 18 mois d’âge (à droite). La vidéo d’origine (en haut) est traduite en une vidéo de « patte digital print » (en bas). La vitesse de la vidéo a été ralentie 5 fois afin que les détails peuvent être mieux appréciées. Au point de 18 mois, note l’hésitation de la patte droite arrière (rouge dans la patte de digital impression) à 2 ~ s et de la patte avant droite (en bleu dans la patte de digital impression) à ~ 4 s. La vitesse de la vidéo a été ralentie par un facteur de 10. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

Movie 2
Film 2. La démarche d’analyse dans l’endophiline 1KO-2WT-3WT (contrôle ; gauche) versus endophiline 1KO-2HT-3KO souris (à droite) à l’âge de 18 mois. La vitesse de la vidéo a été ralentie par un facteur de 5 donc les détails peuvent être mieux appréciées. La souris de 1KO-2HT-3KO endophiline affiche des altérations de démarche qui peuvent être considérées comme la moins stable en cours d’exécution de l’animal. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)

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Discussion

L’étude de la coordination motrice est une approche utile dans la caractérisation de modèles de maladies neurodégénératives, en particulier pour les maladies comme PD dans laquelle la coordination motrice est durement touchée. Avec l’aide d’un test fonctionnel de l’analyse cinématique démarche, nous pouvons identifier les changements subtils dans la démarche d’animaux à l’apparition de problèmes locomoteurs, ou dans les modèles avec faible neurodégénérescence et phénotype donc relativement modeste. Compte tenu de la diversité des phénotypes dans différents modèles de maladies neurodégénératives qui englobe les anomalies petite allure et déficiences graves de mouvement, cette méthode est bien adaptée pour évaluer les paramètres de la démarche fondées sur l’âge de l’animal et la capacité de se déplacer. Animaux sévèrement altérée peut être enregistrées en marchant à basse vitesse sur un tapis de course avion, bien que moins modèles ayant une déficience peuvent être enregistrés en cours d’exécution en montée ou descente à grande vitesse. Cela peut révéler la démarche des différences entre le modèle neurodégénératives et son contrôle de même portée sans effort les animaux.

Avec ce protocole, nous démontrer l’adéquation de la méthode VPI pour surveiller l’évolution du moteur réduite avec l’âge chez la souris. Tests souris WT à plusieurs points dans le temps que leur âge avance nous ont permis d’identifier les anomalies de la démarche de la fonction de l’âge et de caractériser comment ils progressent avec l’âge. En outre, lors de la manipulation de modèles murins de neurodégénérescence, un problème qui se manifeste souvent est qu’en raison des symptômes non liés au comportement moteur (p. ex., anxiété, apathie, difficultés d’apprentissage), la volonté de l’animal à effectuer même un simple moteur de tâche comme la course, est réduite. Ici, nous suggérons des modifications de méthode et outils motivationnels pour encourager en cours d’exécution sur le tapis de course motorisé lumineux qui peut être utile d’appliquer avec succès l’analyse cinématique démarche au vieillissement des lignées de souris avec changements neurodégénératives. En outre, nous utilisons un truc simple d’appliquer la peinture de doigt au spectacle qu’il peut considérablement aider à améliorer la qualité des données enregistrées et les pattes de l’animal. L’obtention de bons enregistrements vidéo est l’étape la plus critique de l’analyse de la démarche : le succès de l’analyse dépend, comme chaque analyse automatisée ou semi-automatisée d’images ou de vidéos, de la qualité des données brutes. Vidéos de mauvaise qualité ne s’améliore dans les étapes ultérieures de l’analyse et ont généralement d’être exclu du processus d’analyse.

Alors qu’il étudie systématiquement la démarche et la posture de WT et plusieurs lignées mutantes endophiline sur une période de 18 mois, nous avons remarqué que même les souris WT et les souris sans problèmes de locomotion/running évidente (c.-à-d. endophiline 1KO-WT-WT), montrent des altérations plusieurs paramètres de la démarche et la posture avec l’âge, de manière progressive (Figure 2 et Figure 3 a). Fait intéressant, nous avons aussi remarqué qu’alors que les anomalies dans plusieurs paramètres de la démarche et la posture, observées au cours du vieillissement endophiline mutants se développent dans la même direction et pente comme dans les animaux WT/témoins, d’autres n’ont pas (Figure 3). Enfin, il est important de noter que même si âgé WT souris et jeunes endophiline mutants ne s’affichent pas toute locomotion évidente, démarche et posture défauts observés par oeil, changements des paramètres de la démarche et la posture sélectives peuvent être détectées grâce à cette approche.

Tester le comportement moteur de souris est un des moyens plus complètes pour illustrer qu’un modèle murin manifeste des principaux aspects de la condition humaine. En conséquence, un certain nombre de tests ont été développé afin d’évaluer divers aspects du comportement moteur. Ces essais incluent le test de plein champ (activité locomotrice générale), rotarod (coordination motrice, ataxie), la force (la force musculaire), roue (activité), suspendu l’essai au fil (endurance), poutre échelle marche tâche (coordination motrice fine, en cours d’exécution de préhension sensorimotrice habilité), démarche d’analyse (locomotion, coordination de branche) et autres (résumées dans Watson,36). Les différents tests ont des avantages et inconvénients et leurs afficheurs sont généralement limitées à l’aspect (ou des aspects) du comportement moteur qu’ils ont été conçus pour l’adresse. Pour cette raison, il est devenu pratique courante pour effectuer une batterie de tests de comportement moteur pour couvrir les principaux aspects de ce domaine.

Analyse de la démarche est souvent pas inclus dans ces batteries, en partie en raison d’un rapport par Guillot à al. 37, qui trouve qu’analyse de la démarche ne détecte pas de déficits moteurs dans des modèles animaux de PD et ALS et en partie en raison de la méthode laborieuse et puissance limitée. Toutefois, Guillot et al. rapport a été contestée par la recherche qui porte sur plusieurs limitations dans l’étude de conception38. L’utilité de cette méthode dans l’analyse de la marche dans des modèles murins avec neurodégénérescence a été démontrée par un certain nombre de récentes publications10,11,12,39,40 ,41,42,43, y compris notre travail13.

Enregistrements de VPI viennent avec plusieurs avantages par rapport à la méthode conventionnelle de peindre les pattes avec de l’encre et de laisser la souris courir sur une feuille blanche de papier44. Le plus évident est le fait que le tapis roulant motorisé, la vitesse de marche de l’animal est contrôlée, qui a une forte influence sur la démarche plusieurs paramètres1. En outre, certaines anomalies de la démarche devient détectable uniquement lorsque l’animal s’exécute à une vitesse élevée exigeante et/ou un inclinaison/déclin, qui ne seraient pas vu dans la course volontaire. En outre, l’analyse élaborée à la main est remplacée par une analyse semi-automatique et à haut débit. Pour cette raison, le nombre d’animaux testés dans chaque groupe peut être augmenté, qui à son tour réduit l’effet dû à la variabilité qui est inévitable dans les animaux vivants. En résumé, nous recommandons que la version modifiée de l’analyse de démarche VPI est incluse dans les batteries de test moteur standard pour compléter l’analyse des déficiences moteurs dans les modèles de rongeurs de neurodégénérescence et/ou de vieillissement.

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Disclosures

Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Acknowledgments

Nous remercions les gardiens animaux à l’animalerie de l’ENI pour aide à l’élevage et Dr. Nuno Raimundo pour des commentaires utiles sur le manuscrit. I.M. est pris en charge par les subventions de la Fondation allemande de la recherche (DFG) à travers le centre de recherche en collaboration SFB-889 (projet A8) et SFB-1190 (projet P02) et le Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. est soutenu par la bourse de recherche de l’Ecole doctorale de Göttingen pour les Neurosciences, biophysique et des Biosciences moléculaires (GGNB).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

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Démarche analyse des déficiences moteurs fonction de l’âge chez la souris avec la neurodégénérescence
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