Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Yaş bağımlı Motor bozuklukları ile ateş farelerde, yürüyüş analizi

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/57752
Automatic Translation
1,2, 1,2
1European Neuroscience Institute (ENI), 2University Medical Center Göttigen (UMG)

Summary

Bu çalışmada, biz ventral uçak motor koordinasyon yanı sıra ateş fare modelleri (Örneğin, endophilin mutant çağda ilerleyen ile ilerleme ince değişiklikleri izlemek için Imaging temel kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermektedir fare hat).

Abstract

Motor davranış testleri genellikle bir kemirgen modelinin fonksiyonel uygunluğu belirlemek için kullanılır ve bu hayvanların tedavilerde yeni test etmek için geliştirilmiştir. Özellikle yürüyüş analizi recapturing hastalığı özellikle Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı (Ah), amyotrofik gibi motor yeteneklere etkiler nörodejeneratif hastalıklarda insan hastalarda gözlenen ilgili fenotipleri sağlar lateral skleroz (ALS) ve diğerleri. Bu hat boyunca erken çalışmalarda, yürüyüş parametrelerinin ölçüm zahmetli ve kontrol etmek zor faktörlere bağlıydı (koşma hızı,Örneğin, sürekli çalışan). Ventral uçak görüntüleme (VPI) sistemlerinin geliştirilmesi mümkün yapım bu yöntemi motor davranış değerlendirilmesi için yararlı bir araç kemirgen bir büyük ölçekli, yürüyüş analizi gerçekleştirmek için yapılmış. Burada, ateş fare modelleri içinde motor açıkları yaş bağımlı ilerleme incelemek için kinematik yürüyüş analizi kullanmak hakkında derinlemesine bir iletişim kuralı mevcut; fare satırları azalan endophilin, hangi nörodejeneratif hasar giderek yaş ile artar düzeyde bir örnek olarak kullanılır.

Introduction

Nörodejeneratif hastalıklar ve hastalar, aileler ve toplum üzerinde önemli bir yük empoze daha büyük endişe yaşam beklentisi artış olarak olacak ve dünya nüfusunun yaş için devam ediyor. Nörodejeneratif hastalıkların en sık görülen belirtiler bir denge sorunu vardır. Böylece, karakterizasyonu yaşlanma memeli (Örneğin, kemirgen) motor davranış modelleri ve/veya nörodejeneratif fenotipleri, gösterilen modelleri olduğunu in vivo alaka belirli hayvan model (ler), ya da tedavi göstermek için değerli bir araç Bu hastalık belirtileri geliştirmek amacı tedavileri. Nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hemen hemen her yaklaşım sonuçta hayvan modelinde bir klinik insanlarda inisiyasyon önce sınama gerektirir. Bu nedenle, bir vitro modelde potansiyel gösterdi, bir aday ilaç olabilir sağlamak için sürekli olarak yaş ilerlemesi, boyunca hastalık ilgili fenotipleri ölçmek için kullanılabilir güvenilir ve tekrarlanabilir davranış testleri önemlidir etkili bir şekilde yaşayan hayvan fenotip iyileştirmek.

Bir motor davranış değerlendirme Rodents VPI (Ayrıca denilen ventral uçak videografisi)1,2tarafından gerçekleştirilen kinematik yürüyüş analizi yönüdür. Kurulan bu yöntem bir şeffaf ve Motorlu Koşu bandı kemer1,2,3,4yürüyüş kemirgenler alt sürekli kayıt capitalizes. Video veri akışı analizi "dijital pençe izleri" dinamik ve güvenilir bir şekilde özetlemek kemirgen 's yürüyen desen, özgün olarak Kale ve ark. tarafından açıklandığı gibi bütün dört ekstremitelerin oluşturur 2 ve Amende vd. 3.

Zamanla, her bireysel pençe için koşu bandı kemeri ile temas pençe alanı ölçmek için görüntüleme tabanlı yürüyüş analizi prensibidir. Her duruş pençe alanının (fren faz) ve pençe alanındaki bir düşüş (itiş aşamasında) bir artış ile temsil edilir. Bu sinyal tespit salıncak aşaması gelir. Salıncak ve duruş birlikte bir adım oluşturuyor. Yürüyüş dynamics parametrelerin yanında, duruş parametreleri de kayıtlı videolardan elde edilebilir. Örnek parametreleri ve bunların tanım Tablo 1 ' de listelenen ve duruş genişliği (SW; burun-kuyruk eksen ön veya arka paws kombine mesafe) dahil, uzunluğu (SL; aynı pençe iki adımlar arasındaki ortalama uzaklığı) stride veya yerleşim pençe açı (pençe çizgisi burun-kuyruk eksen için). Duruş ve yürüyüş dynamics veri (duruş parametreleri ve onların değişkenlik birkaç adım üzerinden tarafından) hayvan denge ve koordinasyon (tarafından yürüyüş dynamics parametreleri) üzerinde sonuç çıkarmayı sağlar. Ataksi katsayısı ([tarafından (maks. hesaplanan SL değişkenliği gibi diğer parametreleri SL−min. SL) / SL demek]), arka bacak duruş süresi (time) her iki arka bacaklarda kemer ile temas halinde olan, paylaşılan veya pençe sürükle (Ümumi sahəsi kemer üzerinden tam duruş kalkış pençe pençe) de elde edilebilir ve çeşitli nörodejeneratif di değiştirilecek bildirilmiştir sease modelleri5,6,7,8 (bkz. Tablo 1).

Parametre Birim Tanımı
salıncak zamanı MS süre belgili tanımlık pençe kemer ile temas halinde değil
duruş zamanı MS zaman pençe kemer ile temas süresi
% fren duruş zaman % belgili tanımlık paws fren aşamasındadır duruş zamanın yüzdesi
% itmek duruş zaman % belgili tanımlık paws itiş aşamasındadır duruş zamanın yüzdesi
duruş genişliği cm burun-kuyruk eksenine uzaklığı ön veya arka paws
adım uzunluğu cm aynı pençe iki adımlar arasındaki ortalama uzaklığı
adım frekans adımlar/s tam adımlar saniyede sayısı
pençe yerleşim açı değ pençe ile ilgili olarak hayvan burnu-kuyruk ekseninin açısı
ataksi katsayısı yapıyordum SL SL değişkenlik hesaplanan [(max SL-min SL)/demek]
% Paylaşılan duruş duruş % Hind paylaşılan bacak duruş zaman; Her iki arka bacaklarda kemer ile temas halinde aynı zamanda çoğu zaman
pençe sürükle mm2 Ümumi sahəsi kemer üzerinden tam duruş kalkış pençe pençe
bacak yükleme cm2 MAX dA/dT; pençe alan değişim en son aşamasında maksimal oranı
adım açısı değişkenlik değ Standart sapma hind arasındaki açının SL ve SW bir fonksiyonu olarak paws

Tablo 1. Ventral uçak görüntüleme tarafından test edilecek anahtar yürüyüş parametreleri tanımı.

Kemirgen modelleri nörodejeneratif hastalıklar için motor davranışını değerlendirme belirli bir modeli fenotip önem bağlı olarak belirli bir yaşta zor olabilir. Çeşitli hastalıklar, en belirgin PD, gösteri güçlü motor davranış (hareket) açıkları, hem hastaların hem de hayvan modellerinde. PD dört anahtar semptomlar biridir bradikinezi, yaşlanma ile ilerler ve şiddetli yürüyüş bozuklukları içinde zaten PD9erken dönemlerinde ortaya çıkar. Akut PD modelinin kemirgenler (MPTP), 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin ile tedavi çalışmaları zaten VPI yürüyüş analizi10,11,12kullandık. Ancak, bu model akut doğası göz önüne alındığında, bu çalışmalar motor açıkları yaşa bağlı ilerlemesini gidermez. Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda ilerleyen yaş ile hastalık ilerleme anlama alaka vurgulayan örneğin13,14,15, yürüyüş analizi ile nörodejeneratif değişiklikler, yaşlı farelerde yaptık .

Ek olarak motor açıkları, nörodejeneratif hastalıkların hayvan modelleri genellikle muayene görevler üzerinde odaklanan zorluklar ve belirgin bilişsel bozuklukları, özellikle ilerleyen yaş ile göstermek. Böyle bir fenotip motor davranış testleri sonucu etkileyebilir. Yani, bir motor açıkları, rotarod test16, incelemek için en çok kullanılan testlerin biliş, dikkat ve stres17,18dayanmaktadır. Motorlu Koşu bandında yürümek için istekli, Ayrıca bu etmenlere bağlı iken, daha standart bir özellik olduğu kaydedilen eşleştirmeyi çalışıyor ve çok daha az tarafından değiştirilmiş biliş etkilemiştir. Stres ve dikkat etkileri stres ve dikkat19,20SL swing/duruş zamanı gibi belirli parametreleri ama genel çalışan yetenek görülebilir.

Kinematik yürüyüş analizi yaklaşımı daha fazla mücadele kemirgen modelleri için ayarlamak için size seçenekler sahip olmanın avantajı sunmaktadır. Koşu Bandı ayarlanabilir açı ve hızlı hız 0.1 - 99.9 cm yürüyüş sağlar/s, böylece kemirgenler şiddetli yürüme bozukluğu olan hala yavaş bir hızda çalıştırmak mümkün olabilir (~ 10 cm/s). Sigara Engelli hayvanlar ölçülen hızı daha hızlı çalışan (30 - 40 cm/s). Olup olmadığını test hayvanları belli bir hızda çalıştırmak mümkün gözlem sonucunda kendiliğinden sağlar. Ayrıca, kemirgen Ayrıca bir eğim yukarı veya aşağı bir düşüş, koşu bandı için istenen açıda bir Gonyometre yardımıyla devirme ya da fare ya da sıçan hind bacaklarda ağırlıklı bir kızak ekleyerek çalıştırmak için meydan okunabilir.

Yanı sıra çok sayıda çalışma hastalarda mutasyona tek proteinlerin bir son artan farkındalık arızalı endositoz süreci ve ateş13,21,22arasında bağlantılar var, 23,24,25,26,27,28. Fare modelleri düşük seviyelerde olduğu endophilin-A (bundan böyle endophilin), her iki clathrin-aracılı endositoz13,21,29,30,31 yılında önemli bir oyuncu , 32 , 33 , 45 ve clathrin bağımsız endositoz34, ateş ve yaş bağımlı bozuklukları lokomotor aktivite13,21' göstermek için bulunmuştur. Üç genler kodlamak endophilin proteinlerin aile: endophilin 1, endophilin 2 ve endophilin 3. Özellikle, endophilin proteinler tükenmesi kaynaklanan fenotip büyük ölçüde bağlı olarak numarası değişir endophilin genler13,21eksik. Üçlü knock-out (KO) tüm endophilin genlerin sadece birkaç saat sonra Doğum ve her iki endophilin 1 ve 2 başaramamak-e doğru gelişmek ve doğumdan sonra 3 hafta içinde ölmek olmadan fare öldürücü olmakla birlikte, herhangi bir üç endophilins için tek KO için test hiçbir belirgin fenotip gösterir koşullar21. Diğer endophilin mutant genotip sınırlı ömrü göstermek ve yaş13artan motor bozuklukları geliştirmek. Örneğin, endophilin 1KO-2HT-3KO fareler ekran yürüyüş değişiklikler ve (test kinematik yürüyüş analizi ve rotarod gibi) motor koordinasyon problemleri 3 ay-in yaş, onların littermates, süre de zaten endophilin 1KO-2WT-3KO hayvanlar, görüntülemek önemli bir Yaş1315 aylıkken sadece motor koordinasyon azalma. Fenotipleri bu modellerinde geniş çeşitlilik nedeniyle, tanımlamak ve yaş yanı sıra hayvanın motorlu ve biliş yetenekleri karşılık gelen sorunlar çeşitli entegre edebilirsiniz bir testi uygulamak gereklidir. Burada, başlangıç ve motor nörodejeneratif değişiklikler (Yani, endophilin mutantlar) gösterir bir fare modeli Kullan Kullan r arabirimnin ilerlemesini değerlendirmek için kinematik yürüyüş analizi yararlanmak deneysel prosedürler ayrıntılı. Bu yürüyüş parametreleri çeşitli yaş ve hareket bozuklukları farklı severities ölçme içerir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Rapor burada tüm hayvan deneyleri için hayvan refah Avrupa esaslarına göre yürütülmektedir (2010/63/AB) Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), kayıt numarası 14 tarafından onayı ile / 1701.

1. tasarım üzerinde çalışmaya

  1. Hayvan davranışları iş dikkatli planlama gerektirir gibi deney tasarımı sırasında aşağıdaki parametreleri göz önünde bulundurun.
    1. Grup gerekli hayvan sayısı.
      1. İstatistiksel bir yazılım (Örneğin, PASS, EDA veya GPower) gerekli Grup boyutunu hesaplamak için kullanın.
        Not: Hayvanlar ve fenotip şiddeti arasında varyasyon Grup boyutu bağlıdır. Kinematik yürüyüş analizi için fare sayısı genellikle grup başına 10-20 dir.
    2. Deneysel hayvan seks.
      1. Östrojen düzeyleri etkisi deneme, hayvan zorlanma bağlı olarak göz önünde bulundurun.
        Not: Birçok davranış çalışma östrojen düzeyleri etkisi deneme önlemek için erkekler üzerinde odaklanın. Bu etkilerden hayvan arka plan zorlanma bağlı olarak daha fazla veya daha az güçlü.
      2. Her iki cinsiyette kullanılacaksa, seks etkisi için test etmek ve değerlendirmek iki cinsiyetten bağımsız olarak gerekli olduğunda.
    3. Deneysel hayvan çağı.
      1. Eğer sadece tek seferlik noktası gereklidir Yetişkin hayvanlar (2 ay yaş, ve üstü) kullanın.
      2. İlerleyen yaş ile motor davranış değişikliği belirlenmesi için birkaç saat noktaları seçin. En kısa zamanda 1 ay sonra fareler annelerinden sütten kesmek noktasıdır. Hayvanlar düzenli aralıklarla, Örneğin, 1, 2 veya 3 ayda sınayın.
  2. Hayvan davranış testleri gerçekleştirmek için yerel yetkililerden yetkilendirme için geçerlidir.
  3. Test hayvanları tedarik için planlar yapmak.
    1. Bir üreme planı yapın ya da yeterli deneysel hayvan deneyleri ne zamandan beri günde kullanılabilir bir hayvan distribütörü zamanında ulaşın.
    2. Deneyler sırasında yeni bir oda/mekana koymanındaha bir hafta boyunca alıştırmak hayvan izin.

2. video kaydı

Not: kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermek için burada bir piyasada bulunan görüntüleme sistemi ( Tablo reçetesigörmek) eşlik eden görüntüleme ve analiz yazılımı ile kullanılır.

  1. Belgili tanımlık bilgisayar ve belgili tanımlık imge bilgisayar yazılımı başlatın.
  2. Ev onun kafes içinde gözlemleyerek ve bir denge üzerinde ağırlık sağlık durumu ve her hayvan refahı belirler.
  3. Gerektiğinde, hafifçe kırmızı parmak boya hayvanın pençeleri bir fırça ile uygulanır. ~ 5 dk içinde yedek temiz kafes için kuru boya izin.
    Not: boya pençeleri ve vücut arasındaki kontrastı arttırmak için kullanılır gibi hayvanın karın boyama kaçının. Siyah parmak boya düzeltmeler için kullanışlı yararlıdır. Kahverengi kürklü hayvanlar için bu adım gerekli veya kimlik için durumda pençeleri dövme. Bir hayvan pençeleri boyamak için seçilen, tüm hayvanlarda aynı grubu ve kontrol grubu de boyalı gerekir.
  4. Koşu bandı cihazları sağ üst panelde hızını; Birden fazla çalışan hızlı uygulanacaksa, en yavaş hızı ile ilk başlar.
  5. Hayvan test odasında yerleştirin (odası kapatırken kuyruğu ya da pençe sıkma önlemek). Karanlık bir bezle odası kapsar ve 1-2 min için ayarlamak her hayvan olanak sağlar.
  6. Test odası ışıkta koşu bandı ışık döner anahtarı "on" konumuna çevirerek açın. "Koşu başlatmak için iletmek için" koşu bandı çevirmeli anahtar açmak, sonra Imager yazılımındaki "kayıt" düğmesini tıklatın.
    Not: koşu bandı çalışırken, bu hayvan performans dikkatle ve sürekli gözlemlemek önemlidir: hayvan koşu bandı hız ile devam edemez koşu bandı hemen durdurmak veya ilgili olmayan hareket için ikincil belirtiler gösterir (Örneğin, epileptik nöbetler). Test koşulları ayarlamalara gidilmesi gerekir.
  7. Hayvan stabil çalıştığında (taraf, ön veya arka hiçbir hızlı kaçar), kayıt için en az 5 koşu bandı durdurmadan önce s. Imager yazılım "Dur"'ı tıklatarak kaydı durdurmak ve koşu bandı çevirmeli anahtar yeniden "off" konumuna açın.
    Not: hayvanların kararsız çalışmasını önlemek için bu birkaç saniye için izin veya diğer yönde ("ileri" yerine "tersine çevirmek için" koşu bandı çevirmeli anahtar çevirerek) çalışmasına izin vermek yararlı olabilir.
  8. Başlangıç ve bitiş noktası (analiz için kullanılmak üzere) video bölümü ayarlanabilir bir menüyü açmak için ımager yazılımındaki "işleme" düğmesini tıklatın. Bunu yapmak için video aracılığıyla gitmek için ekranın altındaki kaydırıcıyı kullanın.
  9. Geçerli saati başlangıç veya bitiş noktası olarak seçmek amacıyla tıklatın "dan çerçeve #" ve "Kime" sırasıyla. Bölüm en az 7 adımlar/pençe (Toplam 14 adım) stabil sabit bir hızda çalışan hayvanın içerdiğinden emin olun.
  10. Hayvan kimlik, Doğum tarihi, ağırlık ve seks girin. Verileri bilgisayara veya sunucuya istediğiniz bir konuma kaydedin. "Kamera" kayıt arabirimine dönmek için tıklatın.
  11. Birden çok çalışan hızları kaydedilmesi gereken, 2.6-2,10 istenen çalışan hızları ile yineleyin. Sonraki videoyu kaydetmeden önce kırmızı boya pençe, aksi takdirde tekrar adım 2.3 hala mevcut olduğundan emin olun.
  12. Kaydettikten sonra ev onun kafes için hayvan serbest bırakın. Bir hayvan kaldırdıktan sonra koşu bandı kemeri iyice deneysel hayvan için hazırlamak için dezenfektan ardından sabunlu su ile temizleyin.

3. video işleme

  1. Analiz yazılımı başlatın ve "çalışma seçin, klasör" tıklatın kaydedilen videoları ile klasörü seçmek için.
  2. Bir video veya art arda işlenebilir ve "git" tıklayın birkaç video seçin
  3. Fare çalıştığı alanı seçmek için "çizmeye" işlevini kullanın; Bu bölüm yalnızca fare ve beyaz arka plan içermelidir.
  4. "Ters" koşu bandı işlevi daha önce kullandıysanız, seçin "ilgilinin burun sağa doğru olup olmadığını kontrol edin >>>" yazılım sadece sola çalışan hayvanlar analiz için tasarlanmış bu yana video ayna için. "Devam etmek için kabul et"'i tıklatın.
  5. Bkz: varsayılan maskesi ve yazılım algılar Yazdır pençe için "Yenile" işlevini kullanın.
    Not: Orijinal video sol tarafta görüntülenir ve önerilen pati izlerini bir siyah beyaz görüntü hakkıdır.
  6. Analiz için hayvan burnu kırmızı çevresi hariç maskesini değiştirmek için "uzunluk" ve "Genişlik" kutularına değerler girin; renk belgili tanımlık paws için benzer olduğu için o bölgede maskeleme değil yanlışlıkla bir pençe olarak burun alan sınıflandırma yazılım neden olabilir.
  7. Ayarlamak belgili tanımlık sürgü "gürültü filtresi" ve "kürk ve karanlık yamalar" filtre"siyah ve beyaz pençe baskı optimize etmek için. ~ 800-950 Siyah hayvanlar için ve ~ 700-800 bağlı olarak hayvan tam kürk rengi kahverengi ya da beyaz hayvanlar için "gürültü" filtre"kaydırıcıyı ayarlayın. "Ayarları tatmin edici are ok" seçin.
    Not: "Kürk ve karanlık yamalar" filtre"kaydırıcıyı bağlıdır üzerinde nasıl"kırmızı"pençe olduğunu. Boyalı paws için genellikle yaklaşık değerdir 100-120 ve pençeleri olmayan boyaması için en iyi değeri civarındadır 50-100. Bu ayarlar, kürk ve pençeleri renk gölgeleme bağlıdır ve her hayvan için optimize edilmiş olması gerekir. Siyah ve beyaz pençe baskı ile belgili tanımlık paws temiz gösterimleri mümkün olduğunca küçük arka plan gürültü olarak olması gerekir.
  8. İlk ayarlama geçirilen bir veya daha fazla videolar seçin (etiketlenmiş "@" video adından önce) ve bu videolar Analizi başlatmak için "git" işlevini seçin.
    Not: Analiz video başına 2-5 dakika sürer. Bu adımı yok girişten deneyci gerektirdiğinden gecede birkaç video analizi çalıştırmak mümkündür.
  9. Analiz bir video seçin (etiketli "@@@") ve "git" tıklayın Not pençe bölgede (cm2) zaman (yürüyüş dynamics) için ayrı her pençe içinde kemer ile temas şimdi görülebilir. Orijinal video ve hesaplanan pençe seçili alan için yazdırma karşılaştırmak için "video oynatma" işlevini kullanın.
  10. Yazılım tarafından yapılan küçük hataları düzeltmek için aşağıdaki (üç) araçlarını kullanın.
    1. Yanlış bir sinyal, karşılık gelen pençe kemer ile temas olmadığı halde bir sinyal yazılım kayıtları ne zaman Örneğin, silmek için "doğru" seçeneğini kullanın. İlgili alanına yakınlaştırma için bir kez tıklatın ve ikinci tıklatmayla kaldırmak için nesnenin sol kenarlığını ve üçüncü tıklama ile sağ kenarlık işaretleyin.
    2. İki sinyal, pençe kemer ile temas olmasına rağmen sinyal için birkaç kare kaydedildiğinde Örneğin, birleştirmek için "bağlamak" seçeneğini kullanın. İlgili alanına yakınlaştırma ve birleştirmek için iki nesne ortasında çift tıklatın için bir kez tıklatın.
    3. Zaman puan analiz tamamen kaldırmak için "Sil" seçeneğini kullanın. Yalnızca hata "doğru" veya işlev, sol forelimb pençe bir sinyal sol arka bacak pençe için yanlışlıkla kaydedildiğinde Örneğin, "connect" ile sabit olamaz, bu seçeneği kullanın. İlgili alanına yakınlaştırma için bir kez tıklatın ve ikinci tıklatmayla kaldırmak için alan sol kenarlığı ve üçüncü tıklama ile sağ kenarlık işaretleyin.
      Not: Araçlar sadece küçük hataları düzeltmek için kullanılabilir; (bir pençe sinyalini son derece zayıf olsaydımesela ) sistematik hatalar düzeltilmiş olamaz: video analizinden çıkarılmalıdır ve ilgili hayvan kayıt tekrarladı, mümkün olduğunda. Not "video oynatma" seçeneği artık "sonra" temin doğruluğundan emin, "connect" veya "Sil" seçeneği kullanılmıştır ve "geri al" düğmesini tıklatarak tüm 3 düzenleme araçları sıfırlamak.
  11. "Sonraki uzuv" seçin 4 bacaklarda; devam etmek için "sonraki bacak" son pençe sonra tıklandığında, yazılım analiz tamamlar ve 4 ekranlarda bu hayvan için sonuçları gösterir.

4. yürüyüş analizi

  1. Ne zaman tüm videoları bir deneme analiz edilir, tüm videoları seçin ve "sonuçları yeniden düzenlemek" tıklatın sonuçlar (elektronik tablo dosyalarını parametrelerinde listesi) vermek için.
  2. İle bitiş "reorganized_stride_info" dosyasını açın ve bu elektronik tabloda bulunmayan bilgi ekleyin: grup bilgilerini (Örneğin, genotip, tedavi), yaş ve diğerinde kaydedilir ölçüleri hayvan uzunluğu ve genişliği elektronik tablo dosyası ile bitiş "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info."
  3. Gerekli hallerde, hayvan genişliği veya uzunluğu için yürüyüş parametreleri normalize Örneğin, SL hayvan uzunluğunu ve SW için hayvan genişliği için.
  4. Sonuçlarına göre grup, yaş ve çalışan hızlı sıralama: bağımsız olarak tüm bu koşulları analiz.
    Not: Farklı yaş veya çalışan hızları aynı grup içinde birlikte kullanılamaz.
  5. Ortalama (Ortalama) değerler, standart sapma ve her parametre için tüm deneysel koşullar için Ortalama, standart hata hesaplamak.
  6. Deneysel tasarım göre istatistiksel analiz yapmak, Örneğin, bir 2 kuyruklu tkullanın-mutant/tedavi hayvan bir vahşi türüne (WT) karşılaştırmak için test / kontrol veya ANOVA çeşitli bağımsız gruplar karşılaştırmak için.
  7. Bak hiç ölçülen parametreler: daha iyi sonuçları görmek için her parametre çizmek yardımcı olur. Belirli bir parametre istatistiki farklılıkları varsa, bağımlı diğer parametreleri buna bağlı olarak değiştirmek kontrol edin.
    Not: SL belirli bir test grubu içinde önemli ölçüde azalır, (çalışan hızlı aynı olduğu için), bu da daha yüksek bir adım frekans neden olur ve artan bir SW (duruş istikrarı korumak için) neden olabilir.
  8. Bir model için en uygun olan ve/veya insan hastalığında gözlemler karşılaştırılabilir parametreleri seçin. Bir sunuda, her grup için temsilcisi videoları oluşturmak ve onları ince yürüyüş değişiklikler sık sık videolardan açık değildir bu yana göstergesi ilgili parametreleri için gösterilen grafik tarafından tamamlıyor.

5. sorun giderme

Not: Bazı hayvanlar, özellikle fare modelleri bir anksiyete fenotip ile bir koşu bandı üzerinde çalışan gibi bile basit bir görevi gerçekleştirmek için zorluklar olabilir. Alt anksiyete düzeyleri için çekilen ve çalışmasını teşvik adımları şunlardır:

  1. Habituation ve olumlu zorlama.
    1. Doğumdan 2-3 gün önce ilk test test odasında fareyi getirin, karanlık bir bezle kapak ve ışık devre dışı bırakın. Olumlu bir dernek kurulmuş ~ 5 dk. Ekle chow için yeni ortam veya çikolata/fındık ezmesi (Örneğin, Nutella) test odası'na ayarlamak fare izin.
  2. Hava puffs/arka sınır tarafından olumsuz zorlama.
    1. Fareler hava puffs veya bir hareketi arkalarındaki sevmiyorum ve karışıklık uzak çalışır. Çalışan motive etmek için hafif hava puffs veya ritmik çubuğunun hareketi, test odası ön kısmını doğru çalıştırmak için fareyi teşvik etmek için test odası, arka sınır oluşturan esnek kullanın.
  3. Yavaş başlamak.
    1. Hızlı çalışan test ederken hızı, daha düşük bir hızda koşu bandı başlatın ve sonra yavaş yavaş istenen sınama koşulu doğru koşu bandı hızını artırmak.
  4. Serbest dolaşımı en aza indirmek.
    1. Test odası uzunluğu ön ve arka iki ayarlanabilir barlarda ile sınırlıdır. Bir test hayvan ile çalışan hızlı devam ederse ancak giderek çalışmaz, odası 's uzunluğu daha istikrarlı çalışan neden sınırlayın.
  5. Yukarıda belirtilen ölçüler başarılı olmazsa, ertesi gün çalışan kaydetmek. Hayvan hala üç gün sonra test çalışmasına kabul etmiyorsa, bu bulgu olarak kaydetmek ve daha fazla test hayvan hariç.
    Not: İyi kalite video kaydı yürüyüş analizi sonuçlarını bağlıdır. Eğer videoları dikkatle kaydetmiş olduğunuz videoları çözümleme sırasında bırakmak bir sebebi yok. Video kalitesi yetersiz ise, dijital pençe baskı oluşturulması için parametreleri belirlendiğinde bu 3,6 adımı sırasında belli olacak. Pençeleri ve burun dışında diğer vücut parçası kırmızı görünür (Örneğin, cinsel organ veya parmak boya sprinklings karın üzerinde etrafında eksik kürk nedeniyle), kalitesi önemli ölçüde düşer. 3.6. adımda ayarlamaları yalnızca küçük sorunları düzeltmek izin ve bu bir kabul edilebilir sinyal/noise oranı video getiremezsek, video analizinden dışlanmaları gerekir ve kayıt tekrarlanması gerekiyor. Böylece, bu yakında kayıtları gerçekleştirilir sonra videolar analiz etmek için tavsiye edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermek için biz yürüyüş analizi ile yaş, aynı zamanda birden fazla endophilin mutasyona uğramış satır, ilerleyen WT C57BL/6J fareler üzerinde ticari araçları ve yazılım kullanarak gerçekleştirdiyseniz ( tablo için bakınız, Malzemeler). Bu kurulum, yüksek hızlı kamera şeffaf bir koşu bandı altında çalışan bir fare (Şekil 1A) kaydeder. Yazılım daha sonra kırmızı renkli pençeleri ve beyaz ya da siyah kürk arasındaki kontrast tanır. Deneysel hayvanlarımızı koyu kahverengi kürk renk olmadığından, belgili tanımlık paws tüm konuların kırmızı parmak boya ile boyanmış. Deneysel hayvan çalışan farklı hızlarda test ettik: (10 cm/s) yürüyüş, (20 cm/s) ve hızlı (30 cm/s) çalıştıran. Saat koşu bandı üzerinde ve havadaki pençeleri vardı ve temas bölgesinin ölçüldü. Bu bilgileri, yürüyüş ritmi (Örneğin, swing/duruş zaman, fren/itiş) veya duruş (Örneğin, pençe açı, SW) özetlemek parametreler vardı (Şekil 1B) hesaplanır.

Biz yürüyüş analizi birkaç motor davranış testi bir parçası olarak gerçekleştirilen. Kavrama gücü (GS), hind (HLC), clasping uzuv değerlendirildi yürüyüş ve hızlandırılmış rotarod performans (ARR). Motor davranış önceki deneyim ve deneysel testleri olarak etkilenen değil gibi olsa da, örneğin, biliş, bu her hayvan testleri aynı sırada ve aynı yaşta aynı pil tabi hala önemlidir. Sipariş önceki deneyler etkilerden geçerli test en aza indirmek hayvan için yüksek düşük zorluk üzerinden gitmek gerekir.

Endophilin mutantlar için kaç üç endophilin allelleri eksik bağlı olarak bu çalışmada beri seçmiş olduğunuz, elde edilen fenotip yok fenotip tek İstanköy hafif nörodejeneratif fenotip genç endophilin 1KO-2HT-3KO içinde değişir yaşlanma ile ilerler fareler. Bu nedenle, bu hayvan satırları yalnızca hayvanlar yaşta geliştirmek ince değişiklikleri incelemek için yeterli bir modeli mevcut. Çoğu endophilin mutantlar sınırlı bir ömrü göstermek olduğunu göz önüne alındığında, biz 18 (18 aylık süresi noktası bile güçlü görüntüler endophilin 1KO-2HT-3KO satırı farelerde beri seçildi ay boyunca endophilin mutantlar motor davranışını inceledik fenotip, felç yok). Yürüyüş analizi sekiz saat noktalarda bir 18 aylık bir süre içinde (Şekil 1 c) gerçekleştirildi. 18 aylıkken hayvanlara ötenazi ve biyokimyasal ve/veya histolojik analiz için korunmuş.

Fare koloni bakım:

Heterozigoz ve homozigoz farelerin endophilin 1, 2 ve 3 gen için başlangıçta Miloseviç ve arkiçinde bulunduğu rapor edilmiştir. 21 C57BL/6J fareler littermate fareler yanı sıra kontrolleri olarak kullanılmıştır. Fareler yiyecek ve su gruplar halinde en fazla 5 hayvanlar, ad libitum ulaşabilen açık kafesleri bir 12-h açık/koyu döngüsünde yer alan. Sadece erkek fareler bu çalışmada kadın döngüsü bağlı değişimler etkileri dışlamak için kullanılmıştır.

Genotipleme Endophilin A1, A2 ve A3 fare modelleri:

Genotipleme endophilin mutant fare kuyruğu ya da kulak yumruk çıkarılan genomik DNA'yı kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon tarafından gerçekleştirildi. Üç endophilin-A genler için PCR ile ilgili astar gerçekleştirilen: endophilin-A1: ileri astar 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' ve ters astar 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' için WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' için KO; endophilin-A2: ileri astar 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' için WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' KO ve ters astar 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' için WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' için KO; endophilin-A3: ileri astar 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' ve ters astar 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' için WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3' KO için. Elde edilen PCR ürünleri farklı grup boyutları WT ve KO gen için verimli bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırılan: endophilin-A1 WT ~ 384 bit/sn, KO ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1,280 bps, KO ~ 1000 bps; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bit/sn. PCR ürünleri WT ve KO şeritli Heterozigoz (HT) hayvan gösterir.

Sonuçlar:

Yürüyüş ve duruş WT farelerde ilerleyen yaş ile karakterize etmek için biz kinematik yürüyüş analizi bu hayvanlar (Şekil 2; gerçekleştirdiyseniz Film 1). Süre bazı parametreler, örneğin SW (ortalama arasındaki mesafe ön plana veya hind hayvan genişliği için normalleştirilmiş ekstremitelerde; Ayrıca bkz. Tablo 1), ilerleyen yaş ile WT hayvanlarda değişmeden kalır, diğer parametreleri aşamalı olarak değiştirmek (Şekil 2A- C). örnek olarak, arka bacak çift kişilik destek (zaman her iki arka bacaklarda aynı zamanda zemin ile temas halinde olan duruş süresi göreli) 38'den % 18 ay (Şekil 2B) % 55 1 ay artırır. Bu parametre kez duruş istikrarsızlık35ile ilişkilidir. Ayrıca, bacak yükleme (en son aşamasında pençe çevrenin değişim maksimal oranı) 59 cm2/s 1 ay 18 ay (Şekil 2C) 38 cm2/s artar. Hızlı yavaşlama azaltılmış kas gücü için bir göstergesi olarak yorumlanabilir. Genel çalışan yetenek (%94 30 cm/s 18 ayda, Şekil 3Açalıştırmak mümkün) WT hayvanlarda etkilenmez. Etkilenmemiş kalır veya yaş WT farelerde ilerleyen ile aşamalı olarak değiştiren yürüyüş ve duruş parametreleri karakterize ek olarak, biz VPI kullanarak kinematik yürüyüş analizi hafif değişiklikler yaşa bağlı eğitim için uygun bir yöntem olduğunu belgeledi yürüyüş ve duruş.

Genel çalışan yetenek WT hayvanlarda değil etkilenir, birkaç endophilin mutant satırları Murdoch ve ark. bildirildiği gibi yürümek veya çalıştırmak Motorlu Koşu bandı (Şekil 3A), değiştirilmiş yetenek göster 13 tarihinde daha küçük veri kümesi. 1 ayda bütün endophilin 1KO-2HT-3KO fareler her 30 cm/s çalıştırmak mümkün olmakla birlikte, özellikle, 18 ayda aynı hayvanların % 81'i çalıştırmak mümkün değildir (Şekil 3A, Not daha büyük tabur 13' te daha önce rapor olanlardan daha analiz edildi). İlginçtir, daha az endophilin allelleri (Yani, endophilin 1KO-2HT-3WT) eksikliği endophilin mutantlar da etkilenir, ama daha düşük derecede (Şekil 3A).

Endophilin 1KO-2HT-3KO mutantlar ilerleyen yaş13ile ağır motor bozuklukları göstermek olsa bile, birkaç yürüyüş parametre WT denetim ile karşılaştırıldığında da 18 ay yaşında değişmez. Örneğin, adım açısı değişkenliği (adım açısı standart sapması) değişmeden (Şekil 3B) kalır. Özellikle, diğer pek çok parametre, örnek itmek için süre (belgili tanımlık paws itiş aşamasındadır duruş süresi yüzdesini), 1 ayda farklı değildir, ama giderek yaşlanma ile daha kötü hale (Şekil 3 c; Ayrıca Film 2bakınız). Bu hem yaş bağımlı parametreleri hem de nörodejeneratif mutant özel değişkenleri kinematik yürüyüş analizi yaklaşımı ile okudu olabilir göstermektedir.

Figure 1
Şekil 1. Ventral uçak görüntüleme kurulum ve prensip. (A)fotoğraf ve şematik bir yürüyüş analizi kurulumu çizim. (B) analiz yazılım ilkesi: şeffaf bir koşu bandı üzerinde çalışan bir fare kaydedilen alt--dan belgili tanımlık bilgisayar yazılımı dijital pençe izleri hesaplar. Onların dynamics koşma sırasında alanı boyutu zaman içinde pençe gibi ölçülür ve bu yürüyüş ritmi hesaplamak ve parametreleri duruş için temel olarak kullanılır. (C) zaman ders yürüyüş analiz deneme endophilin mutantlar üzerinde gerçekleştirilen. Hareket ve yürüyüş 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 ve 18 aylıkken değerlendirildi. Resimleri endophilin 1KO-2HT-3KO fare 2, 12 ve 18 ay göster. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2. Yürüyüş analizi ilerleyen yaş ile vahşi tipi farelerde. 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 ve 18 aylıkken hareket ve yürüyüş WT (C57BL/6J) farelerde değerlendirildi. (A) duruş genişliği WT hayvanlar hayvan genişliği için normalleştirilmiş ilerleyen yaş ile değişmez. (B) hind uzuv çift kişilik destek yaş WT hayvanlarda oranda artar. Grafik, her iki arka bacaklarda yere aynı anda vardır duruş süresi yüzdesini gösterir. Bu parametre bir artış yürüyüş istikrarsızlık yansıtır. (C) (maksimal oran en son aşamasında pençe çevrenin değişimi) yükleme uzuv yaş WT hayvanlarda oranda artar. Daha hızlı yavaşlama azaltılmış kas gücü bir göstergesi olabilir. Tüm grafikler ortalama değer ± SEM temsil eder; p değerleri 2 kuyruklu thesaplanan-testleri karşı 1 - eski ay WT ve olarak gösterilir * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3. Yürüyüş endophilin mutantlar ilerleyen yaş ile analizde. (A) çalışan hızlı endophilin mutant 1, 12 ve 18 ay, Murdoch vd ile karşılaştırıldığında bir genişletilmiş veri kümesi hesaplanan 13 bar renkler hayvanlar 30 (koyu mavi), 20 (mavi) veya 10 cm/s (açık mavi) Motorlu Koşu bandı üzerinde çalıştırmak veya (gri) Kur'u reddetme yüzdesini yansıtır. Tüm test hayvanları 30 m/s 1 ay çalıştırabilirsiniz iken, onlar yaş olarak açıkları çalışan endophilin mutantlar geliştirmek. (B-C) Adım değişkenlik açı ve zaman içinde WT (siyah), endophilin 1KO-2WT-3WT (turquois), endophilin 1KO-2HT-3WT (koyu mavi) ve endophilin 1KO-2HT-3KO (kahverengi) fareler itmek. Adım açısı değişkenlik WT hayvanlar yaşlanma veya WT ve endophilin mutantlar arasında hiçbir fark gösterir. Uskur saat (gibi duruşu yüzdesi) önemli ölçüde endophilin mutantlar ve WT arasında 1 ay değiştirilmez ancak endophilin mutantlar fareler yaş azaltır. Tüm grafikler ortalama değer ± SEM temsil eder; p değerleri 2 kuyruklu thesaplanan-yaş eşlemeli WT karşı test eder ve olarak gösterilir * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Movie 1
Film 1. Yürüyüş analizi vahşi-türü (C57BL/6J) Mouse 3 (solda) ve 18 ay-in yaş (sağda). Orijinal video (üst) bir "dijital pençe baskı" video (alt) çevrilir. Böylece ayrıntıları daha iyi takdir edilebilir video hızlı aşağı 5 kez yavaşladı. 18 aylık zaman noktada, sağ arka pençe (dijital pençe baskı kırmızı) tereddüt ~ 2 Not s ve sağ ön pençe (mavi dijital pençe baskı olarak) ~ 4, s. Video hızı 10 katına yavaşladı. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Movie 2
Film 2. Endophilin 1KO-2WT-3WT (denetim; sol) endophilin 1KO-2HT-3KO (sağda) fareler karşı analizde 18 ayda yürüyüş. Ayrıntılar daha iyi takdir yüzden video hızlı 5 katına yavaşladı. Endophilin 1KO-2HT-3KO fare daha az görülebilir yürüyüş değişiklikler görüntüler istikrarlı koşma hayvan. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Motor koordinasyon eğitim modelleri özellikle içinde ciddi motor koordinasyon etkilenir PD gibi hastalıklar için nörodejeneratif hastalıkların karakterizasyonu yararlı bir yaklaşımdır. Kinematik yürüyüş analizi fonksiyonel tahlil yardımıyla, zayıf ateş ve dolayısıyla nispeten mütevazı fenotip ile yürüyüş hayvanların hareket sorunları başlangıcı veya modelleri ince değişiklikleri belirlemek için. Fenotipleri çeşitli küçük yürüyüş anormallikleri ve ağır hareket bozuklukları kapsar nörodejeneratif hastalıkların çeşitli modelleri göz önüne alındığında, bu yöntem yürüyüş parametreleri hayvanın yaşı ve hareket yeteneği dayalı değerlendirmek için de uygundur. Ciddi bir şekilde zarar görür hayvanlar bir yokuş yukarı çalışan Engelli daha az modelleri kaydedilebilir iken uçak koşu bandı veya yüksek hızda yokuş aşağı vasıl a alçak hız yürüyüş kaydedilebilir. Bu hayvanlar overexerting olmadan nörodejeneratif modeli, littermate denetimi arasındaki yürüyüş farklılıkları ortaya çıkarabilir.

Bu iletişim kuralıyla, farelerde yaşlanma ile motor bozuklukları gelişimini izlemek için VPI yöntemi adequateness göstermektedir. Yaşları ilerledikçe test WT fareler birden fazla zaman noktalarda yaş bağımlı yürüyüş anormallikleri tanımlamak ve nasıl onlar yaşlanma ile ilerleme karakterize bize sağladı. Ayrıca, fare modelleri için ateş işlerken kez sunan bu motor davranış (Örneğin, anksiyete, apati, öğrenme güçlükleri), ilgili olmayan belirtiler nedeniyle çıkıştır bile basit bir gerçekleştirmek için istekli hayvan görev çalışan gibi motor, azalır. Burada, biz yöntemi değişiklikleri ve fare satırları nörodejeneratif değişiklikler ile yaşlanma için kinematik yürüyüş analizi başarıyla uygulamak yararlı olabilir ışıklı Motorlu Koşu bandı üzerinde çalışan teşvik etmek için motivasyon araçları öneririz. Ayrıca, hayvanın pençeleri ve önemli ölçüde kaydedilen verilerin kalitesini artırmak için yardımcı olabilir göstermek için parmak boya uygulanması basit bir hile kullanın. İyi video kayıtları elde etmek olduğunu yürüyüş analizi en kritik adım: analiz başarısı, her otomatik veya yarı otomatik analizi görüntülere veya videolara gibi ham veri kalitesine bağlı. Düşük kaliteli videolar analiz sonraki adımlarında, geliştirilmiş olamaz ve genellikle Analizi işleminden dışlanması gerekir.

Sistematik olarak yürüyüş ve duruş WT ve birkaç endophilin mutant hatları 18 ay span üzerinden okurken, biz bile WT fareler ve fareler hiçbir açık hareket/running sorunları (Yani, endophilin 1KO-WT-WT), ile göstermek içinde değişiklikler fark ettim çeşitli yürüyüş ve duruş parametreleri aşamalı bir şekilde (Şekil 2 ve Şekil 3A) ilerleyen yaş ile. İlginçtir ki, biz de anormallikleri endophilin mutantlar yaşlanma gözlenen çeşitli yürüyüş ve duruş parametrelerinin aynı yönde geliştirmek ve yamaç WT/denetim hayvanlar olduğu gibi iken, diğerleri yok fark ettim (Şekil 3). Son olarak, yaşlı WT fareler ve Genç endophilin mutantlar herhangi bir açık hareket, yürüyüş ve göz tarafından gözlenen duruş kusurları bile görüntülenmiyorsa, seçici yürüyüş ve duruş Parametrelerindeki değişiklikler bu yaklaşım ile algılanabilir unutmamak gerekir.

Fare motor davranış testleri bir fare modeli önemli yönü bir insan durumun bildirimlerini göstermek için en kapsamlı yollarından biridir. Sonuç olarak, bir dizi testler motor davranış çeşitli yönlerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu testler açık alan testi (genel lokomotor aktivite), rotarod (motor koordinasyon, ataksi) dahil, kavrama gücü tel testi (dayanıklılık), görev (ince motor koordinasyon, yürüyen merdiven ışın asılı tekerlek (etkinlik), çalışan (kas gücü), sensorimotor beceri), yürüyüş analizi (hareket, bacak koordinasyon) ve diğerleri (Wahlstein36özetlenmiştir). Farklı testler belirli avantajları ve dezavantajları ve onların okuma genellikle sınırlı motor davranış adresine tasarlanmıştır boy (veya yönleri) vardır. Bu nedenle, bu alan ana yönlerini kapsayacak şekilde motor davranış testi gerçekleştirmek için yaygın bir uygulama haline gelmiştir.

Yürüyüş analizi bu piller kısmen nedeniyle bir rapor Guillot al. tarafından bulunmaz kez 37, yürüyüş analizi motor açıkları hayvan modellerinde PD ve ALS ve kısmen zahmetli yöntemi ve sınırlı çıkış nedeniyle algılamaz bulundu. Ancak, Guillot ve ark. rapor çalışma tasarım38bazı sınırlamaları adresleri research tarafından itiraz edildi. Ateş ile fare modellerinde yürüyüş analizi bu yöntemde yararlılığı son yayınlar10,11,12,39,40 bir dizi tarafından gösterilmiştir da bizim iş13dahil olmak üzere ,41,42,43,.

VPI kayıtları pençeleri ile mürekkep boyama ve kağıt44beyaz bir levha üzerinde çalıştırmak fare icar geleneksel yöntem çeşitli avantajlar ile gel. En belirgin birkaç yürüyüş parametreleri1üzerinde güçlü bir etkisi vardır Motorlu Koşu bandı ile çalışan hızlı hayvan kontrol edilir, gerçek şu ki. Buna ek olarak, bazı yürüyüş anormallikleri sadece ne zaman zorlu bir yüksek hız ve/veya bir eğim/gönüllü çalışan görülen değil düşüş, hayvan çalışır tespit haline. Ayrıca, ayrıntılı analizi el ile bir yarı otomatik, yüksek üretilen iş analizi ile değiştirilir. Bu nedenle, her grupta test hayvan sayısı, hangi sırayla yaşayan hayvanlarda kaçınılmazdır değişkenliği nedeniyle etkisini azaltır artırılabilir. Özetle, ateş ve/veya yaşlanma kemirgen modellerinde motor bozuklukları analizi tamamlamak üzere standart motor test piller VPI yürüyüş analizi değiştirilmiş versiyonu dahil öneririz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Acknowledgments

Hayvan hademe ENI'ın hayvan tesisi üreme ile ilgili yardım ve Dr Nuno Raimundo el yazması yararlı yorumlar için teşekkür ediyoruz. Sohbet ortak araştırma merkezi SFB-889 (proje A8) aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı (DFG) ve SFB-1190 (proje P02) ve Emmy Noether Genç Araştırmacı ödülü gelen hibe tarafından desteklenmektedir (1702/1). C.M.R. sinir, Biyofizik ve moleküler Biosciences (GGNB) için bursu Göttingen Enstitü tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DigiGait Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware
non-transparent blanket or dark cloth cover the test chamber to reduce the animal's feeling of exposure/stress
balance e.g. Satorius balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g
red finger paint e.g. Kreul or Staedtler for increasing the contrast between paws and animal’s body
small paint brush soft brush to apply finger paint to the animal paws
diluted detergent for cleaning
disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol e.g. B.Braun for desinfection

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Clarke, K. A., Still, lJ. Gait analysis in the mouse. Physiology and Behavior. 66, 723-729 (1999).
  2. Kale, A., Amende, I., Meyer, G. P., Crabbe, J. C., Hampton, T. G. Ethanol's effects on gait dynamics in mice investigated by ventral plane videography. Alcohol Clin Exp Res. 28 (2), 1839-1848 (2004).
  3. Amende, I., Kale, A., McCue, S., Glazier, S., Morgan, J. P., Hampton, T. Gait dynamics in mouse models of Parkinson's disease and Huntington's disease. J Neuroeng Rehabil. 25, 2-20 (2005).
  4. Herbin, M., Hackert, R., Gasc, J. P., Renous, S. Gait parameters of treadmill versus overground locomotion in mouse. Behavioural Brain Res. 181 (2), 173-179 (2007).
  5. Powell, E., Anch, A. M., Dyche, J., Bloom, C., Richtert, R. R. The splay angle: A new measure for assessing neuromuscular dysfunction in rats. Physiol Behav. 67 (5), 819-821 (1999).
  6. Blin, O., Ferrandez, A. M., Serratrice, G. Quantitative analysis of gait in Parkinson patients: increased variability of stride length. J Neurol Sci. 98 (1), 91-97 (1990).
  7. Švehlík, M. D., et al. Gait Analysis in Patients With Parkinson's Disease Off Dopaminergic Therapy. Arch Phys Med Rehabil. 90 (11), 1880-1886 (2009).
  8. Roome, R. B., Vanderluit, J. L. Paw-dragging: a novel, sensitive analysis of the mouse cylinder test. J Vis Exp. (98), e52701 (2015).
  9. Roiz Rde, M., Cacho, E. W., Pazinatto, M. M., Reis, J. G., Cliquet, A. Jr, Barasnevicius-Quagliato, E. M. Gait analysis comparing Parkinson's disease with healthy elderly subjects. Arg Neuropsiquiatr. 68 (1), 81-86 (2010).
  10. Wang, X. H., et al. Quantitative assessment of gait and neurochemical correlation in a classical murine model of Parkinson's disease. BMC Neurosci. 13, 142 (2012).
  11. Lao, C. L., Kuo, Y. H., Hsieh, Y. T., Chen, J. C. Intranasal and subcutaneous administration of dopamine D3 receptor agonists functionally restores nigrostriatal dopamine in MPTP-treated mice. Neurotox Res. 24 (4), 523-531 (2013).
  12. Zhao, Q., Cai, D., Bai, Y. Selegiline rescues gait deficits and the loss of dopaminergic neurons in a subacute MPTP mouse model of Parkinson's disease. Int J Mol Med. 32 (4), 883-891 (2013).
  13. Murdoch, J. D., et al. Endophilin-A deficiency induces the FoxO3a-Fbxo32 network in the brain and causes dysregulation of autophagy and the ubiquitin-proteasome system. Cell Rep. 17 (4), 1071-1086 (2016).
  14. Dai, M., et al. Progression of Behavioral and CNS Deficits in a Viable Murine Model of Chronic Neuronopathic Gaucher Disease. PLoS One. 11 (9), e0162367 (2016).
  15. Szalardy, L., et al. Lack of age-related clinical progression in PGC-1α-deficient mice - implications for mitochondrial encephalopathies. Behav Brain Res. , 272-281 (2016).
  16. Rustay, N. R., Wahlsten, D., Crabbe, J. C. Influence of task parameters on rotarod performance and sensitivity to ethanol in mice. Behavioural Brain Research. 141 (2), 237-249 (2003).
  17. Majdak, P., et al. A new mouse model of ADHD for medication development. Sci Rep. 6, 39472 (2016).
  18. Ishige, A., Sasaki, H., Tabira, T. Chronic stress impairs rotarod performance in rats: implications for depressive state. Behavior. (1-2), 79-84 (2002).
  19. Fukui, D., Kawakami, M., Matsumoto, T., Naiki, M. Stress enhances gait disturbance induced by lumbar disc degeneration in rat. European Spine Journal. 27 (1), 205-213 (2017).
  20. Stuart, S., Galna, B., Delicato, L. S., Lord, S., Rochester, L. Direct and indirect effects of attention and visual function on gait impairment in Parkinson's disease: influence of task and turning. Eur J Neuroscience. 46 (1), 1703-1716 (2017).
  21. Milosevic, I., et al. Recruitment of endophilin to clathrin coated pit necks is required for efficient vesicle uncoating after fission. Neuron. 72 (4), 587-601 (2011).
  22. Shi, M., et al. Identification of glutathione S-transferase pi as a protein involved in Parkinson disease progression. Am. J. Pathol. 175 (1), 54-65 (2009).
  23. Arranz, A. M., et al. LRRK2 functions in synaptic vesicle endocytosis through a kinase-dependent mechanism. J. Cell Sci. 128, 541-552 (2015).
  24. Quadri, M., et al. Mutation in the SYNJ1 gene associated with autosomal recessive, early-onset Parkinsonism. Hum. Mutat. 34 (9), 1208-1215 (2013).
  25. Krebs, C. E., et al. The Sac1 domain of SYNJ1 identified mutated in a family with early-onset progressive Parkinsonism with generalized seizures. Hum. Mutat. 34 (9), 1200-1207 (2013).
  26. Edvardson, S., et al. A deleterious mutation in DNAJC6 encoding the neuronal-specific clathrin-uncoating co-chaperone auxilin, is associated with juvenile parkinsonism. PLoS ONE. 7 (5), e36458 (2012).
  27. Cao, M., Milosevic, I., Giovedi, S., De Camilli, P. Upregulation of parkin in endophilin mutant mice. J neurosci. 34 (49), 16544-16549 (2014).
  28. Cao, M., et al. Parkinson sac domain mutation in synaptojanin 1 impairs clathrin uncoating at synapses and triggers dystrophic changes in dopaminergic axons. Neuron. 93 (4), 882-896 (2017).
  29. Farsad, K., Ringstad, N., Takei, K., Floyd, S. R., Rose, K., De Camilli, P. Generation of high curvature membranes mediated by direct endophilin bilayer interactions. J. Cell Biol. 155, 193-200 (2001).
  30. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. The SH3p4/Sh3p8/SH3p13 protein family: binding partners for synaptojanin and dynamin via a Grb2-like Src homology 3 domain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94 (16), 8569-8574 (1997).
  31. Ringstad, N., et al. Endophilin/SH3p4 is required for the transition from early to late stages in clathrin-mediated synaptic vesicle endocytosis. Neuron. 24 (1), 143-154 (1999).
  32. Ringstad, N., Nemoto, Y., De Camilli, P. J. Differential expression of endophilin 1 and 2 dimers at central nervous system synapses. Biol. Chem. 276 (44), 40424-40430 (2001).
  33. Verstreken, P., et al. Endophilin mutations block clathrin-mediated endocytosis but not neurotransmitter release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  34. Boucrot, E., et al. Endophilin marks and controls a clathrin-independent endocytic pathway. Nature. 517, 460-465 (2015).
  35. Takezawa, N., Mizuno, T., Seo, K., Kondo, M., Nakagawa, M. Gait disturbances related to dysfunction of the cerebral cortex and basal ganglia. Brain Nerve. 62 (11), Article in Japanese 1193-1202 (2010).
  36. Wahlsten, D. Mouse Behavioral Testing: How to Use Mice in Behavioral Neuroscience. , Academic Press. (2010).
  37. Guillot, T. S., Asress, S. A., Richardson, J. R., Glass, J. D., Miller, G. D. Treadmill Gait Analysis Does Not Detect Motor Deficits in Animal Models of Parkinson's Disease or Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Mot Behav. 40 (6), 568-577 (2008).
  38. Hampton, T. G., Amende, I. Treadmill gait analysis characterizes gait alterations in Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis mouse models. J Mot Behav. 42 (1), 1-4 (2010).
  39. Glajch, K. E., Fleming, S. M., Surmeier, D. J., Osten, P. Sensorimotor assessment of the unilateral 6-hydroxydopamine mouse model of Parkinson's disease. Behav Brain Res. 230 (2), 309-316 (2012).
  40. Takayanagi, N., et al. Pelvic axis-based gait analysis for ataxic mice. J Neurosci Methods. 219 (1), 162-168 (2013).
  41. Zhou, M., et al. Gait analysis in three different 6-hydroxydopamine rat models of Parkinson's disease. Neurosci Lett. 584, 184-189 (2015).
  42. Geldenhuys, W. J., Guseman, T. L., Pienaar, I. S., Dluzen, D. E., Young, J. W. A novel biomechanical analysis of gait changes in the MPTP mouse model of Parkinson's disease. PeerJ. 3, e1175 (2015).
  43. Baldwin, H. A., Koivula, P. P., Necarsulmer, J. C. Step Sequence is a Critical Gait Parameter of Unilateral 6-OHDA Parkinson's Rat Models. Cell Transplant. 26 (4), 659-667 (2017).
  44. Carter, R. J., Morton, J., Dunnett, S. B. Motor coordination and balance in rodents. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8: Unit 8.12 (2001).
  45. Milosevic, I. Revisiting the Role of Clathrin-Mediated Endocytosis in Synaptic Vesicle Recycling. Front Cell Neurosci. , (2018).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 136 yaşlanma yürüyüş analizi hareket ateş endositoz endophilin motor davranış motor test piller ventral uçak görüntüleme
Yaş bağımlı Motor bozuklukları ile ateş farelerde, yürüyüş analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait… More

Rostosky, C. M., Milosevic, I. Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration. J. Vis. Exp. (136), e57752, doi:10.3791/57752 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter