Summary
Nous présentons ici un protocole pour spatialement et temporellement évaluer la présence de la microflore viable dans les tripes de tique à l’aide d’une approche modifiée entier-Montez l’hybridation in situ.
Abstract
Maladies infectieuses transmises par des arthropodes vecteurs continuent de poser une menace significative pour la santé humaine dans le monde entier. Les pathogènes responsables de ces maladies, n’existent pas isolément lorsqu’ils colonisent le vecteur ; plutôt, ils s’engagent sans doute dans leurs interactions avec les microorganismes résidents dans la lumière du tube digestif. Le vecteur intestinal a été démontré à jouer un rôle important dans la transmission d’agents pathogènes pour plusieurs maladies à transmission vectorielle. Si les bactéries résidant dans l’intestin de la tique Ixodes scapularis , le vecteur de plusieurs agents pathogènes humains, y compris de Borrelia burgdorferi, influent sur la transmission de la tique d’agents pathogènes n’est pas déterminé. Nous avons besoin de méthodes permettant de caractériser la composition des bactéries associées à l’intestin de la tique afin de faciliter une meilleure compréhension des interactions entre les espèces potentielles dans l’intestin de la tique. L’utilisation entier-montent en situ hybridation pour visualiser des ARN transcrits associées à certaines espèces bactériennes permet pour la collecte de données qualitatives concernant l’abondance et la distribution de la microflore dans le tissu intact. Cette technique permet d’analyser les changements dans le milieu de la microflore intestinale au cours de la tique d’alimentation et peut également être appliquée pour analyser l’expression des gènes de la tique. Coloration de toute tique tripes rendement d’informations sur la distribution spatiale brute des ARN dans le tissu cible sans la nécessité d’une reconstruction tridimensionnelle et est moins affectée par la contamination de l’environnement, qui confond souvent basée sur le séquençage Méthodes fréquemment utilisées pour l’étude des communautés microbiennes complexes. Dans l’ensemble, cette technique est un outil précieux qui permet de mieux comprendre les interactions pathogène-vecteur-microbiote et leur rôle dans la transmission de la maladie.
Introduction
Humaine et animale des pathogènes transmis par les arthropodes vecteurs sont trouvent dans le monde entier et représentent environ 20 % des maladies infectieuses dans le monde1, mais efficace et n’existe pas de vaccin sécuritaire contre la plupart de ces agents pathogènes. Notre compréhension de l’importance du rôle des micro-organismes commensaux, symbiotiques et pathogènes, collectivement connus comme le microbiome2, en modulant et façonner la santé de presque tous les métazoaires3 est en expansion. Il est maintenant évident que les arthropodes vecteurs d’agents pathogènes hébergent également le microbiote intestinal et auraient dû être divulgués ces micro-organismes associés à vecteur d’influencer divers vecteurs pathogènes4,5. Le microbiome arthropod se compose des eubactéries, archées, les virus et les microbes eucaryotes comme les protozoaires, nématodes et champignons6. Cependant, recherche prédominant mis l’accent a sur eubactéries due, en partie, à la disponibilité de gènes marqueurs et bases de données bibliographiques pour identifier des membres bactériens spécifiques.
En mettant l’accent sur les Ixodes scapularis, la tique vectrice de plusieurs agents pathogènes humains, dont Borrelia burgdorferi7, l’agent causal de la maladie de Lyme, l’optimisation d’une technique de visualisation microbienne visait à améliorer notre compréhension des tiques microbiote intestinal dans le cadre d’interactions pathogène-vecteur. Il reste plusieurs questions à trancher dans le domaine de microbiome tique. L’intestin est le site de la première rencontre élargie entre la tique et le pathogène entrant dans le cadre des pathogènes horizontalement transférés ; par conséquent, comprendre le rôle de vecteur microbiote intestinal en modulant les interactions pathogène-vecteur révélera aperçu significatif. Tiques ont un mode unique de la digestion du repas de sang, où le traitement de la farine de sang composants prend place intracellulairement8. La lumière du tube digestif sert apparemment comme récipient pour contenir le repas de sang comme les flux de la tique et assimilation et digestion des éléments nutritifs s’ensuivent tout au long des jours d’alimentation et continuent après réplétion. Les agents pathogènes acquis par la tique pendant l’alimentation entrer la lumière du tube digestif ainsi que les farines de sang et la lumière devient donc un site principal d’interactions entre la tique, pathogène et la microflore résidente. Comme digestion produit par le biais de la réplétion et de la tique Ixodes mue, le tube digestif subit des changements structuraux et fonctionnels9. La composition et l’organisation spatiale des bactéries de l’intestin est également susceptible de varier de concert avec le milieu changeant de tube digestif. Par conséquent, il est important de comprendre l’architecture des bactéries résidentes dans l’intestin de la tique pour bien comprendre l’interaction des tiques, pathogène et microbiote intestinal.
Techniques moléculaires pour décrire le microbiote hôte associés à systématiquement utilisent les parallèles séquençage haut débit stratégies10 amplifier et de séquencer l’ADN ribosomique 16 s bactérienne (ADNr). Ces stratégies de séquençage contournent la nécessité d’obtenir des cultures axéniques de bactéries spécifiques et fournir une description détaillée de tous les membres bactériennes représentées dans l’échantillon. Néanmoins, ces stratégies sont confondus par l’incapacité à distinguer des contaminations environnementales des résidents de bona fide . En outre, lors de l’évaluation d’échantillons, comme les tiques, qui sont de petite taille et donc contiennent de l’ADN de microbiote spécifiques faible rendements, la probabilité de l’amplification des contaminants environnementaux est accrue11 et se traduit par l’interprétation ambiguë de composition de microbiome. Caractérisation fonctionnelle en conjonction avec la visualisation de certaines bactéries viables, par conséquent, sera essentielle pour définir et pour discerner le microbiome du coutil temporellement et spatialement. Pour atteindre cet objectif, nous avons profité de l’entier-Montez RNA in situ hybridation. Cette technique est couramment utilisée pour évaluer les profils d’expression génique dans les organes et les embryons12,13,14 et permet une analyse semi-quantitative de l’expression sur l’ensemble de l’échantillon d’intérêt. Cela diffère des traditionnels in situ hybridation des techniques qui utilisent des sections de tissu et nécessitent souvent une analyse approfondie du matériel sectionné avec un assemblage informatique pour prédire l’expression en entier organes15. Tandis que l’ensemble monture désigne généralement tout organismes12, entier-Montez désigne ici les boyaux entiers et organes. Les avantages d’utiliser l’approche de l’ARN entier-montent en situ hybridation afin d’évaluer l’architecture des tiques microbiote intestinal sont multiples. L’intestin de la tique est composé de 7 paires de diverticules, chaque paire variant en taille16. Les différences fonctionnelles, si il en est, parmi ces diverticules, ne sont pas compris dans le contexte de la biologie de la tique, cocher microbiote ou tique-pathogen interactions. Manipulations de l’intestin qui rompent les diverticules de l’intestin écarteraient microbiote présent dans la lumière du tube digestif ou ceux qui sont associés sans serrer le tube digestif et aboutir à une interprétation erronée de la localisation spatiale du microbiote. Fluorescence-étiquetée RNA in situ hybridation a été utilisée plus tôt pour examiner la tique gut transcriptions17 en fixant et en ouvrant les diverticules gut individuels afin d’assurer l’hybridation de la sonde et de localiser de b. burgdorferi transcriptions en sectionnant la paraffine entier tiques18. Ces deux approches nécessitent des manipulations des tissus tique avant l’hybridation qui influeraient sur l’architecture de microflore intestinale.
Dans ce rapport, nous décrivons en détail le protocole afin d’examiner la tique viable microbiote intestinal entier-montent en situ hybridation (WMISH). L’utilisation de l’ensemble de montage RNA in situ hybridation permet une compréhension globale de la présence et l’abondance des bactéries de l’intestin spécifique dans les différentes régions de l’intestin et peut stimuler de nouvelles connaissances sur la biologie gut tick dans le contexte de la colonisation de l’agent pathogène et la transmission. En outre, l’utilisation de sondes d’ARN dirigée contre des ARN bactérien spécifiques permet la détection de bactéries viables dans l’intestin de la tique.
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Protocol
1. préparation des gabarits d’ADN
- Télécharger la séquence de l’ARNr 16 s spécifique à chaque genres bactériens de la NCBI database et conception chaîne par polymérase (PCR) compatible avec impatience et d’inverser les amorces qui vont amplifier les régions de genres spécifiques (~ 200-250 paires longueur) comme décrit précédemment 19. aussi reportez-vous aux libres bases SILVA20,21 et probeBase22 en ligne ressources pour sondes oligonucléotidiques ARNr ciblées et apprêts, comme sondes d’ARN pour certains genres bactériens peuvent être commercialement disponible.
Remarque : Il est important de sélectionner des régions des gènes qui sont spécifiques à des genres et faire en sorte que les amorces n’amplifient pas les genres bactériens liés. Ceci est crucial pour obtenir l’hybridation des genres spécifiques/sonde. - Flux des tiques pour 24, 48 ou 72 h sur des souris, disséquer les tripes de la tique et préparer des ARN et des ADNc de tripes tique comme décrit plus tôt23. Utilisation de cDNA en tant que modèle pour PCR amplifier amplicons genres spécifiques à l’aide d’un thermocycleur. Exécuter une partie aliquote de la PCR-produit/amplicon sur un gel d’agarose de 1,5 % et confirment que l’amplicon correspond à la taille attendue par la visualisation sous la lumière ultraviolette (UV) à l’aide d’un gel, système d’imagerie.
- Cloner l’amplicon d’ARN ribosomal bactériens 16 s d’intérêt dans un vecteur de TA commercialement disponible (Table des matières) contenant des promoteurs de l’ARN polymérase adaptés aux polymérases bactériophage (SP6, T7 ou T3). La séquence des clones pour confirmer l’identité de l’amplicon et la directionnalité du clone à l’égard de chacun des promoteurs. Sur cette base, déterminer le promoteur de choix pour générer des sens ou l’ARN antisens sondes (Figure 1).
- Linéariser 1 mg du plasmide avec une enzyme de restriction appropriée dans un volume réactionnel de jusqu'à 30 µLfor 2 h à une température recommandée par le fabricant. Choisissez des enzymes de restriction basées sur le promoteur qui est utilisé pour générer le sens ou la sonde antisens (Figure 1). Vérifiez linéarisation par la visualisation de 2 µL de réaction digest sur un gel d’agarose à 1 %.
- Purifier le µL 28 restants d’ADN digéré à l’aide d’un kit de purification de colonne de produit PCR disponible dans le commerce et quantifier la concentration d’ADN par le spectrophotomètre.
Remarque : Certaines sondes sens pourraient tacher fond beaucoup plus élevé que la sonde antisense correspondante et autres options peuvent doivent être explorées. Autres témoins négatifs comprennent des plasmides codant des séquences non représentés dans l’échantillon ou d’une autre sonde qui génère un modèle distinctif de l’hybridation.
2. la construction de sondes d’ARN dioxygénine-UTP
- Préparer le mélange de nucléotides en combinant 7,5 µL de 100 mM UTP, 25 µL de 10 mM dioxygénine-UTP et 10 µL de 100 mM ATP, GTP et CTP dans un tube à centrifuger 1,5 mL.
- Effectuer la transcription de in vitro utilisant des kits disponibles dans le commerce de T7 ou Sp6 RNA polymérase, en utilisant 1 µL du mélange nucléotides (point 2.1) et 0,25 - 1 µg d’ADN. Compléter le volume jusqu'à 20 µL d’eau. Mettez le tube afin de combiner et d’impulsions de spin. Incuber à 37 ° C pendant 2,5 à 3 h.
Remarque : Construction de la sonde a réussi avec le plasmide digéré concentrations aussi faibles que 7 ng/µL, mais des concentrations typiques à cette gamme d’étape de 15 à 25 ng/µL. La réaction de transcription peut-être également être incubée pendant une nuit à 37 ° C, mais cela n’augmente pas significativement le rendement de la RNA. - Ajouter 1 µL de DNase (2 000 unités/µL) et incuber à 37 ° C pendant 10 min. Ne dépassez pas 10 min, ou l’enzyme peut commencer dégradants RNA.
- Ajouter 30 µL glacee 7,5 à 8 M de chlorure de lithium et 30 µL d’eau exempte de nucléase réfrigérée à précipiter l’ARN. Mettez le tube pour mélanger. Permettre la précipitation d’ARN pour passer une nuit à-20 ° C.
- Recueillir les RNA par centrifugation à 17 000 x g pendant 20 min à 4 ° C. Laver le culot une fois avec 1 mL d’éthanol de 75 % fraîchement préparés au diéthyl pyrocarbonate (DEPC) l’eau, puis répétez la centrifugation.
- Retirer et jeter le surnageant, inverser le tube sur une serviette en papier propre et laisser pour sécher pour 10 min. Resuspendre le culot dans de l’eau exempte de nucléase. Si la pastille est facilement visible, resuspendre dans 25 µL. Si la pastille est très petite ou non visibles, remettre en 15-20 µL. obtenir une estimation de la concentration en ARN par spectrophotomètre.
Remarque : RNA typique les concentrations varient de 200 à 500 ng/µL.
3. visualisation de l’ARN sondes par électrophorèse sur Gel de formaldéhyde de l’ARN pour évaluer la pureté de l’ARN
ATTENTION : Formaldéhyde présentant un danger d’inhalation ; par conséquent, générer les solutions requises pour l’analyse de la RNA gel sous une hotte. Bromure d’éthidium est un cancérogène ; manipuler avec précaution.
- Préparer un gel d’agarose à 1 % de formaldéhyde comme décrit précédemment24 et monter le gel dans une boîte de gel gratuit de RNases. Une fois refroidi, remplir la boîte gel avec 1 x tampon (1 x vadrouilles à pH 7,0, 5 % de formaldéhyde).
- Préparer la solution tampon (bromure d’éthidium 400 mg/mL de 5 µL, 20 µL 10 x MOPS, 35 µL formaldéhyde et 100 µL formamide). Combiner 2 µL de sonde d’ARN (étape 2.6) avec 8 µL de tampon. Incuber à 70 ° C pendant 10 min.
- Préparer la RNA chargement tampon en combinant glycérol à 50 % 5 mL, 1 mL 10 % de formaldéhyde, bleu de bromophénol 40 mg, 40 mg de xylène cyanol et 20 µL d’EDTA 0,5 M (pH 7.5). Après utilisation, ranger ce tampon à-20 ° C.
- Ajouter 3 µL de tampon de chargement à l’échantillon de RNA d’étape 3.2 et mélanger. Garder les tubes d’échantillons sur la glace.
- Charger le volume de l’échantillon entier de l’étape 3.4 dans le gel. Charger une partie aliquote d’échelle RNA monocaténaire à côté pour vérifier la taille de la RNA. Exécutez le gel à 100 V ou plus bas jusqu'à ce que le colorant bleu migre environ 75 % de la voie sur le gel. Visualiser l’ARN sous UV à l’aide d’un système d’imagerie de gel.
Remarque : Une sonde d’ARN de bonne qualité doit apparaître comme une bande discrète avec une mobilité correspondant à la taille prévue de la sonde (Figure 2, voie 1). Si la sonde apparaît comme une bande diffuse et graisseux (Figure 2allée 2) cela ne devrait pas être utilisé.
4. Cochez Gut Collection et Fixation
- Recueillir des nymphes d’Ixodes scapularis qui ont nourri sur des souris pour les points d’intérêt dans le temps.
Remarque : Pour l’application de cette technique, tiques nourris pendant 48 ou 72 h travail mieux. - Sur une lame de verre sous un microscope à dissection, évitant les dommages à l’organe le plus possible de disséquer l’intestin de la tique dans MEMFA (tableau 1). Placez une coche sur une lame de microscope propre dans 20-30 µL de MEMFA. En utilisant une paire de stérile lame de rasoir en acier haute teneur en carbone #11 tranche la région céphalique à l’écu de Sobieski de la tique, abandonnant le corps de la tique. Appuyez doucement sur le corps pour pousser les diverticules de l’intestin et les glandes salivaires sur la cuticule de corps. Séparer les glandes salivaires et le tube digestif et ramasser les tripes sur la lame de rasoir.
- Recueillir les tripes dans un tube de 1,5 mL contenant 500 µL MEMFA. Incuber les tubes à température ambiante avec un balancement doux pendant 1 h ou toute la nuit à 4 ° C.
Remarque : Glandes salivaires Tick aussi et peuvent être disséquées et de même colorés. - Déshydrater le tissu en le lavant doucement 3 fois avec 1 mL d’éthanol à 100 % glacée. Laissez les tripes couler naturellement au fond du tube entre chaque lavage, centrifugation peut endommager le tissu. Pour le stockage à long terme, conserver les échantillons dans l’éthanol à 100 % à-20 ° C.
5. construction du maillage échantillon paniers et porte-panier de 24 puits
- Couper le fond au large de 2 mL ou 5 mL tubes à centrifuger de casser-dessus à l’aide d’une lame de rasoir simple tranchant chauffée sur un scalpel.
ATTENTION : La lame peut ont besoin d’être réchauffé plusieurs fois avant que la coupe est terminée. - Couper les carrés d’une maille en nylon de 110 µm légèrement plus grand que l’ouverture de la nouvelle. Bond le maillage au fond du tube en les pressant ensemble légèrement sur une plaque de cuisson à feu moyen-doux jusqu'à ce qu’une bonne étanchéité est faite. Laisser refroidir, il n’y a pas d’écart entre le maillage et le tube et ébarber les excès maille autour des bords.
- Percer des trous dans le couvercle d’une plaque 24 puits telle que la lèvre du panier échantillon fait étape 5.2 va siéger au niveau du trou et pas tomber à travers, ce qui donne une installation où le fond des paniers échantillon sera assis complètement dans les puits, lorsqu’ils sont placés dans le trous dans le couvercle.
- Ce porte-panier équipée permet de transférer les paniers d’une plaque à l’autre avec une relative facilité pour l’intégralité du protocole de l’hybridation in situ . Utiliser deux plaques 24 puits de sorte que pendant que se produit une incubation, l’autre plaque est prête pour le prochain lavage.
6. hybridation in Situ : jour 1 (Timing : 4-5 h)
- Tripes de transfert pour marqué les paniers de l’échantillon, séparant par des conditions expérimentales et destinés sonde d’ARN.
Remarque : Une coloration au moins 5 tripes par condition pour tenir compte des variations naturelles entre les répétitions. - Réhydrater les échantillons doucement afin d’éviter d’introduire des bulles d’air dans le tissu en augmentant graduellement le taux de solution saline tamponnée au phosphate 0,1 % tensioactif non ionique (PTw ; Le tableau 1) les lavages d’éthanol.
Remarque : Avoir terminé tous les lavages dans le porte-panier 24 plats à température ambiante avec agitation modérée sauf indication contraire. Aliquote 500-600 µL des solutions de lavage dans chaque puits du titulaire tel que les tripes dans chaque panier soient complètement immergés. Préparer toutes les solutions avec l’eau traitée DEPC pour prévenir la dégradation de l’ARN.- Lavez les échantillons pendant 5 min à 500 µL 100 % d’éthanol.
- Préparer au moins 500 µL par panier d’échantillon de 75 %, 50 % et 25 % d’éthanol dans PTw. réhydrater les échantillons de lavage pendant 5 min dans chaque solution d’éthanol, allant de la plus forte concentration d’éthanol vers le plus bas.
- Laver les échantillons 4 fois de 5 min chacun en PTw.
- Permeabilize les échantillons avec la protéinase K (10 µg/mL) en PTw pendant 5 min.
- Préparer le tissu pour l’hybridation avec des sondes d’ARN.
- Laver les échantillons deux fois comme décrit dans 6,2 dans le porte-panier 24 plats à température ambiante avec une agitation modérée pendant 5 min chaque dans 500 µL de tampon de triéthanolamine (0,1 M, pH 7,0-8,0) (tableau 1) pour conserver les échantillons dans un environnement exempt d’amine.
- Traiter les échantillons deux fois avec 500 µL 0,25 % d’anhydride acétique en tampon triethanolamine (0,1 M, pH 7,0-8,0) de 5 min chacun, puis lavez les échantillons deux fois en PTw de 5 min chacun.
Remarque : L’anhydride acétique acétyle amines libres pour neutraliser la charge positive, ce qui est essentielle pour prévenir les interactions électrostatiques non spécifiques et assurer la liaison spécifique de la sonde à l’ARNm. - Fixer le courage pendant 20 min avec paraformaldéhyde à 4 % 500 µL de PTw, puis laver 5 fois en PTw de 5 min chacun.
- Hatuement en incubant les exemples de 500 µL hybridation tampon /in le porte-panier de 24 puits dans la plaque 24 puits (tableau 1) pour 1,5 à 2,5 h à 60 ° C avec agitation douce dans un bain d’eau secouer. Enregistrer le tampon d’hybridation utilisé pour l’étape pré-hybridation de réutiliser dans le protocole du jour 2 (étape 7.1).
- Préparer les solutions d’hybridation sonde en diluant des sondes d’ARN dans un tampon d’hybridation à une concentration finale de 1 µg/mL. Incuber les échantillons avec les solutions de l’hybridation de sonde dans le porte-panier de 24 puits à 60 ° C avec une agitation modérée pendant la nuit dans un bain d’eau secouer (tableau 2). Couvrir la plaque portant le porte-panier parfaitement avec du papier aluminium pour éviter l’évaporation de la solution d’hybridation.
7. hybridation in Situ : jour 2 (Timing : 4,5 à 5,5 h)
- Supprimer les échantillons dans les solutions d’hybridation de sonde et rangez-les dans le tampon d’hybridation réservé depuis la veille. Incuber à 60 ° C avec une agitation modérée pendant 3 min.
Remarque : Solutions d’hybridation de sonde peuvent être conservées à-20 ° C pour les réutiliser jusqu'à 3 fois. - Préparer 2 x tampon citrate de sodium de la solution saline (SSC) en dilution 20 x SSC dans l’eau traitée DEPC (tableau 1). Laver les échantillons deux fois pendant 3 min avec 2 x SSC, puis 3 fois pendant 20 min avec 2 x SSC à 60 ° C pour éliminer toute trace de sonde et hybridation du tampon.
- Traiter avec de la RNase A (20 µg/mL) et RNase T1 (10 µg/mL) en 2 x SSC pendant 30 min à 37 ° C pour supprimer un seul brin sonde d’ARN représentant gratuite non-hybridée RNA.
- Laver une fois avec 2 x SSC pendant 10 min à température ambiante. Préparer les 0,2 x SSC par dilution 2 x SSC dans l’eau traitée DEPC, puis laver deux fois avec 0,2 x SSC pendant 30 min à 60 ° C pour éliminer les RNases excédentaire.
- Laver deux fois avec 500 µL de tampon de l’acide maléique (MAB ; Le tableau 1) pendant 10 min.
- Incuber les échantillons avec bloquant la solution (réactif de blocage de 2 % dans le Lam) pendant 1,5 à 2 h.
Remarque : Le réactif de blocage peut être difficile à dissoudre ; chauffage doux facilite la dissolution. - Remplacer la solution de blocage avec anti-digoxigénine alcaline phosphatase conjugué 500 µL d’anticorps à une dilution de 1:3,000 en bloquant la solution et incuber à température ambiante pendant environ 4 h ou à 4 ° C durant la nuit.
8. hybridation in Situ : jour 3 (Timing : 6 h de nuit)
- Laver les échantillons au moins 5 fois de 30 min chacun, avec 500 µL MAB pour éliminer les anticorps excédentaire.
Remarque : Ces lavages sont flexibles et peuvent être étendues aux 1-2 h ou 3-4 lavages peuvent être remplacés par un lavage durant la nuit à 4 ° C, avec un effet minime sur l’efficacité. - Laver deux fois pendant 5 min avec le tampon de la phosphatase alcaline, pH 9,5 (tampon AP ; Le tableau 1).
- Commencer la réaction colorée en remplaçant le dernier lavage avec 500 µL de substrat chromogène pour phosphatase alcaline (Table des matières). Couvrir la plaque de l’échantillon avec du papier aluminium et laisser la coloration procéder à température ambiante pendant 3 à 5 h ou une nuit à 4 ° C. Contrôler périodiquement la réaction de coloration en affichant le tissu sous un microscope à dissection pour éviter overstaining.
Remarque : Lorsque la coloration est terminée, une teinte pourpre est détectable par les yeux dans les échantillons antisens-sondé sous le microscope, mais les tissus ne puissent pas devenir très sombre. La coloration progresse très lentement à 4 ° C et peut prendre jusqu'à 20 à 24 h. - Arrêter la réaction colorée par lavage pendant 5 min à 500 µL MAB, puis fixez le tissu pendant la nuit dans une solution de Bouin.
ATTENTION : Manipulez solution de Bouin dans une hotte de laboratoire ; C’est un cancérogène corrosif.
9. hybridation in Situ : jour 4 (Timing : 3-3,5 h)
- Préparer au moins 7 mL par panier d’échantillon de 1 x SSC par dilution 20 x SSC dans l’eau traitée DEPC. Enlever la solution de Bouin en lavant les échantillons de 4 à 6 fois avec 70 % d’éthanol dans 1 x SSC jusqu'à ce que le tissu n’est plus jaune.
- Préparer 500 µL par panier d’échantillon de solutions 75 %, 50 % et 25 % d’éthanol dans 1 x SSC. Laver les échantillons pendant 5 min dans chaque solution, passant de plus forte concentration de l’éthanol à plus faible pour réhydrater les tissus. Laver deux fois pendant 5 min chaque 1 en x SSC.
- Incuber les échantillons dans la solution d’eau de Javel (tableau 1) pendant 90 min sur une visionneuse sous une hotte.
Remarque : Cette étape permet toute pigmentation dans les échantillons ou la coloration de la solution de Bouins à enlever et améliore le signal de la sonde pour la visualisation claire. - Laver les échantillons deux fois avec 500 µL de 1 x SSC pendant 5 min.
- Relocaliser les entrailles avec un minimum de dommages en inversant le panier de l’échantillon dans un puits d’une nouvelle plaque 24 puits et laver avec de l’éthanol 70 % à travers le fond de maille à l’aide d’une pipette de transfert. Conserver à-20 ° C si nécessaire.
- Pour obtenir un aperçu des colorations des échantillons multiples, comme illustré à la Figure 3, , maintenir le courage dans l’éthanol à 70 % dans les 24 puits-plaque et affichage avec n’importe quel microscope lumineux-zone. D’examiner le courage individuel sous un microscope lumineux-zone comme illustré à la Figure 4, Figure 5, et la Figure 6, monter les tripes à 100 % de glycérol en lamelles. Utilisez une spatule en plastique pour manipuler délicatement le tissu avec un minimum de dommages.
Remarque : La haute viscosité du glycérol contribue à protéger les tissus contre les dommages par compression et permet le positionnement prudent de diverticules de telle sorte que le tissu peut considérer de façon optimale à forts grossissements. - Capturer des images sur le microscope à l’aide du logiciel de capture image spécifique de microscope (Table des matières) et l’exporter sous forme d’images Tiff à une logiciel de retouche d’image générique. Afin de quantifier les différences de coloration relatives entre les traitements expérimentaux, télécharger un logiciel d’analyse images génériques (Table des matières). Ouvrez l’image dans le logiciel d’analyse et suivez les instructions dans le logiciel pour mesurer l’intensité des pixels de la coloration et calculer des parcelles de l’histogramme de la coloration.
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Representative Results
La mesure et estimation de la qualité des sondes d’ARN sont essentiels avant de commencer la coloration. In vitro l’efficacité de transcription dépend fortement de la quantité et la qualité de la matrice d’ADN. Régulièrement, nous avons visualisé les sondes d’ARN sur un gel de formaldéhyde pour vérifier la pureté et la quantité de sonde généré par les réactions de la transcription. Les sondes doivent apparaître sous forme de bandes lumineuses, discrets (Figure 2). Mesures spectrophotométriques de concentration d’ARN ont été très révélateur de la qualité de la sonde et en corrélation avec l’apparition des bandes sur le gel. Ainsi, l’étape de visualisation de gel peut-être être ignorée si vous le souhaitez une fois que la familiarité avec le protocole a été atteint. Quoi qu’il en soit, il est important de s’assurer que suffisamment RNA de haute qualité est produit, comme toutes les étapes en aval dépendent de la robustesse des sondes.
La force de cette technique est pour faciliter les observations larges sur la microflore de la tique, y compris la présence ou l’absence d’espèces bactériennes, changements dans l’abondance des bactéries au fil du temps comme les flux de tiques et la localisation des espèces dans les tissus ensemble. Certaines variations dans la quantité et la répartition de la coloration est normale chez les réplicats biologiques, ainsi que parmi les 7 paires de diverticules du courage individuel (Figure 3), donc, qu'il est préférable colorer les tripes au moins cinq par l’État pour avoir une idée de moyenne modèle de marquage. La réussite globale du protocole est mieux évaluée en comparant la coloration des échantillons de sens et antisens pour chaque condition. Les échantillons de sens, les témoins négatifs importants pour ce type d’analyse, devraient avoir peu ou aucune couleur pourpre (Figure 4). À l’inverse, échantillons antisens doivent afficher une coloration robuste avec fond minime, dont l’intensité dépend de l’abondance de la transcription bactérienne spécifique ciblés. Le motif de coloration dans le tissu variera également en fonction de ces paramètres. Ce qui est important, le sens et antisens échantillons doivent être développés pour le même laps de temps afin d’être en mesure de les comparer directement, donc ces échantillons devraient être traitées en parallèle. Surdéveloppement de la réaction de couleur peut entraîner une grande quantité de fond de coloration, où les échantillons de sens commencent à ressembler à l’antisens (Figure 5). Particulier il faut à cette étape dans le protocole pour éviter les overstaining, comme il n’y a aucun moyen d’inverser la réaction une fois qu’il se produit.
Il est essentiel de s’assurer que tous les boyaux sont complètement submergées dans chaque réactif lors de chaque étape ; une augmentation de la variation dans les trois échantillons peut résulter d’une exposition inégale aux réactifs. La quantité de temps que les tiques sont nourris avant les tripes sont recueillies a également un effet significatif sur les résultats. Tiques à jeun ou nourris uniquement pendant 24h étaient difficiles à travailler avec ; les tripes sont également plus facilement endommagées et tache pas bien (Figure 6) et est une limitation de cette approche en ce moment. Tiques nourries pour 48 à 72 heures étaient plus facile à travailler, en raison de la grande taille de ces tripes par rapport aux tripes contre les tiques nourris pendant 24 h. tripes de moments plus tard également teint mieux que 24 h-fed tiques, peut-être en raison de la charge bactérienne pendant la o étapes ultérieur des augmentations f alimentation. Le tissu de 72 h avait souvent un léger fond de teinte brun du sang, mais la coloration pourpre était clairement visible sur la teinte (Figure 4). Les tripes sont la meilleure vue à faible grossissement (5 X ou 10 X) pour pouvoir visualiser les colorations sur les tissus ensemble à l’aide d’un microscope en champ lumineux. Regarde un entier-montent des tissus à fort grossissement, comme avec un 63 X objectif à huile, court le risque d’endommager les tissus comme l’objectif se plaquer contre la diapositive et compresser les tissus en raison de l’épaisseur des échantillons. Si vous souhaitez l’imagerie de résolution plus élevée, le potentiel pour la coupe de tissus doit être examiné.
Figure 1 . Schéma de préparation de modèle pour la génération de sonde. Cloner l’amplicon d’ARNr 16 s dans une TA vecteur contenant les promoteurs T7 et Sp6 de clonage. Linéariser la construction à l’aide d’enzymes de restriction pour couper à sites a ou b pour la transcription in vitro utilisant T7 ou Sp6 promoteur pour générer des sondes sens et antisens respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Visualisation de la sonde d’ARN par électrophorèse sur gel. Sondes d’ARN (~ 700 ng) étaient électrophorèse sur un gel d’agarose de formaldéhyde, visible sous les rayons UV et photographié à l’aide d’un gel commercial système d’imagerie. Un représentant de bonne qualité, piste 1 ; et sonde d’ARN de mauvaise qualité, voie 2.
Figure 3 . Un aperçu représentatif de l’ensemble-mount in situ hybridation des 48 h nourries tripes. Courage contre les tiques nourries pour 48 h coloré avec antisens RNA complémentaire à une séquence d’ARN ribosomique 16 s conservée montre une coloration différentielle des diverticules du tube digestif. Barre d’échelle représente 200 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Images représentatives de succès ensemble monture hybridation in situ en tripes Ixodes scapularis . Courage contre les tiques nourries pendant le temps indiqué ont été colorées à l’aide ou l’autre sens (témoin négatif) ou sondes antisens RNA. Sondes antisens complétaient une séquence d’ARN ribosomique 16 s conservée (16 s universelle) ou une séquence d’ARN 16 s spécifique à un genre bactérien particulière (comme indiqué). Enterococcus n’a donné une coloration robuste à 48 h. échelle barres représentent 140 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 . Des temps de réaction chromogène prolongé conduit à coloration non-spécifique. Tripes de tiques nourries pendant 48 h ont été hybridés avec une sonde d’ARN sens ou une sonde antisense complémentaire à une séquence d’ARN 16 s conservée. Le tissu est incubé avec le substrat de la phosphatase alcaline BM violet nuit à 4 ° C, puis à température ambiante pendant environ 4 h avant d’arrêter la réaction. Barres d’échelle représentent 140 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 . Ensemble de montage in situ hybridation à l’aide de jeun ou 24h nourri tique tripes. Tripes de jeun ou 24 h-fed tiques ont été colorées à l’aide de sondes sens RNA ou anti-sens sondes complémentaire à une séquence d’ARN 16 s conservée ou une séquence spécifique au genre Rickettsia. Coloration dans les échantillons antisens est moins robuste que celle observée aux périodes ultérieures et le courage est aussi plus facilement endommagées. Barres d’échelle représentent 60 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom | Concentration finale | PH final | Notes de stockage |
| MEMFA | 0,1 M MOPS | - | Température ambiante |
| 2 mM EGTA | |||
| sulfate de magnésium de 1 mM | |||
| 3,7 % de formaldéhyde | |||
| PBS-Tween (PTw) | 1 x PBS, 0,1 % de Tween-20 | 7.0 | Température ambiante |
| 0,1 % Tween-20 | |||
| Tampon de triéthanolamine | 1 x PBS | 7.0 à 8.0 | Température ambiante |
| 0,1 triéthanolamine M | |||
| Tampon d’hybridation | 50 % formamide | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 mg/mL Torula RNA | |||
| héparine de 100 µg/mL | |||
| 1 x solution de Denhart | |||
| 0,1 % Tween-20 | |||
| 0,1 CHAPS DE % | |||
| 10 mM EDTA | |||
| Tampon de l’acide maléique (MAB) | acide maléique 100 mM | 7.0 | Température ambiante |
| chlorure de sodium 150 mM | |||
| Tampon de la phosphatase alcaline (PA) | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| chlorure de magnésium 50 mM | |||
| chlorure de sodium 100 mM | |||
| 0,1 % Tween-20 | |||
| 5 mM levamisol | |||
| Solution d’eau de Javel | peroxyde d’hydrogène de 1 % | - | Préparer les frais |
| 5 % formamide | |||
| 0,5 x SSC |
Le tableau 1. Recettes des solutions utilisées dans le protocole.
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Discussion
Il s’agit de la première utilisation d’une technique d’hybridation (WMISH) ensemble-mount sur place pour étudier la flore microbienne d’un arthropod vecteur d’agents pathogènes. Notre protocole est une adaptation de celui utilisé pour étudier le développement chez la drosophile et les embryons de grenouille25,26. Entier-Montez RNA in situ hybridation a été couramment utilisée pour localiser la transcription des gènes dans l’espace et dans le temps27 et visualisation des relevés de notes peuvent être faits par champ lumineux ou par microscopie à fluorescence. Nous avons adopté la première vers la détection du microbiote dans les entrailles de tiques. Il est important de noter que les tentatives effectuer l’ensemble monture in situ hybridation à l’aide de tiques entières dans lequel la région céphalique a été enlevée pour permettre la pénétration des solutions de fixateur et d’hybridation n’a pas réussie. Le protocole décrit ici utilise les tripes disséqués et a été mis en place pour étudier les effets des protéines spécifiques tique sur la colonisation bactérienne dans l' intestin moyen23. Renseignements obtenus de WMISH sont comparables à l’immunohistochimie mais a l’avantage de ne pas exiger la production d’anticorps au gène et protéine ou protéine d’intérêt. Information génomique ne suffit pas générer les réactifs pour WMISH. Les WMISH et les poissons (hybridation in situ fluorescence) peut détecter l’expression des gènes. Cependant, parce qu’elle est un dosage enzymatique et axée sur le chromogène, WMISH a l’avantage que peut être activement suivi le développement de la couleur et la réaction est autorisée à continuer jusqu’au signal désiré et sensibilité est obtenue. Il se prête parfaitement à l’automatisation et est facilement évolutif au format haut débit. Contrairement aux poissons et immunohistochimie, aucune découpe n’est requise. L’inconvénient de WMISH sur le poisson est que seulement 2 des gènes ou des ARNm différents peuvent être traitées simultanément et exigeraient que les sondes être étiquetés avec les analogues de nucléotides différents par exemple digoxigénine-UTP et fluorescéine-UTP28. Avec des poissons jusqu'à 6 différents ARNm peuvent être examinés dans un dosage29. Les deux tests ont besoin de temps comparables, le coût des colorants de fluorescence sont supérieure à celle des substrats chromogènes. Tests de poisson exigerait aussi un microscope à fluorescence pour la visualisation de l’image, tandis que la visualisation d’images WMISH peut être effectuée avec un microscope optique.
Il est crucial que le protocole est suivi de près ; Cependant, il y a quelques étapes nécessitant un soin particulier. Dissection de l’intestin moyen de la tique sans endommager les tissus nécessite une dextérité. Il peut être prudent de recueillir des tiques supplémentaires pour pratiquer la dissection et d’acquérir des compétences. En raison de l’hétérogénéité de la coloration dans les diverticules différents de courage individuel (Figure 3), il est important d’examiner tous les diverticules de chaque intestin pour dériver une preuve concluante de l’abondance des bactéries. Il est également important de traiter plusieurs boyaux (au moins 5) pour chaque condition expérimentale afin d’obtenir des informations concluantes sur la présence, distribution spatiale et l’abondance des bactéries spécifiques au sein de différents diverticules. Production de sondes d’ARN de haute qualité est également essentielle à la coloration des tissus efficace. Il est essentiel de confirmer également la séquence du modèle de sonde dans le vecteur de clonage pour s’assurer qu’antisens et sondes de sens sont générées correctement. Une réaction de transcription productifs en vitro nécessite suffisamment d’ADN de modèle ; un minimum de 100 ng peut-être être utilisé, mais 0,5 - 1 µg est recommandé pour la génération de sonde optimale.
L’utilisation de paniers d’échantillon et plaques 24 puits dans ce protocole évite la manipulation directe du tissu à chaque étape de lavage, ce qui minimise les dommages causés au cours du processus de coloration. Toutefois, les échantillons sont encore parfois perdus ou endommagés ; tripes de tiques nourris ou nourris 24h, en particulier, sont difficiles à voir et faciles à perdre lors du transfert des paniers de l’échantillon dans un récipient de stockage à long terme. Il faut en plus lors de la manipulation de ces échantillons. En raison de cette limitation, nous avons principalement utilisé tripes tique nourris h 48 et 72. La présence de grandes quantités de farine de sang dans les tripes à ces points de temps (plus de 72 h) interfère avec la coloration et la visualisation grâce à fond non spécifique de la farine de sang et présente également une limitation de cette technique. Il est probable que l’utilisation de sondes marquées fluorescent peut contourner ce problème.
L’aspect le plus important de la procédure de marquage est d’établir l’équilibre entre une coloration robuste et de signal faible bruit de fond. Le calendrier de développement de la couleur idéale peut varier selon les conditions expérimentales. Ainsi, il est préférable d’effectuer la réaction de la couleur à la température ambiante et moniteur de coloration environ toutes les 30 min. La réaction peut également être mises en place pour passer une nuit à 4 ° C pour ralentir le développement de la couleur. Toutefois, il est extrêmement critique, ne pas faire cette réaction procéder pour longtemps. La réaction de coloration peut être difficile à surveiller par les yeux, pour que les échantillons doivent être examinés sous un microscope à dissection. Une teinte pourpre devrait être visible sur les échantillons de sondés avec ARN antisens, tandis que les échantillons de sondés avec sens RNA devrait conserver couleur minime. Si les échantillons de RNA-sondé sens tachent vive, étapes de dépannage doit commencer par réduire le temps d’incubation avec BM violet et en augmentant le temps de blocage. Sondes de sens peuvent parfois fond anormalement élevé par rapport aux sondes antisens ; dans ces cas, les différentes régions du gène pourraient avoir à prendre en considération pour la génération des sondes d’ARN. Des séquences d’ADN non représentés dans un échantillon donné peuvent également être considérés comme des modèles pour générer des sondes de contrôle négatif. Par exemple, une matrice d’ADN codant une région de la protéine fluorescente verte, ne pas représentée dans le génome de la tique ou son microbiome, peut être utilisé.
Une des limites de cette technique est que l’analyse est en grande partie qualitative ; Cependant, le logiciel d’analyse image (Table des matières) pourrait être utilisé pour mesurer la quantité de signal coloration dans chaque échantillon. Cela permettrait une comparaison semi-quantitative de l’abondance des différentes espèces de bactéries dans des conditions expérimentales différentes. Alors qu’il s’agit d’un protocole long qui dure 3-4 jours, il n’est pas laborieux ; chaque jour l’heure pratique est seulement environ 3-5 h en moyenne. Cependant, la capacité de traiter de nombreux échantillons en parallèle avec l’utilisation des paniers de l’échantillon et titulaires permet analyse de haut-débit. En outre, ce processus peut être automatisé en utilisant les instruments disponibles dans le commerce (Table des matières) si ce protocole est censé être une composante essentielle et systématique du laboratoire de recherche à l’aide disponible dans le commerce plateformes compatibles Automation (Table des matières) pour mieux réduisent le temps de pratique.
Le protocole décrit utilise des sondes marquées à la dioxygénine qui permettent la production d’un signal colorimétrique qui peut être photographiée à l’aide de la microscopie en champ clair. Alors que nous avons utilisé un substrat chromogène pour détecter les RNA hybridée sondes spécifiques aux objectifs individuels, il est également possible de détecter des cibles multiples simultanément par marquage des sondes avec des analogues de nucléotides différents, par exemple digoxigénine-UTP et fluorescéine-UTP et différents substrats chromogènes,30. Les échantillons de tissus peuvent ensuite être incubés de manière séquentielle avec alcaline phosphatase-couplés aux anticorps anti-digoxigénine et fluorescéine, avec des réactions chromogène différentes pour les deux étapes. Cette technique pourrait être également adaptée pour les sondes marquées fluorescent, qui peuvent faciliter l’imagerie haute résolution en utilisant la microscopie confocale31 et offrent la possibilité d’utiliser plusieurs sondes de couleurs différentes en parallèle. Cette technique peut évaluer spécifiquement quelques microorganismes simultanément dans un seul échantillon. Toutefois, plusieurs échantillons peuvent être évalués dans des essais de haut débit pour traiter plusieurs micro-organismes qui peuvent être représentés dans la tique microbiote.
Enfin, cette technique n’est pas limitée à l’étude des interactions entre tiques et leur microbiote associé. Sondes complémentaires à n’importe quel gène d’intérêt dans le génome de la tique peuvent être générés et utilisés pour examiner l’abondance et la localisation de gènes spécifiques dans différents tissus. Les glandes salivaires de la tique peuvent également être traités et analysés de la même façon à l’intestin. Dans l’ensemble, cette technique a large potentiel d’adaptation à des études sur la dynamique des communautés microbiennes dans les autres arthropodes vecteurs d’intérêt.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions sincèrement le Dr Mustafa Khokha, Yale University, permettant l’utilisation de ses ressources de laboratoire. Nous sommes reconnaissants à M. Wu Ming-Jie pour assistance technique excellente. EF est un enquêteur HHMI. Ce travail a été soutenu par un don du John Monsky et Jennifer Weis Monsky Lyme Disease Research Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
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