Summary
Neste estudo, vamos mostrar o uso da análise cinemática da marcha com base no plano ventral da imagem latente para monitorar as mudanças sutis na coordenação motora, bem como a progressão de neurodegeneração com o avançar da idade em modelos do rato (por exemplo, endophilin mutante linhas de rato).
Abstract
Testes de comportamento motor são comumente usados para determinar a relevância funcional de um modelo de roedor e testar recentemente desenvolvido tratamentos nestes animais. Especificamente, a análise de marcha permite doença recaptura fenótipos relevantes que são observados em pacientes humanos, especialmente em doenças neurodegenerativas que afetam as habilidades de motor tais como a doença de Parkinson (PD), a doença de Alzheimer (AD), amiotrófica esclerose lateral (ALS) e outros. Em estudos iniciais ao longo desta linha, a medição de parâmetros da marcha foi trabalhoso e dependida em fatores que foram difíceis de controle (por exemplo, velocidade, running corredor contínuo). O desenvolvimento de sistemas de imagens de avião ventral (VPI) viabilizados para realizar análise de marcha em grande escala, tornando este método uma ferramenta útil para a avaliação do comportamento motor em roedores. Aqui, apresentamos um protocolo detalhado de como usar a análise cinemática da marcha para examinar a progressão de idade-dependente de déficit motor em modelos do rato de neurodegeneração; linhas de rato com diminuição dos níveis de endophilin, em que danos neurodegenerativas progressivamente aumenta com a idade, são usadas como um exemplo.
Introduction
Doenças neurodegenerativas imponham um encargo significativo para a sociedade, os doentes e as famílias e se tornará ainda maior preocupação com o aumento da expectativa de vida, e a população mundial continua a envelhecer. Um dos sintomas mais comuns de doenças neurodegenerativas são problemas de equilíbrio e mobilidade. Assim, a caracterização do comportamento motor no envelhecimento dos mamíferos (por exemplo, roedores) modelos, e/ou modelos mostrando neurodegenerativas fenótipos, é uma ferramenta valiosa para demonstrar a relevância na vivo , o modelo animal específico, ou terapêutica tratamentos que visam melhorar os sintomas da doença. Quase cada abordagem para tratar doenças neurodegenerativas, finalmente, requer testes em um modelo animal antes do início de um ensaio clínico em humanos. Portanto, é crucial ter testes de comportamento confiável e reproduzível que podem ser usados para quantificar consistentemente fenótipos doença relevantes ao longo da progressão da idade, a fim de garantir que uma droga de candidato, que mostrou potencial em um modelo in vitro , pode efetivamente melhora o fenótipo em um animal vivo.
Um dos aspectos da avaliação do comportamento motor em roedores é análise cinemática da marcha, que pode ser executada por VPI (também chamado plano ventral Videografia)1,2. Este método estabelecido capitaliza sobre gravação contínua da parte inferior dos roedores andando em cima de uma esteira motorizada e transparente correia1,2,3,4. Análise do vídeo alimentar dados cria "digital de pata" de todos os quatro membros que dinamicamente e confiantemente recapitular padrão ambulante do roedor, como originalmente descrita por Kale et al 2 e Amende et al 3.
O princípio da análise da marcha com base em imagem é medir a área de pata em contato com a correia de esteira ao longo do tempo, para cada pata individual. Cada postura é representada por um aumento na área de pata (em fase de travagem) e uma diminuição na área da pata (a fase de propulsão). Isto é seguido pela fase de balanço em que nenhum sinal é detectado. Balanço e postura junto formam um tranco. Além de parâmetros de dinâmica de marcha, parâmetros de postura podem também ser extraídos os vídeos gravados. Parâmetros exemplares e sua definição estão listados na tabela 1 e incluem postura largura (SW; a distância combinada as patas dianteiras ou traseiras ao eixo focinho-cauda), comprimento (SL; distância média entre dois avanços da mesma pata) do passo ou pata de colocação ângulo (o ângulo da pata ao eixo focinho-cauda). Os dados de postura e marcha dinâmica permitem tirar conclusões sobre equilíbrio animal (por parâmetros de postura e sua variabilidade ao longo de várias etapas) e coordenação (pelos parâmetros de dinâmica de marcha). Outros parâmetros, tais como coeficiente de ataxia (SL variabilidade calculada por [(max. SL−min. SL) / quero dizer SL]), membro posterior compartilhado postura (tempo que ambos os membros posteriores estão em contacto com o cinto), ou arrastar pata (área total da pata no cinto de postura completo para decolagem de pata) também podem ser extraídos e foram relatados para ser alterada em vários neurodegenerativas di Sease modelos5,6,7,8 (ver tabela 1).
| Parâmetro | Unidade | Definição |
| tempo de balanço | MS | duração de tempo que a pata não está em contacto com o cinto |
| tempo de postura | MS | duração de tempo que a pata está em contato com a correia |
| % de freio | % de tempo de postura | porcentagem de tempo de postura, que as patas estão em fase de freio |
| propel % | % de tempo de postura | porcentagem de tempo de postura, que as patas estão na fase de propulsão |
| largura de postura | cm | distância combinada das patas dianteiras ou traseiras ao eixo focinho-cauda |
| comprimento do passo | cm | distância média entre dois passos a pata mesmo |
| frequência de passo | passos/s | número de passos completos por segundo |
| ângulo de colocação de pata | DEG | ângulo da pata em relação ao eixo de focinho-cauda do animal |
| coeficiente de ataxia | u.a. | Variabilidade de SL calculado por [(max SL-min SL)/média SL] |
| posição compartilhada % | % de postura | tempo de postura de membro posterior compartilhado; vez que ambos os membros posteriores estão em contacto com o cinto, ao mesmo tempo |
| pata de arrastar | mm2 | área total da pata no cinto de postura completo para pata de decolagem |
| carregamento de membro | cm2 | MAX dA/dT; máxima taxa de variação da área de pata na fase de quebra |
| variação do ângulo de passo | DEG | desvio-padrão do ângulo entre o hind patas em função do SL e SW |
Tabela 1. Definição de parâmetros de chave da marcha que pode ser testado por imagem avião ventral.
Avaliar o comportamento motor dos modelos de roedores para doenças neurodegenerativas pode ser desafiador dependendo da gravidade do fenótipo de um modelo específico em uma determinada idade. Várias doenças, mais proeminentemente PD, mostrar forte comportamento motor (locomoção) déficits, tanto em pacientes e em modelos animais. Um dos quatro principais sintomas em PD é bradicinesia, que progride com o envelhecimento e se manifesta em deficiências severas da marcha já em estágios iniciais de PD9. Estudos do modelo PD agudo, roedores tratados com 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), já utilizados de11,de10,para análise de marcha VPI12. No entanto, dada a natureza aguda deste modelo, estes estudos não se dirija a progressão relacionadas com a idade de déficit motor. Vários estudos recentes têm realizado análise de marcha em ratos envelhecidos com alterações neurodegenerativas, por exemplo,13,14,15, enfatizando a importância de compreender a progressão da doença com o avançar da idade .
Além do déficit motor, modelos animais de doenças neurodegenerativas frequentemente têm dificuldades, enfocando as tarefas de exame e mostram deficiências cognitivas proeminentes, em especial com o avançar da idade. Tal um fenótipo pode influenciar o resultado dos testes de comportamento motor. Ou seja, um dos testes mais utilizados para examinar os défices de motor, o teste rotarod16, baseia-se na cognição, atenção e esforço17,18. Enquanto a vontade de andar em uma esteira motorizada também depende desses fatores, a leitura gravada está em execução, que é uma característica mais padronizada e muito menos influenciada pela cognição alterada. Efeitos do estresse e atenção podem ser visíveis em parâmetros específicos, como tempo de balanço/postura para estresse e SL para atenção19,20, mas não na capacidade de execução global.
A abordagem de análise cinemática da marcha ainda oferece a vantagem de ter opções para ajustar o desafio para os modelos de roedores. A esteira com ângulo ajustável e velocidade permite andar a velocidades de 0,1 - 99,9 cm/s, para que os roedores com graves deficiências ambulante podem ainda ser capazes de correr a uma velocidade lenta (~ 10 cm/s). Animais com deficiência não podem ser medidos em correr mais rápido velocidades (30 - 40 cm/s). A observação de ou não os animais testados são capazes de executar em uma certa velocidade proporciona um resultado por si só. Além disso, o roedor pode ser adicionalmente desafiado para executar um plano inclinado, ou para baixo de um declínio, pela inclinação da esteira para um ângulo desejado com o auxílio de um goniômetro, ou anexando um trenó ponderado a mouse ou rato membros posteriores.
Além de numerosos estudos de proteínas simples que são uma mutação em pacientes, há uma crescente conscientização recente das ligações entre defeituoso endocitose processo e neurodegeneração13,21,22, 23,24,25,26,,27,28. Modelos com níveis reduzidos de endophilin-A de rato (doravante endophilin), um jogador-chave em ambos endocitose mediada por Clatrina13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 e independente de Clatrina endocitose34, foram encontrados para mostrar a neurodegeneração e deficiências de idade-dependente na atividade locomotora13,21. Três genes codificam a família de proteínas de endophilin: endophilin 1, endophilin 2 e endophilin 3. Notavelmente, o fenótipo resultante da depleção de proteínas endophilin varia muito consoante o número de desaparecidos endophilin genes13,21. Enquanto triplo nocaute (KO) de todos os endophilin de genes é letal apenas algumas horas após o nascimento e os ratos sem ambos endophilin 1 e 2 não conseguem prosperar e morrem dentro de 3 semanas após o nascimento, KO único para qualquer um dos três endophilins não mostra nenhum fenótipo óbvio para testados condições de21. Outros genótipos mutantes endophilin mostram vida útil reduzida e desenvolvem deficiências motor com o aumento da idade13. Por exemplo, endophilin 1KO-2HT-3KO ratos exposição ambulante alterações e problemas de coordenação motora (como testado pelo rotarod e análise cinemática da marcha) já aos 3 meses de idade, enquanto seus littermates, endophilin 1KO-2WT-3KO animais, exibir um significativo redução da coordenação motora, somente em 15 meses de idade13. Devido a vasta diversidade de fenótipos nestes modelos, é necessário identificar e aplicar um teste que pode integrar uma variedade de desafios correspondente ao motor do animal e cognição habilidades, bem como a idade. Aqui, detalhamos os procedimentos experimentais que capitalizar a análise cinemática da marcha para avaliar o início e a progressão da deficiência motor em um modelo do rato que mostra alterações neurodegenerativas (i.e., endophilin mutantes). Isso inclui a medição de parâmetros da marcha em várias idades e diferentes severidades de deficiências de locomoção.
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Protocol
Todas as experiências com animais aqui relatadas são conduzidas de acordo com as orientações europeias para o bem-estar animal (2010/63/UE) com aprovação o Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (elevam), número de registro 14 / 1701.
1. estudo Design
- Como trabalho de comportamento animal requer um planejamento cuidadoso, considere os seguintes parâmetros ao projetar o experimento.
- Número de animais necessários por grupo.
- Use um software estatístico (por exemplo, de passagem, EDA ou GPower) para calcular o tamanho de grupo necessários.
Nota: O tamanho de grupo varia de acordo com a variação entre os animais e a severidade do fenótipo. Para a análise cinemática da marcha, o número de ratos é normalmente 10-20 por grupo.
- Use um software estatístico (por exemplo, de passagem, EDA ou GPower) para calcular o tamanho de grupo necessários.
- Sexo dos animais experimentais.
- Considere o efeito dos níveis de estrogênio sobre o experimento, dependendo da estirpe animal.
Nota: Muitos estudos de comportamento focar os machos para evitar a influência dos níveis de estrogênio sobre o experimento. Essas influências são mais ou menos fortes, dependendo da estirpe de fundo animal. - Se ambos os sexos serão usados, testar a influência do sexo e avaliar os dois sexos de forma independente, quando necessário.
- Considere o efeito dos níveis de estrogênio sobre o experimento, dependendo da estirpe animal.
- Idade dos animais experimentais.
- Use animais adultos (2 meses de idade, ou mais) se apenas o único ponto é necessária.
- Selecione vários pontos de tempo quando a mudança de comportamento motor com o avançar da idade está a ser estudado. O mais antigo ponto de tempo possível é 1 mês, depois que os ratos são desmamados de suas mães. Teste os animais em intervalos regulares, por exemplo, a cada 1, 2 ou 3 meses.
- Número de animais necessários por grupo.
- Solicitar autorização das autoridades locais para realizar testes de comportamento animal.
- Faça planos para adquirir os animais de teste.
- Fazer um plano de reprodução ou contacte um distribuidor de animais em tempo hábil para que suficiente animais experimentais estão disponíveis no dia quando começaram os experimentos.
- Permitir que os animais possam se habituar durante uma semana, se forem mantidos em uma sala nova/configuração durante os experimentos.
2. vídeo gravação
Nota: Para ilustrar o uso da análise cinemática da marcha, aqui um sistema de imageamento comercialmente disponível com seu acompanhamento de imagem e software de análise (ver a Tabela de materiais) são utilizados.
- Inicie o computador e o software de sistema de imagem.
- Determine o estado de saúde e o bem-estar de cada animal por observá-la em sua gaiola em casa e pesando em um equilíbrio.
- Quando necessário, aplica suavemente a tinta vermelha para as patas do animal com uma escova. Permitir que a tinta secar por ~ 5 min em uma gaiola limpa sobressalente.
Nota: Evite pintar o abdômen do animal, como a tinta é usada para realçar o contraste entre as patas e o corpo. É útil ter a pintura a dedo preto útil para correções. Este passo é necessário para animais com pelo marrom, ou no caso as patas têm sido tatuadas para identificação. Se escolhida para pintar as patas de um animal, todos os animais do mesmo grupo e grupo controle precisam ser pintada também. - Definir a velocidade da esteira no lado superior direito do aparelho; Se mais de uma velocidade de marcha será aplicada, comece com a menor velocidade.
- Colocar o animal na câmara de teste (evitar aperto a cauda ou patas, quando a câmara fechada). Cobrir a câmara com um pano escuro e permitir que cada animal ajustar para 1-2 min.
- Acenda a luz na câmara de teste, rodando o selector de luz de esteira para a posição "on". Gire o botão rotativo de esteira para "encaminhar", para começar a esteira e, em seguida, clique no botão "gravar" no software gerador de imagens.
Nota: Enquanto a esteira está em execução, é importante observar o desempenho animal com cuidado e constantemente: parar a esteira imediatamente se o animal não consegue acompanhar a velocidade da esteira, ou mostra os sintomas secundários não relacionadas a locomoção (por exemplo, ataques epilépticos). Condições de testes podem precisar ser reajustado. - Quando o animal corre de forma estável (não escapa rápida para os lados, de frente ou costas), gravar pelo menos 5 s antes de parar a esteira. Parar de gravar clicando em "parar" do software de sistema de imagem e coloque o selector de esteira volta para a posição "off".
Nota: Para evitar execução instável dos animais pode ser útil para deixá-los correr por alguns segundos, ou para permitir a correr na direção contrária (rodando o selector de esteira para "reverter" em vez de "Avançar"). - Clique no botão "processamento" no software gerador de imagens para abrir um menu em que podem ser definidos o início e o ponto final da seção de vídeo (para ser usado para análise). Para fazer isso, use o controle deslizante na parte inferior da tela para navegar através do vídeo.
- Para selecionar o ponto de tempo atual como o início ou o ponto final, clique em "do frame #" e "para", respectivamente. Certifique-se que a seção contém pelo menos 7 passos/pata (14 passos no total) do animal funcionando de forma estável a uma velocidade constante.
- Digite a identificação dos animais, data de nascimento, peso e sexo. Salve os dados em um local desejado no computador ou no servidor. Clique em "câmera" para retornar à interface de gravação.
- Se múltiplas velocidades de execução precisam ser gravado, repita as etapas de 2,6-2.10 com as velocidades de execução desejadas. Antes de gravar o próximo vídeo, certifique-se de que a tinta vermelha ainda está presente sobre a pata, caso contrário repita a etapa 2.3.
- Depois da gravação, liberar o animal para sua gaiola em casa. Depois de remover um animal, limpe a correia de esteira com água e sabão seguida de desinfectante para prepará-lo para o próximo animal experimental.
3. a transformação
- Inicie o software de análise e clique em "Selecionar pasta de estudo" para selecionar a pasta com os vídeos gravados.
- Selecione um vídeo, ou vários vídeos que podem ser processados consecutivamente e clicam "go".
- Use a função de "redesenho" para selecionar a área onde o mouse está em execução; Esta seção deve conter apenas o mouse e o fundo branco.
- Se a função de "reverso" esteira foi usada anteriormente, selecione "verificar se o nariz do sujeito é a sua direita >>>" para espelhar o vídeo, desde que o software é projetado para analisar apenas animais correndo para a esquerda. Clique em "aceitar" para prosseguir.
- Use a função "refresh" para ver a máscara padrão e pata a impressão que o software detecta.
Nota: O vídeo original é exibido à esquerda, e uma imagem preto e branca da proposta de pata é à direita. - Insira valores nas caixas de "comprimento" e "largura" para alterar a máscara que exclui a área vermelha ao redor do focinho do animal para análise; como a cor é semelhante para as patas, não mascarando naquela área poderia resultar no software acidentalmente classificando a área como uma pata de focinho.
- Ajuste os controles deslizantes "ruído filtro" e "filtrar a pele e manchas escuras" para otimizar a impressão da pata preto e branco. Defina o controle deslizante "filtrar ruído" ~ 800-950 para animais pretos e ~ 700-800 para animais marrons ou brancos, dependendo da cor exata da pele do animal. Selecione "okey" quando as configurações são satisfatórias.
Nota: O controle deslizante "filtrar a pele e manchas escuras" depende em como "vermelha" a pata é. Para patas pintadas, o valor é geralmente ao redor 100-120 e pelas patas não envernizadas o melhor valor é em torno de 50-100. Estas definições dependem os matizes de cor da pele e patas e precisam ser otimizado para cada animal. A cópia da pata preto e branco deve ter representações claras das patas com como pouco ruído de fundo quanto possível. - Selecione um ou vários vídeos que passado o primeiro ajuste (rotulada com "@" antes do nome do vídeo) e selecione a função "ir" para iniciar a análise destes vídeos.
Nota: A análise leva 2-5 min por vídeo. É possível executar a análise de vários vídeos durante a noite, desde que esta etapa exige sem a participação do experimentador. - Selecione um vídeo analisado (rotulada com "@") e clique em "ir". Observe que a área de pata (em cm2) em contacto com o cinto ao longo do tempo (dinâmica de marcha) para cada pata separado agora pode ser vista. Para comparar o vídeo original e a cópia para uma área selecionada da pata calculado, use a função "reproduzir vídeo".
- Use as seguintes ferramentas (3) para corrigir pequenos erros cometidos pelo software.
- Use a opção "correta" para excluir um sinal errado, por exemplo, quando o software grava um sinal, mesmo que a pata correspondente não está em contacto com o cinto. Clique uma vez para ampliar a área relevante e marque a borda esquerda do objeto para remover com o segundo clique e borda direita com o terceiro clique.
- Use a opção "conectar" para combinar dois sinais, por exemplo, quando nenhum sinal é gravado por alguns quadros, mesmo que a pata está em contacto com o cinto. Clique uma vez para ampliar a área relevante e clique duas vezes no meio de dois objetos para combinar.
- Use a opção 'excluir' para remover pontos de tempo de análise completamente. Use esta opção somente se o erro não pode ser corrigido com o "correto" ou "conectar" função, por exemplo, quando um sinal da pata do membro anterior esquerdo acidentalmente é registrado para a pata esquerda membro posterior. Clique uma vez para ampliar a área relevante e marque a borda esquerda da área para remover com o segundo clique e borda direita com o terceiro clique.
Nota: As ferramentas podem ser utilizadas para corrigir pequenos erros; erros sistemáticos (por exemplo, se o sinal de uma pata era extremamente fraco) não podem ser corrigidos: o vídeo deve ser excluído da análise e repete-se, quando possível, a gravação do respectivo animal. Nota que a opção "reproduzir vídeo" não está mais disponível após o "correto", "ligar", ou a opção "excluir" tem sido usado, e clique no botão "desfazer" redefinirá todas as 3 ferramentas de edição.
- Selecione "seguida de um membro" proceder através de 4 membros; Quando "próximo membro" é clicado após a última pata, o software conclui a análise e mostra os resultados para este animal em 4 telas.
4. análise de marcha
- Quando são analisados todos os vídeos de um experimento, selecione todos os vídeos e clique em "re-organizar resultados" para exportar os resultados (uma lista de parâmetros em arquivos de planilha).
- Abra o arquivo com o final "reorganized_stride_info" e adicionar informações que não estão incluídas nesta planilha: informações (por exemplo, genótipo, tratamento), idade e as medições de largura e comprimento de animais que são salvos em outro grupo arquivo de planilha com o final "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info".
- Normalizar os parâmetros da marcha para animal largura ou comprimento, sempre que necessário, por exemplo, SL para animal comprimento e SW para largura do animal.
- Classificar os resultados por grupo, idade e velocidade de corrida: analisar todas essas condições de forma independente.
Nota: As idades diferentes ou velocidades de execução não podem ser combinadas dentro de um mesmo grupo. - Calcule os valores de média (média), desvio padrão e erro padrão da média para cada parâmetro para todas as condições experimentais.
- Realizar análise estatística de acordo com o projeto experimental, por exemplo, usar um-de-cauda-2 t-teste para comparar animal mutante/tratados para um selvagem-tipo (WT) / controle ou ANOVA para comparar vários grupos independentes.
- Olha medido em todos os parâmetros: é útil traçar cada parâmetro para visualizar melhor os resultados. Se existem diferenças estatísticas em um determinado parâmetro, verifique se outros parâmetros dependentes alterar correspondentemente.
Nota: por exemplo, se o SL é significativamente diminuída em um determinado grupo de teste, isto também causará uma maior frequência de passo (pois a velocidade é a mesma) e pode resultar em um aumento SW (a fim de manter a estabilidade da postura). - Selecione os parâmetros que são mais relevantes para um modelo, e/ou são comparáveis às observações da doença humana. Para uma apresentação, criar vídeos representativos para cada grupo e complementá-las por gráficos mostrando a leitura para os parâmetros pertinentes, desde alterações sutis da marcha muitas vezes não são óbvias dos vídeos.
5. resolução de problemas
Nota: Alguns animais, especialmente os modelos de rato com um fenótipo de ansiedade, podem ter dificuldades para realizar até mesmo uma simples tarefa como correr em uma esteira. A seguir estão as etapas que podem ser tomadas para reduzir os níveis de ansiedade e incentivam a execução.
- Habituação e aplicação positiva.
- Em 2-3 dias antes do primeiro teste, posicione o mouse na câmara de teste, cubra-o com um pano escuro e deixar a luz desligada. Deixe o mouse ajustar ao novo ambiente para ~ 5 min Add chow ou manteiga chocolate/porca (por exemplo, Nutella) para a câmara de teste, então pode ser criada uma associação positiva.
- Aplicação da negativa por limite de sopros/parte traseira do ar.
- Ratos não como sopros de ar ou um movimento por trás deles e vão fugir a perturbação. Para motivar a execução, use sopros de ar suave, ou movimento rítmico da barra flexível que forma o limite posterior da câmara de teste, para incentivar o mouse para correr em direção à parte frontal da câmara de teste.
- Comece devagar.
- Ao testar a velocidades de execução rápidas, comece a esteira a uma velocidade inferior e então lentamente aumentar a velocidade da esteira para a condição de teste desejada.
- Minimize a livre circulação.
- O comprimento de câmara de teste é limitado por duas barras ajustáveis na frente e atrás. Se um teste animal mantém-se com a velocidade, mas não é executado continuamente, limite o comprimento da câmara para resultar no funcionamento mais constante.
- Se as medidas acima mencionadas não são bem sucedidas, grave a correr no dia seguinte. Se o animal ainda se recusa a executar após o teste em três dias, gravar isto como o achado e excluir o animal de mais testes.
Nota: Os resultados da análise da marcha dependem de gravação de vídeo de boa qualidade. Não há nenhuma razão para excluir vídeos durante a análise, se os vídeos foram cuidadosamente registrados. Se a qualidade do vídeo é insuficiente, ele se tornará óbvio durante a etapa de 3.6 quando estão sendo definidos os parâmetros para a criação da impressão digital de pata. Se qualquer outra parte do corpo exceto as patas e focinho aparece vermelho (por exemplo, devido a pele falta em torno da genitália ou sprinklings de pintura de dedo no abdômen), a qualidade cai significativamente. Os ajustes na etapa 3.6 permitem corrigir apenas pequenas questões e se isso não pode trazer o vídeo para uma relação sinal/ruído aceitável, o vídeo precisa ser excluídos da análise e gravação precisa ser repetido. Assim, é aconselhável analisar vídeos logo após as gravações são realizadas.
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Representative Results
Para ilustrar o uso da análise cinemática da marcha, efetuamos análise de marcha em camundongos C57BL/6J de WT com o avançar da idade, bem como várias linhas de mutante endophilin, usando a instrumentação disponível comercialmente e software (consulte a tabela de de Materiais). Nesta configuração, uma câmera de alta velocidade sob uma esteira transparente registra o funcionamento de um rato (figura 1A). Em seguida, o software reconhece o contraste entre as patas de cores vermelhas e a pele branca ou preta. Desde que nossos animais experimentais tinham pelo castanho escuro cor, temos pintado as patas de todas as disciplinas com tinta vermelha. Nós testamos animais experimentais em diferentes velocidades de execução: andando (10 cm/s), corrida (20 cm/s) e correndo rápido (30 cm/s). A área de contato e a hora que as patas estavam na esteira e no ar foram medidos. A partir dessas informações, os parâmetros que recapitular o ritmo da marcha (por exemplo, tempo de balanço/postura, freio/propulsão) ou postura (por exemplo, ângulo de pata, SW) foram calculados (figura 1B).
Realizamos a análise de marcha como parte de uma bateria de vários testes de comportamento motor. Avaliamos a força de preensão (GS), membro posterior apertando (HLC), marcha e desempenho acelerado rotarod (ARR). Enquanto o comportamento motor não é tão afetado pela experiência anterior e testes experimentais como, por exemplo, cognição, é ainda importante que todos os animais sofrem a mesma bateria de testes na mesma ordem e com a mesma idade. A ordem de ir de baixa a alta dificuldade para o animal minimizar as influências de experiências anteriores no teste atual.
Nós selecionamos os mutantes endophilin para este estudo, uma vez que, dependendo de quantos dos três alelos endophilin estão faltando, o fenótipo resultante varia de nenhum fenótipo o Kos único para um fenótipo de suave neurodegenerativas no jovem endophilin 1KO-2HT-3KO ratos que progride com o envelhecimento. Por esta razão, estas linhas animais apresentam um modelo adequado para estudar mudanças sutis que se desenvolvem apenas como idade de animais. Dado que a maioria dos mutantes endophilin mostram uma expectativa de vida reduzida, examinamos o comportamento motor de endophilin mutantes ao longo de 18 meses (ponto de tempo de 18 meses foi seleccionado desde mesmo os ratos na linha 1KO-2HT-3KO endophilin que exibe o mais forte fenótipo, não tem paralisia). A análise da marcha foi realizada em oito pontos de tempo ao longo de um período de 18 meses (Figura 1). Aos 18 meses de idade, os animais foram sacrificados e preservados para análise bioquímica e/ou histológica.
Manutenção de colônia de mouse:
Os ratos homozigotos e heterozigotos para os alelos de endophilin 1, 2 e 3 foram originalmente relatados em Milosevic et al. 21 camundongos C57BL/6J foram usados além de ratos littermate como controles ao longo. Os ratos foram alojados em gaiolas abertas com ad libitum acesso à comida e água em grupos de no máximo 5 animais, em um ciclo claro/escuro de 12-h. Só os ratos masculinos foram utilizados neste estudo para excluir os efeitos das variações de ciclo-dependente em mulheres.
Genotipagem de Endophilin A1, A2 e A3 modelos de Mouse:
Genotipagem de ratos mutantes endophilin foi realizada por amplificação de reação em cadeia (PCR) polimerase usando DNA genômico extraído de socos de cauda ou orelha. PCRs para três genes de endophilin-A foram realizados com respectivos primers: endophilin-A1: encaminhar cartilha 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' e reverter as primeiras demão 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' para WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' para KO; endophilin-A2: encaminhar as primeiras demão 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' para WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' para KO e primeiras demão reversa 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' para WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' para KO; endophilin-A3: encaminhar cartilha 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' e reverter as primeiras demão 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' para WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3' para KO. Os produtos resultantes da PCR foram executados em um gel de agarose a 1%, rendendo tamanhos banda distintivo para alelos WT e KO: WT endophilin-A1 ~ 384 bps, KO ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1.280 bps, KO ~ 1.000 bps; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bps. Produtos PCR com bandas tanto WT e KO indicam um animal (HT) heterozigoto.
Resultados:
Para caracterizar a marcha e postura em camundongos WT com o avançar da idade, efetuamos a análise cinemática da marcha nesses animais (Figura 2; Filme 1). Enquanto alguns parâmetros, por exemplo, SW (média distância entre dianteiro ou patas normalizadas para animal largura; ver também a tabela 1), mantêm-se inalteradas em animais WT com o avançar da idade, outros parâmetros mudam progressivamente (Figura 2A– C). por exemplo, o apoio duplo de membro posterior (tempo em relação à duração da postura que ambos os membros posteriores estão em contato com o solo ao mesmo tempo) aumenta 38%-55% de 1 mês a 18 meses (Figura 2B). Este parâmetro é frequentemente associado com instabilidade de postura35. Além disso, carregamento de membro (máxima taxa de variação da área de pata na fase de ruptura) aumenta 38cm2/s-59 cm2/s de 1 mês a 18 meses (Figura 2). Rápida desaceleração pode ser interpretada como um indicador para a força muscular reduzida. A capacidade de execução total não é afetada em animais WT (94% são capazes de executar a 30 cm/s em 18 meses, Figura 3A). Além de caracterizar os parâmetros da marcha e postura que permanecer inalterados, ou mudam progressivamente com o avançar da idade em camundongos WT, nós têm documentado que a análise cinemática da marcha usando VPI é um método adequado para estudar as alterações leves relacionadas com a idade em marcha e postura.
Enquanto a capacidade de execução total não é afectada em animais WT, várias linhas de mutantes endophilin mostram capacidade alterada para caminhar ou correr na esteira motorizada (Figura 3A), conforme relatado em Murdoch et al 13 no conjunto de dados menor. Notavelmente, enquanto em 1 mês de idade todos os mouses de 1KO-2HT-3KO de endophilin são todos capazes de executar a 30 cm/s, aos 18 meses de idade 81% dos mesmos animais não são capazes de executar (Figura 3A, nota que maiores coortes foram analisados do que os relatados anteriormente em 13). Curiosamente, os mutantes endophilin que falta menos de endophilin de alelos (ou seja, endophilin 1KO-2HT-3WT) também são afetados, mas em um grau mais baixo (Figura 3A).
Apesar dos mutantes 1KO-2HT-3KO de endophilin mostram graves deficiências de motor com o avançar da idade13, vários parâmetros de marcha não são alterados em comparação com o controle WT, também na idade de 18 meses. Por exemplo, a variabilidade de ângulo de passo (o desvio padrão do ângulo de passo) permanece inalterado (Figura 3B). Notavelmente, muitos outros parâmetros, por exemplo propelir tempo (a porcentagem de tempo de postura que as patas estão na fase de propulsão), não são diferentes em 1 mês de idade, mas tornam-se progressivamente piores com o envelhecimento (Figura 3; ver também 2 filme). Isto ilustra que os parâmetros de idade-dependente, bem como as variáveis de mutante específico neurodegenerativas podem ser estudadas com uma abordagem de análise cinemática da marcha.
Figura 1. Configuração de imagem avião ventral e princípio. (A) fotografia e desenho esquemático de uma configuração de análise da marcha. (B) princípio do software de análise: pelo lado gravado debaixo de um rato correndo em uma esteira transparente, o software calcula a pegadas digitais. Sua dinâmica durante a execução é medida como pata o tamanho da área ao longo do tempo, e isso é usado como base para calcular o ritmo da marcha e postura de parâmetros. (C) curso a tempo do experimento de análise da marcha realizada na endophilin mutantes. A locomoção e marcha foram avaliados em 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 meses. Imagens mostram o mouse 1KO-2HT-3KO de endophilin 2, 12 e 18 meses. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Marcha de análise em ratos do selvagem-tipo com o avançar da idade. A locomoção e marcha em camundongos WT (C57BL/6J) foram avaliados em 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 e 18 meses. (A), a postura largura normalizada para animal largura de animais WT não muda com o avançar da idade. (B) o suporte duplo do membro posterior aumenta com a idade em animais WT. O gráfico mostra a porcentagem de tempo de postura que ambos os membros posteriores são no chão ao mesmo tempo. Um aumento nesse parâmetro reflete a instabilidade da marcha. (C) o membro carregando (a máxima taxa de variação da área de pata na fase de ruptura) aumenta com a idade em animais WT. Desaceleração mais rápida pode ser um indicador para a força muscular reduzida. Todos os gráficos representam o valor médio ± SEM; p valores foram calculados a partir-de-cauda-2 t-testes contra o WT 1 - mês de idade e são representados como * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Marcha de análise em endophilin mutantes com o avançar da idade. (A) a velocidade de endophilin mutantes em 1, 12 e 18 meses, calculados a partir de um conjunto de dados expandido em comparação com Murdoch et al 13 bar cores refletem a porcentagem de animais capazes de correr em 30 (azul escuro), 20 (azul) ou 10 cm/s (azul claro) na esteira motorizada, ou recusar a correr sobre a instalação (cinza). Enquanto todos os animais testados podem executar a 30 m/s em 1 mês, os mutantes endophilin desenvolvem déficits em execução com a idade. (B–C) A etapa ângulo variabilidade e impulsionar o tempo no WT (preto), endophilin 1KO-2WT-3WT (turquois), endophilin 1KO-2HT-3WT (azul escuro) e endophilin 1KO-2HT-3KO (marrom), os ratos. A variabilidade de ângulo de passo não mostra nenhuma diferença no envelhecimento animais WT, ou entre mutantes WT e endophilin. O tempo de propel (como a percentagem de postura) não é significativamente alterado entre endophilin mutantes e WT em 1 mês, mas diminui nos mutantes endophilin como a idade de ratos. Todos os gráficos representam o valor médio ± SEM; p valores foram calculados a partir-de-cauda-2 t-testes contra WT idade-combinados e são representados como * p < 0.05, * * p < 0,01, * * * p < 0,001 clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Filme de 1. Marcha de análise no selvagem-tipo rato (C57BL/6J) a 3 (esquerda) e 18 meses de idade (à direita). O vídeo original (superior) é traduzido para um vídeo de "impressão digital pata" (parte inferior). A velocidade de vídeo tem sido abrandada por 5 vezes para que detalhes podem ser melhor apreciados. No ponto de tempo de 18 meses, observe a hesitação da pata direita traseira (vermelho na cópia digital da pata) em ~ 2 s e a pata dianteira direita (azul na cópia digital da pata) em ~ 4 s. A velocidade de vídeo tem sido abrandada para baixo por um fator de 10. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
Filme 2. Marcha análise em endophilin 1KO-2WT-3WT (controle; esquerda) contra endophilin 1KO-2HT-3KO (à direita), os ratos com 18 meses de idade. A velocidade de vídeo tem sido abrandada para baixo por um fator de 5 para que detalhes podem ser melhor apreciados. O endophilin 1KO-2HT-3KO mouse exibe alterações de marcha que podem ser vistas como menos estável em execução do animal. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
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Discussion
Estudar a coordenação motora é uma abordagem útil na caracterização de modelos de doenças neurodegenerativas, especialmente para doenças como a PD em que a coordenação motora é severamente afectada. Com a ajuda de um ensaio funcional de análise cinemática da marcha, podemos identificar mudanças sutis na marcha de animais no início dos problemas de locomoção, ou em modelos com neurodegeneração fraca e, portanto, relativamente modesto fenótipo. Dada a grande variedade de fenótipos em vários modelos de doenças neurodegenerativas que engloba marcha pequenas anomalias e deficiências graves de movimento, este método é adequado para avaliar parâmetros da marcha com base na idade do animal e a capacidade de mover. Animais severamente prejudicados podem ser gravados por andar a baixa velocidade sobre uma esteira de avião, enquanto menos modelos visuais podem ser gravados corrida corrida em ladeiras ou descidas em alta velocidade. Isto pode revelar marcha diferenças entre o modelo neurodegenerativas e seu controle littermate sem exacerbar os animais.
Com este protocolo, demonstramos a adequação do método VPI para monitorar o desenvolvimento de perturbações motor com envelhecimento em ratos. Testes ratos WT em vários pontos do tempo à medida que a idade avança nos permitiram identificar anormalidades da marcha idade-dependente e caracterizar como progridem com o envelhecimento. Além disso, quando o tratamento modelos do rato para a neurodegeneração, uma questão que muitas vezes apresenta é que devido os sintomas não relacionados ao comportamento motor (por exemplo, ansiedade, apatia, dificuldades de aprendizagem), a disposição do animal para realizar até mesmo uma simples motor de tarefa como a corrida, é reduzido. Aqui, sugerimos modificações de método e ferramentas motivacionais para incentivar a correr na esteira motorizada iluminada que pode ser útil para aplicar com sucesso análise cinemática da marcha ao envelhecimento linhas de rato com alterações neurodegenerativas. Além disso, usamos um truque simples de aplicação de tinta de dedo para as patas do animal e mostrar que pode ajudar significativamente para melhorar a qualidade dos dados gravados. Obtenção de boas gravações de vídeo é o passo mais crítico da análise de marcha: o sucesso da análise depende, como cada análise automática ou semi-automática de imagens ou vídeos, a qualidade dos dados brutos. Vídeos de baixa qualidade não podem ser melhorados em etapas posteriores na análise e normalmente têm de ser excluídas do processo de análise.
Enquanto estudava sistematicamente da marcha e postura de WT e várias linhas de mutantes endophilin em um período de 18 meses, notamos que até mesmo WT ratos e camundongos sem problemas de locomoção/correr óbvio (i.e., endophilin 1KO-WT WT), mostram alterações na vários parâmetros da marcha e postura com o avançar da idade de forma progressiva (Figura 2 e Figura 3A). Curiosamente, também notamos que enquanto anormalidades em vários parâmetros da marcha e postura observadas no envelhecimento endophilin mutantes desenvolvem na mesma direção e inclinação como em animais o WT/controle, os outros não fazem (Figura 3). Por último, é importante notar que, mesmo se envelhecido WT ratos e jovens endophilin mutantes não exibem qualquer locomoção óbvia, da marcha e postura defeitos quando observado a olho nu, alterações nos parâmetros da marcha e postura seletivas podem ser detectadas com esta abordagem.
Teste o comportamento motor de rato é uma das maneiras mais abrangentes para ilustrar que um modelo do rato manifesta-se os principais aspectos da condição humana. Como resultado, um número de testes foram desenvolvido para avaliar vários aspectos do comportamento motor. Estes testes incluem o teste de campo aberto (atividade motora geral), rotarod (coordenação motora, ataxia), força (força muscular), roda (atividade), teste de fio (resistência), feixe de escada, andar a tarefa (coordenação motora fina, de suspensão de execução habilidade sensório-motor), marcha de análise (locomoção, coordenação de membro) e outros (resumidos em Wahlstein36). Os diferentes testes têm vantagens específicas e desvantagens e suas leituras são geralmente limitadas para o aspecto (ou aspectos) do comportamento motor que eles foram projetados para endereço. Por essa razão, é prática comum para realizar uma bateria de testes de comportamento motor para cobrir os principais aspectos desta área.
Análise de marcha, muitas vezes não está incluído nestas baterias, em parte devido a um relatório por Guillot em Al. 37, que considerou que a análise da marcha não detecta déficit motor em modelos animais de ALS e PD e em parte devido ao método trabalhoso e saída limitada. No entanto, o Guillot et al. relatório tem sido contestado por pesquisas que aborda várias limitações no projeto de estudo38. A utilidade desse método na análise de marcha em modelos do rato com neurodegeneração foi demonstrada por uma série de recentes publicações10,11,12,39,40 ,41,42,43, incluindo também nosso trabalho13.
Gravações de VPI vem com várias vantagens sobre o método convencional de pintura as patas com tinta e deixar o mouse sobre uma folha branca de papel44. O mais óbvio é o fato de que com o tapete rolante motorizado, a velocidade do animal é controlada, que tem uma forte influência sobre vários parâmetros de marcha1. Além disso, algumas anormalidades da marcha se tornar detectável somente quando o animal corre em uma alta velocidade exigente e/ou um inclinação/declínio, que não seria visto em execução voluntária. Além disso, a análise elaborada pela mão é substituída por uma análise semi-automatizadas, alta produtividade. Por essa razão, pode ser aumentado o número de animais testados em cada grupo, que por sua vez diminui o efeito causado pela variabilidade que é inevitável em animais vivos. Em resumo, recomendamos que a versão modificada da análise da marcha de VPI é incluída nas baterias teste motor padrão para complementar a análise de motor deficiências em modelos de roedores de neurodegeneração e/ou envelhecimento.
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Disclosures
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Acknowledgments
Agradecemos a cuidadores de animais em instalações de animais do ENI para ajuda com a criação e Dr. Nuno Raimundo para comentários úteis sobre o manuscrito. I.M. é suportado por subvenções da Fundação pesquisa alemã (DFG) através do centro de investigação em colaboração SFB-889 (projeto A8) e SFB-1190 (projeto P02) e o Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. é suportado pela sociedade da escola de pós-graduação de Göttingen para Neurociências, biofísica e Biociências moleculares (GGNB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
References
- Clarke, K. A., Still, lJ. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
- Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol's effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
- Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
- Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
- Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
- Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
- Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson's Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
- Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A. Jr, Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson's disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
- Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson's disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
- Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
- Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson's disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
- Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
- Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
- Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice - implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
- Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
- Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Behavior. (1-2), 79-84 (2002).
- Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
- Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson's disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
- Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
- Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
- Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
- Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
- Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
- Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
- Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
- Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
- Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
- Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
- Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
- Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), Article in Japanese 1193-1202 (2010).
- Wahlsten, D. Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , Academic Press. (2010).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson's Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
- Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
- Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
- Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
- Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
- Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8: Unit 8.12 (2001).
- Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).
