Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Visualisering av bakterieflora i Tick Guts av hele-mount In Situ hybridisering

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57758

Summary

Her presenterer vi en protokoll for romlig og timelig vurdere tilstedeværelsen av levedyktig bakterieflora i kryss guts med en modifisert hele-mount i situ hybridisering tilnærming.

Abstract

Infeksjonssykdommer overføres av leddyr vektorer fortsatt utgjør en betydelig trussel mot helse over hele verden. Patogen som forårsaker disse sykdommene, finnes ikke i isolasjon når de kolonisere vektoren; snarere delta de sannsynlig i samhandling med bosatt mikroorganismer i tarmen lumen. Vector bakterieflora har vist seg for å spille en viktig rolle i patogen overføring for flere vektor-sykdommer. Om bosatt bakterier i tarmen av Ixodes scapularis flåtten, vektoren for flere human patogener inkludert Borrelia burgdorferi, påvirke tick overføring av patogener er ikke bestemt. Vi krever metoder for å karakterisere sammensetningen av bakterier assosiert med tick tarmen til rette for en bedre forståelse av potensielle interspecies interaksjoner i kryss tarmen. Bruker hele-mount i situ kan hybridisering visualisere RNA transkripsjoner forbundet med bestemt bakterie-art for innsamling av kvalitative data om overflod og distribusjon av bakterieflora i intakt vev. Denne teknikken kan brukes til å undersøke endringer i tarmen bakterieflora miljøet i løpet av tick fôring og kan også brukes til å analysere uttrykk for tick gener. Farging av hele tick guts gir informasjon om brutto romlige fordelingen av målet RNA i vevet uten behov for 3-dimensjonal modell og er mindre påvirket av miljøforurensning, som ofte forundrer sekvensering-basert metoder brukes ofte til å studere komplekse mikrobielle samfunn. Total, denne teknikken er et verdifullt verktøy som kan brukes til å bedre forstå vektor-patogen-bakterieflora interaksjoner og deres rolle i sykdommer overføring.

Introduction

Mennesker og husdyr patogener som overføres av leddyr vektorer finnes over hele verden og står for omtrent 20% av infeksjonssykdommer globalt1, men effektive og trygge vaksiner mot de fleste av disse patogener er ikke tilgjengelig. Vår forståelse av den viktige rollen av commensal, symbiotisk og sykdomsfremkallende mikroorganismer, kollektivt kjent som microbiome2, i modulerende og forme helsen til nesten alle Metazoer3 utvider. Nå er det klart at leddyr vektorer av patogener også havn tarmen bakterieflora og disse vektor-assosiert bakterieflora har blitt vist å påvirke ulike vektor-patogener4,5. Leddyr microbiome består av eubacteria, archaea, virus og eukaryotic mikrober som protozoer og nematoder sopp6. Men har dominerende fokus vært på eubacteria skyldes, delvis til tilgjengeligheten av markør gener og referanse databaser til å identifisere bestemte bakteriell medlemmer.

Med fokus på Ixodes scapularis, tick vektoren for flere human patogener inkludert Borrelia burgdorferi7, det forårsaker agenten av Lyme sykdom, optimalisering av en mikrobiell visualisering teknikk var rettet mot forbedre vår forståelse av tick tarmen bakterieflora i sammenheng med vektor-patogen interaksjoner. Flere spørsmål gjenstår å bli besvart i feltet tick microbiome. Tarmen er stedet for det første utvidede møtet mellom haken og innkommende patogen i sammenheng med vannrett overførte patogener; Derfor vil forståelsen av vektor tarmen bakterieflora i modulerende vektor-patogen interaksjoner avdekke meningsfull innblikk. Flått har en unik modus blod måltid fordøyelsen, hvor behandlingen av blod måltid komponenter tar sted intracellulært8. Gut lumen tilsynelatende fungerer som et fartøy som skal inneholde blod måltid som tick feedene, og næringsstoffer fordøyelse og assimilering følge gjennom flere dager fôring og fortsette etter repletion. Patogener kjøpt av flåtten under mating angi gut lumen sammen med bloodmeal og dermed lumen blir en hovedwebområdet av interaksjon mellom aksemerker, patogen og bosatt bakterieflora. Som fordøyelsen fortsetter gjennom repletion og Ixodid sjekke molting, gjennomgår tarmen strukturelle og funksjonelle endringer9. Sammensetning og romlig organisering av gut bakterier er også sannsynlig å variere sammen med skiftende gut miljøet. Derfor er det viktig å forstå arkitektur bosatt bakterier i tarmen tick å forstå samspillet mellom aksemerker, patogen og tarmen bakterieflora.

Molekylær teknikker å beskrive vert-assosiert bakterieflora rutinemessig benytte høy gjennomstrømming parallelle sekvenser strategier10 for å forsterke og sekvens bakteriell 16S ribosomal DNA (rDNA). Disse sekvensering strategier omgå behovet for å få axenic kulturer av spesifikke bakterier og gi en detaljert beskrivelse av alle bakteriell medlemmer representert i utvalget. Likevel er slike strategier forvirret av det manglende evne å skille miljømessige forurensing fra bona fide beboere. Videre når vurdere utvalgene, for eksempel flått, som er små i størrelse og dermed inneholder lav bakterieflora-spesifikke DNA gir, sannsynligheten av forsterkning av miljøgifter er økt11 og gir tvetydig tolkningen av Microbiome komposisjon. Funksjonell karakteristikk i forbindelse med visualisering av spesifikke levedyktig bakterier vil derfor være avgjørende for å definere og skjelne microbiome av flåtten timelig og romlig. Mot dette målet tok vi fordel av hele-mount RNA i situ hybridization. Denne teknikken brukes rutinemessig å vurdere genet uttrykk mønstre i organer og embryo12,13,14 og lar semiquantitative analyse av uttrykk over hele utvalget av interesse. Dette er forskjellig fra tradisjonell i situ hybridisering teknikker som utnytter vev deler og krever ofte omfattende analyse av delt materiale med en beregningsorientert samling å forutsi uttrykk i hele organer15. Mens hele-mount refererer vanligvis til hele organismer12, refererer her hele-mount til hele guts eller organer. Fordelene med å bruke hele-mount RNA i situ hybridisering tilnærmingen for å vurdere arkitektur tick tarmen bakterieflora er mangfoldige. Tick tarmen består av 7 diverticula, hvert par varierer i størrelse16. De funksjonelle forskjellene, sjekke hvis noen, blant disse diverticula, ikke er forstått i sammenheng med tick biologi, bakterieflora eller kryss-patogen interaksjoner. Manipulering av tarmen som ruptur gut diverticula vil fortrenge bakterieflora i tarmen lumen eller de løst med gut og resultatet i feiltolkning av den romlige lokaliseringen av bakterieflora. Fluorescens-merket RNA i situ hybridisering har vært benyttet tidligere for å undersøke tick gut transkripsjoner17 ved å feste og åpne personlige gut diverticula å sikre sonde hybridisering og lokalisere B. burgdorferi transkripsjoner av skjæring parafin-embedded hele flått18. Begge disse metodene krever manipulasjoner av tick vev før hybridisering som vil påvirke gut microbiota arkitektur.

I denne rapporten beskrive vi i detalj protokollen for å undersøke levedyktig tick tarmen bakterieflora bruker hele-mount i situ hybridisering (WMISH). Bruk av hele-mount RNA i situ hybridisering muliggjør en global forståelse av nærværet og overflod av bestemte gut bakterier i forskjellige regioner i tarmen og kan anspore ny innsikt i kryss gut biologi i sammenheng med patogen kolonisering og overføring. Videre oppdages bruk av RNA sonder rettet mot bestemte bakteriell RNA av levedyktig bakterier i tarmen tick.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse av DNA maler

  1. Dataoverføre 16S rRNA sekvensen bestemt å hver bakteriell slekter fra den NCBI databasen og design polymerasekjedereaksjons (PCR) kompatibel frem og reversere primere som vil forsterke slekter-spesifikke områder (~ 200-250 base par lang) som beskrevet tidligere 19. også referere til åpen kildekode-databaser SILVA20,21 og probeBase22 online ressurser for rRNA målrettede oligonucleotide prober og grunning som RNA sonder for noen bakteriell slekter kan være kommersielt tilgjengelig.
    Merk: Det er viktig å velge genet områder som er spesifikke for spesifikke slekter og sikre at designet primere ikke forsterke bakteriell lever. Dette er viktig å få genet/slekter-spesifikke sonde hybridisering.
  2. Mate flått 24, 48 og 72 h på mus, dissekere tick guts og forberede RNA og cDNA fra tick guts som beskrevet tidligere23. Bruk cDNA som mal til PCR forsterke slekter-spesifikke amplicons med en thermocycler. Kjøre en aliquot av PCR-produkt/amplicon på en 1,5% agarose gel og Bekreft at amplicon tilsvarer den forventede størrelsen av visualisering under ultrafiolett (UV) lys med en gel tenkelig system.
  3. Klone bakteriell 16S ribosomal RNA amplicon rundt i en kommersielt tilgjengelig TA vektor (Tabell for materiale) som inneholder RNA polymerase arrangører egnet for bacteriophage polymerases (SP6, T7 eller T3). Sekvens kloner for å bekrefte identiteten til amplicon og retningen av klone med hensyn til hver av arrangørene. Basert på dette, fastslå selskapet ønsker å generere følelse eller antisense RNA sonder (figur 1).
  4. Linearize 1 mg plasmider med et passende begrensning enzym i en reaksjon volum på opptil 30 µLfor 2t ved temperaturer anbefalt av produsenten. Velg begrensning enzymer basert på selskapet som skal benyttes for å generere følelse eller antisense sonde (figur 1). Kontrollere linearization ved visualisering av 2 µL av ufullstendig reaksjon på en 1% agarose gel.
  5. Rense den resterende 28 µL av fordøyd DNA ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig PCR produktet kolonnen rensing kit og kvantifisere DNA konsentrasjon av spektrofotometeret.
    Merk: Noen følelse sonder kan forårsake bakgrunnen flekker mye høyere enn tilsvarende antisense sonden og andre alternativer må utforskes. Alternative negative kontroller inkluderer plasmider koding sekvenser som ikke er representert i utvalget eller en annen sonde som gir et karakteristisk mønster av hybridisering.

2. bygging av Digoxygenin-UTP RNA sonder

  1. Klargjør nukleotid blandingen ved å kombinere 7,5 µL av 100 mM UTP, 25 µL av 10 mM digoxygenin-UTP og 10 µL hver 100 mM ATP, GTP og CTP i et 1,5 mL sentrifuge rør.
  2. Utføre i vitro transkripsjon bruke kommersielt tilgjengelig T7 eller Sp6 RNA polymerase kits, 1 µL av nukleotid mix (trinn 2.1) og 0,25 - 1 µg av DNA. Bringe volumet til 20 µL med vann. Sveip røret å forbinde og puls spinn. Ruge på 37 ° C for 2,5-3 h.
    Merk: Sonde bygging har vært vellykket med fordøyd plasmider konsentrasjoner så lavt som 7 ng/µL, men typisk konsentrasjoner på dette trinnet varierer fra 15-25 ng/µL. Transkripsjon reaksjonen kan også være ruges natten på 37 ° C, men dette signifikant øker ikke RNA avkastningen.
  3. Legge 1 µL av DNase (2000 enheter/µL) og Inkuber ved 37 ° C i 10 min. Overstige ikke 10 min, eller enzymet begynne å bli svekket RNA.
  4. Legge til 30 µL av iskalde 7.5-8 M litium klorid og 30 µL av kjølt nuclease-fritt vann til å fremkalle RNA. Sveip røret å blande. Tillate utfelling av RNA fortsette overnatting på 20 ° C.
  5. Samle RNA med sentrifugering 17000 x g for 20 min på 4 ° C. Vask pellet gang med 1 mL av nylagde 75% etanol i Diethyl pyrocarbonate (DEPC) vann, deretter gjenta sentrifugering.
  6. Fjerne og forkaste nedbryting, invertere røret på et rent papirhåndkle og la tørke for 10 min. Resuspend pellets i nuclease-fritt vann. Hvis pellet er lett synlig, resuspend i 25 µL. Hvis pellet er små eller ikke er synlig, resuspend i 15-20 µL. få et anslag over RNA konsentrasjon ved spektrofotometeret.
    Merk: Typisk RNA konsentrasjoner spenner fra 200-500 ng/µL.

3. visualisering av RNA sonder av RNA formaldehyd Gel geleelektroforese å vurdere RNA renhet

FORSIKTIG: Formaldehyd utgjør en fare for innånding; Derfor generere lobbyer for RNA gel analyse i avtrekksvifte. Ethidium bromide er et mulig karsinogen; håndteres med forsiktighet.

  1. Forberede en 1% formaldehyd agarose gel som beskrevet tidligere24 og kastet gel i en gel boks gratis RNases. Når kule, fyll boksen gel med 1 x kjører buffer (1 x MOPPER ved pH 7.0, 5% formaldehyd).
  2. Forberede prøven bufferen (5 µL 400 mg/mL ethidium bromide, 20 µL 10 x MOPPER og 35 µL formaldehyd 100 µL formamide). Kombinere 2 µL av RNA probe (trinn 2.6) med 8 µL eksempel bufferen. Inkuber ved 70 ° C i 10 min.
  3. Forberede RNA lasting Buffer ved å kombinere 5 mL 50% glyserol, 1 mL 10% formaldehyd, 40 mg bromophenol blå, 40 mg xylen cyanol og 20 µL av 0,5 M EDTA (pH 7.5). Etter bruk lagre denne bufferen på 20 ° C.
  4. Legg 3 µL lasting bufferen til RNA prøven trinn 3,2 og bland. Holde eksempel rør på is.
  5. Legg hele prøven volumet fra trinn 3.4 i gel. Laste inn en aliquot av enkelt-strandet RNA stige sammen med å kontrollere RNA størrelse. Kjør gel på 100 V eller Senk til blått fargestoff overfører ca 75% ned gel. Visualisere RNA under UV-lys bruker gel tenkelig system.
    Merk: En god kvalitet RNA sonde skal vises som et atskilt band med en transportabel tilsvarer den forventede størrelsen av sonden (figur 2, lane 1). Hvis sonden vises som et diffus og smeary band (figur 2lane 2) dette ikke bør brukes.

4. tick Gut innsamling og fiksering

  1. Samle Ixodes scapularis nymfer som har matet på mus for tiden interessepunkter.
    Merk: I forbindelse med denne teknikken, flått matet for 48 eller 72 h arbeidet best.
  2. Dissekere tarmen fra haken i MEMFA (tabell 1) på et glass lysbilde under disseksjon mikroskop, unngå skader på orgel som mulig. Plass en hake på en ren microscope skyve i 20-30 µL av MEMFA. Med en steril høy karbon stål razor blad #11 stykke regionen hodet på skjoldet av flåtten forlater kroppen av flåtten. Trykk forsiktig kroppen til å presse tarmen diverticula og spyttkjertler ut kroppen cuticle. Separate spyttkjertler og tarmen og scoop guts på den razor bladet.
  3. Samle guts i en 1,5 mL tube som inneholder 500 µL MEMFA. Inkuber røret ved romtemperatur med milde rocking 1t eller over natten på 4 ° C.
    Merk: Tick spyttkjertler kan også være dissekert og tilsvarende fast og farget.
  4. Tørke vev ved å vaske forsiktig 3 ganger med 1 mL iskald 100% etanol. La guts naturlig synke å bunnen av røret mellom hver vask, som sentrifugering kan skade vev. For langtidslagring, holde prøvene i 100% etanol på 20 ° C.

5. bygging av Mesh eksempel kurver og 24-vel kurv Holder

  1. Skjær bunnen av 2 mL eller 5 mL snapin-top sentrifuge rør med et oppvarmet single-edged razor blad på skalpell.
    FORSIKTIG: Bladet må reheated flere ganger før kuttet er fullført.
  2. Ta av en 110 µm nylon maske litt større enn nye rør åpningen. Bond mesh til bunnen av røret ved å trykke dem sammen lett på en varm plate på middels lav varme til en god tetning er gjort. Avkjøl, sikre det er ingen mellomrom mellom mesh og røret og trim overflødig mesh rundt kantene.
  3. Skjære hull i dekselet av en 24-vel plate slik at kanten av prøven kurven i trinn 5.2 vil sitte på hullet og ikke faller gjennom, gir et oppsett hvor bunnen av prøven kurver vil sitte helt i brønnene når de plasseres i den hull i dekselet.
  4. Bruk dette montert kurv holder overføre kurver fra en plate til en annen med relativ letthet for helheten av i situ hybridisering protokollen. Bruk to 24-vel plater slik at mens en inkubasjon skjer, andre platen er klar for neste vask.

6. i Situ hybridisering: dag 1 (Timing: 4-5 h)

  1. Overføring guts til merket eksempel kurver, atskilt med eksperimentelle tilstand og beregnet RNA sonde.
    Merk: Stain minst 5 guts per stand til kontoen for naturlig variasjon blant gjentak.
  2. Rehydrate prøvene forsiktig for å unngå presenterer luftbobler i vev ved å gradvis øke andelen fosfat-bufret saline med 0,1% ikke-ioniske surfactant (PTw; Tabell 1) til etanol i vasker.
    Merk: Komplett alt vasker i 24-vel kurv holderen ved omgivelsestemperatur med mild agitasjon ikke annet er oppgitt. Aliquot 500-600 µL av vask løsninger i hver brønn av holderen slik at guts i hver kurv helt senkes. Forberede alle løsninger med DEPC-behandlet vann for å hindre RNA nedbrytning.
    1. Vask prøvene i 5 min i 500 µL 100% etanol.
    2. Forbered minst 500 µL per eksempel kurv med 75%, 50% og 25% etanol i PTw. Rehydrate prøvene ved vask i 5 min i hver etanol løsning, flytte fra den høyeste etanol konsentrasjonen til den laveste.
    3. Vask prøvene 4 ganger i 5 min hver i PTw.
  3. Permeabilize prøvene med proteinasen K (10 µg/mL) i PTw i 5 min.
  4. Forberede vevet hybridisering med RNA sonder.
    1. Vask prøvene to ganger som beskrevet i 6.2 i 24-vel kurv holderen ved omgivelsestemperatur med mild agitasjon for 5 min hver 500 µL trietanolamin buffer (0.1 M, pH 7.0-8.0) (tabell 1) å opprettholde eksemplene i en Amin-fritt miljø.
    2. Behandle prøvene to ganger med 500 µL 0,25% eddiksyre trietanolamin buffer (0.1 M, pH 7.0-8.0) i 5 minutter, og deretter vaske prøvene to ganger i PTw i 5 min.
      Merk: Eddiksyre acetylates gratis aminer å nøytralisere positive ladningen, som er avgjørende for å hindre ikke-spesifikk elektrostatisk interaksjoner og sikre bestemt binding av sonden å mRNA.
    3. Fastsette guts for 20 min med 500 µL 4% paraformaldehyde i PTw og vask 5 ganger i PTw i 5 min.
    4. Prehybridize av rugende eksemplene i 500 µL hybridisering buffer /in 24-vel kurv holderen i 24 godt platen (tabell 1) 1.5-2.5 h på 60 ° C med mild agitasjon en risting vannbad. Lagre hybridisering bufferen for prehybridization trinn på nytt i dag 2-protokollen (trinn 7,1).
    5. Forbered sonden hybridisering løsninger fortynne RNA sonder hybridisering buffer til en siste konsentrasjon av 1 µg/mL.  Ruge prøver med sonde hybridisering løsninger i 24-vel kurv holderen på 60 ° C med mild agitasjon overnatter i en risting vannbad (tabell 2). Dekkramme bærer kurv holderen tett med aluminiumsfolie for å hindre fordampning av hybridisering løsningen.

7. i Situ hybridisering: dag 2 (Timing: 4.5-5.5 h)

  1. Fjern prøvene fra sonden hybridisering løsninger og plassere dem inn i reserverte hybridisering bufferen fra forrige dag. Ruge på 60 ° C med mild agitasjon for 3 min.
    Merk: Sonde hybridisering løsninger kan lagres på 20 ° C for bruk opp til 3 ganger.
  2. Klargjør 2 x saltholdig-natriumsitrat buffer (SSC) ved utvannende 20 x SSC i DEPC-behandlet vann (tabell 1). Vask prøvene to ganger for 3 min med 2 x SSC, så 3 ganger for 20 min med 2 x SSC på 60 ° C å fjerne alle spor av sonde og hybridisering.
  3. Behandle med RNase en (20 µg/mL) og RNase T1 (10 µg/mL) i 2 x SSC i 30 min på 37 ° C fjerne enkelt strandet RNA sonde representerer gratis ikke hybridiserte RNA.
  4. Vask en gang med 2 x SSC i 10 min ved romtemperatur. Forberede 0,2 x SSC ved utvannende 2 x SSC i DEPC-behandlet vann, deretter vaske to ganger med 0,2 x SSC i 30 min på 60 ° C å fjerne overflødig RNases.
  5. Vaske to ganger med 500 µL av maleic syre buffer (MAB; Tabell 1) i 10 minutter hver.
  6. Inkuber prøver med blokkering løsning (2% blokkerer reagens i MAB) for 1,5-2 h.
    Merk: Den blokkerende reagensen kan oppløse; mild oppvarming hjelpemidler oppløsning.
  7. Erstatte blokkerer løsningen med anti-digoxigenin alkalisk fosfatase-konjugerte 500 µL antistoff på en 1:3,000 fortynning i blokkering løsning og ruge ved romtemperatur ca 4 h eller 4 ° C over natten.

8. i Situ hybridisering: dag 3 (Timing: 6t overnight)

  1. Vask prøvene minst 5 ganger i 30 min hver med 500 µL MAB fjerne overflødig antistoff.
    Merk: Disse vasker er fleksible og kan utvides til 1-2 h, eller 3-4 vasker kan erstatte en overnatting vask på 4 ° C med minimal innvirkning på effekten.
  2. Vask to ganger i 5 min med alkalisk fosfatase buffer, pH 9,5 (AP buffer; Tabell 1).
  3. Starte farge reaksjonen ved å erstatte siste vask med 500 µL av kromogent underlaget for alkalisk fosfatase (Tabell for materiale). Dekkramme utvalg med aluminiumsfolie og la den flekker fortsette ved romtemperatur for 3 - 5 h eller overnatting på 4 ° C. Overvåke flekker reaksjonen regelmessig ved å vise vevet under dissecting mikroskop å unngå overstaining.
    Merk: Når den flekker er fullført, en lilla fargetone er detectable av øyet i antisense-analysert prøvene under mikroskopet, men vevet skal ikke tillates å bli veldig mørkt. Farging begynner veldig sakte på 4 ° C og kan ta opptil 20-24 h.
  4. Farge reaksjonen innom vaske 5 min med 500 µL MAB og reparere vevet overnatting i Bouins løsning.
    FORSIKTIG: Håndtere den Bouin løsningen i avtrekksvifte; Det er et etsende karsinogen.

9. i Situ hybridisering: dag 4 (Timing: 3-3,5 h)

  1. Forbered minst 7 mL per eksempel kurv av 1 x SSC ved utvannende 20 x SSC i DEPC-behandlet vann. Fjerne det Bouin løsning ved å vaske prøvene 4-6 ganger med 70% etanol i 1 x SSC til vev er ikke lenger gul.
  2. Forberede 500 µL per eksempel kurv med 75%, 50% og 25% etanol løsninger i 1 x SSC. Vask prøvene i 5 min i hver løsning, flytte fra høyeste etanol konsentrasjonen til laveste rehydrate vevet. Vaske to ganger i 5 min hver i 1 x SSC.
  3. Inkuber eksemplene i den bleike løsningen (tabell 1) i 90 minutter på en lysboks i avtrekksvifte.
    Merk: Dette trinnet kan noen pigmentering i prøver eller farge fra Bouins løsning fjernes og forbedrer sonde signalet for tydelig visualisering.
  4. Vask prøvene to ganger med 500 µL av 1 x SSC i 5 minutter.
  5. Flytte mot med minimal skade ved å snu eksempel kurven til en godt av en ny 24-vel plate og vaskes med 70% etanol gjennom mesh bunnen med en overføring pipette. Lagre på 20 ° C om nødvendig.
  6. Opprettholde guts i 70% etanol i 24 godt-plate og se noen lyse-feltet mikroskop for å få en oversikt over flekker mønstre av flere eksempler som vist i Figur 3, . Undersøke personlige guts under mikroskop lyse-feltet som vist i Figur 4 figur 5, og figur 6, montere guts i 100% glyserol under coverslips. Bruk en plast slikkepott forsiktig manipulere vevet med minimal skade.
    Merk: Den høy viskositeten glyserol beskytter vev skade ved komprimering og lar forsiktig posisjonering diverticula slik at vevet kan sees optimalt på høyere forstørrelser.
  7. Ta bilder på mikroskopet ved hjelp av mikroskop spesifikk image fange programvare (Tabell for materiale) og eksporterer som Tiff-bilder til et generelt bilde redigering programvare. Last ned en generisk analyseprogramvare (Tabell for materiale) for å kvantifisere relative flekker forskjellene mellom eksperimentelle behandlinger. Åpne bildet i analyseprogramvare og bruke instruksjonene i programvaren å måle pixel intensiteten av den flekker og beregne histogrammet tomter den flekker.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Måling og beregning av kvaliteten på RNA sonder er viktig før begynnelsen den flekker. In vitro transkripsjon effektiviteten avhenger svært mengden og kvaliteten av malen DNA. Vi visualisert rutinemessig RNA sonder på en formaldehyd gel å bekrefte renhet og mengden av sonden som genereres av transkripsjon reaksjonene. Sonder skal vises som lyse, diskret band (figur 2). Spektrofotometri målinger av RNA konsentrasjon var svært indikativ av sonden kvalitet og korrelert med utseendet på band på gel. Gel visualisering steg kan dermed hoppet hvis ønskelig når kjennskap til protokollen har oppnådd. Uansett, er det viktig å sikre at produseres tilstrekkelig RNA av høy kvalitet, som alle nedstrøms trinnene er avhengig av robust sonder.

Styrken på denne teknikken er å tilrettelegge bred observasjoner om tick bakterieflora, inkludert tilstedeværelse eller fravær av bakterie-art, endringer av bakterier over tid som tick feeds og lokalisering av arter i hele vevet. Noe variasjon i flekker beløp og distribusjon er vanlig blant biologiske gjentak og 7 parene diverticula av personlige guts (Figur 3), derfor er det best å flekk minst fem guts per betingelse for å få en idé om gjennomsnittlig farging mønster. Den totale suksessen til protokollen er best gauged ved å sammenligne den flekker av fornuft og antisense prøvene for hvert vilkår. Følelse prøvene, viktige negative kontroller for denne typen analyse, bør ha minimal å ingen lilla farge (Figur 4). Derimot skal antisense prøver vise robust flekker med minimal bakgrunn, intensiteten som avhenger av spesifikke bakteriell transkripsjoner målrettet. Farging mønsteret i vevet varierer også basert på disse parameterne. Viktigere, må følelse og antisense prøver utvikles for de samme tidsperiode for å kunne direkte sammenligne dem, så disse prøvene skal behandles parallelt. Overdevelopment av farge reaksjonen kan føre en høy mengde bakgrunn flekker, der følelse prøvene begynner å ligne antisense (figur 5). Spesielle bør tas på dette trinnet i protokollen å unngå overstaining, som det er ingen måte å snu reaksjonen når det skjer.

Det er viktig å sikre at alle tarmer fullstendig senkes i hver reagensen i hvert trinn; en økning i variasjonen i et datautvalg kan skyldes ujevn eksponering for reagenser. Mengden tid som flått fôres før guts samles også har en betydelig effekt på resultatene. Flått som ble unfed eller bare matet 24 h var vanskelig å jobbe med; guts var også mer lett skadet og ikke flekker godt (figur 6) og er en begrensning av denne tilnærmingen på dette tidspunktet. Flått matet for 48-72 h var lettest å jobbe med, på grunn av større størrelsen av disse tøff nok i forhold til guts fra ticks matet for 24 h. Guts fra senere tidspunkt også farget bedre enn 24 h-matet flått, muligens på grunn av økninger i bakteriell byrden under senere stadier o f fôring. 72-h vevet hadde ofte en liten bakgrunn av brun farge fra blod, men den lilla flekker var synlig over fargetonen (Figur 4). Guts vises best ved lav forstørrelse (5 X eller 10 X) for å kunne vise flekker mønstre over hele vev med et lys-feltet mikroskop. Ser hele-mount vev på høyere forstørrelse, for eksempel med en 63 X oljeobjektiv, kjører risikoen av å skade vev som målet trykk mot lysbildet og komprimere vev på grunn av tykkelsen av prøvene. Eventuelt høyere oppløsning imaging er bør potensialet for vev snitting undersøkes.

Figure 1
Figur 1 . Skjematisk av malen forberedelse til sonde generasjon. Klone 16S rRNA amplicon i en TA kloning vektor som inneholder T7 og Sp6 arrangører. Linearize konstruksjon med begrensning enzymer for å kutte områder en eller b for i vitro transkripsjon ved hjelp T7 eller Sp6 arrangøren for å generere følelse eller antisense sonder henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2 . Visualisering av RNA sonden av gel geleelektroforese. RNA sonder (~ 700 ng) var electrophoresed på en formaldehyd agarose gel, visualisert under UV lys, og fotografert med en kommersiell gel tenkelig system. Representant god kvalitet, lane 1; og dårlig kvalitet RNA sonde, lane 2.

Figure 3
Figur 3 . En representant oversikt over hele-mount i situ blanding av 48 h-matet guts. Guts fra flått matet for 48t farget med antisense RNA komplementær til en bevart 16S ribosomal RNA sekvens viser differensial flekker gut diverticula. Skala linjen representerer 200 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 . Representant bilder av hele-mount i situ hybridisering i Ixodes scapularis guts. Guts fra flått matet for den angitte tid var farget bruke enten fornuft (negativ kontroll) eller antisense RNA sonder. Antisense sonder var komplementær til en bevart 16S ribosomal RNA sekvens (Universal 16S) eller en 16S RNA sekvens spesifikke for en bestemt bakterie-slekt (som angitt). Enterococcus lot ikke robust flekker på 48 h. skala barer representerer 140 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 . Langvarig kromogent reaksjonstid fører til ikke-spesifikk farging. Guts fra flått matet for 48t ble undersøkt med en fornuftig RNA sonde eller en antisense sonde komplementær til en bevart 16S RNA sekvens. Vevet ble inkubert med alkalisk fosfatase underlaget BM lilla overnatting på 4 ° C, og deretter ved romtemperatur for ca 4 timer før du stopper reaksjonen. Skala stolper representerer 140 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 . Hele-mount i situ hybridisering bruker unfed eller 24 h matet tick guts. Guts fra unfed eller 24 h-matet flått var farget med følelse RNA sonder eller antisense sonder komplementær til en bevart 16S RNA sekvens eller en sekvens som er spesifikke for slekten Rickettsia. Farging i antisense prøvene er mindre robust enn observert på senere tidspunkt guts er også mere lett skadet. Skala stolper representerer 60 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

navn Siste konsentrasjoner Siste pH Lagring notater
MEMFA 0.1 M MOPPER - Romtemperatur
2 mM EGTA
1 mM Magnesiumsulfat
3,7% formaldehyd
PBS-Tween (PTw) 1 x PBS, 0,1% Tween-20 7.0 Romtemperatur
0,1% Tween-20
Trietanolamin buffer 1 x PBS 7.0-8.0 Romtemperatur
0.1 M trietanolamin
Hybridisering buffer 50% formamide - -20 ° C
5 x SSC
1 mg/mL Torula RNA
100 µg/mL heparin
1 x Denharts løsning
0,1% Tween-20
0,1% CHAPS
10 mM EDTA
Maleic syre buffer (MAB) 100 mM maleic acid 7.0 Romtemperatur
150 mM natriumklorid
Alkalisk fosfatase (AP)-buffer 100 mM Tris 9.5 -20 ° C
50 mM magnesiumklorid
100 mM natriumklorid
0,1% Tween-20
5 mM levamisol
Bleike løsning 1% hydrogenperoksid - Forberede frisk
5% formamide
0,5 x SSC

Tabell 1. Oppskrifter løsninger brukes i protokollen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette er den første bruken av en hel-mount i situ hybridisering (WMISH) teknikk å studere bakterieflora i en Leddyr vektoren patogener. Våre protokollen ble tilpasset fra som brukes til å studere utviklingen i Drosophila og frosk embryo25,26. Hele-mount RNA i situ hybridisering rutinemessig er brukt til å lokalisere genet transkripsjoner romlig og timelig27 og visualisering av utskrifter kan gjøres av lyse-feltet eller fluorescerende mikroskopi. Vi har vedtatt tidligere mot påvisning av bakterieflora i kryss guts. Det er viktig å merke som forsøker å utføre hele-mount i situ hybridisering med hele flått som regionen hodet ble fjernet slik at penetrasjonen av bindemiddel og hybridisering ikke var vellykket. Protokollen beskrevet her benytter dissekert guts og har blitt implementert for å studere effekten av spesifikke tick proteiner på bakteriell kolonisering i midttarmen23. Informasjon innhentet fra WMISH sammenlignes med immunohistochemistry men har fordelen av ikke krever generering av protein og antistoffer mot genet eller protein av interesse. Genomisk informasjon er tilstrekkelig til å generere reagensene for WMISH. Både WMISH og fisk (fluorescens i situ hybridisering) finner genuttrykk. Men ettersom det er en enzymatisk og chromogen-baserte analysen, har WMISH fordelen at fargen utvikling kan overvåkes aktivt, og reaksjonen kan fortsette til ønsket signal og følsomhet er oppnådd. Det er fullt mottakelig for automatisering og skaleres enkelt til høy gjennomstrømming format. I motsetning til fisk og immunohistochemistry er heller ingen snitting nødvendig. Ulempen med WMISH over FISKEN er at bare 2 forskjellige mRNAs eller gener kan tas opp samtidig, og krever at sonder merkes med forskjellige nukleotid analogs som digoxigenin-UTP og fluorescein-UTP28. Med fisk, kan opp til 6 ulike mRNAs bli undersøkt i en analysen29. Mens både analyser krever sammenlignbare tid, kostnaden for fluorescens fargestoffer er høyere enn kromogent underlag. FISK analyser vil også kreve fluorescens mikroskop for bildet visualisering, mens WMISH bilde visualisering kan utføres med noen lys mikroskop.

Det er avgjørende at protokollen etterfølges tett; Det er imidlertid noen trinn som krever spesielle. Disseksjon av midttarmen og blir fra tick uten å skade vevet krever noen behendighet. Det kan være klokt å samle ekstra flått å praktisere disseksjoner og få ferdigheter. På grunn av heterogenitet farging i de ulike diverticula av personlige guts (Figur 3), er det viktig å undersøke alle diverticula av hver gut å utlede bevis for bakteriell overflod. Det er også viktig å behandle flere tøff nok (minst 5) for hver eksperimentelle betingelse for å få avgjørende informasjon om tilstedeværelse, romlige fordelingen, og overflod av spesifikke bakterier i forskjellige diverticula. Produksjon av høy kvalitet RNA sonder er også avgjørende for effektiv vev flekker. Det er viktig å også bekrefte sekvensen av malen sonde i kloning vektoren å sikre at antisense og følelse sonder genereres riktig. En produktiv i vitro transkripsjon reaksjon krever tilstrekkelig mal DNA; minimum 100 ng kan brukes, men 0,5 - 1 µg anbefales for optimal sonde generasjon.

Bruk av prøven kurver og 24-og plater i denne protokollen unngår direkte manipulasjon av vev på hver vask trinn, som reduserer skader under farging prosessen. Men prøver fortsatt noen ganger forsvinner eller blir skadet; guts fra unfed eller 24h-matet flått, er spesielt vanskelig å se og lett å miste ved overføring fra eksempel kurver til en langsiktig beholderen. Ekstra forsiktighet bør utvises ved håndtering prøvene. På grunn av denne begrensningen, har vi hovedsakelig brukt 48 og 72 h-matet tick guts. Tilstedeværelsen av store mengder blod måltid i tarmene på disse tidspunkt (lengre enn 72 h) griper flekker og visualisering på grunn av ikke-spesifikk bakgrunn fra blod-måltidet og presenterer også en begrensning av denne teknikken. Det er sannsynlig at bruk av fluorescently-merket sonder kan omgå dette problemet.

Det viktigste aspektet av flekker prosedyren er å etablere balansen mellom robust flekker og lav bakgrunn signal. Tidspunktet for ideelle farge utvikling kan variere avhengig av eksperimentelle forhold. Dermed er det best å utføre farge reaksjonen ved romtemperatur og skjermen fargen utvikling omtrent enhver 30 min. Reaksjonen kan også defineres fortsette over natten ved 4 ° C å bremse farge utvikling. Men er det ekstremt viktig ikke å la denne reaksjonen fortsette for lenge. Farging reaksjonen kan være vanskelig å overvåke av øyet, slik eksemplene bør undersøkes under disseksjon mikroskop. En lilla fargetone skal vises på prøver analysert med antisense RNA, mens eksemplene analysert følelse RNA bør beholde minimale. Hvis følelse RNA-analysert prøvene beis lyst bør feilsøkingstrinn begynne med reduserer inkubasjon med BM lilla og øke blokkere tid. Noen ganger kan følelse sonder føre anomalously høy bakgrunn sammenlignet antisense sonder; i disse tilfellene må regioner av genet vurderes for å generere RNA sonder. DNA-sekvenser som ikke er representert i et gitt utvalg kan også anses som maler for å generere negativ kontroll sonder. For eksempel kan en DNA mal koding en region av grønne fluorescerende protein, ikke representert i kryss genomet eller dens microbiome, benyttes.

En begrensning av denne teknikken er at analysen er hovedsakelig kvalitativ; Imidlertid kan analyseprogramvare (Tabell for materiale) brukes til å måle mengden av flekker signal i hver prøve. Dette gir en semi kvantitative sammenligning av overflod av ulike bakterie-art under ulike eksperimentelle forhold. Mens dette er en tidkrevende protokoll som tar 3-4 dager å fullføre, er det ikke arbeidskrevende; hver dag hands-on tid er bare ca 3-5 h i gjennomsnitt. Muligheten til å behandle mange prøver parallelt med bruk av prøven kurver og holdere kan imidlertid for høy gjennomstrømming analyse. Videre, denne prosessen kan automatisert benytter kommersielt tilgjengelige instrumenter (tabell for materiale) Hvis denne protokollen er forventet å være en nødvendig og rutinemessig komponent i forskningslaboratoriet ved hjelp av kommersielt tilgjengelig automatiseringskompatibelt plattformer (Tabell for materiale) ytterligere redusere hands-on tid.

Beskrevet protokollen gjør bruk av digoxygenin-merket sonder at produksjonen av et fargemetrisk signal som kan avbildes bruke lyse feltet mikroskopi. Mens vi har benyttet et kromogent substrat for å oppdage hybridisert RNA sonder gjelder for individuelle mål, er det også mulig å oppdage flere mål samtidig ved merking sonder med forskjellige nukleotid analogs, som digoxigenin-UTP og fluorescein-UTP og ulike kromogent underlag30. Av vevsprøver kan deretter bli ruges sekvensielt med alkalisk fosfatase-koblede antistoffer mot digoxigenin og fluorescein, med forskjellige kromogent reaksjoner to trinnene. Denne teknikken kan også være tilpasset fluorescently-merket sonder, som kan lette høyere oppløsning bildevisning AC confocal mikroskopi31 og bruke flere sonder i forskjellige farger i parallell. Denne teknikken kan bare spesielt vurdere noen mikroorganismer samtidig i ett utvalg. Imidlertid kan flere prøver vurderes i høy gjennomstrømming analyser å ta flere mikroorganismer som kan representeres i kryss bakterieflora.

Til slutt, denne teknikken er ikke begrenset til etterforskningen av samspillet mellom merker og deres tilknyttede bakterieflora. Sonder utfyllende til noen genet av interesse i kryss genomet kan genereres og brukes til å undersøke overflod og lokalisering av bestemte gener i ulike vev. Spyttkjertler av flåtten kan også behandles og analysert tilsvarende til tarmen. Total, denne teknikken har brede muligheter for tilpasning til studier av dynamikken av mikrobielle samfunn i andre leddyr sykdommen vektorer av interesse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter av interesse å avsløre.

Acknowledgments

Vi Takk oppriktig Dr. Mustafa Khokha, Yale University, for å gi hans laboratorium ressursbruk. Vi er takknemlige for Mr. Ming-Jie Wu for utmerket kundestøtte. LoF er en HHMI etterforsker. Dette arbeidet ble støttet av en gave fra John Monsky og Jennifer Weis Monsky Lyme sykdom Research Fund.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron Amazon 03-110/47
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360
Digoxygenin-11-UTP Roche 1209256910
dNTP New England Biolabs  N0447S
DNAse I(RNAse-free) New England Biolabs M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit New England Biolabs E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated American Bioanalytical AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502-01000
Formaldehyde, 37% JT Baker 2106-01
Formamide American Bioanalytical AB00600-00500
EGTA Sigma Aldrich E-4378
DPBS, 10X Gibco 14300-075
Tween-20 Sigma Aldrich P1379-25ML
Proteinase K Sigma Aldrich 3115879001
Triethanolamine HCl Sigma Aldrich T1502-100G
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102-100ML
Paraformaldehyde ThermoScientific/Pierce 28906
SSC, 20X American Bioanalytical AB13156-01000
RNA from torula yeast Sigma Aldrich R3629-5G
Heparin, sodium salt Sigma Aldrich H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X Sigma Aldrich D2532-5ML
CHAPS hydrate Sigma Aldrich C3023-1G
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
RNase T1 ThermoScientific  EN0541
Maleic acid Sigma Aldrich M0375-100G
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase Sigma Aldrich 11442074001
Bouin's solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Hydrogen peroxide Mallinkrodt Baker, Inc 2186-01
Single stranded RNA ladder Ambion -Millenium AM7151
 #11 High-Carbon steel blades  C and A Scientific Premiere #11-9411
Thermocycler BioRad, CA 1851148
Spectrophotometer ThermoScientific  NanoDrop 2000C
Orbital shaker VWR DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath BELLCO Glass, Inc Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system BioRad Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope  Nikon NikonSM2745T
Bright-field Microscope  Zeiss AXIO Scope.A1
Dissection microscope  Zeiss STEMI 2000-C
 Light box VWR 102097-658
PCR purification kit  Qiagen 28104
Image capture software Zeiss Zen lite
Image editing software  Adobe  Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software National Institutes of Health ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).  Intavis, Biolane HT1.16v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Tags

Genetikk problemet 136 leddyr tikk gut bakterieflora transkripsjon hele-mount i situ hybridisering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., More

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., Narasimhan, S. Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (136), e57758, doi:10.3791/57758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter