Summary
Здесь мы представляем протокол пространственно и височно оценить наличие жизнеспособных микрофлору в тик кишки с использованием подхода изменение состава Гора в гибридизации situ.
Abstract
Инфекционных заболеваний, передаваемых членистоногих векторами по-прежнему представляют собой значительную угрозу для здоровья людей во всем мире. Патогенных микроорганизмов, вызывающих эти заболевания, не существует в изоляции, когда они колонизировали вектор; скорее они скорее всего заниматься взаимодействия с резидентом микроорганизмов в просвете кишки. Микробиота вектор была продемонстрирована возможность играть важную роль в передаче возбудителя для нескольких трансмиссивных заболеваний. Ли-резидентов бактерий в кишечнике Черноногий клещ, вектор ряд патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi, влияние клеща передачи возбудителей не определяется. Мы требуем методы для характеризующие состав бактерий, связанные с тик кишки для содействия более глубокому пониманию потенциальных межвидовой взаимодействий в кишечнике клеща. Использование целом гора в situ гибридизация визуализировать стенограммы РНК, связанные с бактериальных вида позволяет для сбора качественных данных относительно численности и распределения микробиоты в неповрежденной ткани. Этот метод может использоваться для изучения изменений в обстановке микрофлору кишечника в течение клеща кормления и может также применяться для анализа экспрессии генов клеща. Окрашивание всей клеща кишок доходность информация о валовых пространственного распределения целевых РНК в ткани без необходимости для трехмерной реконструкции и менее пострадавших от загрязнения окружающей среды, который часто смешивает на основе виртуализации методы часто используются для изучения сложных микробных сообществ. В целом этот метод является ценным инструментом, который может использоваться для лучше понимать вектор возбудитель микробиоты взаимодействий и их роль в передачи болезни.
Introduction
Человека и животных патогенов, передано членистоногих векторов находятся во всем мире и приходится около 20% инфекционных заболеваний во всем мире1, но эффективный и не доступны безопасные вакцины против большинства этих патогенов. Наше понимание важной роли синантропных, симбиотических и патогенных микроорганизмов, известные как микрофлора2, модуляции и формирования здоровья почти всех размером3 расширяется. Теперь уже очевидно, что членистоногих векторами патогенов также гавани кишка микробиоты и эти связанные векторные микробиоты было показано влияние различных возбудителей трансмиссивных4,5. Членистоногих микрофлора состоит из эубактерии, археи, вирусов и эукариотических микробы как простейшие, нематод и грибов6. Однако, преобладающее исследований основное внимание уделялось эубактерии вследствие, в частности, наличия маркерных генов и справочные базы данных для выявления конкретных бактериальных членов.
С акцентом на Черноногий, тик вектор нескольких патогенов человека, включая Borrelia burgdorferi7, возбудителя болезни Лайма, оптимизации техники микробного визуализации была направлена на улучшение нашего понимания клеща кишка микробиоты в контексте взаимодействия вектор патогена. Несколько вопросов остаются ответа в поле микрофлора клеща. Кишечник является сайт первого расширенная встреча между клеща и входящие возбудителя в контексте горизонтально передаваемых патогенов; Таким образом понимание роли векторных кишка микробиоты в модуляции вектор возбудитель взаимодействия будет выявить значимые идеи. Клещи имеют уникальный режим переваривания крови еды, где обработка крови еды компонентов занимает место внутриклеточно8. В просвет кишки казалось бы служит судно содержать крови еды как тик каналы, и питательных веществ пищеварение и усваивание наступить на протяжении нескольких дней кормления и продолжить после пресыщения. Патогенов, приобретена галочку во время кормления войти в просвет кишки вместе с bloodmeal и таким образом просвет становится основной сайт взаимодействия среди клещей, возбудителя и резидентов микробиоты. Как пищеварение проходит через сытость и иксодовых клещей линьки, кишечнике претерпевает структурные и функциональные изменения9. Состав и пространственной организации gut бактерии также может меняться в концерте с меняющейся обстановке кишки. Таким образом, важно понять архитектуру резидентов бактерий в кишечнике клеща в полной мере понять взаимодействие клеща, возбудителя и микрофлору кишечника.
Молекулярные методы для описания связанного узла микробиоты регулярно используют высок объём параллельной последовательности стратегий10 усилить и последовательность бактериальной 16S рибосомной ДНК (рДНК). Эти стратегии виртуализации обойти необходимость получения стерильных культурах конкретных видов бактерий и предоставить подробное описание всех бактериальных членов, представленных в образце. Тем не менее такие стратегии являются осложняется неспособность различать экологических загрязнений от Бона ФИДЕ жителей. Кроме того при оценке образцов, таких как клещей, которые являются небольшими по размеру и следовательно содержат низкий микрофлору специфических ДНК урожайности, вероятность усиления экологических загрязнителей является увеличение11 и приводит к неоднозначной интерпретации микрофлора композиция. Таким образом, функциональные характеристики в сочетании с визуализацией конкретных жизнеспособных бактерий будет важно определить и различить микрофлора клеща височно и пространственно. К этой цели мы воспользовались целом гора РНК в situ гибридизация. Этот метод обычно используется для оценки картин выражения гена в органах и эмбрионы12,13,14 и позволяет полуколичественный анализ выражения над всей выборки интерес. Это отличается от традиционных в situ гибридизация методов, которые используют разделов ткани и часто требуют обширный анализ секционного материала с вычислительной Ассамблеей предсказать выражение в целом органов15. В то время как целое гора обычно относится к весь организмов12, здесь всего гора относится к весь кишки или органов. Преимущества использования РНК целом гора в situ гибридизация подход для оценки архитектуры клеща кишка микробиоты многократно. Тик кишки состоит из 7 пар дивертикулы, каждая пара разного размера16. Функциональные различия, если таковые имеются, среди этих дивертикулы, не поняли в контексте биологии тик, тик микробиоту или тик возбудитель взаимодействий. Манипуляции кишечника, которые разрыву кишки дивертикулы будет вытеснять микрофлору в просвете кишки или слабо связанные с кишки и привести к неправильному толкованию пространственной локализации микробиоты. Флуоресцировани обозначенного РНК в situ гибридизация ранее использовались для изучения клеща кишки стенограммы17 , фиксации и открыв индивидуальный кишку дивертикулы обеспечить зонд гибридизации и локализовать B. burgdorferi стенограммы путем разрезания парафин врезанных всего18, клещей. Оба эти подходы требуют манипуляций деления тканей до гибридизации, которые могут повлиять на архитектуру микрофлору кишечника.
В настоящем докладе мы подробно описать протокол для изучения жизнеспособных клеща кишка микробиоты с помощью целом гора в situ гибридизация (WMISH). Использование всего гора РНК в situ гибридизация позволяет глобального понимания присутствия и обилие конкретных кишки бактерий в различных регионах кишечник и может стимулировать новые идеи в биологии кишки клеща в контексте возбудителя колонизации и передачи. Кроме того использование РНК зондов, направленных против определенных бактериальных РНК позволяет обнаружение жизнеспособных бактерий в кишечнике клеща.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка ДНК шаблонов
- Скачать 16S рРНК последовательности конкретных для каждого бактериальных родов от NCBI базы данных и дизайн полимеразной цепной реакции (ПЦР) совместимые вперед и обратить вспять грунты, которые усиливают родов конкретных регионах (~ 200-250-пары длинный), как описано выше 19. также относятся к открытым исходным кодом базы данных Силва20,21 и probeBase22 онлайн ресурсам для зондов олигонуклеотида рРНК ориентированных и грунтовки, как РНК зонды для некоторых бактериальных родов может быть коммерчески доступны.
Примечание: Важно выбрать гена регионы, которые являются специфические для отдельных родов и убедитесь, что разработанные праймеры не усилить связанные бактериальных родов. Это очень важно для получения родов/ген специфического зонд гибридизации. - Кормить клещей, 24, 48 или 72 h на мышах, вскрыть клеща кишки и подготовить РНК и cDNA от клеща кишки как описано ранее23. Используйте шаблон для PCR усиливает ампликонов родов конкретным, с помощью Термоциклер cDNA. Запустить Алиготе ПЦР продукта/ампликон на 1,5% агарозном геле и подтвердите, что amplicon соответствует ожидаемый размер визуализации под ультрафиолетовой (УФ) света, с использованием геля изображений системы.
- Клон бактериальных 16S рибосомной РНК ампликонами интерес в коммерчески доступных вектор TA (Таблица материалов), содержащие РНК-полимеразы промоутеров для бактериофага полимеразы (SP6, T7 или T3). Последовательность клонов для подтверждения личности amplicon и направленность клон применительно к каждому из промоутеров. Исходя из этого, определите, что промоутер выбора для создания чувства или Антисмысловые РНК зонды (рис. 1).
- Линеаризации 1 мг плазмида с соответствующей энзима ограничения в объеме реакции до 30 µLfor 2 ч при температуре, рекомендованные производителем. Выберите энзимов ограничения, основанные на промоутер, который будет использоваться для генерации чувство или антисмысловых зонд (рис. 1). Проверка Линеаризация путем визуализации 2 мкл дайджест реакции на геле агарозы 1%.
- Очистит оставшиеся 28 мкл переваривается ДНК, использование коммерчески доступных комплект очистки столбца продукта ПЦР и количественно ДНК концентрации в спектрофотометре.
Примечание: Некоторые смысле зондов может вызвать фон окраски намного выше, чем соответствующие антисмысловых зонд и может необходимо изучить другие варианты. Альтернативные негативный контроль включают плазмид, кодирование последовательностей не представлены в образце или другой зонд, который дает характерный узор гибридизации.
2. Строительство Digoxygenin-UTP РНК зонды
- Подготовьте смесь нуклеотидов, объединяя 7,5 µL 100 мм UTP, 25 мкл 10 мм digoxygenin-UTP и 10 мкл 100 мм АТФ, GTP и CTP в пластиковых пробирок 1.5 мл.
- Выполнять в vitro транскрипция использование коммерчески доступных T7 или Sp6 РНК полимеразы наборы, используя 1 мкл, комплекса нуклеотидов (шаг 2.1) и 0,25 - 1 мкг шаблона ДНК. Довести объем до 20 мкл с водой. Флик трубки объединить и пульс спина. Инкубируйте при 37 ° C для 2,5-3 ч.
Примечание: Строительство зонд был успешным с переваривается плазмида концентрации как низко как 7 нг/мкл, но типичные концентрации на этот шаг диапазон от 15-25 нг/мкл. Транскрипции реакции также может быть ночь инкубировали при 37 ° C, но это не значительно увеличить доходность РНК. - 1 мкл DNase (2000 единиц/мкл) и инкубировать при 37 ° C за 10 мин. Не превышать 10 мин, или фермента может начать унижающего достоинство РНК.
- Добавьте 30 мкл ледяной хлорида лития 7,5-8 M и 30 мкл охлажденной воды, свободной от нуклеиназы, чтобы осадить РНК. Флик трубки смешивать. Разрешить осадков РНК перейти на ночь при-20 ° C.
- Собирать РНК центрифугированием в 17,000 g x 20 мин при 4 ° C. Помыть лепешка однажды с 1 мл свежеприготовленные 75% этанола в диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) воду, а затем повторить центрифугирования.
- Удалите и удалить супернатант, перевернуть трубку на чистой бумажной салфеткой и дать высохнуть за 10 мин Ресуспензируйте Пелле в нуклеиназы свободной воды. Если гранулы легко видно, Ресуспензируйте в 25 мкл. Если гранулы очень мало или не видна, Ресуспензируйте в 15-20 мкл. получить оценку концентрации РНК, спектрофотометр.
Примечание: Типичный РНК концентраций в диапазоне от 200-500 нг/мкл.
3. Визуализация РНК зонды электрофорезом геля RNA формальдегида для оценки чистоты РНК
Предупреждение: Формальдегид представляет опасности вдыхания; Таким образом создавать решения, необходимые для анализа геля RNA в зонта. Бромид ethidium — подозреваемых канцерогенов; обращаться с осторожностью.
- Как описано ранее24 и бросили гель в лари поле бесплатно полиадениновый Подготовьте гель агарозы 1% формальдегида. После прохладной, заполните поле гель с 1 x работает буфер (1 x MOPS при pH 7.0, 5% формальдегида).
- Подготовьте буфер образца (бромид ethidium 400 мг/мл 5 мкл, 20 мкл 10 x MOPS, 35 мкл формальдегида и 100 мкл формамид). Объединить 2 мкл РНК зонда (шаг 2.6) с 8 мкл пример буфера. Инкубируйте на 70 ° C на 10 мин.
- Подготовка загрузки буфера РНК путем объединения 5 мл 50% глицерина, 1 мл 10% формальдегида, 40 мг бромфеноловый синий, ксилол cyanol 40 мг и 20 мкл 0,5 М ЭДТА (рН 7,5). После использования Храните этот буфер при-20 ° C.
- Добавить 3 мкл буфера загрузки образцов РНК от 3.2 шаг и перемешать. Держите пробоотборные трубки на льду.
- Загрузите весь пример тома из шаг 3.4 в гель. Загрузите Алиготе одноцепочечной РНК лестнице вместе с тем, чтобы проверить размер РНК. Побегите гель на 100 V или ниже до тех пор, пока синий краситель переносит примерно 75% пути вниз геля. Визуализируйте РНК под УФ светом с помощью геля тепловизионные системы.
Примечание: Хорошее качество РНК зонд должен отображаться как дискретный группа с мобильностью, соответствующий ожидаемый размер датчика (рис. 2, переулок 1). Если зонд появляется в виде диффузного залитых и замазанных текстов группы (Рисунок 2переулок 2), это не должно использоваться.
4. Отметьте кишки коллекции и фиксация
- Соберите Черноногий нимф, которые кормили на мышах для времени точек интереса.
Примечание: Для целей этой техники, клещи ФРС для 48 или 72 ч работы лучше всего. - Вскрыть кишечник от клеща в MEMFA (Таблица 1) на слайде стекла под микроскопом рассечение, избегая повреждения органа как можно больше. Установите галочку на чистой микроскопа в 20-30 мкл MEMFA. Используя пару стерильных Высокоуглеродистая сталь лезвия бритвы #11 срез головы региона в щита клеща, оставляя тело клеща. Аккуратно нажмите тела толкать дивертикул кишечника и слюнных желез из тела кутикулы. Отдельные слюнных желез и кишечнике и черпать мужество на лезвии бритвы.
- Соберите кишки в 1,5 мл, содержащих 500 мкл MEMFA. Инкубировать трубки при комнатной температуре с плавное покачивание за 1 ч или на ночь при 4 ° C.
Примечание: Клеща слюнных желез может также быть расчленены и аналогично фиксированной и витражи. - Мыть нежно 3 раза с 1 мл ледяной 100% этанола обезвоживает ткани. Пусть кишки естественно опускаться на дно трубки между каждой мыть, как центрифугирования может повредить ткани. Для длительного хранения сохранить образцы в 100% этанола в-20 ° C.
5. Строительство сетка образца корзины и 24-ну корзина держатель
- Вырежьте дно прочь 2 мл и 5 мл оснастки Топ пробирок с помощью подогреваемый одним краем лезвия на скальпель.
Предупреждение: Лезвие может потребоваться быть разогреть несколько раз, прежде чем вырезать завершена. - Вырежьте квадраты сетки нейлона 110 мкм немного больше, чем открытие нового трубки. Бонд сетку в нижней части трубки их вместе слегка нажав на горячей плите на средне слабом огне до тех пор, пока сделал хорошее уплотнение. Пусть прохладно, убедитесь, что есть без пробелов между сеткой и трубки и обрезать излишки сетки вокруг краев.
- Вырезать отверстия в крышке плита 24-Ну что губы образца корзины в 5.2 шаг будет сидеть в отверстие и не проваливаться, уступая set-up, где дно корзины образца будет сидеть всю дорогу в скважинах, когда они находятся в отверстия в крышке.
- Используйте этот держатель установлены корзины для передачи корзины от одной плиты к другой с относительной легкостью для полностью в situ гибридизация протокола. Используйте две пластины 24-хорошо, так что хотя один инкубация происходит, другие плиты готова для следующего вымыть.
6. в Situ гибридизация: день 1 (сроки: 4-5 ч)
- Передача решился надписью Образец корзины, разделенных экспериментальные условия и предназначен РНК зонд.
Примечание: Пятно по крайней мере 5 кишки на условие для учета природные различия между реплицирует. - Увлажняет образцы осторожно, чтобы избежать воздушных пузырей в ткани, постепенно увеличивая соотношение фосфат амортизированное saline с 0.1% неионные ПАВ (PTw; Таблица 1) для этанола в стирок.
Примечание: Завершите все моет в держателе 24-ну корзины при комнатной температуре с нежным агитации, если не указано иное. Аликвота 500-600 мкл Вымойте решения в каждой скважине держателя такого полностью погружены кишки в каждой корзине. Подготовьте все решения DEPC-лечение водой для предотвращения деградации РНК.- Стирать образцы для 5 мин в 500 мкл 100% этанола.
- Подготовка по меньшей мере 500 мкл за образец корзину 75%, 50% и 25% этанола в ПТРС. увлажняет образцы промывкой для 5 минут в каждом этанола раствор, переход от самая высокая концентрация этанола на минимальную.
- Стирать образцы 4 раза за 5 мин в ПТРС.
- Разрушения образцов с протеиназы K (10 мкг/мл) в PTw за 5 мин.
- Подготовка ткани для гибридизации с зондами РНК.
- Стирайте образцы дважды, как описано в 6.2 в 24-ну корзина держатель с нежным агитации за 5 мин в 500 мкл буфера триэтаноламин (0,1 М, pH 7.0-8.0) при температуре окружающего воздуха (Таблица 1) сохранить образцы в среде Амин бесплатно.
- Лечить образцы дважды с 500 мкл 0,25% ангидрида уксусной кислоты в буфере триэтаноламин (0,1 М, pH 7.0-8.0) за 5 минут, затем промыть образцы дважды в PTw за 5 мин.
Примечание: Ангидрид уксусной кислоты acetylates бесплатно амины для нейтрализуют положительный заряд, который имеет решающее значение для предотвращения электростатических взаимодействий неспецифической и обеспечения конкретной привязки зонда к мРНК. - Исправить кишки для 20 мин с 500 мкл параформальдегида 4% в PTw, затем помыть 5 раз в PTw за 5 мин.
- Prehybridize по инкубации пробы в 500 мкл гибридизации буфера дополнителяных 24-ну корзина держатель в 24 хорошо пластину (Таблица 1) для 1,5-2,5 ч, при 60 ° C с нежным агитации в тряску водяной бане. Сохраните гибридизации буфер, используемый для prehybridization шага для повторного использования в Протоколе 2 день (шаг 7.1).
- Подготовьте зонд гибридизации решения путем разбавления зонды RNA в гибридизации буфера до конечной концентрации 1 мкг/мл. Проинкубируйте образцы с решениями зонд гибридизации в держателе 24-ну корзины при 60 ° C с нежным агитации на ночь в тряску водяной бане (таблица 2). Накладка, перевозящих корзины держатель плотно с алюминиевой фольги для предотвращения испарения раствора гибридизации.
7. в Situ гибридизация: день 2 (сроки: 4.5-5.5 ч)
- Удалить образцы из растворов гибридизация зонда и поместите их в буфере защищены гибридизации от предыдущего дня. Инкубируйте на 60 ° C с нежным агитации за 3 мин.
Примечание: Зонд гибридизации решения могут храниться при температуре-20 ° C для повторного использования в 3 раза. - Подготовка 2 x буфер солевой раствор натрия цитрата (SSC) путем разбавления 20 x SSC в воде DEPC-лечение (Таблица 1). Стирать образцы дважды за 3 мин с 2 x SSC, затем 3 раза втечение 20 мин с 2 x SSC при 60 ° C для удаления всех следов зонд и гибридизации буфера.
- Лечения с РНКазы (20 мкг/мл) и РНКазы T1 (10 мкг/мл) 2 x SSC на 30 минут при 37 ° C для удаления одного мель зонд РНК, представляющие бесплатно не гибридизированных РНК.
- Мыть раз с 2 x SSC 10 мин при комнатной температуре. Подготовить 0,2 x SSC путем разбавления 2 x SSC в DEPC-лечение водой, затем промыть дважды 0,2 x SSC за 30 мин при 60 ° C для удаления избыточного полиадениновый.
- Мыть два раза с 500 мкл буфера малеиновой кислоты (МАБ; Таблица 1) за 10 минут.
- Проинкубируйте образцы с блокировкой решение (2% блокировки реагента в МАБ) для 1,5-2 ч.
Примечание: Блокирование реагент может быть трудно растворить; Нежный Отопление СПИДа распада. - Заменить блокировки решение с анти digoxigenin щелочной фосфатазы конъюгированных 500 мкл антител на 1:3,000 разрежения в блокировании решения и инкубации при комнатной температуре около 4 ч или при температуре 4 ° C на ночь.
8. гибридизации in Situ : день 3 (сроки: 6 h для ночевки)
- Стирайте образцы по крайней мере 5 раз за 30 минут с 500 мкл МАБ для удаления избыточных антитела.
Примечание: Эти моет являются гибкими и может быть продлен до 1-2 ч, или 3-4 моет может быть заменен на одну ночь мыть при 4 ° C с минимальным влиянием на эффективность. - Мыть дважды за 5 мин с щелочной фосфатазы буфера, рН 9,5 (AP буфер; Таблица 1).
- Начинают цвет реакции, заменив последний мыть с 500 мкл Хромогенный субстрат для щелочной фосфатазы (Таблица материалов). Крышка образца с алюминиевой фольгой и пусть окрашивание действовать при комнатной температуре 3 - 5 часов или на ночь при 4 ° C. Периодически контролировать реакцию окрашивания, просмотрев ткани под микроскопом рассечения, чтобы избежать overstaining.
Примечание: Когда окрашивание, фиолетовый оттенок обнаруживаемых глаз в antisense исследовали образцы под микроскопом, но ткани не должно быть позволено стать очень темно. Пятнать проходит очень медленно при 4 ° C и может занять до 20-24 ч. - Остановить цветной реакции промывкой для 5 минут в 500 мкл МАБ, а затем исправить ткани на ночь в Буэна в растворе.
Предупреждение: Обрабатывать Буэна решение в вытяжного шкафа; это коррозионных канцероген.
9. в Situ гибридизация: день 4 (сроки: 3-3,5 ч)
- Подготовить по крайней мере 7 мл на образец корзина 1 x SSC путем разбавления 20 x SSC в DEPC-лечение водой. Удаление Буэна решения путем промывания образцы 4 – 6 раз с 70% этанола в 1 x SSC до тех пор, пока ткань больше не желтый.
- Подготовка 500 мкл за образец корзину 75%, 50% и 25% растворы этанола в 1 x SSC. Стирать образцы для 5 минут в каждом решении, переход от высокой концентрации этанола в низкие увлажняет ткань. Мыть дважды за 5 мин каждый в 1 x SSC.
- Проинкубируйте образцы в раствор отбеливателя (Таблица 1) 90 мин на лайтбоксе в зонта.
Примечание: Этот шаг позволяет любой пигментации в образцы или окраской от Bouins решения должны быть удалены и усиливает сигнал зонда для четкой визуализации. - Стирать образцы дважды с 500 мкл 1 x SSC 5 мин.
- Передислоцировать кишок с минимальным ущербом, инвертирование образца корзина в колодец нового 24-ну плиты и смыть через дно сетки с помощью пипетки передачи на 70% спирте. Хранить при температуре от-20 ° C, при необходимости.
- Чтобы получить обзор окрашивания моделей несколько образцов, как показано на рисунке 3, поддерживать кишки в 70% этанола в 24 хорошо плиты и вид с любой ярко поле Микроскоп. Для изучения отдельных кишки под микроскопом ярко поле, как показано на рис. 4, рис. 5, и Рисунок 6, смонтировать кишки в 100% глицерина под coverslips. Пластиковой лопаточкой нежно манипулировать ткани с минимальным ущербом.
Примечание: Высокая вязкость глицерина помогает защитить от повреждения тканей путем сжатия и позволяет тщательно позиционирования дивертикулы, таким образом, что ткани может рассматриваться оптимально при более высоких увеличениях. - Захват изображения микроскопа с помощью микроскопа конкретный образ захвата программного обеспечения (Таблица материалов) и экспортировать изображения в формате Tiff для общего редактирования изображений программное обеспечение. Для количественного определения относительной окрашивание различия между экспериментальное лечение, скачайте программное обеспечение анализа общий образ (Таблица материалов). Открыть изображение в программное обеспечение для анализа и использовать инструкции в программное обеспечение для измерения интенсивности пикселей окрашивание и вычислить окрашивание участков гистограммы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Измерение и оценка качества зонды RNA критических до начала окрашивания. В vitro транскрипция эффективность весьма зависит от количества и качества ДНК шаблона. Мы регулярно визуализирована РНК зонды на формальдегид гель для проверки чистоты и количество зонд, порожденных реакциях транскрипции. Датчики должны появиться как яркие, дискретные диапазоны (рис. 2). Спектрофотометрические измерения концентрации РНК были весьма ориентировочный зонд качества и коррелированные хорошо с появлением полос на геле. Таким образом гель визуализации шаг может быть пропущен при желании после достижения знакомство с протоколом. В любом случае, важно обеспечить что производится достаточно РНК высокого качества, как все ниже по течению шаги зависят от надежности зондов.
Сила этой техники состоит в содействии широкого наблюдения о клеща микробиоты, включая наличие или отсутствие бактериальной видов, изменения в обилие бактерий со временем как тик каналы и локализации видов в пределах всей ткани. Некоторые вариации в окрашивание объем и распределение нормальное биологическое реплицирует а также среди 7 пар дивертикулы отдельных кишок (рис. 3), таким образом, это лучшее пятно по меньшей мере пять кишки на условие, чтобы получить представление о среднем Окрашивание шаблон. Общий успех Протокола лучше всего оценить путем сравнения окрашивания образцов смысл и antisense для каждого условия. Смысл образцы, важные негативный контроль для этого типа анализа, должны иметь минимальный не фиолетовый цвет (рис. 4). И наоборот антисмысловых образцов должен отображать надежный окрашивание с минимальными фон, интенсивность которого будет зависеть от обилие конкретных бактериальных стенограммы мишенью. Окрашивание шаблона в ткани будут также различаться в зависимости от этих параметров. Важно отметить, что смысл и антисмысловых образцы должны разрабатываться для одинаковое количество времени для того, чтобы иметь возможность непосредственно сравнить их, так что эти примеры должны обрабатываться параллельно. Чрезмерное расширение цветовой реакции может привести к большим количеством фона, окрашивание, где образцы смысле начинают выглядеть antisense (рис. 5). Особое внимание следует на этот шаг в протоколе во избежание overstaining, поскольку нет способа изменить реакции после того, как это происходит.
Важно, чтобы убедиться, что все кишки полностью погруженной в каждом реагента во время каждого шага; Увеличение колебаний через образцы могут быть из-за неравномерного воздействия реагентов. Сумма времени что клещи питаются до кишки собираются также имеет значительное влияние на результаты. Клещи, которые были придавленные, или только кормят за 24 часа было трудно работать с; кишки были также более легко повреждены и не испачкать хорошо (рис. 6), и это ограничение этого подхода в настоящее время. Клещи, кормили за 48-72 ч были легче работать, из-за большего размера этих кишки по сравнению с кишки от клещей, кормили за 24 ч. кишки от более поздних точек времени также витражи лучше, чем 24 h кормили клещей, возможно из-за увеличения бактериальной нагрузки в более поздних стадиях o f кормления. 72-h ткани часто имел небольшой фон коричневый оттенок из крови, но фиолетового окрашивания была хорошо видна над оттенок (рис. 4). Кишки лучше всего просматривать на малое увеличение (5 X или 10 X), чтобы иметь возможность просматривать окрашивания моделей по всей ткани с помощью микроскопа ярко поле. Просмотр всего гора ткани на увеличение, таких как с 63 X нефти цель, бежит риск повреждения тканей, как цель будет давить слайд и сжать ткани за счет толщины образцов. Если выше резолюции изображений, следует изучить возможности для разрезания тканей.
Рисунок 1 . Схема подготовки шаблона для поколения зонд. Клонировать 16S рРНК ампликон в TA клонирования вектор, содержащий T7 и Sp6 промоутеров. Линеаризации конструкция, с помощью энзимов ограничения Cut на сайты или b для в vitro транскрипция используя T7 или Sp6 промоутер для создания чувства или antisense зонды соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 . Визуализация РНК зонда электрофорезом геля. Зонды RNA (~ 700 нг) были electrophoresed на геле агарозы формальдегида, визуализированы под УФ светом и образы с использованием коммерческих гель системы. Представитель хорошее качество, переулок 1; и низкое качество РНК зонд, переулок 2.
Рисунок 3 . Представитель обзор всего гора в situ гибридизация 48 h кормили кишок. Кишки от клещей кормили 48 ч, окрашивали antisense РНК в дополнение к сохраняемой 16S рибосомной РНК последовательности показывает дифференцированного окрашивания дивертикул кишечника. Линейки шкалы представляет 200 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 . Представитель изображения успешных целом гора в situ гибридизация в Черноногий кишки. Кишки от клещей, кормили за указанный период времени были окрашенных с помощью либо смысла (отрицательный контроль) или antisense РНК зонды. Антисмысловые зонды дополняют рибосомной РНК последовательности сохранены 16S (универсальный 16S) или 16S РНК последовательности, специфичные для определенного бактериального род (как указано). Enterococcus не дало надежную окрашивания на 48 ч. Шкала бары представляют 140 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 . Длительное время реакции хромогенных приводит к неспецифичный пятнать. Кишки от клещей, кормили в течение 48 часов были зондируемой с зондом РНК смысле или антисмысловых зонда, в дополнение к сохраняемой 16S РНК последовательности. Ткань была инкубировали с щелочной фосфатазы субстрата BM фиолетовый на ночь при 4 ° C, а затем при комнатной температуре около 4 ч до остановки реакции. Масштаб бары представляют 140 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 . Целом гора в situ гибридизация с помощью придавленные или 24 h кормили клеща кишки. Кишки от придавленные или 24 h кормили клещей были окрашенных с помощью зондов чувство РНК или antisense зонды дополнение к сохраняемой 16S РНК последовательности или последовательности, относящиеся к роду риккетсии. Окрашивание в антисмысловых образцах менее надежной, чем наблюдается в позднее время точках и кишки являются также более легко повреждены. Масштаб бары представляют 60 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Окончательный концентрации | Окончательный рН | Заметки для хранения |
| MEMFA | 0,1 М ШВАБРЫ | - | Комнатной температуре |
| 2 мм EGTA | |||
| Сульфат магния 1 мм | |||
| 3.7% формальдегида | |||
| PBS-анимации (PTw) | 1 x PBS, 0.1% Tween-20 | 7.0 | Комнатной температуре |
| 0,1% Tween-20 | |||
| Триэтаноламин буфер | ПБС | 7.0-8.0 | Комнатной температуре |
| 0.1 триэтаноламин М | |||
| Гибридизация буфер | 50% формамида | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 мг/мл Torula РНК | |||
| гепарин 100 мкг/мл | |||
| 1 x Denhart в решение | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| 0,1% ПАРНЕЙ | |||
| 10 мм ЭДТА | |||
| Малеиновой кислоты буфера (МАБ) | 100 мм малеиновой кислоты | 7.0 | Комнатной температуре |
| натрия хлорида 150 мм | |||
| Щелочная фосфатаза (АР) буфер | 100 мм трис | 9.5 | -20 ° C |
| Хлорид магния 50 мм | |||
| натрия хлорид 100 мм | |||
| 0,1% Tween-20 | |||
| Левамизол 5 мм | |||
| Раствор отбеливателя | 1% перекиси водорода | - | Подготовьте свежие |
| 5% формамида | |||
| 0.5 x SSC |
Таблица 1. Рецепты решений используется в протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Это первое использование техники целом гора в situ гибридизация (WMISH) для изучения микробиоты членистоногих вектора патогенов. Наш протокол был адаптирован от одного используется для изучения развития дрозофилы и лягушка эмбрионов25,26. Целом гора РНК в situ гибридизация регулярно используется для локализации транскрипты гена пространственно и височно27 и визуализация, стенографических отчетов может быть сделано путем ярко поле или флуоресцентной микроскопии. Мы приняли бывший к обнаружения микробиоты в тик кишки. Важно отметить, что попытки выполнить всего гора в situ гибридизация с использованием всего клещей, в которых глава региона был удален чтобы позволить проникновения фиксатором и гибридизации решений не был успешным. Описанные здесь протокол использует расчлененных кишки и реализован для изучения последствий конкретных клеща белков бактериальной колонизации в средняя23. Информация, полученная от WMISH сопоставима с иммуногистохимии, но имеет преимущество, не требующие поколения протеина и антитела к ген или протеина интереса. Геномная информация является достаточной для получения реагентов для WMISH. WMISH и рыбы (флуоресценции в гибридизации situ) может обнаружить экспрессии генов. Однако из-за его ферментативные и на основе хромогена assay, WMISH имеет то преимущество, что цвет развития активно контролироваться и реакция может продолжить до желаемого сигнала и чувствительности достигается. Он полностью поддается автоматизации и легко масштабируется для формата высокой пропускной способности. В отличие от рыбы и иммуногистохимии секционирование не требуется. Недостаток WMISH за рыба, что только 2 различных мРНК или гены могут решаться одновременно и потребует помечены зонды с различных нуклеотида аналогов таких digoxigenin-UTP и флюоресцеином UTP28. С рыбой до 6 различных мРНК могут рассматриваться в одном пробирного29. Хотя оба анализы требуют сопоставимых время, стоимость флуоресценции красители выше чем у хромогенных субстратов. РЫБУ анализов также потребует флуоресцентным микроскопом для визуализации изображения, в то время как WMISH изображение визуализации может быть выполнена с любой световой микроскоп.
Важно, что протокол является следил; Однако есть несколько шагов, которые требуют определенного ухода. Рассечение средняя от клеща не повреждая ткани требует определенной сноровке. Это может быть разумным для сбора дополнительных тактов на практике вскрытия и получить знание. Из-за неоднородности пятнать в различных дивертикулы отдельных кишок (рис. 3) важно изучить все дивертикулы каждого кишки для получения убедительных доказательств бактериальной изобилия. Важно также обрабатывать несколько кишки (по крайней мере 5) для каждого экспериментальные условия для получения исчерпывающей информации на присутствие, пространственное распределение и обилие конкретных видов бактерий в рамках различных дивертикулов. Производство высококачественных РНК зонды также имеет решающее значение для эффективного ткани пятнать. Важно также подтвердить последовательность зонд шаблон клонирования вектора для обеспечения что antisense и смысл зонды надлежащим образом создаются. Продуктивной в vitro транскрипция реакция требует достаточно шаблон ДНК; минимум 100 нг могут быть использованы, но 0,5 - 1 мкг рекомендуется для оптимальной зонд поколения.
Использование образца корзины и 24-ну пластины в этом протоколе избегает прямого манипулирования ткани на каждом шагу мыть, что сводит к минимуму повреждение во время процесса окрашивания. Однако образцы до сих пор иногда потеряны или повреждены; кишки от придавленные или 24h-кормили клещей, в частности, трудно понять и легко потерять при передаче из образца корзины для долгосрочного хранения контейнера. Следует дополнительная осторожность при обработке этих образцов. Из-за этого ограничения мы использовали главным образом 48 и 72 h кормили клеща кишки. Наличие большого количества крови еды в кишки на эти-моменты времени (более 72 ч) вмешивается окрашивание и визуализации благодаря неспецифической фон от крови еды и представляет также ограничением этой методики. Вполне вероятно, что использование дневно меченых зондов может обойти этот вопрос.
Наиболее важным аспектом процедуры окрашивания является установить баланс между надежные окрашивание и низкой фонового сигнала. Сроки разработки идеальный цвет может варьироваться в зависимости от экспериментальных условий. Таким образом лучше всего выполнять цветные реакции на комнатной температуре и монитор цвета развития примерно каждые 30 мин. Реакции могут создаваться также перейти на ночь при 4 ° C для замедления развития цвет. Однако чрезвычайно важно, чтобы не позволить этой реакции перейти долго. Окрашивание реакция может быть трудно контролировать на глаз, поэтому образцы должны рассматриваться под микроскопом рассечение. Фиолетовый оттенок должны быть видимыми на пробы исследовали с Антисмысловые РНК, в то время как образцы исследован с чувством, что РНК должны сохранять минимальный цвет. Если смысл РНК исследовали образцы пятна ярко, шаги по устранению неполадок должен начинаться с сокращение время инкубации с BM фиолетовый и увеличение времени блокировки. Иногда чувство зондов может вызвать аномально высокий фон, по сравнению с антисмысловых УЗП; в этих случаях различных регионах гена возможно должны рассматриваться для генерации зонды RNA. Последовательностей ДНК, не представлены в данной выборке также может рассматриваться в качестве шаблонов для создания отрицательного контроля датчиков. Например шаблон ДНК кодирования региона Зеленый флуоресцирующий белок, не представлены в геноме клеща или его микрофлора, могут быть использованы.
Единственным ограничением этой методики является значительной степени качественные; анализ Однако программное обеспечение для анализа изображений (Таблица материалов) может использоваться для измерения количества окрашивание сигнала в каждом образце. Это позволило бы полуколичественного сравнение обилие различных видов бактерий в различных экспериментальных условиях. Хотя это много времени протокол, который занимает 3-4 дня, это не трудоемкий; Каждый день практический время составляет только около 3-5 ч в среднем. Однако возможность обрабатывать множество образцов параллельно с использованием образца корзины и держатели позволяет для высокой пропускной способности анализа. Кроме того, этот процесс можно автоматизировать с помощью коммерчески доступных инструментов (таблица материалов) если этот протокол, как ожидается, будет важным и рутинной компонентом научно-исследовательской лаборатории с помощью коммерчески доступных Автоматизация совместимых платформ (Таблица материалов) для дальнейшего снижения практический время.
Описывается протокол позволяет использовать digoxygenin меченых зондами, которые позволяют производство колориметрические сигнал, который может быть образы с помощью микроскопии светлые области. Хотя мы использовали один Хромогенный субстрат для обнаружения RNA гибридизированные зонды для индивидуальных целей, это также можно обнаружить несколько целей одновременно, снабдив зонды с различных нуклеотида аналоги, такие как digoxigenin-UTP и флуоресцеин UTP и30различных хромогенных субстратов. Образцы тканей можно затем инкубируют последовательно с щелочной фосфатазы связанный антителами против digoxigenin и флуоресцеин, с различными хромогенных реакций за два шага. Этот метод также может быть адаптирована для дневно меченых датчиков, которые могут способствовать более высоким разрешением изображений с помощью конфокальной микроскопии31 и предоставляют возможность использования нескольких датчиков разных цветов параллельно. Этот метод может только конкретно оценить несколько микроорганизмов в одно время в одном образце. Однако несколько образцов может оцениваться в высок объём анализов для решения нескольких микроорганизмов, которые могут быть представлены в тик микробиоты.
Наконец эта техника не ограничивается исследование взаимодействия между клещей и их связанные микробиоты. Зонды дополняет любой ген интереса в геноме клеща могут быть и используется для изучения изобилия и локализации конкретных генов в различных тканях. Слюнные железы клеща может быть обработан и аналогичным образом проанализированы в кишечнике. В целом этот метод имеет широкий потенциал для адаптации к исследований по динамике микробных сообществ в рамках других членистоногих переносчиков интерес.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы искренне благодарим д-р Мустафа Коха, Йельский университет, для обеспечения использования его ресурсов лаборатории. Мы благодарны г-н Ву Минг-Цзе за отличную техническую помощь. EF является следователь HHMI. Эта работа была поддержана в подарок от Джона Monsky и Дженнифер Вейс Monsky болезнь Лайма исследований фонда.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
