Summary
I denna studie demonstrera vi användningen av kinematisk gånganalys baserat på ventrala planet imaging för att övervaka de subtila förändringarna i motorisk koordination samt utvecklingen av neurodegeneration med stigande ålder i musmodeller (t.ex. endophilin mutant mus linjer).
Abstract
Motoriska beteende tester används vanligen för att bestämma funktionella betydelsen av en gnagare modell och testa nyligen utvecklat behandlingar hos dessa djur. Specifikt, kan gånganalys återerövra sjukdom relevanta fenotyper som observeras hos patienter, speciellt vid neurodegenerativa sjukdomar som påverkar motoriska förmågor såsom Parkinsons sjukdom (PD), Alzheimers sjukdom (AD), amyotrofisk lateral skleros (ALS), och andra. I tidiga studier längs denna linje, mätning av gait parametrar var mödosamma och berodde på faktorer som var svåra att kontrollera (t.ex. kör hastighet, kontinuerlig löpning). Utvecklingen av ventrala planet bildsystem (VPI) gjorde det möjligt att utföra gånganalys i stor skala, vilket gör denna metod ett användbart verktyg för bedömning av motoriska beteende hos gnagare. Här presenterar vi en djupgående protokollet om hur man använder kinematisk gånganalys för att undersöka åldersberoende utvecklingen av motoriska brister i musmodeller av neurodegeneration; mus linjer med minskade nivåer av endophilin, där neurodegenerativa skada gradvis ökar med åldern, används som ett exempel.
Introduction
Neurodegenerativa sjukdomar innebär en betydande börda på patienter, familjer och samhället, och blir ännu större oro när livslängden ökar, och världens befolkning fortsätter att åldras. En av de vanligaste symtomen på neurodegenerativa sjukdomar är problem med balans och rörlighet. Således, karakterisering av motoriska beteende i åldrande hos däggdjur (t.ex. gnagare) modeller eller modeller visar neurodegenerativa fenotyper, är ett värdefullt verktyg att demonstrera i vivo relevansen av den specifika djur modeller, eller terapeutiska behandlingar som syftar till att förbättra sjukdomssymtomen. Nästan varje strategi att behandla neurodegenerativa sjukdomar kräver slutligen testning i en djurmodell före inledandet av en klinisk prövning på människa. Därför är det viktigt att ha tillförlitliga och reproducerbara beteende tester som kan användas för att kvantifiera konsekvent sjukdom-relevanta fenotyper längs ålder progression, för att säkerställa att en läkemedelskandidat, som visade potential i en in vitro- modell, kan effektivt lindra fenotypen i ett levande djur.
En aspekt av motoriska beteende bedömning hos gnagare är kinematisk gånganalys, som kan utföras av VPI (också kallade ventrala planet videography)1,2. Denna etablerade metod kapitaliserar på kontinuerlig registrering av undersidan av gnagare gå ovanpå en transparent och motordrivna löpband bälte1,2,3,4. Analys av videon foder data skapar ”digital tassavtryck” i alla fyra extremiteterna som dynamiskt och tillförlitligt recapitulate gnagares walking mönster, som ursprungligen beskrivs av grönkål o.a. 2 och Amende o.a. 3.
Principen om imaging-baserade gånganalys är att mäta området tass kontakt med löpband bältet över tid, för varje enskild tass. Varje hållning representeras av en ökning av tass område (i bromsning fas) och en minskning i tass område (den framdrivning fasen). Detta följs av en swing-fas där ingen signal detekteras. Swing och hållning tillsammans bildar en steglängd. Utöver gait dynamics parametrar, kan hållning parametrar också extraheras från de inspelade videorna. Exemplarisk parametrar och deras definition är listade i tabell 1 och inkluderar hållning bredd (SW; kombinerade avståndet från fore eller hind tassar med nos-svans-axeln), steglängd (SL; genomsnittliga avståndet mellan två kliv av samma tass) eller tass placering vinkel (vinkeln på tass med nos-svans-axeln). Hållning och gång dynamics data kan dra slutsatser om djurs balans (genom hållning parametrar och deras variationer över flera steg) och samordning (av gait dynamics parametrar). Andra parametrar, såsom ataxi koefficient (SL variabiliteten beräknas av (max. SL−min. SL) / menar SL]), bakbenen delade hållning tid (tid som båda bakbenen är i kontakt med bältet), eller tass drar (total yta på tass på bältet från full hållning till tass lyft) kan också extraheras, och har rapporterats till ändras i olika neurodegenerativa di Sease modeller5,6,7,8 (se tabell 1).
| Parametern | Enhet | Definition |
| Swing tid | MS | tid tass inte är i kontakt med bältet |
| hållning tid | MS | tid tass är i kontakt med bältet |
| % broms | % av hållning tid | procentandel av tid som hållning tassarna är i fasen broms |
| % driva | % av hållning tid | procentandel av tid som hållning tassarna är i fasen framdrivning |
| hållning bredd | cm | kombinerade avstånd från förgrunden eller hind tassar med nos-svans-axeln |
| steglängd | cm | genomsnittliga avståndet mellan två kliv av samma tass |
| Stride frekvens | framsteg/s | antalet kompletta steg per sekund |
| tass placering vinkel | deg | vinkeln på tass i förhållande till djurets nos-tail axel |
| ataxi koefficient | a.u. | SL variabiliteten beräknas med [(max SL-min SL)/SL] |
| % delade hållning | % av hållning | bakbenen delade hållning tid; gången som båda bakbenen är i kontakt med bältet samtidigt |
| tass drar | mm2 | total yta på tass på bältet från full hållning till tass lyft |
| lem lastning | cm2 | MAX dA/dT; maximal förändringstakten i tass område i fasen att bryta |
| steg vinkel variabilitet | deg | standardavvikelsen för vinkeln mellan hind tassar som en funktion av SL och SW |
Tabell 1. Definition av viktiga gait parametrar som kan testas av ventrala planet imaging.
Bedömning av motoriska beteendet hos gnagare modeller för neurodegenerativa sjukdomar kan vara svårt beroende på svårighetsgraden av fenotypen av en specifik modell på en viss ålder. Flera sjukdomar, mest framträdande PD, Visa stark motor beteende (förflyttning) underskott, både hos patienter och i djurmodeller. En av de fyra viktigaste symptomen i PD är bradykinesi, som fortskrider med åldrande och yttrar i svår gångart nedskrivningar redan i tidigt skede av PD9. Studier av akuta PD modell, gnagare vilka behandlats med 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin (MPTP), har redan använt VPI gait analys10,11,12. Dock behandlar akut med tanke på denna modell, dessa studier inte den åldersrelaterade progressionen av motoriska brister. Flera färska studier har genomfört gånganalys i åldern möss med neurodegenerativa förändringar, till exempel13,14,15, betonar betydelsen av att förstå sjukdomsförloppet med stigande ålder .
Förutom motor underskott, djurmodeller av neurodegenerativa sjukdomar ofta har svårigheter med fokus på uppgifterna som undersökning och Visa framträdande kognitiva funktionsnedsättningar, särskilt med stigande ålder. Sådan en fenotyp kan påverka resultatet av motoriska beteende tester. Nämligen bygger en av de mest använda testerna för att undersöka motor underskott, den rotarod test16, på kognition, uppmärksamhet och stress17,18. Medan viljan att gå på ett motordrivet löpband beror också på dessa faktorer, den inspelade avläsning är igång, vilket är en mer standardiserad funktion och långt mindre påverkade av förändrad kognition. Effekterna av stress och uppmärksamhet kan vara synliga i särskilda parametrar, som swing/hållning tid för stress och SL för uppmärksamhet19,20, men inte i övergripande körs förmåga.
Kinematiska gait analys strategi ytterligare erbjuder fördelen av att ha alternativ för att justera utmaningen för gnagare modeller. Löpbandet med justerbar vinkel och hastighet gör att promenader hastigheter från 0,1 - 99,9 cm/s, så att gnagare med svår gångavstånd funktionsnedsättningar kan fortfarande att kunna köra med låg hastighet (~ 10 cm/s). Icke-nedsatt djur kan mätas vid snabbare kör hastigheter (30 - 40 cm/s). Observation av huruvida de testa djur klarar att köra med en viss hastighet ger ett resultat av sig själv. Ytterligare, gnagare kan utmanas dessutom att köra upp en sluttning eller ned en nedgång, genom att luta löpbandet till en önskad vinkel med hjälp av en goniometer eller genom att bifoga en vägda släde till mus eller råtta bakbenen.
Förutom många studier av enstaka proteiner som är muterad i patienter, finns det en nyligen ökande medvetenhet om sambanden mellan defekta endocytos processen och neurodegeneration13,21,22, 23,24,25,26,27,28. Mus-modeller med sänkta nivåer av endophilin-A (hädanefter endophilin), en viktig aktör i båda clathrin-medierad endocytos13,21,29,30,31 , 32 , 33 , 45 och clathrin-oberoende endocytos34, befanns Visa neurodegeneration och åldersberoende nedskrivningar i rörelseaktivitet13,21. Tre gener kodar familjen av endophilin proteiner: endophilin 1, endophilin 2, och endophilin 3. Särskilt den fenotyp som följd av utarmning av endophilin proteiner varierar kraftigt beroende på antalet av saknas endophilin gener13,21. Även triple knock-out (KO) av endophilin gener är dödliga bara några timmar efter födseln, och möss utan båda endophilin 1 och 2 inte frodas och dö inom 3 veckor efter födseln, visar enda KO för någon av de tre endophilins ingen uppenbar fenotyp för testade villkor21. Andra endophilin mutant genotyper visar reducerad livslängd och utveckla motoriska funktionsnedsättningar med ökande ålder13. För exempel, endophilin 1KO-2HT-3KO möss display gångavstånd förändringar och motoriska samordningsproblem (som testats av kinematisk gånganalys och rotarod) redan vid 3 månaders ålder, medan deras littermates, visar endophilin 1KO-2WT-3KO djur, en betydande minskning av finmotorik samordning endast vid 15 månaders ålder13. På grund av den stora mångfalden av fenotyper i dessa modeller är det nödvändigt att identifiera och tillämpa ett test som kan integrera en mängd utmaningar som motsvarar djurens motor och kognition förmågor, samt ålder. Här, detalj vi experimentella procedurer som kapitalisera på den kinematiska gånganalys att bedöma debut och progression av motoriska funktionsnedsättningar i en musmodell som visar neurodegenerativa förändringar (dvs. endophilin mutanter). Detta inkluderar mätning gait parametrar vid olika åldrar och olika svårighetsgrader av locomotion nedskrivningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som redovisas här utförs enligt de europeiska riktlinjerna för djurskydd (2010/63/EU) med godkännande av Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), registreringsnummer 14 / 1701.
1. studera Design
- Djurs beteende arbete kräver noggrann planering, anser följande parametrar medan du designar experimentet.
- Antal djur som krävs per grupp.
- Använda en statistisk programvara (t.ex. PASS, EDA eller GPower) för att beräkna krävs gruppens storlek.
Obs: Gruppens storlek beror på variationen mellan djur och svårighetsgraden av fenotypen. Den kinematiska gånganalys är antalet möss vanligen 10-20 per grupp.
- Använda en statistisk programvara (t.ex. PASS, EDA eller GPower) för att beräkna krävs gruppens storlek.
- Sex av försöksdjuren.
- Överväga effekten av östrogennivåer på experimentet, beroende på den animaliska stammen.
Obs: Många beteende studier fokuserar på män för att undvika påverkan av östrogennivåer på experimentet. Dessa influenser är mer eller mindre starka beroende på djurens bakgrund stammen. - Om båda könen ska användas, testa för sex inflytande och utvärdera de två könen självständigt när det är nödvändigt.
- Överväga effekten av östrogennivåer på experimentet, beroende på den animaliska stammen.
- Ålder av försöksdjuren.
- Använd vuxna djur (2 månader, eller äldre) om endast enstaka punkt behövs.
- Välj flera tidpunkter när ändringen i motoriska beteende med stigande ålder är att studeras. Det tidigaste möjliga tid är 1 månad, efter möss är avvanda från sina mödrar. Testa djuren i regelbundet, exempelvis varje 1, 2 eller 3 månader.
- Antal djur som krävs per grupp.
- Ansöka om tillstånd från de lokala myndigheterna att utföra djurs beteende tester.
- Göra upp planer för att skaffa försöksdjuren.
- Göra en plan för avel eller kontakta ett djur distributör i god tid så att tillräckligt försöksdjur är tillgängliga den dagen när experimenten startar.
- Låt djuren till habituerar för en vecka om de hålls i en ny rum/inställning under experimenten.
2. videoinspelning
Obs: För att illustrera användningen av kinematisk gånganalys, här ett kommersiellt tillgängliga imaging system med dess åtföljande imaging och analysprogram (se Tabell för material) används.
- Starta datorn och programvaran imager.
- Bestämma hälsostatus och välbefinnande av varje djur genom att observera det i dess hem bur, och väger det på en balans.
- När det behövs, Applicera försiktigt röda finger paint till djurets tassar med en borste. Låt färgen torka i ~ 5 min i en extra ren bur.
Obs: Undvik målning djurets buk som färgen används för att förbättra kontrasten mellan tassar och kropp. Det är bra att ha svart finger färg praktiskt för korrigeringar. Detta steg behövs för djur med brun päls, eller i fall tassar har varit tatuerade för identifiering. Om valt att måla tassarna av ett djur, behöver alla djur i samma grupp och kontrollgrupp målas också. - Ställa in hastigheten på löpbandet på den övre högra panelen av apparaten; Om mer än en hastighet kommer att tillämpas, börja med den lägsta hastigheten.
- Placera djuret i provkammaren (undvika fastspänning den svans eller tassar när stängningsen kammaren). Täck kammaren med en mörk duk och låt varje djur att justera för 1-2 min.
- Slå på ljuset i provkammaren genom att vrida på löpband ljus omkopplaren till läget ”på”. Vrid på rotary switch för löpband att ”vidarebefordra” om du vill starta löpbandet, klicka på knappen ”record” i programvaran imager.
Obs: Medan löpbandet är igång, det är viktigt att observera djur prestanda noggrant och ständigt: stoppa löpbandet omedelbart om djuret inte kan hänga med den treadmill hastigheten eller visar sekundära symptom icke-relaterade till locomotion (t.ex. epileptiska anfall). Provningsvillkoren kan behöva justeras. - När djuret går stabilt (ingen snabb flyr till sidor, framsidan eller baksidan), registrera för minst 5 s innan du stoppar löpbandet. Stoppa inspelningen genom att klicka på ”stop” på imager programvara och vrid på rotary switch för löpband tillbaka till den ”off” positionen.
Obs: Undvik instabila driften av djur kan det vara bra att låta dem köras i flera sekunder, eller att tillåta dem att köra i andra riktningen (genom att vrida på löpband omkopplaren för att ”vända” istället för ”forward”). - Klicka på knappen ”behandling” i den imager programvaran för att öppna en meny där start och slutpunkt av videon avsnitt (som används för analys) kan ställas in. För att göra detta, Använd skjutreglaget längst ned på skärmen för att navigera igenom videon.
- Markera den aktuella tidpunkten som start- eller slutpunkten, klicka på ”från ram nr” och ”till”, respektive. Kontrollera avsnittet innehåller minst 7 steg/paw (14 steg totalt) av djur kör stabilt vid en konstant hastighet.
- Ange identifiering av djur, födelsedatum, vikt och kön. Spara data på en önskad plats på den dator eller server. Klicka på ”kamera” för att återgå till det inspelning gränssnittet.
- Om flera löphastigheter behöver registreras, upprepa steg 2,6-2.10 med de önskade löphastigheter. Innan inspelningen nästa video, se till att den röda färgen finns kvar på tass, annars Upprepa steg 2,3.
- Efter inspelningen, släppa djur till dess buren. Efter borttagning av ett djur, ren löpbandet bältet ordentligt med tvål och vatten följt av desinfektionsmedel för att förbereda den för nästa experimentella djur.
3. video-bearbetning
- Starta programvaran analys och klicka på ”Välj studera broschyren” att välja mappen med det inspelade videor.
- Välj en video eller flera videor som kan bearbetas i följd, och klicka på ”go”.
- Funktionen ”Rita” för att välja det område där musen körs; Detta avsnitt bör endast innehålla de mus och vit bakgrund.
- Om funktionen ”omvänd” löpband användes tidigare, Välj ”kontrollera om motivets näsa är till höger >>>” att spegla videon eftersom programvaran är avsedd att endast analysera djur kör till vänster. Klicka ”acceptera” för att fortsätta.
- Använd funktionen ”uppdatera” att se standard masken och tass print som programvaran upptäcker.
Obs: Den ursprungliga videon visas till vänster och en svartvit bild av de föreslagna tassavtryck är till höger. - Ange värden i rutorna ”längd” och ”bredd” ändra masken som utesluter det röda området runt nosen i djuret för analys. eftersom färgen liknar tassar, kan inte maskera området resultera i programvaran oavsiktligt klassificera området nos som en tass.
- Justera reglagen ”filter brus” och ”filtrera päls och mörka fläckar” att optimera svart och vit tass print. Ställ skjutreglaget ”filtrera buller” ~ 800-950 för svarta djur och ~ 700-800 för bruna eller vita djur, beroende på exakta päls färg av djuret. Välj ”ok” när inställningarna är tillfredsställande.
Obs: Skjutreglaget ”filtrera päls och mörka fläckar” beror på hur ”röd” tass är. För målade tassar, värdet är vanligtvis omkring 100-120, och för icke-målade tassar det bästa värdet är runt 50-100. Dessa inställningar beroende på färg shadings av päls och tassar, och behöver optimeras för varje djur. Svart och vit tass utskrift bör ha tydliga representationer av tassarna med som lite bakgrundsljud som möjligt. - Välj ett eller flera videoklipp som passerat den första justeringen (märkt med ”@@” före video namn) och Välj funktionen ”gå” för att starta analysen av dessa filmer.
Obs: Analysen tar 2-5 min per video. Det är möjligt att köra analysen av flera videor över natten eftersom detta steg kräver ingen inmatning från experimenter. - Välj en analyserad video (märkt med ”@@@”) och klicka på ”go”. Observera att området tass (i cm2) i kontakt med bältet över tiden (gait dynamics) för varje separat tass nu kan ses. För att jämföra den ursprungliga videon och beräknade paw print för ett markerat område, Använd funktionen ”Spela video”.
- Använda följande (tre) verktyg för att korrigera små misstag som gjorts av programvaran.
- Använd alternativet ”rätt” att ta bort en fel signal, t.ex. när programvaran registrerar en signal även om motsvarande tass inte är i kontakt med bältet. Klicka en gång för att zooma in på det berörda området, och markera objektet för att ta bort med andra klick vänster kantlinje och rätt gränsen med ett tredje klick.
- Använd alternativet ”Anslut” för att kombinera två signaler, t.ex., när ingen signal registreras för ett par bildrutor även om tass är i kontakt med bältet. Klicka en gång för att zooma in på det berörda området och dubbelklicka mitt två objekt att kombinera.
- Använd alternativet ”ta bort” att ta bort punkter från analysen helt. Använd detta alternativ endast om felet inte kan åtgärdas med ”rätt” eller ”ansluta” funktion, exempelvis när en signal från den vänstra forelimb tassen registreras av misstag för vänster bakben tass. Klicka en gång för att zooma in på det berörda området och markera den vänstra kantlinjen i området för att ta bort med det andra klicket och rätt gränsen med ett tredje klick.
Obs: Verktygen kan endast användas till att korrigera små misstag; systematiska fel (t.ex. om signalen från en tass var extremt svag) inte kan korrigeras: videon bör undantas från analys och inspelningen av det respektiva djuren upprepas, när det är möjligt. Observera att alternativet ”Spela video” är inte längre tillgänglig efter den ”rätta”, ”ansluta” eller ”ta bort” alternativ har använts, och att klicka på knappen ”Ångra” återställs alla 3 redigeringsverktyg.
- Välj ”nästa extremiteter” att fortsätta genom 4 armar; När du klickar på ”nästa lem” efter sista tass, programvaran är klar analys och visar resultaten för detta djur på 4 skärmar.
4. gånganalys
- När alla videor från ett experiment analyseras, Välj alla videor och klicka på ”omorganisera resultat” att exportera resultaten (en lista över parametrar i kalkylbladsfiler).
- Öppna filen med den avslutande ”reorganized_stride_info” och Lägg till information som inte ingår i kalkylbladet: gruppera information (t.ex., genotyp, behandling), ålder och mätningar av djur längd och bredd som sparas i en annan kalkylbladsfil med den avslutande ”SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info”.
- Normalisera gait parametrarna till djur bredd eller längd vid behov, exempelvis SL till djur längd och SW till djur bredd.
- Sortera resultaten efter grupp, ålder och hastighet: analysera alla dessa villkor självständigt.
Obs: Olika åldrar eller löphastigheter kan inte kombineras inom en och samma koncern. - Beräkna den genomsnittet (medelvärdet) värden, standardavvikelse och medelfel av medelvärdet för varje parameter för alla experimentella förhållanden.
- Utföra statistiska analyser enligt experimentell design, t.ex. använda en 2-tailed t-test för att jämföra mutant/behandlade djur till en vildtyp (WT) / kontroll eller ANOVA att jämföra flera oberoende grupper.
- Titta på alla uppmätta parametrar: det är bra att rita varje parameter för att bättre visualisera resultaten. Om det finns statistiska skillnader i en given parameter, kontrollera om andra beroende parametrar ändras på motsvarande sätt.
Obs: till exempel om SL minskas avsevärt i en viss grupp, detta medför även högre steglängd frekvens (eftersom körhastigheten är samma) och kan resultera i en ökad SW (för att bibehålla kroppsställning stabilitet). - Välj parametrar som är mest relevanta för en modell, eller är jämförbara med observationer i den mänskliga sjukdomen. För en presentation, skapa representativa videor för varje grupp och komplettera dem genom grafer visar avläsningen för relevanta parametrar, eftersom subtila gait förändringar är ofta inte uppenbart från videor.
5. felsökning
Obs: Vissa djur, särskilt musmodeller med en ångest fenotyp, kan ha svårigheter att utföra ens en enkel uppgift som att springa på ett löpband. Följande är stegen som kan tas till lägre ångest nivåer och uppmuntra löpning.
- Tillvänjning och positiva verkställighet.
- 2-3 dagar innan det första testet, Placera musen i provkammaren, täcka den med en mörk duk och lämna ljuset avstängd. Låt musen anpassa sig till den nya miljön för ~ 5 min. Lägg chow eller choklad/mutter smör (t.ex. Nutella) till provkammaren så en positiv association kan bildas.
- Negativa verkställighet av luft puffar/bakre gräns.
- Möss gillar inte luft puffar eller en rörelse bakom dem och kommer att springa ifrån störningen. För att motivera löpning, Använd mild luft puffar eller rytmisk rörelse av flexibla bar som bildar den baksida gränsen av provkammaren, att uppmuntra musen för att köra mot den främre delen av provkammaren.
- Långsam start.
- När du testar snabbt kör hastigheter, starta löpbandet på lägre hastighet och sedan öka långsamt löpband hastigheten mot villkoret för önskad provning.
- Minimera fri rörlighet.
- Test kammare längd begränsas av två justerbara barer i fram- och baksidan. Om ett test djur håller upp med körhastigheten men körs inte stadigt, begränsa avdelningens längd för att resultera i mer stabila.
- Om ovan nämnda mätningarna inte lyckas registrera körs på nästa dag. Om djuret fortfarande vägrar att köra efter att ha testat på tre dagar, registrera detta som konstaterandet och utesluta djuret från ytterligare testning.
Obs: Resultaten av gånganalys är beroende av god kvalitet videoinspelning. Det finns ingen anledning att utesluta videor under analysen om filmerna spelats in noggrant. Om bildkvaliteten är otillräcklig, blir uppenbara under steg 3.6 när parametrarna för skapandet av digitala tass ut fastställs. Om någon annan del av kroppen utom tassar och nos visas i rött (t.ex. på grund av den saknade pälsen runt könsorganen eller finger paint sprinklings på buken), kvaliteten sjunker. Justeringarna i steg 3.6 tillåta korrigera endast små frågor, och om detta inte kan få videon till ett acceptabelt signal/brus-förhållande, videon behöver uteslutas från analysen, och inspelningen behöver upprepas. Således rekommenderas att analysera videor snart när inspelningar genomförs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att illustrera användningen av kinematisk gånganalys, vi har utfört gånganalys på WT C57BL/6J möss med stigande ålder, liksom flera endophilin mutant rader, med hjälp av kommersiellt tillgängliga instrument och programvara (hänvisas till tabell för Material). I den här installationen en höghastighets kamera under en transparent löpband registrerar driften av en mus (figur 1A). Programvaran kan sedan identifiera kontrasten mellan de röda färgade tassarna och vit eller svart päls. Eftersom våra försöksdjur hade mörk brunt päls färg, har vi målat tassarna i alla ämnen med röda finger färg. Vi har testat försöksdjur på olika löphastigheter: promenader (10 cm/s), kör (20 cm/s) och snabbt kör (30 cm/s). Den kontaktyta och tiden tassar var på löpbandet och i luften mättes. Från denna information, var de parametrar som recapitulate gait rytm (t.ex. swing/hållning tid, broms/framdrivningen) eller kroppshållning (t.ex. tass vinkel, SW) beräknas (figur 1B).
Vi genomförde gånganalys som en del av ett batteri av flera motoriska beteende tester. Vi bedömde greppstyrka (GS), bakbenen som knäpper fast (HLC), gånganalys och accelererade rotarod prestanda (ARR). Motoriska beteende är inte som påverkas av tidigare erfarenheter och experimentella tester som, till exempel kognition, det är fortfarande viktigt att varje djur genomgår samma batteri av tester i samma ordning och vid samma ålder. Uppdraget bör gå från låg till hög svårighetsgrad för djuret att minimera påverkan från tidigare experiment på testet.
Vi har valt endophilin mutanter för denna studie sedan, beroende på hur många av tre endophilin alleler saknas, den resulterande fenotypen varierar från ingen fenotyp i den enda KOs till en mild neurodegenerativa fenotyp i unga endophilin 1KO-2HT-3KO möss som utvecklas i takt med åldrandet. Därför presenterar dessa djur rader en lämplig modell för att studera subtila förändringar som utvecklar endast som djur ålder. Med tanke på att de flesta endophilin mutanter visar en minskad livslängd, har vi undersökt endophilin mutanter motoriska beteende under loppet av 18 månader (18-månaders tidpunkten valdes sedan även möss i raden endophilin 1KO-2HT-3KO som visar den starkaste fenotyp har inte förlamning). Gånganalys utfördes vid åtta tidpunkter under en 18-månadersperiod (figur 1 c). Vid 18 månaders ålder, var djuren euthanized och bevaras för biokemiska och/eller histologiska analysen.
Mus kolonin underhåll:
Heterozygota och homozygota möss för de endophilin 1, 2 och 3 allelerna rapporterades ursprungligen i Milosevic et al. 21 C57BL/6J möss användes förutom littermate möss som kontroller i hela. Möss var inrymt i öppna burar med ad libitum tillgång till mat och vatten i grupper om högst 5 djur, på en 12-h ljus/mörk cykel. Endast manliga möss användes i denna studie för att utesluta effekterna av cykel-beroende variationer hos kvinnor.
Genotypning av Endophilin A1, A2 och A3 mus-modeller:
Genotypning av endophilin möss utfördes av polymeras-kedjereaktion (PCR) förstärkning med genomiskt DNA extraheras från svans eller örat stämplingar. Primärvården för tre endophilin-A gener utfördes med respektive grundfärger: endophilin-A1: vidarebefordra primer 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' och reverse primer 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' för WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' för KO; endophilin-A2: vidarebefordra primers 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' för WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' för KO och omvänd primers 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' för WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' för KO; endophilin-A3: vidarebefordra primer 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' och reverse primer 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' för WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3' för KO. De resulterande PCR-produkterna kördes på en 1% agarosgel, vilket ger distinkt band storlekar för WT och KO alleler: endophilin-A1 WT ~ 384 bps, KO ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1,280 bps, KO ~ 1 000 bps; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bps. PCR-produkter med både WT och KO band indikerar en heterozygot (HT) djur.
Resultat:
För att karakterisera rörelser och kroppshållning i WT möss med stigande ålder, har vi utfört kinematisk gånganalys i dessa djur (figur 2. Film 1). Medan vissa parametrar, till exempel SW (genomsnittliga avståndet mellan fore eller bakbenen normaliserade till djur bredd; Se även tabell 1), förblir oförändrade i WT djur med stigande ålder, andra parametrar ändras successivt (figur 2A– C). exempelvis bakbenen dubbel stöd (tid i förhållande till hållning varaktighet som båda bakbenen är i kontakt med marken samtidigt) ökar från 38% till 55% från 1 månad till 18 månader (figur 2B). Denna parameter är ofta associerade med kroppshållning instabilitet35. Dessutom ökar lem lastning (maximal förändringstakten i området tass i banbrytande fas) från 38 cm2/s till 59 cm2/s från 1 månad till 18 månader (figur 2 c). Snabb inbromsning kan tolkas som en indikator för nedsatt muskelstyrka. Totala löpande förmågan påverkas inte i WT djur (94% klarar att köra på 30 cm/s på 18 månader, figur 3A). Utöver kännetecknar rörelser och kroppshållning parametrar som bo inte påverkas eller förändras successivt med stigande ålder i WT möss, har vi dokumenterat att den kinematiska gånganalys använder VPI är en lämplig metod att studera de åldersrelaterade lindriga förändringarna i rörelser och kroppshållning.
Medan den övergripande körs förmågan inte påverkas i WT djur, visar flera endophilin mutant linjerna förändrad förmåga att gå eller springa på det motordrivna löpbandet (figur 3A), som rapporterats i Murdoch et al. 13 på mindre datauppsättningen. Särskilt, medan vid 1 månads ålder är alla endophilin 1KO-2HT-3KO möss allt kunna köra på 30 cm/s, vid 18 månaders ålder 81% av samma djur kan inte köra (figur 3A, Obs att större kohorter analyserades än de som tidigare rapporterats i 13). Intressant, påverkas även endophilin mutanter som saknar färre endophilin alleler (dvs. endophilin 1KO-2HT-3WT), men i lägre grad (figur 3A).
Även om endophilin 1KO-2HT-3KO mutanter Visa allvarliga motoriska funktionsnedsättningar med stigande ålder13, ändras flera gait parametrar inte i jämförelse med WT kontroll, även vid 18 månaders ålder. Exempelvis förblir steg vinkel variabilitet (standardavvikelsen för steg vinkeln) oförändrad (figur 3B). Särskilt många andra parametrar, för exempel driva tid (procenten hållning tid som tassarna är i fasen framdrivning), skiljer inte på 1 månads ålder, men successivt förvärras med åldrande (figur 3 c; Se även Movie 2). Detta illustrerar att såväl åldersberoende parametrar som neurodegenerativa mutant-specifika variabler kan studeras med en kinematisk gait analys strategi.
Figur 1. Ventrala planet imaging setup och principen. (A) foto och Schematisk ritning av en gångart analys setup. (B) analys programvara principen: från inspelade undersidan av en mus som körs på ett transparent löpband, beräknar programvaran digital tass skriver ut. Deras dynamik under körningen mäts som paw storlek över tiden, och detta används som underlag för att beräkna gait rytm och hållning parametrar. (C) tidsförloppet för gångarten analys experimentet utförs på endophilin mutanter. Den förflyttning och gånganalys bedömdes vid 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 och 18 månader. Bilderna visar endophilin 1KO-2HT-3KO musen på 2, 12 och 18 månader. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Gång analys i vildtyp möss med stigande ålder. Den förflyttning och gång i WT (C57BL/6J) möss bedömdes vid 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 och 18 månader. (A) hållning bredd normaliserade till djur bredd av WT djur inte förändras med stigande ålder. (B) bakbenen dubbel stöd ökar med åldern hos WT djur. Diagrammet visar procentandelen av tiden för hållning som båda bakbenen på marken samtidigt. En ökning av denna parameter återspeglar gait instabilitet. (C) lemmen lastning (maximal förändringstakten i området tass i banbrytande fas) ökar med åldern hos WT djur. Snabb inbromsning kan vara en indikator för nedsatt muskelstyrka. Alla diagram representerar medelvärde ± SEM; p -värdena beräknades från 2-tailed t-testar kontra den 1 - månader gammal WT och representeras som * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3. Gång analys i endophilin mutanter med stigande ålder. (A), tåghastigheten av endophilin mutanter på 1, 12 och 18 månader, räknat från en utökad datamängd i jämförelse med Murdoch et al. 13 bar färger spegla procentandelen av djur kunna springa 30 (mörkblå), 20 (blå) eller 10 cm/s (ljusblå) på det motordrivna löpbandet eller vägra köra på setup (grå). Medan alla testade djur kan köra på 30 m/s på 1 månad, utveckla endophilin mutanter kör underskott när de blir äldre. (B–C) Steget vinkel variabilitet och driva tid i WT (svart), endophilin 1KO-2WT-3WT (turkos), endophilin 1KO-2HT-3WT (mörkblå) och endophilin 1KO-2HT-3KO (brun) möss. Steg vinkel variabiliteten visar ingen skillnad i åldrande WT djur, eller mellan WT och endophilin mutanter. Propel tiden (som procentuella andelen hållning) är inte signifikant mellan endophilin mutanter och WT på 1 månad, men minskar i endophilin mutanter som möss ålder. Alla diagram representerar den medelvärde ± SEM; p -värdena beräknades från 2-tailed t-tester jämfört med åldersmatchade WT och representeras som * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Film 1. Gång analys i vildtyp (C57BL/6J) musen på 3 (vänster) och 18 månaders ålder (höger). Den ursprungliga videon (överst) är översatt till en ”digital paw print” video (nederst). Den video hastigheten har fördröjts 5 gånger så att Detaljer kan uppskattas bättre. Vid 18 månaders tidpunkt, notera tveksamhet av höger bakben tass (röd i digital paw print) på ~ 2 s, och höger tass (blå i digital paw print) på ~ 4 s. Den video hastigheten har fördröjts med en faktor på 10. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 2. Gång analys i endophilin 1KO-2WT-3WT (kontroll, vänster) kontra endophilin 1KO-2HT-3KO (höger) möss vid 18 månaders ålder. Den video hastigheten har fördröjts av en faktor 5 så Detaljer kan uppskattas bättre. Endophilin 1KO-2HT-3KO musen visar gait förändringar som kan ses som mindre stabil drift av djuret. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studera den finmotorik samordningen är en användbar strategi i karakterisering av modeller av neurodegenerativa sjukdomar, särskilt för sjukdomar som PD som finmotorik samordning är störs. Med hjälp av en kinematisk gait analys funktionell analys, kan vi identifiera subtila förändringar i gångarten djur vid uppkomsten av locomotion problem eller i modeller med svag neurodegeneration och därmed relativt blygsamma fenotyp. Med tanke på det breda utbudet av fenotyper i olika modeller av neurodegenerativa sjukdomar som omfattar små gait anomalier och svår rörelse nedskrivningar, är denna metod väl lämpade att bedöma gait parametrar baserat på djurets ålder och förmåga att flytta. Gravt nedsatt djur kan registreras promenader på en låg hastighet på en planet löpband, medan mindre nedsatt modeller kan registreras kör uppförsbacke eller nedförsbacke med hög hastighet. Detta kan avslöja gait skillnaderna mellan den neurodegenerativa och dess littermate kontroll utan overexerting djuren.
Med detta protokoll visar vi adequateness VPI metoden att övervaka utvecklingen av motoriska funktionsnedsättningar med åldrande hos möss. Testning WT möss vid flera tidpunkter har som deras ålder förskott tillåtit oss att identifiera åldersberoende gait avvikelser och karaktärisera hur de framskrider med åldrande. Dessutom när du hanterar musmodeller för neurodegeneration, ett problem som ofta presenterar beror på att symtomen inte relaterade till motoriska beteende (t.ex. ångest, apati, svårigheter i lärande), djuret beredvillighet att utföra även en enkel motorisk aktivitet såsom löpning, minskas. Här föreslår vi metoden ändringar och motiverande verktyg för att uppmuntra körs på den belysta motordrivna löpband som kan vara till hjälp att framgångsrikt tillämpa kinematisk gånganalys till åldrande musen linjer med neurodegenerativa förändringar. Dessutom använder vi ett enkelt trick att tillämpa finger paint på djurets tassar och visar att det kan avsevärt bidra till att förbättra kvaliteten på inspelade uppgifterna. Att erhålla bra videoinspelningar är det mest kritiska steget av gånganalys: framgången av analysen som varje automatiskt eller halvautomatiskt analys av bilder eller videor, beror på kvaliteten på rådata. Låg kvalitet videor kan inte förbättras på senare steg i analysen, och har oftast att uteslutas från analysprocessen.
Samtidigt systematiskt studera gångarten och hållning av både WT och flera endophilin mutant linjer över en spännvidd på 18 månader, har vi märkt att även WT möss och möss utan uppenbara locomotion/kör frågor (dvs. endophilin 1KO-WT-WT), visar förändringar i flera rörelser och kroppshållning parametrar med stigande ålder i ett progressivt sätt (figur 2 och figur 3A). Intressant, vi har också märkt att även avvikelser i flera rörelser och kroppshållning parametrar som har iakttagits i åldrande endophilin mutanter utvecklas i samma riktning och lutning som WT/kontroll djuren, andra inte (figur 3). Avslutningsvis är det viktigt att notera att även om åldern WT möss och ung endophilin mutanter inte visar några uppenbara locomotion, gånganalys och kroppshållning defekter när observeras av ögat, förändringar i selektiv rörelser och kroppshållning parametrar kan upptäckas med denna metod.
Testar den mus motoriska beteenden är en av de mest omfattande sätt att illustrera att en musmodell manifesterar viktiga aspekter av ett mänskligt tillstånd. Som ett resultat, har ett antal tester utvecklats för att bedöma olika aspekter av motoriska beteende. Dessa tester inkluderar öppna fältet testet (allmänna rörelseaktivitet), rotarod (finmotorik samordning, ataxi), greppstyrka (muskelstyrka), kör hjulet (aktivitet), hängande tråd testet (uthållighet), stege beam promenader uppgift (finmotorik samordning, sensomotoriska skicklighet), gång analys (locomotion, lem samordning) och andra (sammanfattas i Wahlstein36). De olika testerna har särskilda fördelar och nackdelar och deras Läs-outs är vanligtvis begränsad till aspekt (eller aspekter) av motoriska beteende att de var avsedda att adress. Därför har det blivit vanligt att utföra ett batteri av motoriska beteende tester att täcka de viktigaste aspekterna av detta område.
Gånganalys ingår ofta inte i dessa batterier, delvis på grund av en rapport av Guillot på al. 37, fann att gånganalys inte upptäcker motor underskott i djurmodeller av PD och ALS, och delvis på grund av den arbetskrävande metod och begränsade produktionen. Dock den Guillot et al. rapporten har ifrågasatts av forskning som behandlar flera begränsningar i studien design38. Nyttan av denna metod i analysen av gångart i musmodeller med neurodegeneration har påvisats av ett antal senaste publikationer10,11,12,39,40 ,41,42,43, även inklusive vårt arbete13.
VPI inspelningar har flera fördelar jämfört med den konventionella metoden för målning tassar med bläck och låta musen kör på ett vitt ark av papper44. Det mest uppenbara är det faktum att med motoriserad löpbandet, tåghastigheten av djuret styrs, som har ett starkt inflytande på flera gait parametrar1. Dessutom blir vissa gait avvikelser detekterbar när djuret körs bara på en krävande hög hastighet och/eller en lutning/nedgång, som inte skulle ses i frivilliga Spring. Dessutom ersätts utarbeta analysen för hand med en halvautomatisk, hög genomströmning analys. Därför kan antalet djur testas i varje grupp kan ökas, vilket i sin tur minskar den effekt som orsakas av variationer som är oundvikliga i levande djur. Sammanfattningsvis rekommenderar vi att den modifierade versionen av den VPI gånganalys ingår i standard motor testa batterierna att komplettera analysen av motoriska funktionsnedsättningar i djurmodeller av neurodegeneration och/eller åldrande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inget konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Vi tackar djur vaktmästare på den ENIS djuranläggningen för hjälp med avel och Dr Nuno Raimundo för värdefulla synpunkter på manuskriptet. I.M. stöds av anslag från den tyska Research Foundation (DFG) genom forskningssamverkan centrum SFB-889 (A8-projektet) och SFB-1190 (projektet P02) och Emmy Noether Young Investigator Award (1702/1). C.M.R. stöds av stipendiet från Göttingen forskarskolan för neurovetenskap, biofysik och molekylära biovetenskaper (GGNB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DigiGait | Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA | DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware | |
| non-transparent blanket or dark cloth | cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress | ||
| balance | e.g. Satorius | balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g | |
| red finger paint | e.g. Kreul or Staedtler | for increasing the contrast between paws and animal’s body | |
| small paint brush | soft brush to apply finger paint to the animal paws | ||
| diluted detergent | for cleaning | ||
| disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol | e.g. B.Braun | for desinfection |
References
- Clarke, K. A., Still, lJ. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
- Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol's effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
- Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
- Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
- Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
- Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
- Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson's Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
- Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
- Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A. Jr, Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson's disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
- Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson's disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
- Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
- Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson's disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
- Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
- Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
- Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice - implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
- Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
- Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
- Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Behavior. (1-2), 79-84 (2002).
- Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
- Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson's disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
- Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
- Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
- Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
- Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
- Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
- Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
- Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
- Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
- Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
- Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
- Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
- Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
- Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
- Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), Article in Japanese 1193-1202 (2010).
- Wahlsten, D. Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , Academic Press. (2010).
- Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson's Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
- Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
- Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
- Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
- Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
- Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
- Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
- Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8: Unit 8.12 (2001).
- Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).
