Summary
In questo studio, dimostriamo l'uso dell'analisi cinematica andatura basato su piano ventrale di imaging per monitorare i cambiamenti sottili nella coordinazione motoria, come pure la neurodegenerazione con l'avanzare dell'età in modelli murini (ad es., endophilin mutante linee del mouse).
Abstract
Test di comportamento motorio sono comunemente usati per determinare la rilevanza funzionale di un modello del roditore e per testare recentemente sviluppato trattamenti in questi animali. In particolare, l'analisi del passo permette riconquista malattia fenotipi rilevanti che sono osservati in pazienti umani, soprattutto nelle malattie di neurodegenerative che influiscono sulla capacità motorie come la malattia di Parkinson (MDP), morbo di Alzheimer (annuncio), amiotrofica sclerosi laterale (ALS) e altri. Nei primi studi lungo questa linea, la misura di parametri di andatura era faticoso e dipendeva da fattori che erano difficili da controllare (ad es., velocità, funzionamento continuo). Lo sviluppo piano ventrale (VPI) di sistemi di imaging reso fattibile per eseguire analisi di andatura a larga scala, rendendo questo metodo uno strumento utile per la valutazione del comportamento del motore nei roditori. Qui, presentiamo un protocollo approfondito di come utilizzare analisi cinematica di andatura per esaminare la progressione di età-dipendente di deficit motori in modelli murini di neurodegenerazione; linee del mouse con diminuzione dei livelli di endophilin, in cui neurodegenerative danno aumenta progressivamente con l'età, sono usate come esempio.
Introduction
Malattie neurodegenerative impongano un onere significativo per i pazienti, le famiglie e la società e diventeranno ancora più preoccupante come aumento della speranza di vita, e la popolazione mondiale continua ad invecchiare. Uno dei sintomi più comuni di malattie neurodegenerative sono problemi di mobilità e dell'equilibrio. Così, la caratterizzazione del comportamento del motore nell'invecchiamento dei mammiferi (ad es., roditore) modelli e/o modelli che mostrano fenotipi neurodegenerative, è un prezioso strumento per dimostrare l'importanza in vivo del modello animale specifico (s), o terapeutico trattamenti che mirano a migliorare i sintomi della malattia. Quasi ogni approccio per il trattamento di malattie neurodegenerative in definitiva richiede il test in un modello animale prima dell'inizio di una sperimentazione clinica nell'uomo. Pertanto, è fondamentale avere test di comportamento affidabile, riproducibile, che può essere utilizzato per quantificare costantemente fenotipi rilevanti per la malattia lungo progressione di età, al fine di garantire che un farmaco candidato, che ha mostrato potenziale in un modello in vitro , può effettivamente migliorare il fenotipo in un animale vivente.
Uno degli aspetti della valutazione del comportamento del motore nei roditori è analisi cinematica di andatura, che può essere eseguita da VPI (anche chiamato piano ventrale Videografia)1,2. Questo metodo stabilito capitalizza la registrazione continua della parte inferiore dei roditori a piedi sulla cima di un tapis roulant motorizzato e trasparente cintura1,2,3,4. Analisi del video feed dati crea "digitale paw prints" di tutte e quattro le membra che dinamicamente e in modo affidabile ricapitolano a piedi modello di roditore, come originariamente descritto da Kale et al. 2 e Amende et al. 3.
Il principio dell'analisi di andatura basata su formazione immagine è di misurare l'area di zampa a contatto con il nastro nel corso del tempo, per ogni zampa individuo. Ogni posizione è rappresentata da un aumento nella zona di zampa (in fase di frenata) e una diminuzione nella zona di zampa (in fase di propulsione). Segue la fase di oscillazione in cui viene rilevato alcun segnale. Swing e atteggiamento insieme formano una falcata. Oltre ai parametri di dinamiche di andatura, parametri di postura possono essere estratta anche dai video registrati. Parametri di esemplari e la loro definizione sono elencati nella tabella 1 e includono larghezza stance (SW; la distanza combinata tra le zampe anteriori o posteriori e l'asse del muso-coda), lunghezza (SL; distanza media tra due passi della zampa stessa) della falcata o paw posizionamento angolo (l'angolo della zampa all'asse del muso-coda). I dati di dinamiche andatura e postura consentono di trarre conclusioni sull'equilibrio degli animali (dai parametri di postura e la loro variabilità diversi passi) e coordinamento (dai parametri di dinamiche di andatura). Altri parametri, come coefficiente di atassia (la variabilità di SL calcolata da [(max. SL−min. SL) / dire SL]), dell'arto ha condiviso la posizione (tempo che entrambi gli arti posteriori sono a contatto con la cinghia), o trascinamento della zampa (superficie totale della zampa alla cintura da completo posizione a zampa Lift-off) può anche essere estratta e sono stati segnalati per essere cambiato in vari neurodegenerative di Sease modelli5,6,7,8 (Vedi tabella 1).
| Parametro | Unità | Definizione |
| tempo di oscillazione | MS | durata di tempo che la zampa non è a contatto con la cinghia |
| tempo di presa di posizione | MS | durata di tempo che la zampa è a contatto con la cinghia |
| freno di % | % del tempo di presa di posizione | percentuale del tempo di presa di posizione che le zampe sono in fase di freno |
| spingere % | % del tempo di presa di posizione | percentuale del tempo di presa di posizione che le zampe sono in fase di propulsione |
| larghezza di presa di posizione | cm | distanza combinato dalle zampe anteriori o posteriori all'asse del muso-coda |
| lunghezza della falcata | cm | distanza media tra due passi della stessa zampa |
| frequenza di falcata | passi/s | numero di passi completi al secondo |
| angolo di posizionamento di zampa | deg | angolo della zampa rispetto all'asse del muso-coda dell'animale |
| coefficiente di atassia | a.u. | Variabilità di SL calcolato da [(max SL-min SL)/media SL] |
| posizione condivisa % | % della posizione | tempo di atteggiamento dell'arto ha condiviso; momento in cui entrambi gli arti posteriori sono a contatto con la cinghia allo stesso tempo |
| trascinamento di zampa | mm2 | superficie totale della zampa alla cintura da completo posizione a zampa a sollevamento |
| caricamento dell'arto | cm2 | MAX dA/dT; tasso massimo di cambiamento di zona zampa nella fase di rottura |
| variabilità di angolo di passaggio | deg | deviazione standard dell'angolo tra hind zampe in funzione della SL e SW |
Tabella 1. Definizione dei parametri di andatura chiave che possono essere testati da formazione immagine piano ventrale.
Valutare il comportamento del motore di modelli di roditori per le malattie neurodegenerative può essere difficile a seconda della gravità del fenotipo di un modello specifico ad una certa età. Diverse malattie, più prominente PD, Visualizza forte comportamento motorio (locomozione) deficit, sia nei pazienti e nei modelli animali. Uno dei quattro sintomi chiavi nel PD è bradicinesia, che progredisce con l'invecchiamento e si manifesta in disabilità grave andatura già nelle prime fasi della PD9. Gli studi del modello PD acuto, roditori trattati con 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), hanno già usato VPI andatura analisi10,11,12. Tuttavia, data la natura acuta di questo modello, questi studi non affrontano la progressione senile di deficit motori. Parecchi studi recenti hanno condotto analisi di andatura in topi invecchiati con cambiamenti neurodegenerative, ad esempio13,14,15, sottolineando l'importanza di comprendere la progressione di malattia con l'avanzare dell'età .
Oltre ai deficit motori, modelli animali di malattie neurodegenerative spesso hanno difficoltà di messa a fuoco sulle mansioni in esame e visualizza prominenti danni conoscitivi, in particolare con l'avanzare dell'età. Tale un fenotipo possa influenzare il risultato delle prove di comportamento motorio. Vale a dire, uno dei test più ampiamente usato per esaminare i deficit del motore, il rotarod test16, si basa sulla cognizione, attenzione e sforzo17,18. Mentre la volontà di camminare su un tapis roulant motorizzato dipende anche da questi fattori, la lettura registrata è in esecuzione, che è una caratteristica più standardizzata e molto meno influenzato dalla cognizione alterata. Effetti dello stress e attenzione potrebbero essere visibili in parametri specifici, come il tempo di oscillazione/atteggiamento per lo stress e SL per attenzione19,20, ma non in generale abilità corrente.
Ulteriormente l'approccio di analisi cinematica andatura offre il vantaggio di avere opzioni per regolare la sfida per i modelli del roditore. Il tapis roulant con inclinazione regolabile e velocità permette a piedi di velocità da 0,1 - 99,9 cm/s, così che i roditori con grave disabilità a piedi possono essere ancora in grado di eseguire a bassa velocità (~ 10 cm/s). Animali con problemi di vista non possono essere misurati a correre più veloci velocità (30 - 40 cm/s). L'osservazione di animali siano o meno in grado di eseguire a una certa velocità fornisce un risultato di per sé. Ulteriormente, il roditore può essere inoltre contestato per eseguire su un piano inclinato o giù un declino, inclinando il tapis roulant per un angolo desiderato con l'aiuto di un goniometro, o collegando una slitta ponderata a zampe di topo o ratto.
Oltre a numerosi studi di singole proteine che sono mutati in pazienti, c'è una recente crescente consapevolezza dei legami tra endocitosi difettoso processo e neurodegenerazione13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Modelli con livelli ridotti di endophilin-A murini (d'ora in poi endophilin), un giocatore chiave in entrambi endocytosis clathrin-mediato13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 ed endocitosi clatrina-indipendente34, sono stati trovati per mostrare neurodegenerazione e danni età-dipendenti in attività locomotrice13,21. Tre geni codificano la famiglia delle proteine endophilin: endophilin 1, endophilin 2 ed endophilin 3. In particolare, il fenotipo risultante dalla deplezione delle proteine endophilin varia notevolmente a seconda del numero dei dispersi endophilin geni13,21. Mentre triple knock-out (KO) di tutti i geni di endophilin è letale solo poche ore dopo la nascita e topi senza entrambi endophilin 1 e 2 non riescono a prosperare e morire entro 3 settimane dopo la nascita, singolo KO per una qualsiasi delle tre endophilins non mostra nessun fenotipo evidente per testate condizioni21. Altri genotipi mutanti endophilin mostrano ridotta durata della vita e sviluppano motorie con l'aumento dell'età13. Ad esempio, endophilin 1KO-2HT-3KO topi esposizione ambulante alterazioni e problemi di coordinazione motoria (come provato da rotarod e analisi cinematica di andatura) già a 3 mesi dell'età, mentre loro littermates, endophilin 1KO-2WT-3KO animali, visualizzare un significativo riduzione nella coordinazione motoria solo a 15 mesi di età13. A causa della grande diversità dei fenotipi in questi modelli, è necessario identificare e applicare un test che può integrare una varietà di sfide corrispondente al motore dell'animale e la capacità di cognizione, come pure l'età. Qui, abbiamo dettaglio le procedure sperimentali che capitalizzare l'analisi cinematica andatura per valutare l'insorgenza e la progressione del motorie in un modello murino che mostra cambiamenti neurodegenerative (cioè, endophilin mutanti). Questo include andatura parametri di misura alle varie età e diversi livelli di gravità della disabilità di locomozione.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali segnalati qui sono condotte secondo le linee guida europee per il benessere animale (2010/63/UE) con approvazione Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), numero di registrazione 14 / 1701.
1. studio di progettazione
- Come il lavoro di comportamento animale richiede un'attenta pianificazione, considerare i seguenti parametri durante la progettazione dell'esperimento.
- Numero di animali necessari per ogni gruppo.
- Utilizzare un software statistico (ad es., PASS, EDA o GPower) per calcolare la dimensione di gruppo richiesto.
Nota: La dimensione del gruppo dipende la variazione tra gli animali e la severità del fenotipo. Per l'analisi cinematica di andatura, il numero dei topi è di solito 10-20 per ogni gruppo.
- Utilizzare un software statistico (ad es., PASS, EDA o GPower) per calcolare la dimensione di gruppo richiesto.
- Sesso degli animali sperimentali.
- Considerare l'effetto dei livelli di estrogeno sull'esperimento, a seconda del ceppo animale.
Nota: Molti studi di comportamento si concentrano su maschi al fine di evitare l'influenza dei livelli di estrogeno sull'esperimento. Queste influenze sono più o meno forte a seconda del ceppo animale. - Se verranno utilizzati entrambi i sessi, test per l'influenza del sesso e valutare i due sessi in modo indipendente quando necessario.
- Considerare l'effetto dei livelli di estrogeno sull'esperimento, a seconda del ceppo animale.
- Età degli animali sperimentali.
- Se solo una tantum punto è necessario, utilizzare animali adulti (2 mesi di età, o più).
- Selezionare parecchi punti di tempo, quando il cambiamento nel comportamento del motore con l'avanzare dell'età è da studiare. Il punto più in anticipo di tempo possibile è di 1 mese, dopo topi sono svezzati dalle loro madri. Testare gli animali a intervalli regolari, ad esempio, ogni 1, 2 o 3 mesi.
- Numero di animali necessari per ogni gruppo.
- Richiedere l'autorizzazione dalle autorità locali per eseguire il test del comportamento animale.
- Fare piani per procurare animali da esperimento.
- Fare un piano di allevamento o contattare un distributore animale in modo tempestivo, in modo che abbastanza animali da esperimento sono disponibili il giorno quando iniziare gli esperimenti.
- Consentire agli animali di habituate per una settimana se sono tenuti in una nuova camera/impostazione durante gli esperimenti.
2. registrazione video
Nota: Per illustrare l'utilizzo dell'analisi di andatura cinematica, qui un sistema di imaging disponibile in commercio con il suo accompagnamento imaging e software di analisi (Vedi Tabella materiali) sono usati.
- Avviare il computer e il software di imager.
- Determinare lo stato di salute e il benessere di ogni animale di osservarlo nella sua gabbia a casa e pesa su una bilancia.
- Quando necessario, applicare delicatamente il dito rosso vernice per le zampe dell'animale con un pennello. Consentire la vernice si asciughi per ~ 5 min in una gabbia pulita ricambio.
Nota: Evitare di pittura dell'addome dell'animale, come la vernice viene utilizzata per migliorare il contrasto tra le zampe e il corpo. È utile avere vernice nera dito comodo per le correzioni. Questo passaggio è necessario per gli animali con pelliccia marrone, o nel caso le zampe sono state tatuate per l'identificazione. Se scelto di dipingere le zampe di un animale, tutti gli animali del gruppo stesso e il gruppo di controllo devono essere disegnate come bene. - Impostare la velocità del tapis roulant sul pannello di destro superiore dell'apparecchio; Se verrà applicato più di una velocità di marcia, prima di avviare con velocità più lenta.
- Metti l'animale nella camera di prova (evitare le code o zampe di bloccaggio quando la chiusura della camera). Coprire la camera con un panno scuro e consentire ogni animale regolare per 1-2 min.
- Accendere la luce nella camera di prova ruotando il commutatore rotativo luce tapis roulant nella posizione "on". Girare l'interruttore rotante di tapis roulant su "Inoltra" per avviare il tapis roulant, quindi fare clic sul pulsante "Registra" nel software imager.
Nota: Mentre il tapis roulant è in esecuzione, è importante osservare le performance animali attentamente e costantemente: arrestare il tapis roulant immediatamente se l'animale non può tenere il passo con la velocità del tapis roulant, o mostra sintomi secondari non correlati alla locomozione (per esempio, crisi epilettiche). Condizioni di prova potrebbero essere necessario essere riadattato. - Quando l'animale funziona stabile (nessun rapido sfugge ai lati, anteriore o posteriore), registrare per almeno 5 s prima di arrestare il tapis roulant. Interrompere la registrazione facendo clic su "stop" sul software imager e ruotare la manopola di tapis roulant nella posizione "off".
Nota: Per evitare il funzionamento instabile degli animali può essere utile per far loro eseguire per alcuni secondi, o per permettere loro di correre nella direzione opposta (ruotando il selettore di tapis roulant per "invertire" invece di "forward"). - Fare clic sul pulsante "elaborazione" nel software imager per aprire un menu in cui può essere impostate all'inizio e il punto finale della sezione video (da utilizzare per l'analisi). Per effettuare questa operazione, utilizzare il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dello schermo per navigare attraverso il video.
- Per selezionare il punto di tempo corrente come il punto iniziale o finale, fare clic su "da n # fotogramma" e "a" rispettivamente. Assicurarsi che la sezione contiene almeno 7 passaggi/zampa (14 passi in totale) dell'animale in esecuzione stabile a una velocità costante.
- Immettere l'identificazione dell'animale, data di nascita, peso e sesso. Salvare i dati su una posizione desiderata sul computer o sul server. Fare clic su "fotocamera" per tornare all'interfaccia di registrazione.
- Se più velocità in esecuzione devono essere registrate, ripetere i passaggi da 2.6-2.10 con la velocità desiderata. Prima di registrare il video successivo, assicurarsi che la vernice rossa è ancora presente sulla zampa, altrimenti ripetere il punto 2.3.
- Dopo la registrazione, rilasciare l'animale alla sua gabbia a casa. Dopo la rimozione di un animale, pulire il nastro accuratamente con acqua e sapone, seguito da disinfettante per prepararla per il prossimo animale sperimentale.
3. video Processing
- Avviare il software di analisi e fare clic su "Seleziona cartella di studio" per selezionare la cartella con i video registrati.
- Selezionare un video, o diversi video che possa essere trattati consecutivamente e clicca su "Vai".
- Utilizzare la funzione di "ridisegnare" per selezionare l'area in cui è in esecuzione il mouse; Questa sezione dovrebbe contenere solo il mouse e sfondo bianco.
- Se in precedenza è stata utilizzata la funzione "reverse" tapis roulant, scegliere "verifica se il naso del soggetto è alla vostra destra >>>" a specchio il video dato che il software è progettato per analizzare solo gli animali in esecuzione a sinistra. Fare clic su "Accetto" per procedere.
- Utilizzare la funzione "refresh" per vedere la maschera predefinita e stampa che rileva il software della zampa.
Nota: Il video originale viene visualizzato sulla sinistra, e un'immagine in bianco e nero delle stampe della zampa proposto è sulla destra. - Immettere i valori nelle caselle "lunghezza" e "larghezza" per modificare la maschera che esclude la zona rossa intorno al muso dell'animale per analisi; come il colore è simile per le zampe, non mascherare quella zona ha potuto provocare il software accidentalmente classificare la zona del muso come una zampa.
- Regolare i cursori "filtro rumore" e "filtro pelliccia e macchie scure" per ottimizzare la stampa bianco e nero della zampa. Impostare il dispositivo di scorrimento "filtro rumore" a ~ 800-950 per animali neri e a ~ 700-800 animali marrone o bianco, a seconda del colore esatto pelliccia dell'animale. Selezionare "ok" quando le impostazioni sono soddisfacenti.
Nota: Il dispositivo di scorrimento "filtro pelliccia e macchie scure" dipende su come "rossa" la zampa è. Per le zampe verniciate, il valore è di solito circa 100-120 e per le zampe non verniciate il valore migliore è circa 50-100. Queste impostazioni dipendono le sfumature di colore della pelliccia e zampe e devono essere ottimizzate per ogni animale. La stampa della zampa del bianco e nero dovrebbe avere chiare rappresentazioni delle zampe con poco rumore di fondo possibile. - Selezionare uno o diversi video che passato il primo adeguamento (etichettato con "@ @" prima il nome del video) e selezionare la funzione "vanno" per avviare l'analisi di questi video.
Nota: L'analisi prende 2-5 minuti per ogni video. È possibile eseguire l'analisi di diversi video durante la notte, dal momento che questo passaggio non richiede alcun input da sperimentatore. - Selezionare un video analizzato (etichettato con "@ @ @") e clicca su "Vai". Si noti che l'area di zampa (in cm2) a contatto con la cintura nel corso del tempo (andatura dinamica) per ogni zampa separata può ora essere visto. Per confrontare il video originale e la stampa per un'area selezionata della zampa calcolato, utilizzare la funzione "play video".
- Utilizzare i seguenti strumenti (tre) per correggere piccoli errori commessi dal software.
- Utilizzare l'opzione "corretta" per eliminare un segnale sbagliato, per esempio, quando il software registra un segnale anche se la zampa corrispondente non è a contatto con la cinghia. Fare clic una volta per ingrandire l'area pertinente e segna il bordo sinistro dell'oggetto da rimuovere con il secondo clic e il bordo destro con il terzo clic.
- Utilizzare l'opzione "Connetti" per combinare due segnali, ad esempio, quando nessun segnale viene registrato per alcuni fotogrammi, anche se la zampa è a contatto con la cinghia. Fare clic una volta per ingrandire l'area pertinente e fare doppio clic al centro i due oggetti per combinare.
- Utilizzare l'opzione "Elimina" per rimuovere i punti di tempo dall'analisi completamente. Utilizzare questa opzione solo se l'errore non può essere risolto con la "corretta" o "collegare" funzione, ad esempio, quando un segnale dalla zampa zampa anteriore sinistra è accidentalmente registrato per la zampa sinistra dell'arto. Fare clic una volta per ingrandire l'area pertinente e segna il bordo sinistro dell'area da rimuovere con il secondo clic e il bordo destro con il terzo clic.
Nota: Gli strumenti possono essere utilizzati solo per correggere piccoli errori; guasti sistematici (ad esempio, se il segnale da una zampa era estremamente debole) non possono essere corretti: il video dovrebbe essere esclusi dall'analisi e la registrazione dell'animale rispettiva ripetuta, quando possibile. Nota che l'opzione "Riproduci video" non è più disponibile dopo la "corretta", "collegamento" o "Elimina" opzione è stato utilizzato, e facendo clic sul pulsante "Annulla" verrà reimpostato tutti i 3 strumenti di editing.
- Selezionare "arto avanti" per procedere attraverso i 4 membra; Quando "arto successivo" viene selezionato dopo l'ultima zampa, il software viene completata l'analisi e Mostra i risultati per questo animale su 4 schermi.
4. analisi del passo
- Quando vengono analizzati tutti i video da un esperimento, selezionare tutti i video e fare clic su "ri-organizzare i risultati" per esportare i risultati (un elenco di parametri nei file di foglio di calcolo).
- Aprire il file con il finale "reorganized_stride_info" e aggiungere informazioni che non sono incluso in questo foglio di calcolo: gruppo di informazioni (ad es., genotipo, trattamento), l'età e le misure di larghezza e lunghezza degli animali che vengono salvate in un altro file di foglio di calcolo con il finale "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info."
- Normalizzare i parametri di andatura animale larghezza o lunghezza, ove necessario, ad esempio, SL alla lunghezza degli animali e SW alla larghezza degli animali.
- Ordinare i risultati di gruppo, età e velocità di esecuzione: analizzare tutte queste condizioni in modo indipendente.
Nota: Diverse età o velocità di corsa non può essere combinati all'interno di uno stesso gruppo. - Calcolare i valori di media (media), deviazione standard ed errore standard della media per ogni parametro per tutte le condizioni sperimentali.
- Effettuare analisi statistiche, secondo il disegno sperimentale, ad esempio, utilizzare una coda 2 t-test per confrontare animale mutante/trattati una wild-type (WT) / controllo o ANOVA per confrontare diversi gruppi indipendenti.
- Sguardo a tutti i parametri misurati: è utile tracciare ogni parametro per visualizzare meglio i risultati. Se ci sono differenze statistiche in un dato parametro, verifica se altri parametri dipendenti modificare corrispondentemente.
Nota: ad esempio, se la SL è diminuita significativamente in un determinato gruppo di prova, questo causerà una maggiore frequenza di falcata (poiché la velocità di esecuzione è lo stesso) e può provocare un aumento SW (al fine di mantenere la postura stabilità). - Selezionare i parametri che sono più rilevanti per un modello, e/o sono paragonabili alle osservazioni nella malattia umana. Per una presentazione, creare video rappresentante per ciascun gruppo e li integrano di grafici che mostrano la lettura per i parametri rilevanti, poiché i cambiamenti di andatura sottile spesso non sono evidenti dai video.
5. risoluzione dei problemi
Nota: Alcuni animali, soprattutto i modelli di mouse con un fenotipo di ansia, possono avere difficoltà a eseguire anche un compito semplice come correre su un tapis roulant. Di seguito sono passaggi che possono essere adottate per i livelli più bassi di ansia e incoraggiano la corsa.
- L'assuefazione e l'esecuzione positiva.
- A 2-3 giorni prima della prima prova, posizionare il mouse nella camera di prova, coprire con un panno scuro e lasciare la luce spenta. Lasciare che il mouse regolare al nuovo ambiente per un minimo di 5 ~ Aggiungi chow o burro di cioccolato/dado (ad es., Nutella) per la camera di prova in modo che può formare un'associazione positiva.
- Negativo l'applicazione di limite di aria soffi/posteriore.
- Topi non piace sbuffi d'aria o un movimento dietro di loro e verranno eseguito dal disturbo. Per motivare in esecuzione, utilizzare sbuffi d'aria mite, o movimento ritmico della barra flessibile che forma il limite posteriore della camera di prova, per incoraggiare il mouse a correre verso la parte anteriore della camera di prova.
- Avvio lento.
- Durante il test di velocità in esecuzione, avviare il tapis roulant a bassa velocità e poi lentamente aumentare la velocità del tapis roulant verso la condizione di test desiderata.
- Ridurre al minimo la libera circolazione.
- La lunghezza di camera di prova è limitata da due barre regolabili nella parte anteriore e posteriore. Se un animale prova tiene il passo con la velocità di esecuzione, ma non viene eseguito costantemente, limitare la lunghezza della camera per provocare il funzionamento più costante.
- Se le suddette misure non sono corretto, è necessario registrare in esecuzione il giorno successivo. Se l'animale si rifiuta ancora di eseguire dopo la prova su tre giorni, registrare questo come l'individuazione ed escludere l'animale da ulteriori test.
Nota: I risultati dell'analisi di andatura dipendono dalla buona qualità registrazione video. Non c'è alcun motivo per escludere video durante l'analisi, se i video sono stati registrati con attenzione. Se la qualità video è insufficiente, diventerà evidente durante il passaggio 3.6 quando vengono impostati i parametri per la creazione della stampa digitale zampa. Se compare in qualsiasi altra parte del corpo tranne le zampe e il muso rossa (per esempio, a causa del pelo manca intorno genitali o gli spruzzi di vernice dito sull'addome), la qualità si riduce notevolmente. Le regolazioni nel passaggio 3.6 permettono di correggere solo piccoli problemi e se questo non può portare il video a un rapporto segnale/rumore accettabile, il video deve essere esclusa dall'analisi e registrazione deve essere ripetuto. Pertanto, si consiglia di analizzare il video subito dopo le registrazioni vengono effettuate.
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Representative Results
Per illustrare l'utilizzo dell'analisi di andatura cinematica, abbiamo effettuato analisi di andatura sui topi WT C57BL/6J con l'avanzare dell'età, come pure parecchie linee mutanti di endophilin, utilizzando software e strumentazione disponibile in commercio (consultare la tabella di di Materiali). In questa configurazione, una telecamera ad alta velocità sotto un tapis roulant trasparente riprende il funzionamento di un mouse (Figura 1A). Il software riconosce quindi il contrasto tra le zampe di colore rosse e la pelliccia bianca o nera. Poiché i nostri animali da esperimento avevano pelliccia marrone scuro colore, abbiamo dipinto le zampe di tutti i soggetti con dito rosso vernice. Abbiamo testato gli animali sperimentali alle diverse velocità di corsa: a piedi (10 cm/s), in esecuzione (20 cm/s) e l'esecuzione veloce (30 cm/s). L'area di contatto e ora che le zampe erano sul tapis roulant e nell'aria sono stati misurati. Da queste informazioni, i parametri che ricapitolano andatura ritmica (per esempio, il tempo di oscillazione/posizione, freno/propulsione) o della postura (ad es., angolo di zampa, SW) sono stati calcolati (Figura 1B).
Abbiamo effettuato l'analisi di andatura come parte di una batteria di diversi test di comportamento motorio. Abbiamo valutato la forza prensile (GS), dell'arto posteriore clasping (HLC), andatura e accelerata rotarod performance (ARR). Mentre il comportamento motorio non è influenzata dalla precedente esperienza e prove sperimentali come, ad esempio, cognizione, è ancora importante che tutti gli animali subiscono la stessa batteria di test nello stesso ordine e alla stessa età. L'ordine dovrebbe andare da bassa ad alta difficoltà per l'animale minimizzare le influenze da esperimenti precedenti il test corrente.
Abbiamo selezionato endophilin mutanti per questo studio dal momento che, a seconda di quanti dei tre alleli endophilin sono mancanti, il fenotipo risultante varia da nessun fenotipo nella singola KOs ad un fenotipo lieve neurodegenerative in endophilin giovane 1KO-2HT-3KO topi che progredisce con l'invecchiamento. Per questo motivo, queste linee animali presentano un modello adeguato per studiare i cambiamenti sottili che si sviluppano solo come età di animali. Dato che la maggior parte endophilin mutanti mostrano una ridotta durata della vita, abbiamo esaminato il comportamento del motore di endophilin mutanti nel corso di 18 mesi (il punto di tempo di 18 mesi è stato selezionato dal anche i topi nella linea 1KO-2HT-3KO endophilin che consente di visualizzare il più forte fenotipo, non hanno paralisi). L'analisi di andatura è stato effettuato a otto punti di tempo su un periodo di 18 mesi (Figura 1). A 18 mesi di età, gli animali erano sacrificati e conservati per analisi biochimiche e/o istologici.
Manutenzione di Colonia del mouse:
Topi omozigoti ed eterozigoti per gli alleli di endophilin 1, 2 e 3 sono stati originariamente riferiti a Milosevic et al. 21 topi C57BL/6J sono stati utilizzati oltre ai topi littermate come controlli in tutto. Topi sono stati alloggiati in gabbie aperte con ad libitum accesso a cibo e acqua in gruppi di un massimo di 5 animali, su un ciclo luce/buio di 12 h. Solo topi maschi sono stati utilizzati in questo studio per escludere gli effetti delle variazioni del ciclo-dipendente nelle femmine.
Genotipizzazione di Endophilin A1, A2 e A3 modelli di Mouse:
Genotipizzazione di topi mutanti endophilin è stata eseguita dall'amplificazione di reazione a catena (PCR) della polimerasi usando il DNA genomic estratto dalla coda o orecchio pugni. PCRs per tre endophilin-A geni sono stati effettuati con i rispettivi primer: endophilin-A1: forward primer 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' e reverse Primer 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' per WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' per KO; endophilin-A2: avanti Primer 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' per WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' per KO e reverse Primer 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' per WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' per KO; endophilin-A3: avanti primer 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' e reverse Primer 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' per WT, 5-'ATTC-CAACGGACAGACGAGAG-3' per KO. I prodotti PCR ottenuti sono stati analizzati su un gel di agarosio all'1%, producendo dimensioni caratteristica banda per alleli WT e KO: endophilin-A1 WT ~ 384 bps, KO ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1.280 bps, KO ~ 1.000 bps; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bps. I prodotti di PCR con bande sia WT e KO indicano un animale (HT) eterozigotico.
Risultati:
Per caratterizzare l'andatura e postura in topi WT con l'avanzare dell'età, abbiamo effettuato analisi cinematica di andatura in questi animali (Figura 2; Movie 1). Mentre alcuni parametri, ad esempio SW (media distanza tra ribalta o arti posteriori normalizzati alla larghezza animale; cfr. anche tabella 1), rimangono invariati in animali WT con l'avanzare dell'età, altri parametri cambiano progressivamente (Figura 2A– C). ad esempio, il supporto doppio dell'arto (tempo rispetto alla durata di atteggiamento che entrambi gli arti posteriori sono a contatto con il suolo allo stesso tempo) aumenta dal 38% al 55% da 1 mese a 18 mesi (Figura 2B). Questo parametro è spesso associato con postura instabilità35. Inoltre, caricamento dell'arto (tasso massimo di cambiamento della zona zampa nella fase di rottura) aumenta da 38 cm2/s a 59cm2/s da 1 mese a 18 mesi (Figura 2). Decelerazione rapida può essere interpretato come un indicatore per forza muscolare ridotta. La capacità complessiva di esecuzione non è interessata negli animali WT (94% sono in grado di eseguire a 30 cm/s a 18 mesi, Figura 3A). Oltre a caratterizzare i parametri di andatura e postura che rimanere inalterati, o cambiano progressivamente con l'avanzare dell'età nei topi WT, abbiamo documentato che l'analisi cinematica andatura utilizzando VPI è un metodo adatto per studiare le alterazioni lievi età-correlate nel andatura e postura.
Mentre la capacità complessiva di esecuzione non è interessata negli animali WT, diverse linee mutanti di endophilin mostrano alterata capacità di camminare o correre sul tapis roulant motorizzato (Figura 3A), come riportato in Murdoch et al. 13 sul set di dati più piccolo. In particolare, mentre a 1 mese di età tutti i endophilin 1KO-2HT-3KO topi sono tutti in grado di eseguire a 30 cm/s, a 18 mesi di età 81% degli animali stessi non sono in grado di eseguire (Figura 3A, nota che i più grandi gruppi sono stati analizzati rispetto a quelli precedentemente segnalati in 13). Interessante, i mutanti di endophilin che mancano meno endophilin alleli (cioè, endophilin 1KO-2HT-3WT) sono anche colpiti, ma a un grado inferiore (Figura 3A).
Anche se endophilin 1KO-2HT-3KO mutanti mostrano gravi motorie con l'avanzare dell'età13, diversi parametri di andatura non sono cambiati rispetto al controllo WT, anche all'età di 18 mesi. Per esempio, passo angolo variabilità (la deviazione standard dell'angolo di passo) rimane invariato (Figura 3B). In particolare, molti altri parametri, per esempio spingere tempo (la percentuale di tempo di presa di posizione che le zampe sono in fase di propulsione), non sono diversi a 1 mese di età, ma progressivamente peggiorare con l'invecchiamento (Figura 3; vedere anche film 2). Ciò illustra che sia parametri età-dipendente, nonché le variabili specifiche del mutante di neurodegenerative possono essere studiate con un approccio di analisi cinematica di andatura.
Figura 1. Installazione di imaging piano ventrale e principio. (A) foto e disegno schematico di una configurazione di analisi di andatura. (B) principio di software di analisi: da registrato sotto un mouse in esecuzione su un tapis roulant trasparente, il software calcola la zampa digitale stampa. Loro dinamica durante l'esecuzione viene misurata come zampa dimensione area nel corso del tempo, e questo viene utilizzato come base per calcolare il ritmo di andatura e postura parametri. (C) corso di tempo dell'esperimento andatura analisi eseguita in mutanti di endophilin. La locomozione e l'andatura sono stati valutati a 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 mesi. Le immagini mostrano il mouse 1KO-2HT-3KO endophilin a 2, 12 e 18 mesi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. L'andatura analisi nei topi wild-type con l'avanzare dell'età. La locomozione e l'andatura nei topi WT (C57BL/6J) sono stati valutati a 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 mesi. Larghezza (A) la posizione normalizzata alla larghezza degli animali degli animali WT non cambia con l'avanzare dell'età. (B) il doppio supporto dell'arto aumenta con l'età negli animali WT. Il grafico mostra la percentuale di tempo di presa di posizione che entrambi gli arti posteriori sono a terra allo stesso tempo. Un aumento di questo parametro riflette l'instabilità di andatura. (C) l'arto (il tasso massimo di cambiamento della zona zampa nella fase di rottura) di carico aumenta con l'età negli animali WT. Più rapida decelerazione potrebbe essere un indicatore per forza muscolare ridotta. Tutti i grafici rappresentano il valore medio ± SEM; valori di p sono stati calcolati da 2-tailed t-test contro il WT 1 - mese-vecchio e sono rappresentati come * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. L'andatura analisi nei mutanti di endophilin con l'avanzare dell'età. (A) la velocità di marcia di mutanti di endophilin alle 1, 12 e 18 mesi, calcolati da un dataset espanso rispetto a Murdoch et al. 13 bar colori riflettono la percentuale di animali in grado di eseguire al 30 (blu scuro), 20 (blu) o 10 cm/s (blu chiaro) sul tapis roulant motorizzato, oppure rifiutare in esecuzione il programma di installazione (grigio). Mentre tutti gli animali testati possono essere eseguito a 30 m/s a 1 mese, i mutanti di endophilin sviluppano disavanzi che invecchiano. (B–C) Il passo angolo variabilità e spingere ora in (nero), endophilin 1KO-2WT-3WT (turquois), endophilin 1KO-2HT-3WT (blu scuro), topi WT ed endophilin 1KO-2HT-3KO (marrone). La variabilità di angolo di passo presenta alcuna differenza negli animali WT di invecchiamento, o tra mutanti WT ed endophilin. Il tempo di propel (come la percentuale di posizione) non è cambiato significativamente tra mutanti di endophilin e WT a 1 mese, ma diminuisce i mutanti di endophilin come l'età di topi. Tutti i grafici rappresentano il valore medio ± SEM; valori di p sono stati calcolati da 2-tailed t-test contro i pari età WT e sono rappresentati come * p < 0,05, * * p < 0.01, * * * p < 0,001 Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Film 1. L'andatura analisi nel selvaggio-tipo di mouse (C57BL/6J) a 3 (a sinistra) e 18 mesi di età (a destra). Il video originale (in alto) viene convertito in un video di "digital paw print" (in basso). La velocità dei video è stata rallentata 5 volte in modo che dettagli possono essere meglio apprezzate. Presso il punto di tempo di 18 mesi, si noti l'esitazione della zampa destra posteriore (rosso nella zampa digitale stampa) a ~ 2 s e della zampa anteriore destra (blu nella zampa digitale stampa) a ~ 4 s. La velocità dei video è stata rallentata da un fattore di 10. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
Film 2. Gait analysis in endophilin 1KO-2WT-3WT (controllo; sinistra), contro i endophilin 1KO-2HT-3KO topi (a destra) a 18 mesi dell'età. La velocità dei video è stata rallentata da un fattore di 5 modo dettagli possono essere meglio apprezzate. Il endophilin 1KO-2HT-3KO mouse Visualizza le alterazioni di andatura che possono essere visto come il meno stabile in esecuzione dell'animale. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
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Discussion
Studiare la coordinazione motoria è un approccio utile nella caratterizzazione di modelli di malattie neurodegenerative, soprattutto per le malattie come PD in cui coordinazione motoria è gravemente colpiti. Con l'aiuto di un test funzionale di analisi cinematica andatura, possiamo identificare sottili cambiamenti nell'andatura degli animali al momento della comparsa di problemi di locomozione, o nei modelli con debole neurodegenerazione e quindi relativamente modesto fenotipo. Data l'ampia gamma di fenotipi in vari modelli di malattie neurodegenerative che comprende anomalie piccola andatura e movimento gravi menomazioni, questo metodo è adatto per valutare parametri di andatura basati sull'età dell'animale e la capacità di muoversi. Animali gravemente alterati possono essere registrati a piedi a bassa velocità su un tapis roulant aereo, mentre modelli meno alterate possono essere registrati in esecuzione in salita o in discesa ad alta velocità. Questo può rivelare andatura differenze tra il modello di neurodegenerative e relativo controllo littermate senza forzarne gli animali.
Con questo protocollo, dimostriamo l'adeguatezza del metodo VPI per monitorare lo sviluppo del motorie con invecchiamento nei topi. Test topi WT a più punti di tempo come loro età avanza ci hanno permesso di identificare anomalie dell'andatura età-dipendente e caratterizzare come progrediscono con l'invecchiamento. Inoltre, quando si gestiscono modelli murini di neurodegenerazione, un problema che si presenta spesso è che a causa dei sintomi non legati al comportamento del motore (ad es., ansia, apatia, difficoltà di apprendimento), la volontà dell'animale di eseguire anche un semplice attività come la corsa a motore, è ridotta. Qui, vi suggeriamo di modifiche di metodo e strumenti motivazionali per incoraggiare in esecuzione sul tapis roulant motorizzato illuminate che possono essere utili per applicare con successo analisi cinematica di andatura a linee del mouse con cambiamenti neurodegenerative di invecchiamento. Inoltre, utilizziamo un semplice trucco dell'applicazione vernice dito a zampe dell'animale e dimostrare che può significativamente contribuire a migliorare la qualità dei dati registrati. Ottenere buone registrazioni video è la fase più critica dell'analisi di andatura: il successo dell'analisi dipende, come ogni analisi automatizzata o semi-automatica di immagini o video, la qualità dei dati grezzi. Video di bassa qualità non può essere migliorata a passaggi successivi nell'analisi e di solito hanno a essere esclusi dal processo di analisi.
Mentre studia sistematicamente andatura e postura di WT e di diverse linee mutanti di endophilin nell'arco di 18 mesi, abbiamo notato che anche topi WT e topi senza problemi di locomozione/running ovvio (cioè, endophilin 1KO-WT-WT), mostrano le alterazioni in diversi parametri di andatura e postura con l'avanzare dell'età in modo progressivo (Figura 2 e Figura 3A). È interessante notare che, abbiamo anche notato che mentre le anomalie in parecchi parametri di andatura e postura osservati nei mutanti di endophilin di invecchiamento sviluppano nella stessa direzione e pendenza come gli animali WT/controllo, altri non lo fanno (Figura 3). Infine, è importante notare che, anche se invecchiato WT topi e giovani endophilin mutanti non visualizzare qualsiasi locomozione ovvio, andatura e postura difetti quando osservata dall'occhio, cambiamenti nei parametri di andatura e postura selettivi possono essere rilevati con questo approccio.
Prova il comportamento del motore di mouse è uno dei modi più completi per illustrare che un modello del topo si manifesta gli aspetti principali di una condizione umana. Di conseguenza, un numero di test è stato sviluppato per valutare vari aspetti del comportamento del motore. Questi test comprendono la prova di campo aperto (generale attività locomotoria), rotarod (coordinazione motoria, atassia), presa di forza (forza muscolare), in esecuzione di ruota (attività), appeso prova del filo (endurance), fascio scaletta camminare attività (coordinazione motoria, sensorimotoria abilità), andatura analisi (locomozione, coordinamento degli arti) e altri (riassunti in Wahlstein36). I vari test hanno specifici vantaggi e svantaggi e loro letture sono solitamente limitati all'aspetto (o aspetti) del comportamento del motore che sono stati progettati per indirizzo. Per questo motivo, è diventato pratica comune eseguire una batteria di test di comportamento motorio per coprire gli aspetti principali di questa zona.
Analisi del passo spesso non è incluso in queste batterie, in parte a causa di un rapporto da Guillot et al. 37, quello ha trovato che l'analisi di andatura non rileva i deficit del motore nei modelli animali di PD e ALS e in parte a causa del metodo laborioso e potenza limitata. Tuttavia, Guillot et al. rapporto è stato contestato dalla ricerca che affronta diverse limitazioni in studio progettazione38. L'utilità di questo metodo nell'analisi di andatura in modelli murini con neurodegenerazione è stata dimostrata da una serie di recenti pubblicazioni10,11,12,39,40 ,41,42,43, includendo anche il nostro lavoro13.
Registrazioni di VPI sono dotate di diversi vantaggi rispetto al metodo convenzionale di pittura le zampe con inchiostro e lasciare il mouse su un foglio bianco di carta44. Il più evidente è il fatto che con il tapis roulant motorizzato, la velocità di marcia dell'animale è controllata, che ha una forte influenza su diversi parametri di andatura1. Inoltre, alcune anomalie dell'andatura diventano rilevabile solo quando l'animale viene eseguito a una velocità elevata esigente e/o un'inclinazione/declino, che non sarebbe visto in esecuzione volontaria. Inoltre, l'analisi elaborata a mano viene sostituita da un'analisi semi-automatica, ad alta velocità. Per questo motivo, può essere aumentato il numero degli animali testati in ogni gruppo, che a sua volta diminuisce l'effetto causato dalla variabilità che è inevitabile in animali vivi. In sintesi, è consigliabile che la versione modificata dell'analisi di andatura VPI è incluso nelle batterie motore standard di prova per completare l'analisi di motorie nei modelli del roditore di neurodegenerazione e/o invecchiamento.
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Disclosures
Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari.
Acknowledgments
Ringraziamo i guardiani animali presso la struttura animale di ENI per aiuto con l'allevamento e Dr. Nuno Raimundo per commenti utili sul manoscritto. I.M. è supportato dalle sovvenzioni dalla Fondazione di ricerca tedesca (DFG) attraverso il centro di ricerca collaborativa SFB-889 (progetto A8) e SFB-1190 (progetto P02) ed Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.m.r. è supportato dalla compagnia dalla scuola di specializzazione di Gottinga per neuroscienze, biofisica e bioscienze molecolari (GGNB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
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