Summary
نقدم هنا، بروتوكول مكانياً وزمنياً تقييم وجود الحجمية قابلة للتطبيق في الشجاعة التجزئة باستخدام نهج تعديل الجامعة-جبل تهجين في الموقع.
Abstract
تواصل الأمراض المعدية المنقولة بواسطة ناقلات المفصلية تشكل خطرا كبيرا على صحة الإنسان في جميع أنحاء العالم. مسببات الأمراض تسبب هذه الأمراض، ولا توجد في عزلة عندما أنهم استعمار ناقلات الأمراض؛ بدلاً من ذلك، يرجح أن يخوضوا في التفاعل مع الكائنات الدقيقة المقيمة في تجويف القناة الهضمية. قد تجلى الحجمية متجه تلعب دوراً هاما في انتقال مسببات المرض للعديد من الأمراض التي تحملها ناقلات المرض. لم يتم تحديد ما إذا كانت البكتيريا المقيمة في الأمعاء الغليظة للقراد سكابولاريس إيكسوديس ، ناقل للعديد من مسببات الأمراض البشرية بما في ذلك البورليه burgdorferi، التأثير القراد انتقال مسببات الأمراض. نحن تتطلب أساليب لوصف تكوين البكتيريا المرتبطة بالقناة الهضمية التجزئة لتيسير فهم أفضل للتفاعلات فيما يحتمل في القناة الهضمية القراد. استخدام كل جبل في الموقع التهجين لتصور الجيش الملكي النيبالي النصوص المرتبطة بالأنواع البكتيرية خاصة تسمح لجمع البيانات النوعية فيما يتعلق بوفرة وتوزيع الحجمية في أنسجة سليمة. هذا الأسلوب يمكن استخدامه لدراسة التغيرات في الوسط الحجمية القناة الهضمية على مدى القراد التغذية ويمكن تطبيقها أيضا على تحليل الجينات القراد. تلوين كامل التجزئة الشجاعة العائد من المعلومات حول التوزيع المكاني الإجمالي لهدف الجيش الملكي النيبالي في الأنسجة دون الحاجة لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد وهو أقل تأثرا بالتلوث البيئي، الذي كثيرا ما يفند القائم على التسلسل الطرق استخداماً في دراسة المجتمعات الميكروبية المعقدة. وعموما، هذا الأسلوب هو أداة قيمة يمكن استخدامها لتحسين فهم التفاعلات المتجهات-الممرض-الحجمية ودورها في نقل الأمراض.
Introduction
مسببات الأمراض البشرية والحيوانية المرسلة بواسطة ناقلات المفصلية يتم العثور عليها في جميع أنحاء العالم، وتستأثر بحوالي 20 في المائة أمراض المعدية على الصعيد العالمي1، ولكنها فعالة، ولا تتوفر لقاحات آمنة ضد معظم هذه العوامل المسببة للمرض. هو توسيع فهمنا للدور الهام للكائنات المجهرية commensal والتكافلية والمسببة للأمراض، المعروفة بميكروبيومي2، في تحوير وتشكيل صحة تقريبا جميع ميتازوانس3 . من الواضح الآن أن المفصليات الناقلة لمسببات الأمراض أيضا ميناء الحجمية القناة الهضمية وأظهرت هذه الحجمية المرتبطة بمكافحة ناقلات للتأثير على مختلف مسببات الأمراض المحمولة بالنواقل4،5. وتتألف من eubacteria والعتيقات، والفيروسات والميكروبات حقيقية النواة مثل البروتوزوا والديدان الخيطية والفطريات6ميكروبيومي المفصلية. بيد الأبحاث الغالبة انصب التركيز على eubacteria يرجع، جزئيا، إلى توافر علامة الجينات وقواعد بيانات مرجعية لتحديد أعضاء بكتيرية معينة.
مع تركيز على سكابولاريس إيكسوديس، ناقلات التجزئة من مسببات الأمراض البشرية متعددة بما في ذلك، البورليه burgdorferi7المسبّب لمرض لايم، الاستفادة المثلى من تقنية التصور الميكروبية تهدف إلى تحسين فهمنا للتجزئة الحجمية القناة الهضمية في سياق التفاعلات الممرض متجه. تظل عدة أسئلة يتعين الإجابة عليها في ميدان ميكروبيومي التجزئة. القناة الهضمية هو موقع أول لقاء موسع بين القراد والممرض واردة في سياق الكائنات الممرضة المنقولة أفقياً؛ ولذلك، فهم دور ناقل القناة الهضمية الحجمية في تحوير التفاعلات الممرض ناقلات سوف تكشف عن رؤى مفيدة. القراد بطريقة فريدة من نوعها لهضم وجبة الدم، حيث تجهيز وجبة الدم مكونات يأخذ مكان إينتراسيلولارلي8. تجويف القناة الهضمية على ما يبدو بمثابة وعاء لاحتواء وجبة الدم كما يغذي القراد، والهضم المغذيات والاستيعاب تترتب على ذلك طوال عدة أيام من التغذية ومواصلة الإحلال بعد. أدخل مسببات الأمراض المكتسبة بالقراد أثناء تغذية التجويف القناة الهضمية جنبا إلى جنب مع بلودميل وبالتالي يصبح التجويف موقع أساسي للتفاعلات بين القراد، والممرضات، والحجمية المقيم. كما عائدات الهضم عن طريق الإحلال والتجزئة إيكسوديد الصوف، يخضع القناة الهضمية9من التغييرات الهيكلية والوظيفية. التكوين وتنظيم المكانية بكتيريا القناة الهضمية من المرجح أن تختلف في الحفل مع الوسط القناة الهضمية المتغيرة أيضا. ولذلك، من المهم فهم بنية البكتيريا المقيمة في الأمعاء القراد تماما فهم التفاعل بين التجزئة والممرض والحجمية القناة الهضمية.
التقنيات الجزيئية لوصف الحجمية المرتبطة بالمضيف بشكل روتيني استخدام تسلسل المتوازي الفائق استراتيجيات10 إلى تضخيم وتسلسل الحمض النووي ريبوسومال 16S البكتيرية (المتاشب). هذه الاستراتيجيات تسلسل التحايل على الحاجة إلى الحصول على الثقافات أكسينيك من بكتيريا محددة، وتوفير وصف متعمق لجميع أعضاء البكتيرية الممثلة في العينة. ومع ذلك فهي خلطت بين هذه الاستراتيجيات بعدم القدرة على التمييز بين التلوث البيئي من المقيمين في حسن النية . علاوة على ذلك، عند تقييم العينات، مثل القراد، أن صغيرة في حجمها ومن ثم تحتوي على الحمض النووي الخاصة الحجمية منخفضة الغلة، احتمالات تضخيم ملوثات البيئية هو زيادة11 والنتائج في تفسير غامض تكوين ميكروبيومي. ولذلك توصيف وظيفي بالاقتران مع تصور البكتيريا قادرة على البقاء محددة سيكون حاسما لتحديد وتمييز ميكروبيومي القراد زمنياً ومكانيا. نحو تحقيق هذا الهدف، ونحن استغل من الحمض النووي الريبي التهجين الجامع-جبل في الموقع . هذه التقنية تستخدم بشكل روتيني لتقييم أنماط التعبير الجيني في الأجهزة والأجنة12،،من1314 ويسمح تحليل مسوحات للتعبير على نموذج كامل للفائدة. وهذا يختلف عن التقليدي في الموقع تقنيات التهجين التي تستخدم أقسام الأنسجة وغالباً ما تتطلب تحليل مستفيض للمواد مقطعة مع الجمعية حسابية للتنبؤ بالتعبير في كامل أجهزة15. بينما يشن كل يشير عموما إلى كل الكائنات الحية12، هنا كل-جبل يشير إلى الشجاعة كله أو الأجهزة. مزايا استخدام الحمض النووي الريبي الجامع-جبل في الموقع التهجين نهج لتقييم هيكل التجزئة الحجمية القناة الهضمية المتعددة الوجوه. تتألف القناة الهضمية التجزئة 7 أزواج من رتوج، كل زوج متفاوتة في حجم16. الاختلافات الوظيفية، إذا وجدت، بين هذه رتوج، غير مفهومة في سياق التجزئة البيولوجيا، ضع علامة أمام تفاعلات الحجمية أو الممرض القراد. سوف يزيح التلاعب من القناة الهضمية التي تمزق رتوج الأمعاء الحجمية موجودة في تجويف القناة الهضمية أو تلك المرتبطة فضفاضة بالقناة الهضمية والنتيجة في التفسير الخاطئ لتوطين الحجمية المكانية. وقد استخدمت الأسفار المسماة الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين في وقت سابق لدراسة القراد القناة الهضمية المستنسخات17 من خلال تحديد وفتح رتوج الأمعاء الفردية لضمان التحقيق التهجين وتعريب burgdorferi (ب) النصوص بتقطيع القراد كلها جزءا لا يتجزأ من البارافين18. تتطلب كلا من هذين النهجين التلاعب في الأنسجة التجزئة قبل التهجين التي تؤثر على بنية الحجمية القناة الهضمية.
في هذا التقرير، يصف لنا بالتفصيل على دراسة الحجمية القناة الهضمية القراد قابلة للتطبيق الجامع-جبل في الموقع التهجين (وميش) باستخدام البروتوكول. استخدام الحمض النووي الريبي الجامع-جبل في الموقع التهجين يمكن فهم عالمي لوجود ووفرة من بكتيريا القناة الهضمية محددة في مناطق مختلفة من القناة الهضمية وقد حفز رؤى جديدة في الأحياء القناة الهضمية القراد في سياق الاستعمار الممرض وانتقال العدوى. علاوة على ذلك، يتيح استخدام الحمض النووي الريبي المجسات الموجهة ضد الجيش الملكي النيبالي بكتيرية معينة الكشف عن البكتيريا قادرة على البقاء في القناة الهضمية القراد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-إعداد قوالب الحمض النووي
- تحميل تسلسل الرنا الريباسي 16S محددة لكل أجناس البكتيرية من نكبي قاعدة البيانات وتصميم البلمرة المتسلسل (PCR) متوافقة إلى الأمام وعكس الإشعال التي سيتم تضخيم المناطق جنسا على حدة (~ 200-250 زوج قاعدي طويل) كما هو موضح سابقا 19-تشير أيضا إلى المصدر المفتوح قواعد البيانات سيلفا20،21 بروبيباسي22 على الإنترنت الموارد والمسابير استهدفت الرنا الريباسي اليغنوكليوتيد والإشعال، كما قد تكون تحقيقات الجيش الملكي النيبالي لبعض أجناس بكتيرية تجارياً المتاحة.
ملاحظة: من المهم تحديد مناطق الجينات التي أجناس محددة إلى محددة وضمان أن كبسولة تفجير تصميم عدم تضخيم أجناس البكتيريا ذات الصلة. وهذا أمر حاسم للحصول على التحقيقات الخاصة بالجينات/جنسا التهجين. - تغذية القراد لتشريح الشجاعة القراد ح 24 أو 48 أو 72 في الفئران، وإعداد الجيش الملكي النيبالي وكدنا من الشجاعة التجزئة ك سابقة وصف23. تضخيم كدنا استخدام كقالب لبكر أمبليكونس جنسا على حدة باستخدام ثيرموسيكلير. تشغيل قاسمة PCR-المنتج/أمبليكون على 1.5% [اغروس] هلام وتأكيد أن amplicon يتوافق مع الحجم المتوقع حسب التصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية) باستخدام هلام نظام التصوير.
- استنساخ amplicon الرنا الريباسي الجرثومي 16S الاهتمام إلى ناقل تا متاحة تجارياً (جدول المواد) التي تحتوي على الحمض النووي الريبي بوليميراز المروجين مناسبة بولمرس عاثية (SP6 أو T7 T3). التسلسل المستنسخين للتأكد من هوية أمبليكون واتجاهية لاستنساخ فيما يتعلق بكل من المروجين. وبناء على ذلك، تحديد يسبر المروج لاختيار لتوليد معنى أو العقاقير الحمض النووي الريبي (الشكل 1).
- لينيريزي 1 ملغ بلازميد مع إنزيم التقييد ملائمة في حجم رد فعل µLfor يصل إلى 30 ح 2 في درجات الحرارة الموصى بها من قبل الشركة المصنعة. اختر إنزيمات التقييد استناداً إلى المروج التي سوف تستخدم لتوليد معنى أو العقاقير التحقيق (الشكل 1). تحقق من استخطاط بالتصور 2 ميليلتر من خلاصة الرد على 1% [اغروس] هلام.
- تنقية ميليلتر 28 المتبقية من هضم الحمض النووي استخدام مجموعة تنقية عمود منتجات PCR متاحة تجارياً وقياس تركيز الحمض النووي بجهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: قد يسبب بعض المسابير الإحساس بتلوين الخلفية أعلى بكثير من المسبار العقاقير المقابلة وخيارات أخرى قد تحتاج إلى استكشاف. وتشمل الضوابط السلبية البديلة والبلازميدات ترميز تسلسلات غير الممثلة في العينة أو مسبار آخر أن ينتج نمط مميز من التهجين.
2-تشييد لتحقيقات الجيش الملكي النيبالي ديجوكسيجينين-UTP
- إعداد مزيج النوكليوتيدات عن طريق الجمع بين 7.5 ميليلتر من 100 ملم UTP، 25 ميليلتر من 10 مم ديجوكسيجينين-UTP، وميليلتر 10 من كل 100 ملم ATP، وأنشئ والأداء النظري المركب في أنبوب الطرد مركزي 1.5 مل.
- إجراء النسخ في المختبر باستخدام مجموعات بوليميريز T7 أو الحمض النووي الريبي Sp6 المتاحة تجارياً، باستخدام 1 ميليلتر من مزيج النوكليوتيدات (2.1 خطوة) و 0.25-1 ميكروغرام من قالب الحمض النووي. إحضار حجم ما يصل إلى 20 ميليلتر بالماء. نفض الغبار على أنبوب للجمع ونبض تدور. احتضان في 37 درجة مئوية ح 2.5-3.
ملاحظة: البناء المسبار قد نجحت مع بلازميد هضمها تركيزات منخفضة تصل إلى 7 نانوغرام/ميليلتر، لكن تركيزات نموذجية في هذا النطاق خطوة من 15-25 نانوغرام/ميليلتر. أيضا قد يكون المحتضنة رد فعل النسخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، ولكن هذا لا يزيد إلى حد كبير العائد الجيش الملكي النيبالي. - أضف 1 ميليلتر من الدناز (وحدات 2,000/ميليلتر) واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. لا تتجاوز 10 دقائق، أو قد تبدأ الإنزيم اللاإنسانية الحمض النووي الريبي.
- إضافة 30 ميليلتر من المثلج كلوريد الليثيوم 7.5-8 متر و 30 ميليلتر لتبريد المياه خالية من نوكلاس يعجل بالجيش الملكي النيبالي. نفض الغبار على أنبوب للمزيج. السماح لهطول الأمطار من الحمض النووي الريبي المضي قدما، بين عشية وضحاها في-20 درجة مئوية.
- تجميع الجيش الملكي النيبالي بالطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. أغسل بيليه مرة واحدة مع 1 مل إيثانول 75% الطازجة في الماء بيروكاربوناتي (ديبك) إثيل، ثم كرر الطرد المركزي.
- إزالة وتجاهل المادة طافية وعكس الأنبوب على منشفة ورقية نظيفة، والسماح لتجف للحد الأدنى 10 ريسوسبيند بيليه في المياه خالية من نوكلاس. إذا كان بيليه مرئياً بسهولة، ريسوسبيند في 25 ميليلتر. إذا كان بيليه ريسوسبيند صغيرة جداً أو غير مرئية، في 15-20 ميليلتر. الحصول على تقدير لتركيز الحمض النووي الريبي بجهاز المطياف الضوئي.
ملاحظة: رنا نموذجي تركيزات تتراوح بين 200-500 نانوغرام/ميليلتر.
3-التصور من الحمض النووي الريبي يسبر بالتفريد جل فورمالدهايد الحمض النووي الريبي لتقييم نقاء الحمض النووي الريبي
تنبيه: فورمالدهايد يشكل مخاطر استنشاق؛ ولذلك، تولد الحلول المطلوبة لتحليل الحمض النووي الريبي جل في غطاء دخان. اثيديوم بروميد مادة مسرطنة المشتبه فيها؛ التعامل مع الرعاية.
- إعداد فورمالدهايد 1% [اغروس] هلام كما تم وصفه سابقا24 ويلقي الهلام في مربع هلام خالية من رناسيس. مجرد بارد، ملء مربع هلام مع 1 × تشغيل المخزن المؤقت (1 x الممسحات، على درجة الحموضة 7.0، فورمالدهايد 5%).
- إعداد "المخزن المؤقت" الذي عينة (5 ميليلتر 400 مغ/مل اثيديوم بروميد، 20 ميليلتر 10 × 35 ميليلتر فورمالدهايد، والمماسح و 100 ميليلتر ميثلامين). الجمع بين 2 ميليلتر من مسبار الحمض النووي الريبي (الخطوة 2.6) مع 8 ميكروليتر من "عينة المخزن المؤقت". تبني على 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- إعداد "الجيش الملكي النيبالي تحميل المخزن المؤقت" عن طريق الجمع بين والغليسيرول 50% 5 مل، 1 مل 10% فورمالدهايد، 40 مغ بروموفينول الأزرق، 40 مغ زيلين نفط زايلين و 20 ميليلتر يدتا 0.5 M (درجة الحموضة 7.5). بعد استخدام وتخزين هذا المخزن المؤقت في-20 درجة مئوية.
- إضافة 3 ميليلتر من "تحميل المخزن المؤقت" إلى عينة الحمض النووي الريبي من 3.2 خطوة ومزيج. تبقى أنابيب العينة على الجليد.
- تحميل حجم عينة كاملة من 3.4 خطوة إلى الهلام. تحميل قاسمة سلم الحمض النووي الريبي المفرد-الذين تقطعت بهم السبل إلى جانب للتحقق من حجم الجيش الملكي النيبالي. تشغيل الهلام في 100 V أو أقل حتى الصبغة الزرقاء وترحيل حوالي 75 ٪ الطريق إلى أسفل الجل. تصور الجيش الملكي النيبالي تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية باستخدام نظام تصوير هلام.
ملاحظة: يجب أن يظهر تحقيق رنا ذات نوعية جيدة كعصابة منفصلة مع تنقل المقابل للحجم المتوقع للتحقيق (الشكل 2، لين 1). إذا كان التحقيق يظهر أنه منتشر وملطخ عصابة (الشكل 2، لين 2) وهذا لا ينبغي أن تستخدم.
4-وضع علامة جمع القناة الهضمية والتثبيت
- جمع الحوريات سكابولاريس إيكسوديس التي قد تتغذى على الفئران للوقت نقاط الاهتمام.
ملاحظة: لأغراض هذا الأسلوب، القراد تغذية لعمل ح 48 أو 72 أفضل. - تشريح القناة الهضمية من القراد في ميمفا (الجدول 1) على شريحة زجاجية تحت مجهر تشريح، تجنب الضرر للجهاز إلى أقصى حد ممكن. ضع علامة على شريحة مجهر نظيفة في 20-30 ميليلتر من ميمفا. استخدام زوج من شريحة عقيمة عالية من الكربون الصلب موس #11 منطقة الرأس في الترس القراد ترك الجسم القراد. اضغط برفق الجسم لدفع رتوج القناة الهضمية والغدد اللعابية ببشرة الجسم. فصل الغدد اللعابية والقناة الهضمية وحلج القطن الشجاعة على شفرة حلاقة.
- جمع الشجاعة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على 500 ميليلتر ميمفا. احتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة مع هزاز لطيف ح 1 أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: الغدد اللعابية التجزئة قد أيضا يكون تشريح والمثل الثابتة والملون. - يذوي الأنسجة بالغسيل 3 مرات بلطف مع 1 مل المثلج الإيثانول 100%. واسمحوا الشجاعة بالوعة بطبيعة الحال إلى الجزء السفلي من الأنبوب بين كل غسل، الطرد المركزي قد تلحق الضرر الأنسجة. للتخزين على المدى الطويل، تبقى العينات في الإيثانول 100% عند-20 درجة مئوية.
5. بناء شبكة عينة سلال وحامل سلة 24-جيدا
- قطع أنابيب الطرد المركزي الإضافية-أعلى باستخدام شفرة حلاقة واحد ذو حدين ساخنة على مشرط قيعان الخروج من 2 مل أو 5 مل.
تنبيه: قد تحتاج الشفرة تكون تسخين عدة مرات قبل اكتمال القص. - قطع المربعات من النايلون 110 ميكرون أكبر قليلاً من افتتاح أنبوب جديد. السندات في mesh إلى الجزء السفلي من الأنبوب بالضغط عليهما معا طفيفة على لوحة الساخن على حرارة منخفضة ومتوسطة حتى يتم اعتماد ختم جيدة. السماح لتبرد وضمان وجود أي ثغرات بين الشبكة والانبوب وتقليم مش الزائدة حول الحواف.
- قطع ثقوب في غطاء لوحة 24-جيدا أن هذه الشفة سلة عينة في "الخطوة 5، 2" سوف تجلس في الحفرة ولا تقع من خلال، مما أسفر عن مجموعة حيث سيجلس القيعان من سلال عينة كل وسيلة في الآبار عندما يوضعون في ثقوب في الغطاء.
- استخدام هذا حامل سلة المجهزة لنقل سلال من لوح واحد إلى آخر بسهولة نسبية للبروتوكول التهجين في الموقع بأكملها. استخدام اثنين 24-جيدا لوحات بحيث أثناء حدوث حضانة واحدة، لوحة أخرى مستعدة ليغسل المقبلة.
6-التهجين في الموقع : يوم 1 (توقيت: ح 4-5)
- نقل الشجاعة للمسمى سلال عينة، مفصولة بشرط التجريبية ويقصد بها مسبار الحمض النووي الريبي.
ملاحظة: وصمة عار الشجاعة على الأقل 5 كل شرط لحساب التباين الطبيعي بين replicates. - ترطيب العينات برفق لتجنب إدخال فقاعات الهواء في الأنسجة تدريجيا زيادة نسبة الفوسفات مخزنة المالحة مع الفاعل غير الأيونية 0.1% (محطة؛ الجدول 1) إلى الإيثانول في يغسل.
ملاحظة: إكمال يغسل جميع في حامل سلة 24-جيدا في درجة الحرارة المحيطة بالانفعالات لطيف إلا إذا ذكر خلاف ذلك. الكوة 500-600 ميليلتر لحلول المياه والصرف الصحي في كل بئر من صاحب هذه الشجاعة في كل سلة مغمورة تماما. إعداد جميع الحلول مع المياه المعالجة ديبك لمنع تدهور الجيش الملكي النيبالي.- تغسل العينات لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر 100 ٪ الإيثانول.
- إعداد على الأقل 500 ميليلتر كل سلة عينة من 75%، 50%، و 25 ٪ إيثانول في محطة. ترطيب العينات قبل الغسيل لمدة 5 دقائق في كل حل الإيثانول، تتحرك من أعلى تركيز الإيثانول إلى أدنى مستوى.
- تغسل العينات 4 مرات لمدة 5 دقائق في محطة.
- بيرميبيليزي العينات مع "ك البروتيناز" (10 ميكروغرام/مل) في محطة لمدة 5 دقائق.
- إعداد الأنسجة التهجين مع تحقيقات الجيش الملكي النيبالي.
- تغسل العينات مرتين كما هو موضح في 6.2 في حامل سلة 24-جيدا في درجة الحرارة المحيطة بالانفعالات لطيف لمدة كل 5 دقائق في 500 ميليلتر ثلاثي إيثانول أمين المخزن المؤقت (0.1 M، درجة الحموضة 7.0-8.0) (الجدول 1) المحافظة على العينات في بيئة خالية من أمين.
- معالجة العينات مرتين مع 500 ميليلتر 0.25% أنهيدريد الخل في ثلاثي إيثانول أمين المخزن المؤقت (0.1 م، درجة الحموضة 7.0-8.0) لمدة 5 دقائق، ثم تغسل العينات مرتين في محطة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: أنهيدريد الخل أسيتيلاتيس الأمينات مجاناً لتحييد تهمة إيجابية، هو أمر حيوي لمنع التفاعلات الالكتروستاتيكي غير محددة وضمان ملزمة محددة للتحقيق معه مرناً. - إصلاح الشجاعة لمدة 20 دقيقة مع 500 ميليلتر 4% بارافورمالدهيد في محطة، ثم يغسل 5 مرات في محطة لمدة 5 دقائق.
- بريهيبريديزي بحضانة العينات في 500 ميليلتر التهجين/in المخزن المؤقت مع الانفعالات لطيف في حمام مائي تهز حامل سلة 24-جيدا في 24 لوحة جيدا (الجدول 1) ح 1.5-2.5 عند 60 درجة مئوية. حفظ التهجين المخزن المؤقت المستخدم للخطوة بريهيبريديزيشن لإعادة استخدامها في البروتوكول 2 يوم (الخطوة 7، 1).
- إعداد الحلول التهجين مسبار بإضعاف تحقيقات الجيش الملكي النيبالي في المخزن المؤقت التهجين إلى تركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل. احتضان عينات مع حلول التهجين المسبار في حامل سلة 24-جيدا عند 60 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف بين عشية وضحاها في حمام مائي تهز (الجدول 2). تغطية لوحة تحمل شكل مريح مع رقائق الألومنيوم حامل سلة لمنع تبخر المحلول التهجين.
7-التهجين في الموقع : يوم 2 (توقيت: ح 4.5 5.5)
- إزالة العينات من الحلول التهجين المسبار ووضعها في المخزن المؤقت محجوز التهجين عن اليوم السابق. احتضان عند 60 درجة مئوية مع الانفعالات لطيف لمدة 3 دقائق.
ملاحظة: التحقيق التهجين الحلول قد تكون مخزنة في-20 درجة مئوية لإعادة الاستخدام تصل إلى 3 مرات. - إعداد 2 × سترات الصوديوم المالحة المخزن المؤقت (SSC) بتمييع 20 x SSC في المياه المعالجة ديبك (الجدول 1). تغسل العينات مرتين لمدة 3 دقيقة مع 2 × التعاون بين بلدان الجنوب، ثم 3 مرات لمدة 20 دقيقة مع 2 x SSC عند 60 درجة مئوية لإزالة جميع آثار المخزن المسبار والتهجين.
- تعامل مع رناسي (20 ميكروغرام/مل) و T رناسي1 (10 ميكروغرام/مل) في 2 x SSC لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية لإزالة واحد الذين تقطعت بهم السبل مسبار الحمض النووي الريبي تمثل مجاناً غير-تهجين الحمض النووي الريبي.
- أغسل مرة واحدة مع 2 x SSC لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تعد 0.2 x SSC بتمييع 2 x SSC في المياه المعالجة ديبك، ثم يغسل مرتين مع 0.2 x SSC لمدة 30 دقيقة عند 60 درجة مئوية لإزالة رنسيس الزائدة.
- تغسل مرتين مع 500 ميليلتر من حمض الماليك المخزن المؤقت (ماب؛ الجدول 1) لكل 10 دقائق.
- احتضان العينات بعرقلة الحل (كاشف حظر 2% في ماب) 1.5-2 ح.
ملاحظة: الكاشف حظر يمكن أن يكون من الصعب على حل؛ تدفئة لطيف متلازمة انحلال. - يستعاض عن عرقلة الحل بمكافحة ديجوكسيجينين القلوية الفوسفاتيز مترافق 500 ميليلتر من جسم في إضعاف 1:3,000 في عرقلة الحل واحتضان في درجة حرارة الغرفة لحوالي 4 ح أو عند 4 درجة مئوية بين عشية وضحاها.
8-التهجين في الموقع : 3 يوم (التوقيت: 6 (ح) بين عشية وضحاها)
- تغسل العينات 5 مرات على الأقل عن 30 دقيقة مع 500 ميليلتر ماب لإزالة الأجسام المضادة الزائدة.
ملاحظة: يغسل هذه تتسم بالمرونة ويمكن أن تمتد إلى ح 1-2، أو يمكن الاستعاضة عن واحد يغسل بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع أقل تأثير على فعالية يغسل 3-4. - تغسل مرتين لمدة 5 دقائق مع المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوية، pH 9.5 (AP المخزن المؤقت؛ الجدول 1).
- يبدأ رد الفعل اللون بالاستعاضة عن الغسيل الأخير مع 500 ميليلتر من الركازة اللونية الفوسفاتيز القلوية (جدول المواد). تغطية لوحة عينة مع رقائق الألومنيوم وترك تلطيخ المضي قدما في درجة حرارة الغرفة ل 3-5 ح أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. مراقبة رد فعل المصبوغة دورياً عن طريق عرض الأنسجة تحت مجهر تشريح لتجنب أوفيرستينينج.
ملاحظة: عند اكتمال تلطيخ اللون أرجواني خفيف يمكن كشفها بالعين المجردة في عينات سبر antisense تحت المجهر، ولكن الأنسجة لا ينبغي أن تصبح داكنة جداً. تلوين تمضي ببطء شديد عند 4 درجة مئوية، وقد يستغرق ما يصل إلى 20-24 س. - وقف رد الفعل اللون قبل الغسيل لمدة 5 دقائق في 500 ميليلتر ماب، ثم إصلاح الأنسجة بين عشية وضحاها في الحل بوين.
تنبيه: تعامل مع الحل بوين في غطاء دخان؛ أنها مادة مسرطنة أكالة.
9-التهجين في الموقع : يوم 4 (توقيت: ح 3-3.5)
- إعداد على الأقل 7 مل كل سلة عينة من 1 x SSC 20 تمييع x SSC في المياه المعالجة ديبك. إزالة الحل بوين غسل العينات 4 إلى 6 مرات مع الإيثانول 70% في 1 x SSC حتى لم يعد النسيج الأصفر.
- إعداد 500 ميليلتر كل عينة سلة حلول الإيثانول 75%، 50%، و 25% في 1 x SSC. تغسل العينات لمدة 5 دقائق في كل حل، ينتقلون من تركيز الإيثانول أعلى إلى أدنى ترطيب الأنسجة. تغسل مرتين لمدة 5 دقائق كل 1 في x SSC.
- احتضان هذه العينات في محلول التبييض (الجدول 1) لمدة 90 دقيقة في الضوء في غطاء دخان.
ملاحظة: هذه الخطوة يسمح أي تصبغ في عينات أو التلون من حل بوينس المراد إزالتها ويعزز إشارة مسبار لرؤية واضحة. - تغسل العينات مرتين مع 500 ميليلتر من 1 x SSC لمدة 5 دقائق.
- نقل الشجاعة مع الحد الأدنى من الضرر بعكس سلة عينة في بئر صفيحة 24-بئر جديدة وتغسل مع الإيثانول 70% من خلال شبكة أسفل استخدام ماصة نقل. تخزين في-20 درجة مئوية إذا لزم الأمر.
- للحصول على لمحة عامة عن أنماط المصبوغة من عينات متعددة، كما هو موضح في الشكل 3، الحفاظ على الشجاعة في الإيثانول 70% في 24 لوحة جيدا وعرض مع أي مجهر الحقل مشرق. دراسة الشجاعة الفردية تحت مجهر مشرق الحقل كما هو موضح في الشكل 4، 5 الشكل، و الشكل 6، جبل الشجاعة في والغليسيرول 100 ٪ تحت كوفيرسليبس. استخدام ملعقة بلاستيكية للتلاعب بلطف بالانسجة مع الحد الأدنى من الضرر.
ملاحظة: لزوجة عالية الجلسرين يساعد على حماية الأنسجة من التلف بالضغط ويسمح الموضع الدقيق من رتوج مثل الأنسجة يمكن أن ينظر على النحو الأمثل في تكبير أعلى. - التقاط الصور في المجهر استخدام مجهر برنامج التقاط الصور محددة (جدول المواد) والتصدير كصور Tiff إلى صورة عامة برامج تحرير. لقياس الاختلافات المصبوغة النسبي بين علاجات تجريبية، تنزيل برامج تحليل صورة عامة (الجدول للمواد). فتح الصورة داخل برنامج تحليل واستخدام التعليمات داخل البرنامج لقياس كثافة بكسل لتلطيخ وحساب الرسم البياني مؤامرات لتلطيخ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
قياس وتقدير نوعية المسابير الحمض النووي الريبي الحاسمة قبل بداية تلطيخ. في المختبر كفاءة النسخ عالية يعتمد على كمية ونوعية من قالب الحمض النووي. ونحن بشكل روتيني تصور تحقيقات الجيش الملكي النيبالي على جل فورمالدهايد التحقق من النقاء وكمية من مسبار المتولدة عن ردود فعل النسخ. يجب أن تظهر المسابير العصابات مشرقة والمنفصلة (الشكل 2). Spectrophotometric قياسات تركيز الحمض النووي الريبي كانت يدل على نوعية التحقيق للغاية وترتبط أيضا بظهور العصابات على الهلام. وبالتالي، قد يتم تخطي الخطوة التصور جل إذا رغبت بمجرد تحقق الألفة مع البروتوكول. وفي كلتا الحالتين، من المهم ضمان أن يتم إنتاج الحمض النووي الريبي كافية ذات جودة عالية، جميع الخطوات النهائية تتوقف على مدى متانة التحقيقات.
قوام هذا الأسلوب في تيسير الملاحظات واسعة حول الحجمية التجزئة، بما في ذلك وجود أو عدم وجود الأنواع البكتيرية، والتغيرات في وفرة بكتيريا مع مرور الوقت كما يغذي القراد، والترجمة من الأنواع داخل النسيج كله. بعض الاختلاف في تلطيخ المبلغ والتوزيع أمر طبيعي بين replicates البيولوجية وكذلك بين 7 أزواج رتوج الشجاعة الفردية (الشكل 3)، ولذلك، فمن الأفضل أن وصمة عار الشجاعة على الأقل خمسة كل شرط للحصول على فكرة عن متوسط تلوين النقش. أفضل يقاس النجاح الشامل للبروتوكول عن طريق مقارنة تلطيخ عينات الإحساس و antisense لكل حالة. عينات الإحساس، عناصر سلبية هامة لهذا النوع من التحليل، ينبغي أن يكون الحد الأدنى لأي لون الأرجواني (الشكل 4). على العكس من ذلك، يجب عرض عينات العقاقير تلطيخ قوية مع خلفية الحد الأدنى، كثافة الذي سيعتمد على وفرة النصوص البكتيرية محددة مستهدفة. كما يختلف نمط المصبوغة داخل الأنسجة استناداً إلى هذه المعلمات. الأهم من ذلك، يجب وضع معنى وعينات العقاقير لنفس المقدار من الوقت لكي تتمكن من مقارنة مباشرة لهم، حيث يجب أن يتم معالجة هذه العينات بالتوازي. تذبل لرد فعل اللون يمكن أن ينتج كمية كبيرة من الخلفية تلطيخ، حيث تبدأ العينات الشعور لتبدو مشابهة ل antisense (الشكل 5). وينبغي إيلاء عناية خاصة في هذه الخطوة في البروتوكول لتجنب أوفيرستينينج، كما لا توجد وسيلة لعكس رد فعل بمجرد حدوثه.
من الأهمية بمكان التأكد من الشجاعة جميع مغمورة تماما في كل كاشف خلال كل خطوة؛ قد تكون زيادة التباين عبر العينات نظراً لتفاوت التعرض للمواد الكاشفة. مقدار من الوقت أن القراد تتغذى قبل أن يتم جمع الشجاعة أيضا له أثر كبير على النتائج. علامات التجزئة التي كانت الشبعانة أو تتغذى فقط على 24 ساعة كانت صعبة للعمل؛ الشجاعة هي أيضا أكثر بسهولة بأضرار ووصمة عار لا جيدا (الشكل 6)، وحد من هذا النهج في هذا الوقت. القراد بنك الاحتياطي الفيدرالي ح 48-72 أسهل للعمل مع، نظراً لحجم أكبر من هذه الشجاعة عند مقارنتها بالشجاعة من القراد تغذية للشجاعة 24 h. نقاط وقت لاحق أيضا الملون أفضل من القراد تغذية ح 24، ربما بسبب الزيادة في عبء البكتيرية خلال س مراحل لاحقة و التغذية. الأنسجة ح 72 كثيرا ما كان خلفية طفيف للون البنى من الدم، ولكن تلطيخ الأرجواني كانت واضحة للعيان على الصبغة (الشكل 4). الشجاعة هي أفضل عرض تكبير منخفضة (5 X أو 10 X) ليتمكن من عرض أنماط المصبوغة عبر الأنسجة كاملة باستخدام مجهر الحقل مشرق. عرض النسيج الجامع-جبل في أعلى التكبير، كما هو الحال مع 63 × الهدف النفط، ينطوي على خطر إلحاق الضرر الأنسجة كما أن الهدف اضغط على الشريحة وضغط الأنسجة بسبب سمك العينات. إذا كان المطلوب هو أعلى قرار التصوير، ينبغي أن تدرس إمكانية تقطيع الأنسجة.
الشكل 1 . التخطيطي لإعداد قالب لتوليد مسبار. استنساخ أمبليكون الرنا الريباسي 16S في تا استنساخ المتجهات التي تحتوي على المروجين T7 و Sp6. لينيريزي بناء استخدام إنزيمات التقييد لقص في مواقع أو ب للنسخ في المختبر باستخدام المروج T7 أو Sp6 إلى توليد مجسات الإحساس أو أنتيسينسي على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 . التصور لمسبار الحمض النووي الريبي بالتفريد جل. تحقيقات الجيش الملكي النيبالي (~ 700 نغ) كانوا اليكتروفوريسيد على فورمالدهايد [اغروس] هلام، تصور تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية، وتصويرها باستخدام هلام تجارية نظام التصوير. ممثل ذات نوعية جيدة، لين 1؛ ورداءة مسبار الحمض النووي الريبي، لين 2.
الشكل 3 . نظرة ممثل لكل جبل في الموقع التهجين من الشجاعة التي تغذيها ح 48. تغذية الشجاعة من القراد ليظهر ح 48 ملطخة antisense الحمض النووي الريبي مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي الريباسي 16S مصانة تلطيخ التفاضلية من رتوج الأمعاء. يمثل الشريط مقياس 200 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 . الصور التمثيلية لنجاح كل جبل التهجين في الموقع في الشجاعة سكابولاريس إيكسوديس . الشجاعة من القراد تغذية للمبلغ المشار إليه في وقت كانت الملون باستخدام أما معنى (مراقبة سلبية) أو يسبر antisense الجيش الملكي النيبالي. المسابر العقاقير تعتبر مكملة لتسلسل الحمض النووي الريبي الريباسي 16S مصانة (16S العالمي) أو تسلسل الحمض النووي الريبي 16S محددة لجنس بكتيرية معينة (كما هو موضح). البرازية لم تسفر عن تلطيخ قوية في h. 48 حجم أشرطة تمثل 140 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 . وقت رد الفعل اللونية المطول يؤدي إلى تلطيخ غير محددة. تم سبر الشجاعة من القراد لمدة 48 ساعة مع تحقيق رنا إحساس أو تحقيقا العقاقير تكميلية لتسلسل الحمض النووي الريبي 16S مصانة. وكان المحتضنة الأنسجة مع الركيزة الفوسفاتيز القلوية BM الأرجواني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ثم في درجة حرارة الغرفة لحوالي 4 ح قبل وقف رد الفعل. تمثل أشرطة مقياس 140 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 . كل جبل في الموقع باستخدام التهجين الشبعانة أو 24 ساعة تغذية القراد الشجاعة. الشجاعة من القراد الشبعانة أو 24 ح التي تغذيها كانت الملون باستخدام المسابر الإحساس بالحمض النووي الريبي أو antisense تحقيقات تكميلية لتسلسل الحمض النووي الريبي 16S مصانة أو تسلسل معين إلى جنس الريكتسية. تلوين في عينات العقاقير أقل متانة مما لوحظ في نقاط زمنية لاحقة والشجاعة أيضا أكثر سهولة بأضرار. تمثل أشرطة مقياس 60 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الاسم | تركيزات النهائي | الرقم الهيدروجيني النهائي | تخزين الملاحظات |
| ميمفا | 0.1 والمماسح M | - | درجة حرارة الغرفة |
| 2 مم عطا | |||
| سلفات المغنيزيوم 1 مم | |||
| 3.7% فورمالدهايد | |||
| برنامج تلفزيوني-توين (محطة) | 1 x PBS، 0.1% توين-20 | 7.0 | درجة حرارة الغرفة |
| 0.1% 20 توين | |||
| ثلاثي إيثانول أمين المخزن المؤقت | 1 x برنامج تلفزيوني | 7.0-8.0 | درجة حرارة الغرفة |
| 0.1 ثلاثي إيثانول أمين M | |||
| المخزن المؤقت التهجين | ميثلامين 50% | - | -20 درجة مئوية |
| 5 x SSC | |||
| 1 ملغ/مل تورلا الحمض النووي الريبي | |||
| الهيبارين 100 ميكروغرام/مل | |||
| 1 × الحل دينهارت | |||
| 0.1% 20 توين | |||
| 0.1 الفصول % | |||
| 10 مم يدتا | |||
| حمض الماليك المخزن المؤقت (ماب) | حمض الماليك 100 مم | 7.0 | درجة حرارة الغرفة |
| كلوريد الصوديوم 150 مم | |||
| المخزن المؤقت الفوسفاتيز القلوي (AP) | 100 مم تريس | 9.5 | -20 درجة مئوية |
| كلوريد المغنيسيوم 50 مم | |||
| كلوريد الصوديوم 100 مم | |||
| 0.1% 20 توين | |||
| ليفاميسول 5 مم | |||
| الحل التبييض | فوق أكسيد الهيدروجين 1% | - | إعداد جديدة |
| ميثلامين 5% | |||
| 0.5 x SSC |
الجدول 1. وصفات الحلول المستخدمة في البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وهذا هو أول استخدام لتقنية التهجين (وميش) كل جبل في الموقع لدراسة الحجمية لمتجه المفصلية من مسببات الأمراض. وكان لدينا بروتوكول مقتبس من واحد يستخدم لدراسة التنمية في المورفولوجية والضفدع الأجنة25،26. كل يشن الجيش الملكي النيبالي في الموقع التهجين قد استخدمت بشكل روتيني لترجمة النصوص الجينات مكانياً ووقتيا27 والتصور للنصوص يمكن أن يتم بمشرق الميدانية أو بواسطة مجهر فلوري. وقد اعتمدنا السابقة نحو الكشف عن الحجمية في الشجاعة القراد. من المهم أن نلاحظ أن محاولات لأداء كل جبل في الموقع التهجين كله القراد التي تمت إزالة منطقة الرأس للسماح بتغلغل الحلول مثبت والتهجين لم تكن ناجحة باستخدام. يستخدم الشجاعة تشريح البروتوكول الموصوفة هنا وقد نفذت إلى دراسة آثار الاستعمار الجرثومي في الأمامي23البروتينات التجزئة المحددة. المعلومات التي تم الحصول عليها من وميش قابل للمقارنة إلى إيمونوهيستوتشيميستري ولكن له ميزة لا تتطلب توليد البروتين والأجسام المضادة للجين أو البروتين من الفائدة. المعلومات الجينومية غير كافية لتوليد الكواشف وميش. وميش والأسماك (الأسفار في الموقع التهجين) يمكن الكشف عن التعبير الجيني. ومع ذلك، نظراً لكونها تحليل الأنزيمي والمستندة إلى chromogen، وميش له ميزة أن التنمية لون يمكن رصدها بفعالية، ورد الفعل هو السماح بالمضي حتى الإشارات المرغوبة وحساسية ويتحقق. فهي قابلة تماما للتشغيل الآلي وقابلة بسهولة إلى تنسيق الفائق. وخلافا للأسماك وإيمونوهيستوتشيميستري، مطلوب لا تمزيقها. سيئات وميش على الأسماك هو أن فقط 2 مرناس مختلفة أو الجينات يمكن أن تعالج في نفس الوقت وتتطلب أن يكون المسمى تحقيقات مع النظير النوكليوتيدات مختلفة مثل ديجوكسيجينين-UTP و UTP فلوريسسين28. مع الأسماك، ما يصل إلى 6 مرناس مختلفة يمكن النظر في تحليل واحد29. بينما تتطلب فحوصات كل الوقت قابلة للمقارنة، تكلفة الأصباغ الفلورية أعلى من ركائز اللونية. كما سيتطلب فحوصات الأسماك مجهر الأسفار لرؤية الصورة، بينما يمكن أن يؤديها وميش صورة التصور مع أي مجهر الضوء.
من الأهمية بمكان أن البروتوكول هو تابعت عن كثب؛ ومع ذلك، هناك بعض الخطوات التي تحتاج إلى رعاية خاصة. تشريح الأمامي من القراد دون إلحاق الضرر بالانسجة يتطلب بعض المهارة. قد يكون من الحكمة لجمع القراد إضافي لممارسة تشريح واكتساب الكفاءة. نظراً لعدم تجانس تلطيخ في رتوج مختلفة من الشجاعة الفردية (الشكل 3)، من المهم أن تدرس جميع رتوج من كل القناة الهضمية لاستخلاص أدلة قاطعة على وفرة البكتيرية. من المهم أيضا معالجة عدة الشجاعة (على الأقل 5) لكل شرط التجريبية بغية الحصول على معلومات حاسمة على وجود والتوزيع المكاني، ووفرة من بكتيريا محددة داخل رتوج مختلفة. إنتاج تحقيقات الجيش الملكي النيبالي عالية الجودة ضروري أيضا لتلطيخ الأنسجة الفعالة. من المهم أيضا تأكيد تسلسل القالب المسبار في ناقل الاستنساخ لضمان أن antisense والمسابير الشعور يتم إنشاؤها على نحو ملائم. يتطلب رد فعل نسخ منتجة في المختبر كافية قالب الدنا؛ حد أدنى 100 نانوغرام يمكن استخدامها، ولكن 0.5-1 ميكروغرام من المستحسن لتوليد التحقيق الأمثل.
ويتجنب استخدام سلال عينة ولوحات 24-جيدا في هذا البروتوكول التلاعب المباشر للأنسجة في كل خطوة الغسيل، مما يقلل من ضرر أثناء عملية المصبوغة. ومع ذلك، العينات يتم لا يزال أحياناً فقدت أو أتلفت؛ الشجاعة من القراد الشبعانة أو تغذية 24 ساعة، على وجه الخصوص، صعوبة في رؤية وسهلة لتفقد عند نقل من سلال عينة لحاوية تخزين الطويل الأجل. إضافية ينبغي الحرص أثناء التعامل مع هذه العينات. بسبب هذا القيد، وقد استخدمنا أساسا الشجاعة التجزئة التي تغذيها ح 48 و 72. وجود كميات كبيرة من وجبة الدم في الشجاعة في هذه النقاط الزمنية (أطول من ح 72) يتداخل مع تلطيخ والتصور بسبب الخلفية غير محددة من الدم-الوجبة ويعرض أيضا حد من هذا الأسلوب. ومن المرجح أن استخدام المسابير المسمى فلوريسسينتلي يمكن التحايل على هذه المشكلة.
الجانب الأكثر أهمية من الإجراء المصبوغة إقامة التوازن بين تلطيخ قوية وإشارة خلفية منخفضة. توقيت وضع لون مثالية يمكن أن تختلف تبعاً لظروف تجريبية. وهكذا، فمن الأفضل القيام برد فعل اللون في درجة حرارة الغرفة ومراقبة التنمية لون كل 30 دقيقة تقريبا. يمكن أيضا إعداد رد فعل المضي بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية بطء التنمية اللون. ومع ذلك، أنها حرجة للغاية لا للسماح لرد الفعل هذا العمل لفترة طويلة. يمكن أن يكون رد فعل المصبوغة صعوبة رصد بالعين المجردة، حيث ينبغي فحص العينات تحت مجهر تشريح. اللون أرجواني خفيف يجب أن تكون مرئية على عينات سبر مع العقاقير الحمض النووي الريبي، بينما سبر العينات مع الإحساس بالجيش الملكي النيبالي أن تحتفظ بلون الحد الأدنى. إذا كانت عينات الحمض النووي الريبي سبر الشعور بوصمة عار الزاهية، خطوات استكشاف الأخطاء وإصلاحها ينبغي أن تبدأ بتقليل وقت الحضانة مع BM الأرجواني وزيادة فترة حظر. أحياناً يمكن أن يسبب الإحساس بتحقيقات خلفية طولية عالية مقارنة بالمسابير العقاقير؛ وفي هذه الحالات، قد يكون مناطق مختلفة من الجينات التي سينظر فيها لتوليد تحقيقات الجيش الملكي النيبالي. تسلسل الحمض النووي غير ممثلة في نموذج معين قد يعتبر كقوالب لتوليد مجسات مراقبة سلبية. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم قالب الحمض النووي ترميز منطقة من البروتين الفلورية الخضراء، ليست ممثلة في الجينوم التجزئة أو في ميكروبيومي،.
واحد الحد من هذا الأسلوب أن التحليل النوعي إلى حد كبير؛ ومع ذلك، يمكن استخدام برمجيات تحليل الصورة (جدول المواد) لقياس مقدار إشارة المصبوغة في كل عينة. وهذا سيتيح مقارنة شبه كمي لوفرة الأنواع البكتيرية المختلفة تحت ظروف تجريبية مختلفة. وبينما هذا هو بروتوكول مضيعة للوقت الذي يستغرق 3-4 أيام لإكمال، أنها ليست شاقة؛ وقت التدريب العملي على كل يوم فقط حوالي 3-5 ساعة في المتوسط. ومع ذلك، القدرة على معالجة العديد من عينات بالتوازي مع استخدام سلال عينة وأصحاب يسمح بتحليل الفائق. علاوة على ذلك، هذه العملية يمكن أن يكون آليا باستخدام الأدوات المتوفرة تجارياً (الجدول للمواد) إذا كان هذا البروتوكول يتوقع أن يكون عنصرا أساسيا والروتينية في مختبر البحوث باستخدام متاحة تجارياً منصات متوافق مع التنفيذ التلقائي (جدول المواد) لمواصلة تقليل وقت التدريب العملي.
وصف بروتوكول يجعل استخدام المسابير المسمى ديجوكسيجينين التي تسمح بإنتاج إشارة اللونية التي يمكن تصويرها باستخدام مجهر الحقل مشرق. وفي حين أننا قد استخدمت واحد الركازة اللونية للكشف عن الحمض النووي الريبي المهجن تحقيقات محددة الأهداف الفردية، من الممكن أيضا للكشف عن أهداف متعددة في نفس الوقت بوصفها تحقيقات مع النظير النوكليوتيدات مختلفة، مثل ديجوكسيجينين-UTP و fluorescein UTP وركائز اللونية مختلفة30. ثم يمكن أن عينات الأنسجة المحتضنة تسلسلياً مع اقتران الفوسفاتيز القلوية أجسام مضادة ضد ديجوكسيجينين وفلوريسسين، مع مختلف التفاعلات اللونية للخطوتين التاليتين. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتحقيقات المسمى فلوريسسينتلي، التي قد تسهل التصوير عالية الدقة باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]31 وتوفير خيار استخدام المسابير متعددة من ألوان مختلفة في نفس الوقت. يمكن هذا الأسلوب فقط على وجه التحديد لتقييم بعض الكائنات المجهرية في وقت واحد في عينة واحدة. ومع ذلك، يمكن تقييم عدة عينات في فحوصات الفائق للتصدي للعديد من الكائنات الحية الدقيقة التي قد تكون ممثلة في التجزئة الحجمية.
أخيرا، هذا الأسلوب لا يقتصر على تحقيق التفاعلات بين علامات التجزئة والحجمية المرتبطة بهم. قد ولدت تحقيقات تكميلية لأي الجينات من الاهتمام داخل الجينوم القراد والمستخدمة لدراسة وفرة والتعريب من جينات محددة في أنسجة مختلفة. يمكن أيضا معالجة الغدد اللعابية للقراد وتحليلها على نحو مماثل للقناة الهضمية. عموما، هذا الأسلوب إمكانات واسعة للتكيف للدراسات عن ديناميات المجتمعات الميكروبية داخل ناقلات الأمراض المفصلية الأخرى ذات الاهتمام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.
Acknowledgments
ونشكر الدكتور مصطفى الخوخة مع، جامعة ييل، مخلصا لتوفير استخدام الموارد المختبر له. ونحن ممتنون للسيد وو جي مينغ للمساعدة التقنية الممتازة. EF محقق HHMI. وأيد هذا العمل هدية من جون مونسكي وجينيفر ويس مونسكي صندوق أبحاث مرض لايم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
- Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
- Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
- Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
- Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
- Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
- Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
- Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
- Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
- Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
- Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
- Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
- Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
- Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
- Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
- Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
- Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
- Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
- Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
- Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
- Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
- Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
- Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
- Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
- Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
- Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
- Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
- Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
- Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
- Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
- Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).
