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JoVE Journal Developmental Biology
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Developmental Biology

Ganganalyse altersabhängigen motorische Beeinträchtigungen bei Mäusen mit neurodegenerativen Erkrankungen

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

In dieser Studie zeigen wir Ihnen die Nutzung der kinematischen Ganganalyse anhand der ventralen Flugzeug imaging zu überwachen, die subtilen Veränderungen in motorische Koordination sowie das Fortschreiten der Neurodegeneration mit zunehmendem Alter in Maus-Modellen (z. B. Endophilin mutant Mauslinien).

Abstract

Motor Verhalten Tests sind häufig verwendet, um die funktionelle Relevanz eines Nagetier Modells ermitteln und testen neu entwickelte Behandlungen in diesen Tieren. Kann insbesondere Ganganalyse Recapture Krankheit, relevanten Phänotypen, die bei menschlichen Patienten, insbesondere bei neurodegenerativen Erkrankungen beobachtet werden, die motorische Fähigkeiten wie Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Amyotrophe beeinflussen Lateralsklerose (ALS) und andere. In frühen Studien entlang dieser Linie, die Messung der gangartparameter war umständlich und abhängig von Faktoren, die schwer zu kontrollieren waren (z. B. Laufgeschwindigkeit, Dauerbetrieb). Die Entwicklung der ventralen Flugzeug Bildsysteme (VPI) machte es möglich, Ganganalyse in großem Maßstab, so dass diese Methode ein nützliches Werkzeug für die Beurteilung der motorischen Verhalten bei Nagetieren führen. Hier präsentieren wir Ihnen eine ausführliche Protokoll wie kinematische Ganganalyse verwendet, um den altersabhängigen Verlauf der motorischen Defizite in Mausmodellen der Neurodegeneration zu prüfen; Maus mit verringerte Niveaus des Endophilin, in denen neurodegenerativen Schäden nach und nach mit dem Alter steigt, als Vorbild dienen.

Introduction

Neurodegenerative Erkrankungen eine erhebliche Belastung für Patienten, Familien und Gesellschaft zu verhängen, und werden noch besorgniserregender als die Lebenserwartung steigt, und die Weltbevölkerung wächst weiter, Alter. Eines der häufigsten Symptome von neurodegenerativen Erkrankungen sind Balance und Mobilität Probleme. So, Charakterisierung der motorischen Verhalten im Altern Säugetieren (z. B. Nagetier) Modelle und/oder Modelle zeigen Neurodegenerative Phänotypen, ist ein wertvolles Werkzeug zu zeigen, die in Vivo -Bedeutung von den bestimmten tierischen Modelle oder therapeutische Behandlungen, die darauf abzielen, die Krankheitssymptome zu verbessern. Fast jeder Ansatz zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen erfordert letztlich in einem Tiermodell vor Beginn einer klinischen Prüfung am Menschen getestet. Daher ist es wichtig, zuverlässige, reproduzierbare Verhalten Tests haben, die konsequent quantifizieren krankheitsrelevante Phänotypen entlang alter Fortschreiten, um sicherzustellen, dass ein Kandidat-Medikament, das Potenzial in einem in Vitro -Modell zeigte, kann verwendet werden den Phänotyp in ein lebendes Tier effektiv zu verbessern.

Ein Aspekt der motorischen Verhalten Beurteilung bei Nagetieren ist kinematische Ganganalyse, die von VPI (auch genannt ventrale Flugzeug Videografie)1,2ausgeführt werden können. Diese bewährte Methode nutzt die kontinuierliche Aufnahme von der Unterseite der Nagetiere zu Fuß auf eine transparente und motorisiertes Laufband Gürtel1,2,3,4. Analyse des Videos Datenfeed erzeugt "digitale pfotenabdrücken" von allen vier Gliedmaßen, die dynamisch und zuverlässig das Nagetier Gangbild, als ursprünglich von Kale Et Al. beschrieben rekapitulieren 2 und Amende Et al. 3.

Das Prinzip der Imaging-basierte Ganganalyse ist um die Pfote Fläche in Kontakt mit dem Laufband Gürtel im Laufe der Zeit für jeden einzelnen Pfote zu messen. Jede Haltung wird durch eine Erhöhung der Pfote Bereich (in der Bremsphase) und eine Abnahme der Pfote Bereich (in der Antriebs-Phase) dargestellt. Darauf folgt der Schwungphase in dem kein Signal erkannt wird. Schwung- und Standphase zusammen bilden eine Schrittlänge. Neben gangartparameter Dynamik können Körperhaltung Parameter auch die aufgenommenen Videos entnommen werden. Vorbildliche Parameter und deren Definition sind in Tabelle 1 aufgeführten und gehören Haltung Breite (SW; der kombinierten Abstand von der vorderen oder hinteren Pfoten auf die Schnauze-Tail-Achse), Länge (SL; durchschnittliche Entfernung zwischen zwei Schritte von der gleichen Pfote) schreiten oder Pfote Platzierung Winkel (der Winkel von der Pfote auf die Schnauze-Tail-Achse). Die Körperhaltung und Gangart Dynamik Daten ermöglichen Schlussfolgerungen auf tierische Balance (durch Körperhaltung Parameter und ihre Variabilität über mehrere Stufen) und Koordination (von Dynamik gangartparameter). Andere Parameter, wie z. B. Ataxie-Koeffizient (SL Variabilität berechnet, indem [(Max.) SL−min. SL) bedeuten SL /]), Hind Gliedmaßen Haltung (Zeit, die beide Hinterbeine in Kontakt mit dem Gürtel sind), geteilt oder Pfote ziehen (Gesamtfläche von der Pfote auf den Riemen aus volle Haltung, Lift-Off Pfote) auch extrahiert werden können, und berichtet in verschiedenen neurodegenerativen di geändert werden zu5,6,7,8 -Modelle (siehe Tabelle 1).

Parameter Einheit Definition
Angriffszeit MS Dauer der Zeit ist die Pfote nicht in Kontakt mit den Riemen
Haltung-Zeit MS Dauer der Zeit, die die Pfote in Kontakt mit dem Gürtel ist
% Bremse % der Haltung Zeit Prozentsatz der Haltung Zeit sind die Pfoten in die Bremse-phase
% zu treiben % der Haltung Zeit Prozentsatz der Haltung Zeit sind die Pfoten in der Antriebs-phase
Haltung-Breite cm kombinierte Abstand zwischen der vorderen oder hinteren Pfoten und Schnauze-Tail-Achse
Schrittlänge cm durchschnittliche Entfernung zwischen zwei Schritte von der gleichen Pfote
Schrittfrequenz Schritte/s Anzahl der vollständigen Schritte pro Sekunde
Pfote Platzierung Winkel DEG Winkel von der Pfote in Bezug auf die Schnauze-Tail-Achse des Tieres
Ataxie-Koeffizient a.u SL-Variabilität von [(max SL-min SL)/Mittelwert berechnet SL]
% gemeinsame Haltung % der Haltung Hind Gliedmaßen gemeinsame Haltung Zeit; Zeit, die beide Hinterbeine gleichzeitig in Kontakt mit dem Gürtel sind
Pfote ziehen mm2 Gesamtfläche von der Pfote auf den Riemen aus volle Haltung, Lift-Off Pfote
Extremität be- cm2 MAX dA/dT; maximale Änderungsrate der Pfote Bereich in der Bruch-phase
Schritt Winkel Variabilität DEG Standardabweichung des Winkels zwischen den hinteren Pfoten als Funktion der SL und SW

Tabelle 1. Definition der wichtigsten gangartparameter, die durch ventrale Flugzeug Bildgebung getestet werden können.

Beurteilung der motorischen Verhaltens der Nager-Modelle für Neurodegenerative Erkrankungen kann abhängig von der Schwere des Phänotyps eines bestimmten Modells in einem bestimmten Alter schwierig sein. Mehrere Krankheiten, vor allem PD zeigen starke motor Verhalten (Fortbewegung) Defizite, sowohl bei Patienten als auch in Tiermodellen. Eines der vier wichtigsten Symptome bei Morbus Parkinson ist Bradykinesie, die mit dem Altern fortschreitet und manifestiert sich in schweren Gang Beeinträchtigungen bereits in frühen Stadien der PD9. Studien über die akute PD Modell, Nagetiere mit 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP) behandelt wurden bereits VPI Gangart Analyse10,11,12eingesetzt. Jedoch sprechen angesichts der akuten Art dieses Modells, diese Studien die altersbedingte Fortschreiten der motorischen Defizite nicht. Mehrere Studien haben Ganganalyse bei gealterten Mäusen mit Neurodegenerative Veränderungen, zum Beispiel13,14,15, betont die Relevanz des Verständnisses der Progression der Erkrankung mit zunehmendem Alter durchgeführt. .

Neben motorischen Defizite Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen oft haben Schwierigkeiten mit Schwerpunkt auf die Prüfungsaufgaben und prominente kognitive Beeinträchtigungen, insbesondere mit zunehmendem Alter zeigen. Solch ein Phänotyp beeinflussen das Ergebnis von Tests der motorischen Verhalten. Eines der am häufigsten verwendeten Tests zu prüfen, motorische Defizite, die Rotarod Test16, hängt nämlich, Wahrnehmung, Aufmerksamkeit und Stress17,18. Während die Bereitschaft, sich auf ein motorisiertes Laufband gehen auch von diesen Faktoren abhängt, die aufgezeichneten Auslesen läuft, die zeichnet sich mehr standardisiert und weit weniger durch veränderte Wahrnehmung beeinflusst. Auswirkungen von Stress und Aufmerksamkeit möglicherweise in bestimmten Parametern, wie Swing/Haltung Zeit für Stress und SL für Aufmerksamkeit19,20, aber nicht im laufenden Gesamtergebnis sichtbar.

Des kinematischen Gangart Analyseansatzes weiter bietet den Vorteil, dass Optionen zum Anpassen der Herausforderung für Nager-Modelle. Das Laufband mit einstellbarer Winkel und die Geschwindigkeit ermöglicht es wenige Geschwindigkeiten von 0,1 - 99,9 cm/s, so dass Nagetiere mit schweren Beeinträchtigungen zu Fuß noch mit langsamer Geschwindigkeit ausgeführt werden können (~ 10 cm/s). Nicht beeinträchtigte Tiere auf schnelleres laufen Geschwindigkeiten gemessen werden (30 - 40 cm/s). Die Beobachtung der unabhängig davon, ob die getesteten Tiere mit einer bestimmten Geschwindigkeit ausführen können liefert ein Ergebnis von selbst. Darüber hinaus kann der Nager zusätzlich eine Steigung oder unten einen Rückgang durch das Laufband in einem gewünschten Winkel mit Hilfe eines goniometers kippen oder durch Anhängen einen gewichteten Schlitten an Maus oder Ratte Hinterbeine laufen angefochten werden.

Neben zahlreichen Studien der einzelnen Proteine, die bei Patienten mutiert sind, ist eine aktuelle Sensibilisierung der Verbindungen zwischen defekten Endozytose Prozess- und Neurodegeneration13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Maus-Modelle mit verringerte Niveaus des Endophilin-A (nunmehr Endophilin), ein wichtiger Akteur in beiden Clathrin-vermittelte Endozytose13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 und Clathrin-unabhängige Endozytose34, erwiesen sich als Neurodegeneration und altersabhängigen Beeinträchtigungen im motorischen Aktivität13,21zeigen. Drei Gene kodieren die Familie von Proteinen, Endophilin: Endophilin 1, Endophilin 2, und 3 Endophilin. Vor allem der Phänotyp infolge Erschöpfung der Endophilin Proteine variiert stark abhängig von der Anzahl der fehlenden Endophilin Gene13,21. Während triple Knock Out (KO) aller Endophilin Gene tödlich nur wenige Stunden nach der Geburt und Mäuse ohne beide Endophilin 1 und 2 nicht gedeihen und innerhalb von 3 Wochen nach der Geburt sterben ist, zeigt einzelne KO für eines der drei Endophilins keine offensichtlichen Phänotyp für getestet Bedingungen-21. Andere Endophilin mutierte Genotypen zeigen geringere Lebensdauer und motorische Beeinträchtigungen mit zunehmendem Alter13zu entwickeln. Z. B. Endophilin 1KO 2HT 3KO Mäuse Anzeige zu Fuß Veränderungen und feinmotorische Koordinationsprobleme (wie durch kinematische Ganganalyse und Rotarod getestet) bereits nach 3 Monaten des Alters, während ihren wurfgeschwistern zeigen Endophilin 1KO 2WT 3KO Tiere eine signifikante Rückgang der motorischen Koordination nur auf 15 Monate alter13. Aufgrund der großen Vielfalt der Phänotypen in diesen Modellen ist es notwendig zu erkennen und anwenden ein Tests, das eine Vielzahl von Herausforderungen, die das Tier Motor und Kognition Fähigkeiten sowie dem Alter entsprechend integrieren können. Hier zeigen wir die experimentellen Verfahren, die auf die kinematische Ganganalyse zur Bewertung der Entstehung und Progression von motorischen Beeinträchtigungen in einem Mausmodell, die Neurodegenerative Veränderungen (z. B. Endophilin Mutanten) zeigt. Dazu gehören die Messung gangartparameter bei verschiedenen Alters und unterschiedlicher Schweregrade der Fortbewegung Beeinträchtigungen.

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Protocol

Alle Tierversuche hier berichtet werden durchgeführt nach den europäischen Richtlinien für den Tierschutz (2010/63/EU) mit Genehmigung der Niedersächsisches Landesamt Für Verbraucherschutz Und Lebensmittelsicherheit (LAVES), Nummer 14 / 1701.

1. Design der Studie

  1. Berücksichtigen Sie Tierverhalten Arbeit erfordert eine sorgfältige Planung, die folgenden Parameter beim Entwerfen des Experiments.
    1. Anzahl der Tiere pro Gruppe benötigt.
      1. Verwenden Sie eine statistische-Software (z. B. PASS, EDA oder GPower), um die erforderliche Gruppengröße berechnen.
        Hinweis: Die Größe der Gruppe hängt die Variation zwischen Tieren und dem Schweregrad des Phänotyps. Für die kinematische Ganganalyse ist die Anzahl der Mäuse in der Regel 10-20 pro Gruppe.
    2. Geschlecht der Versuchstiere.
      1. Betrachten Sie die Wirkung von Östrogen auf das Experiment, abhängig von dem Tier Sorte.
        Hinweis: Viele Verhalten Studien konzentrieren sich auf Männer um den Einfluss von Östrogen auf das Experiment zu vermeiden. Diese Einflüsse sind mehr oder weniger stark abhängig von der Sorte Tier Hintergrund.
      2. Wenn beide Geschlechter verwendet werden, für Sex Einfluss testen Sie und bewerten Sie die beiden Geschlechter unabhängig, wenn nötig.
    3. Alter der Versuchstiere.
      1. Erwachsene Tiere (2 Monate alt, oder älter) zu verwenden, wenn nur einmalige Punkt benötigt wird.
      2. Wählen Sie mehrere Zeitpunkte, wenn Änderung im motorischen Verhalten mit zunehmendem Alter untersucht werden soll. Die früheste möglichen Zeitpunkt beträgt 1 Monat, nach Mäusen von der Mutter entwöhnt werden. Testen Sie die Tiere in regelmäßigen Abständen, z.B. alle 1, 2 oder 3 Monate.
  2. Gelten Sie für die Zulassung durch die lokalen Behörden, Tierverhalten Tests durchzuführen.
  3. Machen Sie Pläne für die Beschaffung von den Versuchstieren.
    1. Machen Sie einen Zuchtplan oder kontaktieren Sie einen Tieren Distributor in einer fristgerechten Weise zu, damit genug Versuchstiere am Tag zur Verfügung stehen, wenn die Experimente starten.
    2. Lassen Sie die Tiere eine Woche lang zu gewöhnen, wenn sie während der Experimente in einem neuen Raum/Rahmen gehalten werden.

2. Videoaufzeichnung

Hinweis: Um die Nutzung der kinematischen Ganganalyse zu veranschaulichen, hier eine handelsübliche imaging-System mit seinen begleitenden Bildgebung und Analysesoftware (siehe die Tabelle der Materialien) dienen.

  1. Starten Sie den Computer und die Software Imager.
  2. Der Gesundheitszustand und das Wohlbefinden jedes einzelnen Tieres durch beobachten es in seinem Hause Käfig, und wiegen es auf ein ausgewogenes Verhältnis zu bestimmen.
  3. Bei Bedarf gelten Sie sanft rote Fingerfarben für das Tier Pfoten mit einem Pinsel. Lassen Sie die Farbe für ~ 5 min in einem freien sauberen Käfig trocknen.
    Hinweis: Vermeiden Sie, das Tier Bauch malen, wie die Farbe verwendet wird, um den Kontrast zwischen den Pfoten und Körper zu verbessern. Es ist sinnvoll, schwarze Finger malen praktisch für Korrekturen haben. Dieser Schritt ist erforderlich für Tiere mit braunem Fell, oder im Fall der Pfoten haben zur Identifikation tätowiert worden. Gewählt, die Pfoten eines Tieres zu malen, wenn alle Tiere in der gleichen Gruppe und Kontrollgruppe als auch lackiert werden.
  4. Stellen Sie die Geschwindigkeit des Laufbandes auf der rechten Oberseite des Geräts; Wenn mehr als eine Laufgeschwindigkeit angewendet wird, zuerst die langsamste Geschwindigkeit.
  5. Legen Sie das Tier in der Prüfkammer (vermeiden Sie spannen die Rute oder Pfoten beim Schließen der Kammers). Decken Sie die Kammer mit einem dunklen Tuch ab und lassen Sie jedes Tier für 1-2 min einstellen.
  6. Schalten Sie das Licht in der Prüfkammer durch Drehen des Laufband Licht Drehschalters in die Position "on". Drehen Sie den Drehschalter "Laufband" auf "Vorwärts", um das Laufband zu starten, klicken Sie auf die Schaltfläche "Datensatz" in der Imager-Software.
    Hinweis: Während das Laufband läuft, es ist wichtig, die Tierleistung sorgfältig und kontinuierlich zu beobachten: das Laufband sofort stoppen, wenn das Tier mit dem Laufband Geschwindigkeit mithalten kann, oder zeigt sekundäre Symptome nichtverwandten zur Fortbewegung (z.B. epileptische Anfälle). Prüfbedingungen müssen neu justiert werden.
  7. Wenn das Tier läuft stabil (keine schnelle Fluchten, Seiten, vorne oder hinten), Aufnahme für mindestens 5 s vor das Laufband anhalten. Stoppen Sie die Aufnahme, indem Sie auf "stop" auf der Imager-Software, und drehen Sie den Drehschalter Laufband wieder in die Position "off".
    Hinweis: Zur Vermeidung von instabilen Betrieb der Tiere kann es hilfreich, sie für einige Sekunden laufen lassen, oder damit sie sich in die andere Richtung laufen (durch Drehen des Laufband-Drehschalters auf "reverse" anstelle von "Forward") sein.
  8. Klicken Sie auf "Bearbeiten" in der Imager-Software, um ein Menü zu öffnen, in dem der Start- und der Endpunkt der video-Sektion (zu Analysezwecken verwendet werden) eingestellt werden können. Um dies zu tun, verwenden Sie den Schieberegler an der Unterseite des Bildschirms durch das Video zu navigieren.
  9. Um den aktuellen Zeitpunkt als Start- oder Endpunkt auszuwählen, klicken Sie auf "von frame #" und "an" beziehungsweise. Stellen Sie sicher, dass der Abschnitt enthält mindestens 7 Schritte/Paw (14 Stufen insgesamt) des Tieres läuft stabil mit einer konstanten Geschwindigkeit.
  10. Geben Sie die Kennzeichnung von Tieren, Geburtsdatum, Gewicht und Geschlecht. Speichern Sie die Daten auf eine gewünschte Stelle auf dem Computer oder Server. Klicken Sie auf "Kamera" Recording Interface zurückzukehren.
  11. Wenn mehrere Laufgeschwindigkeiten werden aufgezeichnet müssen, wiederholen Sie die Schritte 2,6-2.10 mit den gewünschten Fahrgeschwindigkeiten. Vor der Aufnahme des nächsten Videos, stellen Sie sicher, dass die rote Farbe auf der Pfote, andernfalls wiederholen Sie Schritt 2.3 noch vorhanden ist.
  12. Lassen Sie nach der Aufnahme das Tier in seiner Heimat Käfig. Nach dem Entfernen eines Tieres, reinigen Sie den Laufband Gürtel gründlich mit Wasser und Seife gefolgt von Desinfektionsmittel für die nächste Versuchstier vorzubereiten.

3. video-Verarbeitung

  1. Starten Sie die Analysesoftware und klicken Sie auf "wählen Sie studieren Ordner" den Ordner mit den aufgezeichneten Videos auswählen.
  2. Wählen Sie ein Video oder mehrere Videos, die nacheinander bearbeitet werden können, und klicken Sie auf "go".
  3. Verwenden Sie die Funktion "Neuzeichnen" um den Bereich auszuwählen, wo die Maus läuft; Dieser Abschnitt sollte nur die Maus und weißem Hintergrund enthalten.
  4. Wenn die Funktion "reverse" Laufband vorher verwendet wurde, wählen Sie "überprüfen, ob das Thema Nase auf der rechten Seite >>>" um das Video zu spiegeln, da die Software nur Tiere laufen auf der linken Seite analysieren soll. Klicken Sie auf "akzeptieren", um fortzufahren.
  5. Verwenden Sie die Funktion "Aktualisieren" zu sehen die Standardmaske und paw Print, die die Software erkennt.
    Hinweis: Das originale-Video wird auf der linken Seite angezeigt, und ein schwarz / weißes Bild von den vorgeschlagenen pfotenabdrücken ist auf der rechten Seite.
  6. Geben Sie Werte in den Feldern "Länge" und "Breite", die Maske zu ändern, die ausschließt, den roten Bereich um die Schnauze des Tieres für die Analyse; Da die Farbe ähnlich wie die Pfoten ist, führen Maskierung nicht diesem Bereich die Software versehentlich Klassifizierung Bereich Schnauze als eine Pfote.
  7. Passen Sie die Schieberegler "Filter Rauschen" und "filter Fell und dunkle Flecken", die schwarzen und weißen Pfote drucken zu optimieren. Stellen Sie den Schieberegler "filter Rauschen", ~ 800-950 für schwarze Tiere und ~ 700-800 für braune oder weiße Tiere, abhängig von der genauen Fellfarbe des Tieres. Wählen Sie "ok", wenn die Einstellungen zufriedenstellend sind.
    Hinweis: Der Schieberegler "filter Fell und dunkle Flecken" richtet sich an wie "rot" die Pfote ist. Für lackierte Pfoten, der Wert ist in der Regel rund 100-120, und für unlackierte Pfoten ist der beste Wert um 50-100. Diese Einstellungen hängen von der Farbschattierungen von Fell und Pfoten, und für jedes Tier optimiert werden müssen. Die schwarzen und weißen Pfotenabdruck sollten klare Darstellungen von den Pfoten mit wie wenig Hintergrundgeräusche wie möglich haben.
  8. Wählen Sie ein oder mehrere Videos, die die erste Anpassung übergeben (beschriftet mit "@@" vor dem video) und wählen Sie die "gehe" Funktion um die Analyse dieser Videos zu starten.
    Hinweis: Die Analyse dauert ca. 2-5 min pro Video. Es ist möglich, die Analyse von mehreren Videos über Nacht laufen, da dieser Schritt keine Eingabe von der Experimentator erfordert.
  9. Wählen Sie eine Video aus analysierte (beschriftet mit "@@@") und klicken Sie auf "go". Beachten Sie, dass die Pfote-Bereich (in cm2) in Kontakt mit der Band im Laufe der Zeit (Gangart Dynamik) für jede separate Pfote jetzt gesehen werden kann. Um das original-Video und die berechnete Pfotenabdruck für einen ausgewählten Bereich zu vergleichen, verwenden Sie die Funktion "video abspielen".
  10. Verwenden Sie die folgenden Tools (3), um kleine Fehler der Software zu korrigieren.
    1. Verwenden Sie die "richtige" Option, um ein falsches Signal, z. B. wenn die Software ein Signal aufzeichnet, obwohl die entsprechende Pfote nicht in Kontakt mit dem Gürtel zu löschen. Klicken Sie einmal, um in dem betreffenden Gebiet zu vergrößern, und markieren Sie den linken Rand des Objekts, mit dem zweiten Klick entfernen und den rechten Rand mit einem dritten Klick.
    2. Die Option "verbinden", um zwei Signale, z.B., wenn kein Signal für ein paar Frames aufgezeichnet wird, obwohl die Pfote in Kontakt mit dem Gürtel ist zu kombinieren. Klicken Sie einmal, um zu zoomen Sie in den entsprechenden Bereich und doppelklicken in der Mitte der beiden Objekte zu kombinieren.
    3. Verwenden Sie die Option "Löschen", um Zeitpunkten aus der Analyse vollständig zu entfernen. Verwenden Sie diese Option nur, wenn der Fehler nicht behoben werden kann, mit dem "richtigen" oder "connect"-Funktion, z. B., wenn ein Signal von der linken Vorderbein Pfote versehentlich für den linken hinteren Gliedmaßen Pfote aufgezeichnet wird. Klicken Sie einmal, um in dem betreffenden Gebiet zu vergrößern, und markieren Sie den linken Rand des Bereichs, mit dem zweiten Klick entfernen und den rechten Rand mit einem dritten Klick.
      Hinweis: Die Werkzeuge können nur verwendet werden, um kleine Fehler zu korrigieren. systematischer Fehler (z. B., wenn das Signal von einer Pfote extrem schwach war) nicht korrigiert werden: das Video von der Analyse ausgeschlossen werden sollten und die Aufzeichnung des jeweiligen Tieres wiederholt, wenn möglich. Beachten Sie, dass die Option "video abspielen" nach der "richtigen" nicht mehr zur Verfügung steht, "verbinden" oder die Option "Löschen" verwendet wurde, und klicken auf die Schaltfläche "Rückgängig" setzt alle 3 Bearbeitungs-Tools.
  11. Wählen Sie "als nächstes Leib" gehen durch die 4 Glieder; Wenn nach der letzten Pfote "nächste Glied" geklickt wird, wird die Software schließt die Analyse und zeigt die Ergebnisse für dieses Tier auf 4 Bildschirme.

4. die Ganganalyse

  1. Wenn alle Videos von einem Experiment analysiert werden, wählen Sie alle Videos und klicken Sie auf "neu zu organisieren, Ergebnisse", die Ergebnisse (eine Liste der Parameter in Tabellenkalkulationsdateien) zu exportieren.
  2. Öffnen Sie die Datei mit der Endung "Reorganized_stride_info" und Hinzufügen von Informationen, die in dieser Tabelle nicht enthalten ist: Gruppieren von Informationen (z. B. Genotyp, Behandlung), Alter und die Messungen der Tier Länge und Breite, die in einem anderen gespeichert sind Tabellenkalkulationsdatei mit der Endung "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info".
  3. Die gangartparameter Tier Breite oder Länge zu normalisieren, soweit erforderlich, z. B. SL Tier Länge und SW auf tierische Breite.
  4. Sortieren Sie die Ergebnisse nach Gruppe, Alter und Laufgeschwindigkeit: all diese Bedingungen unabhängig voneinander zu analysieren.
    Hinweis: Verschiedene Altersgruppen oder Laufgeschwindigkeiten innerhalb derselben Gruppe nicht kumulierbar.
  5. Berechnen Sie den Durchschnitt (Mittelwert) Werte, die Standardabweichung und den Standardfehler des Mittelwerts für jeden Parameter für alle experimentellen Bedingungen.
  6. Statistische Auswertung nach den Versuchsplan durchzuführen, verwenden Sie z. B. eine 2-tailed t-Test, Mutant/behandelt Tier zu einem Wild-Typ (WT) vergleichen / Kontrolle oder ANOVA, mehrere unabhängige Gruppen zu vergleichen.
  7. Blick auf allen gemessenen Parameter: Es ist hilfreich, plot-jeder Parameter, um die Ergebnisse besser zu visualisieren. Überprüfen Sie statistische Unterschiede in einem bestimmten Parameter vorhanden sind, ob andere abhängige Parameter entsprechend ändern.
    Hinweis: zum Beispiel, wenn die SL in einer bestimmten Testgruppe deutlich verringert wird, auch dadurch wird eine höhere Schrittfrequenz (da die Laufgeschwindigkeit der gleiche ist) und eine erhöhte SW (Aufrechterhaltung der Stabilität der Körperhaltung) führen kann.
  8. Wählen Sie Parameter, die für ein Modell am relevantesten sind, und/oder sind vergleichbar mit Beobachtungen bei der menschlichen Krankheit. Für eine Präsentation erstellen repräsentative Videos für jede Gruppe und ergänzt sie durch Diagramme, die Anzeige für die relevanten Parameter, da feine Gangart Veränderungen oft nicht klar von den Videos sind.

5. Fehlerbehebung

Hinweis: Manche Tiere, vor allem Mausmodelle mit einer Angst-Phänotyp, möglicherweise Schwierigkeiten, selbst eine einfache Aufgabe wie laufen auf einem Laufband durchzuführen. Im folgenden sind die Schritte, die können man auf ein niedrigeres Niveau der Angst und laufen zu fördern.

  1. Gewöhnung und positiven Durchsetzung.
    1. 2-3 Tage vor dem ersten Test platzieren Sie den Mauszeiger in der Prüfkammer, bedecken Sie es mit einem dunklen Tuch und lassen Sie das Licht ausgeschaltet. Lassen Sie die Maus auf die neue Umgebung für ~ 5 min. Add Chow oder Schokolade/Nuss-Butter (z.B. Nutella) in der Prüfkammer anpassen, so dass eine positive Assoziation gebildet werden kann.
  2. Negativen Durchsetzung durch Luft-Züge/hinten-Grenze.
    1. Mäuse mögen keine Luftstöße oder eine Bewegung hinter sich und läuft weg von der Störung. Zum laufen motivieren, verwenden Sie milde Luftstöße oder rhythmische Bewegung der flexiblen Leiste, die die hintere Grenze der Prüfkammer, Förderung die Maus in Richtung der vordere Teil der Prüfkammer bildet.
  3. Langsam beginnen.
    1. Beim schnellen Laufgeschwindigkeiten testen, starten Sie das Laufband mit einer geringeren Geschwindigkeit und dann steigern Sie langsam die Laufband Geschwindigkeit in Richtung der gewünschten Prüfung Zustand.
  4. Minimieren Sie die freie Bewegung.
    1. Der Test kammerlänge ist durch zwei verstellbare Balken in der Vorder- und Rückseite begrenzt. Wenn ein Versuchstier mit der Laufgeschwindigkeit hält, aber nicht kontinuierlich läuft, begrenzen Sie die kammerlänge um stetige laufen zur Folge haben.
  5. Wenn die oben genannten Messungen nicht erfolgreich sind, notieren Sie am nächsten Tag ausgeführt. Lehnt das Tier immer noch nach der Prüfung an drei Tagen laufen, nehmen Sie dies als die Feststellung auf und schließen Sie aus, dass das Tier weiter testen.
    Hinweis: Die Ergebnisse der Ganganalyse abhängig von qualitativ hochwertigen video-Aufzeichnung. Es gibt keinen Grund, Videos während der Analyse auszuschließen, wenn die Videos sorgfältig aufgezeichnet wurden. Wenn die Videoqualität nicht ausreicht, wird es offensichtlich geworden während Schritt 3.6 Wenn die Parameter für die Erstellung von digitalen Paw Print gesetzt werden. Wenn andere Körperteile mit Ausnahme der Pfoten und Schnauze rot angezeigt wird (z. B. durch das fehlende Fell rund um die Genitalien oder Finger malen Einsprengsel auf dem Bauch), die Qualität sinkt deutlich. Die Anpassungen im Schritt 3.6 erlauben nur kleine Probleme zu korrigieren, und wenn dies das Video für eine akzeptable Signal-/Rauschverhältnis vorlegen kann, muss das Video aus der Analyse ausgeschlossen werden, und Aufnahme muss wiederholt werden. Daher empfiehlt es sich, Videos zu analysieren, bald nachdem Aufnahmen durchgeführt werden.

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Representative Results

Um die Nutzung der kinematischen Ganganalyse zu veranschaulichen, haben wir durchgeführt Ganganalyse auf WT C57BL/6J Mäuse mit zunehmendem Alter, sowie mehrere Endophilin mutierten Zeilen, mit im Handel erhältlichen Instrumente und Software (entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien). In diesem Setup zeichnet eine Hochgeschwindigkeitskamera unter einem transparenten Laufband laufen einer Maus (Abbildung 1A). Die Software erkennt dann den Kontrast zwischen den roten gefärbten Pfoten und weißem oder schwarzem Fell. Da unsere Versuchstiere dunklen braunen Fellfarbe hatten, haben wir die Pfoten aller Fächer mit rote Fingerfarben bemalt. Wir haben Versuchstiere bei verschiedenen Laufgeschwindigkeiten getestet: gehen (10 cm/s), laufen (20 cm/s) und schnell laufende (30 cm/s). Die Kontaktfläche und Mal waren die Pfoten auf dem Laufband und in der Luft gemessen. Aus diesen Informationen wurden die Parameter, die Gangart Rhythmus (z. B. Schaukel/Haltung Zeit, Bremsen/Antrieb) oder Körperhaltung (z. B. Pfote Winkel, SW) rekapitulieren berechnet (Abbildung 1 b).

Wir haben Ganganalyse als Teil einer Reihe von mehreren motorischen Verhalten Tests durchgeführt. Wir beurteilen Griffkraft (GS), Hind Glied umklammert (HLC), Gang- und beschleunigten Rotarod Leistung (ARR). Motor Verhalten ist, zwar nicht wie von Vorerfahrungen und experimenteller Untersuchungen als betroffen ist z. B. Wahrnehmung, es immer noch wichtig, dass jedes Tier die gleiche Batterie der Tests in der gleichen Reihenfolge und im gleichen Alter zu unterziehen. Die Reihenfolge sollte von niedriger bis hoher Schwierigkeitsgrad für das Tier zu minimieren Sie Einflüsse aus früheren Experimenten auf den aktuellen Test gehen.

Wir Endophilin durch Mutation entstehende Variationen für diese Studie seit, je nachdem, wie viele der drei Endophilin Allele fehlen ausgewählt haben, der daraus resultierenden Phänotyp schwankt zwischen keine Phänotyp in der einzigen KOs und einen milden Neurodegenerative Phänotyp in jungen Endophilin 1KO-2HT-3KO Mäuse, die mit dem Altern schreitet voran. Aus diesem Grund präsentieren diese tierischen Linien eine angemessene Modell um subtile Veränderungen zu untersuchen, die nur als Tiere Alter entwickeln. Angesichts der Tatsache, dass die meisten Endophilin Mutanten eine reduzierte Lebensdauer zeigen, haben wir das motorische Verhalten des Endophilin Mutanten im Laufe von 18 Monaten geprüft (der 18-Monats-Zeit war seit sogar die Mäuse in der Endophilin 1KO 2HT 3KO Linie, die die stärkste zeigt ausgewählt Phänotyp, haben keine Lähmung). Die Ganganalyse erfolgte zu acht Zeitpunkten über einen Zeitraum von 18 Monaten (Abbildung 1). Im Alter von 18 Monaten wurden die Tiere eingeschläfert und für Biochemische und/oder histologische Analyse erhalten.

Maus-Kolonie-Wartung:

Endophilin 1, 2 und 3 Allele heterozygot und homozygot-Mäuse wurden ursprünglich in Milosevic Et al.berichtet. 21 C57BL/6J Mäuse wurden neben stellt Mäuse als Kontrollen in der gesamten verwendet. Mäuse wurden in offenen Käfigen mit Ad Libitum Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser in Gruppen von maximal 5 Tiere auf einem 12-h-Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Nur männliche Mäuse wurden in dieser Studie verwendet, um die Auswirkungen der Zyklus-abhängigen Schwankungen bei Frauen ausschließen.

Genotypisierung von Endophilin A1, A2 und A3-Maus-Modellen:

Genotypisierung von Endophilin mutierten Mäusen wurde durch Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Amplifikation mit genomischer DNA extrahiert vom Schweif oder Ohr Schläge durchgeführt. PCRs für drei Endophilin-A-Gene wurden mit entsprechenden Primern durchgeführt: Endophilin-A1: forward Primer 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' und reverse-Primer 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3 "für WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3" für KO; Endophilin-A2: forward Primer 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3 "für WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3 "für KO und reverse Primer 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3" für WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3 "für KO; Endophilin-A3: forward Primer 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' und reverse-Primer 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3 "für WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3" für KO. Die daraus resultierende PCR-Produkte wurden auf einem 1 % Agarosegel, wodurch unverwechselbare Band Größen für WT und KO Allele laufen: Endophilin-A1 WT ~ 384 Bit/s, KO ~ 950 bps; Endophilin-A2 WT ~ 1.280 bps, KO ~ 1.000 Bit/s; Endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bps. PCR-Produkte mit WT und KO Bands zeigen eine heterozygote (HT) Tier.

Ergebnisse:

Zur Charakterisierung von Gang und Körperhaltung bei WT-Mäusen mit zunehmendem Alter haben wir kinematische Ganganalyse bei diesen Tieren (Abbildung 2; durchgeführt. Film 1). Während einige Parameter, z. B. SW (Durchschnittlicher Abstand zwischen Vorder und Hinterbeine normiert auf tierische Breite; siehe auch Tabelle 1), in WT Tiere mit zunehmendem Alter unverändert, andere Parameter ändern schrittweise (Abbildung 2A– ( C). zum Beispiel der hinteren Gliedmaßen Doppelständer (Zeit relativ Haltung Duration, die beide Hinterbeine gleichzeitig Bodenkontakt haben) steigt von 38 % auf 55 % ab 1 Monat bis zu 18 Monaten (Abb. 2 b). Dieser Parameter ist oft verbunden mit Haltung Instabilität35. Darüber hinaus steigt Extremität laden (maximale Änderungsrate des Bereichs Pfote in der Bruch-Phase) von 38 cm2/s auf 59 cm2/s ab 1 Monat bis 18 Monate (Abbildung 2). Schnelles Abbremsen kann als Indikator für die reduzierte Muskelkraft interpretiert werden. Die gesamte laufenden Fähigkeit ist nicht im WT Tiere betroffen (94 % sind mit 30 cm/s 18 Monate, Abbildung 3Aausführen). Neben der Charakterisierung von Gangart und Körperhaltung Parameter, die bleiben unberührt, oder mit zunehmendem Alter in WT Mäuse schrittweise zu ändern, haben wir dokumentiert, dass die kinematische Ganganalyse mit VPI eine geeignete Methode ist, um die altersbedingte leichten Veränderungen in studieren Gang und Haltung.

Während die gesamte laufenden Fähigkeit nicht in WT Tiere betroffen ist, zeigen mehrere Endophilin mutierte Linien veränderte Fähigkeit, gehen oder laufen auf dem motorisiertes Laufband (Abbildung 3A), wie in Murdoch Et Al. berichtet 13 auf die kleineren DataSet. Insbesondere während 1 Monat alt alle Endophilin 1KO 2HT 3KO Mäuse Alle 30 cm/s ausführen können, im Alter von 18 Monaten 81 % gleiche Tiere sind nicht in der Lage zu laufen (Abb. 3A, beachten Sie, dass größere Kohorten als die bisher in 13berichtet analysiert wurden). Interessanterweise sind die Endophilin-Mutanten, die weniger Endophilin Allele (d. h. Endophilin 1KO-2HT-3WT) fehlt ebenfalls betroffen, aber zu einem geringeren Grad (Abb. 3A).

Obwohl Endophilin 1KO 2HT 3KO Mutanten schweren motorische Beeinträchtigungen mit fortschreitendem Alter13zeigen, werden mehrere gangartparameter nicht im Vergleich zur WT-Kontrolle, auch im Alter von 18 Monaten geändert. Zum Beispiel bleibt Schritt Winkel Variabilität (die Standardabweichung der Schrittwinkel) unverändert (Abb. 3 b). Vor allem viele andere Parameter für Beispiel treiben Zeit (Prozentsatz der Haltung Zeit, dass die Pfoten in der Antriebs-Phase), unterscheiden sich nicht im Alter von 1 Monat, aber nach und nach mit dem Alter schlimmer geworden (Abbildung 3; siehe auch Movie 2). Dies zeigt, dass sowohl altersabhängig Parameter sowie die neurodegenerativen Mutant-spezifische Variablen mit einem kinematischen Gang-Analyse-Ansatz untersucht werden können.

Figure 1
Abbildung 1: Ventralen Flugzeug bildgebenden Aufbau und Prinzip. (A) Foto und schematische Zeichnung eines Gang-Analyse-Setup. (B) Analyse Software Prinzip: von der aufgezeichneten Unterseite einer Maus auf einem transparenten Laufband, berechnet die Software die digitale Pfotenabdrücke. Ihre Dynamik während des Betriebs wird gemessen, wie Flächengröße im Laufe der Zeit Pfote, und dies dient als Grundlage zur Berechnung Rhythmus der Gangart und Körperhaltung Parameter. (C) zeitlicher Verlauf des Experiments Gangart Analyse auf Endophilin Mutanten durchgeführt. Die Fortbewegung und die Gangart wurden mit 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 und 18 Monaten beurteilt. Bilder zeigen die Endophilin 1KO 2HT 3KO Maus mit 2, 12 und 18 Monaten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Gang-Analyse in Wildtyp Mäusen mit zunehmendem Alter. Die Fortbewegung und die Gangart im WT (C57BL/6J) Mäuse wurden mit 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 und 18 Monaten beurteilt. (A) die Haltung Breite normiert auf tierische Breite des WT Tiere ändert sich nicht mit zunehmendem Alter. (B) steigt mit dem Alter bei WT Tieren der hinteren Gliedmaßen Doppelständer. Die Grafik zeigt den Prozentsatz der Zeit Haltung, die beide Hinterbeine gleichzeitig auf dem Boden stehen. Eine Erhöhung dieses Parameters spiegelt Gangart Instabilität. (C) steigt mit dem Alter bei WT Tieren die Extremität laden (die maximale Änderungsrate des Bereichs Pfote in der Bruch-Phase). Eine schnellere Verzögerung möglicherweise ein Indikator für die reduzierte Muskelkraft. Alle Graphen darstellen Mittelwert ± SEM; p -Werte wurden berechnet, aus 2-tailed t-tests im Vergleich zu den 1 - Monate alten WT und als dargestellt * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Gang-Analyse in Endophilin Mutanten mit zunehmendem Alter. (A) die Laufgeschwindigkeit des Endophilin Mutanten 1, 12 und 18 Monate, gerechnet ab einer erweiterten Dataset im Vergleich zu Murdoch Et al. Spiegeln Sie 13 bar Farben den Prozentsatz der Tiere in der Lage, bei 30 (dunkelblau), 20 (blau) oder 10 cm/s (hellblau) auf dem motorisiertes Laufband laufen, oder verweigern, die auf das Setup (grau). Während alle getestete Tieren 1 Monat bei 30 m/s ausgeführt werden können, entwickeln die Endophilin Mutanten Defizite ausgeführt, während sie altern. (B–C) Der Schritt Winkel Variabilität und treiben im WT (schwarz), Endophilin 1KO-2WT-3WT (geschönten), Endophilin 1KO-2HT-3WT (dunkelblau) und Endophilin 1KO 2HT 3KO (braun) Mäuse. Die Schritt Winkel Variabilität zeigt keinen Unterschied in alternden WT Tiere oder zwischen WT und Endophilin Mutanten. Das treiben mal (als Prozentsatz der Haltung) ist nicht wesentlich verändert zwischen Endophilin Mutanten und WT 1 Monat, aber in den Endophilin-Mutanten als die Mäuse im Alter abnimmt. Alle Diagramme stellen den Mittelwert ± SEM; p -Werte wurden berechnet, aus 2-tailed t-testet gegen WT Alter abgestimmt und werden als dargestellt * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Movie 1
Film 1. Gang-Analyse in Wildtyp (C57BL/6J) Maus 3 (links) und 18 Monate alt (rechts). Das originale-Video (oben) wird zu einem "digitalen Paw Print" Video (unten) übersetzt. Die Videogeschwindigkeit hat 5 Mal gebremst worden, damit Details besser geschätzt werden können. Zeitpunkt der 18-monatigen, beachten Sie das Zögern der rechten Hinterpfote (rot in der digitalen Pfotenabdruck) ~ 2 s, und von der rechten Vorderpfote (blau in der digitalen Pfotenabdruck) bei ~ 4 s. Die Videogeschwindigkeit hat sich um den Faktor 10 verlangsamt. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

Movie 2
Film 2. Gang-Analyse in Endophilin 1KO-2WT-3WT (Kontrolle; Links) im Vergleich zu Endophilin 1KO 2HT 3KO (rechts) Mäuse im Alter von 18 Monaten. Die Videogeschwindigkeit hat sich verlangsamt worden um den Faktor 5 so Details besser geschätzt werden können. Die Endophilin 1KO 2HT 3KO Maus zeigt Gang Veränderungen, die als weniger sichtbar sind stabil laufen des Tieres. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)

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Discussion

Die motorische Koordination zu studieren, ist ein sinnvoller Ansatz in der Charakterisierung der Modelle von neurodegenerativen Erkrankungen, vor allem für Krankheiten wie PD in denen motorische Koordination stark betroffen ist. Mit Hilfe eines kinematischen Gangart Analyse funktionelle Assays identifizieren wir subtile Veränderungen in den Gang der Tiere bei Beginn der Fortbewegung Probleme oder Modelle mit schwachen Neurodegeneration und daher relativ bescheidenen Phänotyp. Angesichts der breiten Palette der Phänotypen in verschiedenen Modellen von neurodegenerativen Erkrankungen, die kleinen Gang Anomalien und schweren Bewegung Beeinträchtigungen umfasst, ist diese Methode gut geeignet, um die gangartparameter basierend auf Alter und Bewegungsfähigkeit des Tieres zu beurteilen. Stark beeinträchtigt Tiere können zu Fuß mit niedriger Geschwindigkeit auf ein Flugzeug Laufband, während weniger beeinträchtigt Modelle aufgenommen werden können, läuft bergauf oder bergab mit hoher Geschwindigkeit erfasst werden. Dies kann Gangart Unterschiede zwischen Neurodegenerative Modell und seine Kontrolle stellt zeigen, ohne die Tiere überanstrengen.

Mit diesem Protokoll zeigen wir die Angemessenheit der VPI-Methode, die Entwicklung der motorischen Beeinträchtigungen mit dem Altern bei Mäusen zu überwachen. Test WT Mäuse zu mehreren Zeitpunkten haben Fortschreiten ihres Alters uns erlaubt, altersabhängigen Gangart Anomalien zu identifizieren und zu charakterisieren, wie sie Fortschritte mit dem Altern. Darüber hinaus beim Umgang mit Mausmodellen für Neurodegeneration ein Thema, das oft stellt ist, dass aufgrund der Symptome nicht zu motorischen Verhalten (z. B. Angst, Apathie, Lernschwierigkeiten), die Leistungsbereitschaft des Tieres auch eine einfache Motor-Aufgabe wie laufen, wird reduziert. Hier empfehlen wir Methode Änderungen und motivierende Werkzeuge zu ermutigen, auf dem beleuchteten motorisiertes Laufband, das kinematische Ganganalyse erfolgreich anwenden, den alternden Mauslinien mit Neurodegenerative Veränderungen hilfreich sein kann. Darüber hinaus verwenden wir einen einfachen Trick anwenden Fingerfarben auf Pfoten und Show, die es maßgeblich dazu beitragen kann, verbessern Sie die Qualität der aufgezeichneten Daten des Tieres. Gute video-Aufnahmen ist der wichtigste Schritt der Ganganalyse: der Erfolg der Analyse hängt, wie jede automatisierte oder halbautomatische Analyse von Bildern oder Videos, die Qualität der raw-Daten. Low-Quality-Videos nicht in späteren Schritten in der Analyse verbessert werden und müssen in der Regel von der Analyse ausgeschlossen werden.

Während des Studiums systematisch Gang und Haltung des WT und mehrere Endophilin mutierten Zeilen über einen Zeitraum von 18 Monaten haben wir festgestellt, dass sogar WT Mäuse und Mäuse ohne offensichtliche Fortbewegung/laufende Ausgaben (d. h. Endophilin 1KO-WT-WT), zeigen Veränderungen in mehrere Parameter für Gang und Haltung mit zunehmendem Alter in einer progressiven Art und Weise (Abbildung 2 und Abbildung 3A). Interessanterweise haben wir auch festgestellt, dass während Anomalien in mehreren Gangart und Körperhaltung Parameter beobachtet in alternden Endophilin Mutanten entwickeln sich in die gleiche Richtung und Neigung wie der WT/Kontrolltiere, andere nicht (Abbildung 3). Zu guter Letzt ist es wichtig zu beachten, dass selbst wenn alter WT Mäuse und junge Endophilin Mutanten offensichtliche Fortbewegung, Gang und Haltungsschäden beim Auge beobachtet nicht angezeigt werden, Änderungen im selektiven Gangart und Körperhaltung Parameter mit diesem Ansatz erkannt werden können.

Testen der motorischen Verhalten der Maus ist eines der umfassendsten Möglichkeiten veranschaulicht, dass ein Mausmodell Hauptaspekte der conditio humana manifestiert. Infolgedessen wurden eine Reihe von Tests entwickelt, um verschiedene Aspekte der motorischen Verhalten zu beurteilen. Diese Tests umfassen die Freiland-Test (allgemeine lokomotorische Aktivität), Rotarod (motorische Koordination, Ataxie), Stärke (Muskelkraft), Rad (Aktivität), hängende Kabel Test (Ausdauer), Leiter Strahl Aufgabe (feinmotorische Koordination, zu Fuß laufen Halt sensomotorischen Fähigkeiten), Gang-Analyse (Fortbewegung, Koordination der Gliedmaßen), und andere (zusammengefasst in Wahlstein36). Verschiedene Tests haben spezifische vor- und Nachteile und ihre Auslesen beschränken sich meist auf den Aspekt (oder Aspekte) der motor Verhalten, dass sie, um Adresse entworfen wurden. Aus diesem Grund ist es üblich, führen Sie eine Reihe von motorischen Verhalten Tests decken die wichtigsten Aspekte dieser Gegend geworden.

Ganganalyse ist oft nicht in diesen Batterien teilweise aufgrund eines Berichts durch Guillot at al. enthalten 37, gefunden, dass Ganganalyse in Tiermodellen der PD und ALS und zum Teil durch die umständliche Methode und begrenzte Ausgabe nicht motorische Defizite erkennt. Jedoch die Guillot Et Al. Bericht wurde durch Forschung herausgefordert, die mehrere Einschränkungen in der Studie Design38befasst. Die Nützlichkeit dieser Methode bei der Analyse der Gangart in Mausmodellen mit neurodegenerativen Erkrankungen nachgewiesen durch eine Anzahl von den letzten Veröffentlichungen10,11,12,39,40 ,41,42,43, darunter auch unsere Arbeit13.

VPI-Aufnahmen verfügen über mehrere Vorteile gegenüber der konventionellen Methode der Malerei der Pfoten mit Tinte und die Maus auf ein weißes Blatt Papier44laufen zu lassen. Das offensichtlichste ist die Tatsache, dass mit dem motorisiertes Laufband, die Laufgeschwindigkeit des Tieres kontrolliert wird, hat einen starken Einfluss auf mehrere Gang Parameter1. Darüber hinaus werden einige Anomalien Gang nachweisbar nur wenn das Tier ausgeführt wird auf einem anspruchsvollen high-Speed und/oder eine Steigung/zurückgehen, die nicht freiwillig laufen betrachtet werden würde. Darüber hinaus wird die aufwändige Analyse von Hand durch eine halbautomatische, Hochdurchsatz-Analyse ersetzt. Aus diesem Grund kann die Anzahl der Tiere in jeder Gruppe getestet erhöht werden, wodurch wiederum der Effekt durch die Variabilität, die unvermeidlich in lebenden Tieren ist. Zusammenfassend lässt sich sagen empfehlen wir, dass die modifizierte Version des VPI-Ganganalyse in der standard motor Testbatterien zur Analyse der motorischen Beeinträchtigungen der Nager-Modelle der Neurodegeneration und/oder Altern Ergänzung enthalten ist.

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Disclosures

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Acknowledgments

Wir danken Tierpfleger bei der ENI Tierhaus für Hilfe bei der Zucht und Dr. Nuno Raimundo für nützliche Kommentare auf das Manuskript. I.m. wird unterstützt durch Zuschüsse von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) durch den Sonderforschungsbereich SFB-889 (Projekt A8) und SFB-1190 (Projekt P02) und Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. wird durch das Stipendium von der Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und Biophysik, Molekulare Biowissenschaften (GGNB) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

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Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (136), e57752, doi:10.3791/57752 (2018).

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