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Genetics

सीटू संकरण में पूरे माउंट द्वारा टिक हिम्मत में Microbiota के दृश्य

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57758
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

Summary

यहां, हम विशेष रूप से एक प्रोटोकॉल वर्तमान और अस्थाई टिक हिम्मत में व्यवहार्य microbiota की उपस्थिति का आकलन एक संशोधित पूरे का उपयोग कर-सीटू संकरण दृष्टिकोण में माउंट ।

Abstract

सन्धिपाद वैक्टर द्वारा संचारित संक्रामक रोगों दुनिया भर में मानव स्वास्थ्य के लिए एक महत्वपूर्ण खतरा पैदा करने के लिए जारी है । रोगजनकों इन रोगों के कारण, अलगाव में मौजूद नहीं है जब वे उपनिवेश वेक्टर; बल्कि, वे की संभावना आंत लुमेन में निवासी सूक्ष्मजीवों के साथ बातचीत में संलग्न हैं । वेक्टर microbiota कई वेक्टर जनित रोगों के लिए रोगज़नक़ संचरण में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए प्रदर्शन किया गया है । चाहे Ixodes scapularis टिक के पेट में निवासी बैक्टीरिया, अरै burgdorferi सहित कई मानव रोगजनकों के वेक्टर, रोगजनकों के प्रभाव टिक संचरण निर्धारित नहीं है । हम निस्र्पक के लिए तरीकों की आवश्यकता के लिए टिक पेट के साथ जुड़े बैक्टीरिया की संरचना की जरूरत है टिक पेट में संभावित प्रजातियों के संपर्क की एक बेहतर समझ की सुविधा । सीटू संकरण में पूरे माउंट का उपयोग कर आरएनए विशेष जीवाणु प्रजातियों के साथ जुड़े टेप कल्पना करने के लिए गुणात्मक और बरकरार ऊतक में microbiota के वितरण के बारे में डेटा के संग्रह के लिए अनुमति देता है । इस तकनीक को टिक खिला के पाठ्यक्रम पर पेट microbiota वातावरण में परिवर्तन की जांच करने के लिए और भी टिक जीन की अभिव्यक्ति का विश्लेषण लागू किया जा सकता है इस्तेमाल किया जा सकता है । पूरी टिक हिम्मत के दाग तीन आयामी पुनर्निर्माण के लिए की आवश्यकता के बिना ऊतक में लक्ष्य आरएनए के सकल स्थानिक वितरण के बारे में जानकारी उपज और कम पर्यावरणीय संक्रमण से प्रभावित है, जो अक्सर अनुक्रमण आधारित पाया तरीकों अक्सर जटिल माइक्रोबियल समुदायों के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया । कुल मिलाकर, इस तकनीक का एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि बेहतर वेक्टर समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है-रोगज़नक़-microbiota बातचीत और रोग संचरण में उनकी भूमिका ।

Introduction

मानव और पशुधन सन्धिपाद वैक्टर द्वारा प्रेषित रोगजनकों दुनिया भर में पाए जाते है और संक्रामक रोगों के बारे में 20% विश्व स्तर पर के लिए खाते में1, लेकिन इन रोगजनकों के अधिकांश के खिलाफ प्रभावी और सुरक्षित टीके उपलब्ध नहीं हैं । खाना खानेवाला, सहजीवी और रोगजनक सूक्ष्मजीवों, सामूहिक रूप से microbiome 2 के रूप में जाना जाता है की महत्वपूर्ण भूमिका की हमारी समझ, नियमन और लगभग सभी metazoans 3 के स्वास्थ्य को आकार देने में विस्तार है । अब यह स्पष्ट है कि रोगजनकों के सन्धिपाद वैक्टर भी आंत microbiota बंदरगाह और इन वेक्टर-संबद्ध microbiota को विभिंन वेक्टर जनित रोगजनकों4,5प्रभावित दिखाया गया है । सन्धिपाद microbiome eubacteria, archaea, वायरस और eukaryotic रोगाणुओं जैसे प्रोटोजोआ, सूत्रकृमि, और कवक6से बना है । हालांकि, प्रमुख अनुसंधान फोकस eubacteria कारण पर किया गया है, भाग में, मार्कर जीन और संदर्भ डेटाबेस की उपलब्धता के लिए विशिष्ट बैक्टीरियल सदस्यों की पहचान ।

Ixodes scapularisपर एक ध्यान के साथ, अरै burgdorferi7सहित कई मानव रोगजनकों के टिक वेक्टर, लाइम रोग के प्रेरणा का एजेंट, एक माइक्रोबियल दृश्य तकनीक के अनुकूलन के उद्देश्य से किया गया था वेक्टर के संदर्भ में टिक आंत microbiota की हमारी समझ में सुधार-रोगज़नक़ बातचीत. टिक microbiome मैदान में जवाब देने के लिए कई सवाल रहते हैं । आंत टिक और क्षैतिज स्थानांतरित रोगजनकों के संदर्भ में आने वाले रोगज़नक़ के बीच पहली विस्तारित मुठभेड़ की साइट है; इसलिए, वेक्टर मॉडुलन में वेक्टर आंत microbiota की भूमिका को समझना-रोगज़नक़ बातचीत सार्थक अंतर्दृष्टि प्रकट होगा । ticks रक्त भोजन के पाचन की एक अनूठी विधा है, जहां रक्त आहार घटकों के प्रसंस्करण जगह लेता है intracellularly8। आंत लुमेन प्रतीत होता है एक पोत के रूप में कार्य करता है के रूप में रक्त भोजन को शामिल टिक फ़ीड, और पोषक तत्व पाचन और आत्मसात खिला के कई दिनों भर में पीछा करना और पोस्ट-repletion जारी है । खिलाने के दौरान टिक द्वारा अधिग्रहीत रोगजनकों bloodmeal के साथ आंत लुमेन दर्ज करें और इस तरह लुमेन टिक, रोगज़नक़ के बीच बातचीत का एक प्राथमिक साइट बन जाता है, और निवासी microbiota । के रूप में पाचन repletion और Ixodid टिक molting के माध्यम से आय, आंत संरचनात्मक और कार्यात्मक परिवर्तन9से गुजरती है । संरचना और आंत बैक्टीरिया के स्थानिक संगठन भी बदलते आंत वातावरण के साथ संगीत कार्यक्रम में भिंन होने की संभावना है । यह है, इसलिए, टिक पेट में निवासी बैक्टीरिया की वास्तुकला को समझने के लिए पूरी तरह से टिक की पुनरावृत्ति, रोगज़नक़, और आंत microbiota समझ महत्वपूर्ण है ।

आणविक तकनीक का वर्णन करने के लिए मेजबान संबद्ध microbiota नियमित रूप से उच्च प्रवाह समानांतर अनुक्रमण रणनीतियों10 बढ़ाना और अनुक्रम बैक्टीरियल 16S राइबोसोमल डीएनए (rDNA) का उपयोग । इन अनुक्रमण रणनीतियों विशिष्ट बैक्टीरिया की axenic संस्कृतियों को प्राप्त करने और नमूना में प्रतिनिधित्व सभी बैक्टीरियल सदस्यों का एक में गहराई से वर्णन प्रदान करने की आवश्यकता को दरकिनार. फिर भी, इस तरह की रणनीतियों के लिए बोना ी निवासियों से पर्यावरणीय संदूषणों को भेद अक्षमता द्वारा पाए जाते हैं । इसके अलावा, जब नमूनों का आकलन, ऐसे ticks के रूप में, कि आकार में छोटे होते है और इसलिए कम microbiota विशिष्ट डीएनए पैदावार होते हैं, पर्यावरण दूषित पदार्थों के प्रवर्धन की संभावना बढ़ जाती है11 और के अस्पष्ट व्याख्या में परिणाम microbiome रचना. विशिष्ट व्यवहार्य बैक्टीरिया के दृश्य के साथ संयोजन के रूप में कार्यात्मक लक्षण वर्णन है, इसलिए होगा, को परिभाषित करने के लिए महत्वपूर्ण हो और microbiome के विचार के लिए अस्थाई और स्थानिकी टिक । इस लक्ष्य की ओर हमने सीटू संकरण में पूरी-माउंट आरएनए का लाभ उठाया. इस तकनीक को नियमित रूप से अंगों और भ्रूण में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन करने के लिए12,13,14 और ब्याज की पूरी नमूना पर अभिव्यक्ति की semiquantitative विश्लेषण की अनुमति देता है प्रयोग किया जाता है । यह सीटू संकरण तकनीक जो ऊतक वर्गों का उपयोग और अक्सर एक अभिकलनी विधानसभा के साथ व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता के लिए पूरे अंगों में अभिव्यक्ति की भविष्यवाणी15पारंपरिक से अलग है । जबकि पूरे माउंट आम तौर पर पूरे जीवों को संदर्भित करता है12, यहां पूरे-माउंट पूरी हिंमत या अंगों को संदर्भित करता है । टिक आंत microbiota की वास्तुकला का आकलन करने के लिए सीटू संकरण दृष्टिकोण में पूरे माउंट आरएनए का उपयोग करने के फायदे मुख़्तलिफ़ हैं. टिक आंत diverticula के 7 जोड़े से बना है, प्रत्येक जोड़ी आकार में बदलती16। कार्यात्मक अंतर, यदि कोई हो, इन diverticula के बीच, टिक जीवविज्ञान के संदर्भ में समझ में नहीं आ रहे हैं, टिक microbiota या टिक-रोगज़नक़ बातचीत. पेट की जोड़तोड़ कि पेट diverticula टूटना आंत लुमेन या microbiota के स्थानिक स्थानीयकरण के अशुद्ध अर्थ में परिणाम के साथ शिथिल और संबंधित उन लोगों में मौजूद microbiota होता है । प्रतिदीप्ति- सीटू संकरण में लेबल आरएनए पहले टिक आंत की जांच करने के लिए उपयोग किया गया है17 फिक्सिंग और व्यक्तिगत आंत diverticula खोलने के लिए सुनिश्चित करने के लिए जांच संकरण और information to B. burgdorferi टेप अनुभाग के द्वारा आयल-एंबेडेड पूरे ticks18। इन दोनों दृष्टिकोण संकरण से पहले टिक ऊतकों के जोड़तोड़ की आवश्यकता है कि आंत microbiota वास्तुकला को प्रभावित करेगा ।

इस रिपोर्ट में, हम विस्तार से प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए व्यवहार्य टिक आंत microbiota का उपयोग कर पूरे माउंट सीटू में संकरण (WMISH) की जांच । सीटू संकरण में पूरे माउंट आरएनए के उपयोग की उपस्थिति और आंत के विभिन्न क्षेत्रों में विशिष्ट आंत बैक्टीरिया की बहुतायत की एक वैश्विक समझ में सक्षम बनाता है और रोगाणु के संदर्भ में टिक आंत जीव विज्ञान में नई अंतर्दृष्टि प्रेरणा सकता है औपनिवेशीकरण और संचरण । इसके अलावा, आरएनए जांच विशिष्ट बैक्टीरियल आरएनए के खिलाफ निर्देशित की टिक आंत में व्यवहार्य बैक्टीरिया का पता लगाने की अनुमति देता है ।

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Protocol

1. डीएनए टेम्पलेट्स की तैयारी

  1. NCBI डेटाबेस और डिजाइन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) संगत आगे और रिवर्स प्राइमरों कि पीढ़ी-विशिष्ट क्षेत्रों (~ २००-२५० आधार जोड़ी लंबी) बढ़ाना होगा से प्रत्येक जीवाणु पीढ़ी के लिए विशिष्ट 16S rRNA अनुक्रम डाउनलोड करें पहले वर्णित के रूप में 19. भी खुला स्रोत डेटाबेस सिल्वा20,21 और probeBase के लिए22 ऑनलाइन संसाधनों का उल्लेख rRNA-लक्षित oligonucleotide जांच और प्राइमर के लिए, आरएनए जांच के रूप में कुछ जीवाणु पीढ़ी के लिए व्यावसायिक रूप से हो सकता है उपलब्ध.
    नोट: यह महत्वपूर्ण है जीन क्षेत्रों है कि विशिष्ट पीढ़ी के लिए विशिष्ट है और यह सुनिश्चित करें कि डिजाइन प्राइमरों संबंधित बैक्टीरियल पीढ़ी बढ़ाना नहीं है । यह जीन/पीढ़ी-विशिष्ट जांच संकरण प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
  2. चूहों पर 24, ४८ या ७२ एच के लिए फ़ीड, काटना टिक हिम्मत और पूर्व23वर्णित के रूप में टिक हिम्मत से आरएनए और सीडीएनए तैयार. एक thermocycler का उपयोग कर पीसीआर बढ़ाना पीढ़ी-विशिष्ट amplicons के लिए टेंपलेट के रूप में सीडीएनए का प्रयोग करें । एक १.५% agarose जेल पर पीसीआर-उत्पाद/amplicon के aliquot भागो और पुष्टि करें कि amplicon पराबैंगनी (यूवी) प्रकाश एक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर के तहत दृश्य द्वारा अपेक्षित आकार से मेल खाती है ।
  3. भोजी polymerases (SP6, T7 या T3) के लिए उपयुक्त आरएनए पोलीमरेज़ प्रवर्तकों युक्त एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध टीए वेक्टर (सामग्री की तालिका) में, बैक्टीरियल 16S राइबोसोमल आरएनए amplicon में रुचि का क्लोन करें । अनुक्रम क्लोन amplicon की पहचान और प्रत्येक प्रवर्तकों के संबंध में क्लोन के दिशात्मकता की पुष्टि करने के लिए । इस के आधार पर, भावना या antisense आरएनए जांच (चित्रा 1) उत्पन्न करने के लिए पसंद के प्रवर्तक का निर्धारण ।
  4. Linearize 1 प्लाज्मिड के एमजी एक प्रतिक्रिया मात्रा में एक उचित प्रतिबंध एंजाइम के साथ अप करने के लिए 30 µ lfor 2 h के निर्माता द्वारा अनुशंसित तापमान पर. प्रतिबंध प्रवर्तक है कि भावना या antisense जांच (चित्रा 1) उत्पंन करने के लिए उपयोग किया जाएगा के आधार पर एंजाइम चुनें । एक 1% agarose जेल पर डाइजेस्ट प्रतिक्रिया के 2 µ एल के दृश्य द्वारा linearization सत्यापित करें ।
  5. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पीसीआर उत्पाद कॉलम शोधन किट का उपयोग कर पचा डीएनए के शेष 28 µ l को शुद्ध करें और spectrophotometer द्वारा डीएनए एकाग्रता को बढ़ाता है ।
    नोट: कुछ अर्थ जांच पृष्ठभूमि धुंधला बहुत इसी antisense जांच और अंय विकल्पों से पता लगाया जा आवश्यकता हो सकती है की तुलना में अधिक हो सकता है । वैकल्पिक नकारात्मक नियंत्रणों में नमूना या किसी अंय जांच जो संकरण का एक विशिष्ट प्रतिमान पैदावार में प्रतिनिधित्व नहीं plasmids एंकोडिंग अनुक्रम शामिल हैं ।

2. Digoxygenin-UTP आरएनए जांच का निर्माण

  1. १०० mm UTP के ७.५ µ l के संयोजन से न्यूक्लियोटाइड मिश्रण तैयार करें, 25 µ एल के 10 मिमी digoxygenin-UTP, और 10 µ एल प्रत्येक १०० मिमी एटीपी, GTP, और CTP में एक १.५ एमएल केंद्रापसारक ट्यूब.
  2. इन विट्रो में प्रदर्शन व्यावसायिक रूप से उपलब्ध T7 या Sp6 आरएनए पोलीमरेज़ किट का उपयोग कर, न्यूक्लियोटाइड मिश्रण के 1 µ l का उपयोग (चरण २.१) और टेम्पलेट डीएनए के ०.२५-1 µ जी. मात्रा को पानी के साथ 20 µ l तक लाएं । गठबंधन और नाड़ी स्पिन करने के लिए ट्यूब झटका । २.५-3 एच के लिए ३७ ° c पर मशीन
    नोट: जांच निर्माण के रूप में कम के रूप में पचा प्लाज्मिड सांद्रता के साथ सफल रहा है 7 एनजी/µ एल, लेकिन इस चरण में ठेठ सांद्रता 15-25 एनजी/µ एल से सीमा । प्रतिलेखन प्रतिक्रिया भी ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात गर्मी हो सकती है, लेकिन यह काफी आरएनए उपज में वृद्धि नहीं करता है ।
  3. DNase के 1 µ एल जोड़ें (२,००० इकाइयों/µ एल) और 10 मिनट के लिए ३७ ° c पर मशीन । 10 मिनट से अधिक मत करो, या एंजाइम अपमानजनक आरएनए शुरू हो सकता है ।
  4. आरएनए को तेज करने के लिए बर्फ के 30 µ एल-ठंडा ७.५-8 एम लिथियम क्लोराइड और ठंडा nuclease के 30 µ एल जोड़ें । मिश्रण करने के लिए ट्यूब झटका । -20 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगे बढ़ने के लिए आरएनए की वर्षा की अनुमति दें ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए १७,००० x g पर केंद्रापसारक द्वारा आरएनए ले लीजिए । Diethyl pyrocarbonate (DEPC) पानी में नए सिरे से तैयार ७५% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर के साथ एक बार गोली धो, तो दोहराने केंद्रापसारक ।
  6. निकालें और supernatant को त्यागें, एक साफ कागज तौलिया पर ट्यूब पलटना, और 10 मिनट के लिए शुष्क करने की अनुमति nuclease-मुफ्त पानी में गोली reसस्पेंड । अगर गोली आसानी से दिख जाए तो 25 µ में फिर से सस्पेंड कर दे l गोली बहुत छोटा है या दिखाई नहीं देता है, तो 15-20 µ एल में reसस्पैंड spectrophotometer द्वारा आरएनए एकाग्रता का एक अनुमान प्राप्त करें ।
    नोट: ठेठ आरएनए सांद्रता सीमा से २००-५०० एनजी/µ एल

3. आरएनए Formaldehyde जेल ट्रो द्वारा आरएनए की जांच के दृश्य आरएनए शुद्धता का आकलन करने के लिए

चेतावनी: Formaldehyde एक साँस लेना खतरा बन गया है; इसलिए, एक धुएं हुड में आरएनए जेल विश्लेषण के लिए आवश्यक समाधान उत्पन्न करते हैं । Ethidium ब्रोमाइड एक संदिग् ध स् क् यलो है; देखभाल के साथ संभाल ।

  1. एक 1% formaldehyde agarose जेल तैयार के रूप में पहले वर्णित24 और एक जेल बॉक्स में जेल RNases से मुक्त डाली । एक बार शांत, 1x रनिंग बफर के साथ जेल बॉक्स (पीएच ७.०, 5% formaldehyde पर 1x MOPS) भरें ।
  2. नमूना बफर तैयार (5 µ एल ४०० मिलीग्राम/एमएल ethidium ब्रोमाइड, 20 µ एल 10x MOPS, ३५ µ एल formaldehyde, और १०० µ एल formamide) । नमूना बफर के 8 µ एल के साथ आरएनए जांच (चरण २.६) के 2 µ एल का मिश्रण । 10 मिनट के लिए ७० ° c पर मशीन ।
  3. 5 मिलीलीटर ५०% ग्लिसरॉल, 1 मिलीलीटर 10% formaldehyde, ४० मिलीग्राम bromophenol नीला, ४० मिलीग्राम xylene cyanol, और ०.५ M µ (पीएच ७.५) के 20 EDTA एल के संयोजन से आरएनए लोडिंग बफर तैयार करें । उपयोग के बाद, इस बफ़र को-20 ° c पर संग्रहीत करें ।
  4. चरण ३.२ और मिश्रण से आरएनए नमूना करने के लिए लदान बफर के 3 µ एल जोड़ें । बर्फ पर नमूना ट्यूबों रखें ।
  5. पूरे नमूना मात्रा चरण ३.४ से जेल में लोड । आरएनए आकार सत्यापित करने के लिए साथ एकल-असहाय आरएनए सीढ़ी का एक aliquot लोड करें । १०० वी या कम पर जेल भागो जब तक नीले रंग जेल नीचे रास्ते के लगभग ७५% की ओर जाता है । एक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग यूवी प्रकाश के तहत आरएनए कल्पना ।
    नोट: एक अच्छी गुणवत्ता आरएनए जांच जांच (चित्रा 2, लेन 1) के अपेक्षित आकार के लिए इसी गतिशीलता के साथ एक असतत बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए । यदि जांच एक फैलाना और धब्बा बैंड के रूप में प्रकट होता है (चित्रा 2, लेन 2) यह नहीं किया जाना चाहिए ।

4. टिक आंत संग्रह और निर्धारण

  1. Ixodes scapularis अप्सराएं लीजिए जो रूचि के समय बिंदुओं के लिए चूहों पर खिलाया है ।
    नोट: इस तकनीक के प्रयोजनों के लिए, ४८ या ७२ एच काम सबसे अच्छा के लिए खिलाया ticks ।
  2. एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक गिलास स्लाइड पर MEMFA (तालिका 1) में टिक से आंत काटना, जितना संभव हो अंग को नुकसान से परहेज. MEMFA के 20-30 µ एल में एक साफ माइक्रोस्कोप स्लाइड पर एक टिक प्लेस । बाँझ उच्च कार्बन इस्पात उस्तरा ब्लेड की एक जोड़ी का उपयोग कर #11 टिक के शरीर को छोड़ टिक के scutum पर सिर क्षेत्र टुकड़ा । धीरे शरीर छल्ली बाहर आंत diverticula और लार ग्रंथियों धक्का करने के लिए मुख्य प्रेस । लार ग्रंथियों और पेट अलग और उस्तरा ब्लेड पर हिंमत स्कूप ।
  3. एक १.५ मिलीलीटर ट्यूब ५०० µ l MEMFA युक्त में हिंमत ले लीजिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे या रात के लिए कोमल कमाल के साथ कमरे के तापमान पर ट्यूब मशीन ।
    नोट: टिक लार ग्रंथियों भी और इसी तरह स्थिर और दाग विच्छेदित किया जा सकता है ।
  4. 1 मिलीलीटर बर्फ ठंडा १००% इथेनॉल के साथ धीरे से 3 बार धोने के ऊतकों निर्जलीकरण । हिंमत एक धोने के बीच ट्यूब के नीचे करने के लिए स्वाभाविक रूप से सिंक करते हैं, के रूप में केंद्रापसारक ऊतक नुकसान हो सकता है । लंबी अवधि के भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर १००% इथेनॉल में नमूने रखें ।

5. जाल नमूना टोकरी और 24-अच्छी तरह से टोकरी धारक का निर्माण

  1. 2 मिलीलीटर या 5 मिलीलीटर स्नैप-टॉप केंद्रापसारक ट्यूबों का उपयोग कर एक गर्म एकल स्केलपेल पर उस्तरा ब्लेड धार के नीचे से काट ।
    चेतावनी: ब्लेड कटौती पूरा होने से पहले कई बार फिर से गरम किया जा करने की आवश्यकता हो सकती है ।
  2. एक ११० µm नायलॉन जाल की कटौती चौकों थोड़ा नया ट्यूब खोलने से भी बड़ा है । बंधन ट्यूब के नीचे करने के लिए उन्हें एक साथ हल्के से मध्यम-कम गर्मी पर एक गर्म थाली पर एक अच्छा सील किया जाता है जब तक दबाकर । शांत, सुनिश्चित करें कि वहां मेष और ट्यूब के बीच कोई अंतराल हैं, और किनारों के आसपास अतिरिक्त जाल ट्रिम कर दीजिए ।
  3. एक 24-अच्छी तरह से थाली के आवरण में छेद कट कि नमूना टोकरी के होंठ ५.२ कदम में बनाया छेद पर बैठते है और नहीं गिर जाएगा के माध्यम से, एक सेट-अप उपज जहां नमूना टोकरी के नीचे के कुओं में सभी तरह बैठ जाएगा जब वे में रखा जाता है आवरण में छेद ।
  4. इस फिट टोकरी धारक का प्रयोग करें एक थाली से दूसरे में बास्केट हस्तांतरण के लिए सीटू संकरण प्रोटोकॉल में की संपूर्णता के लिए रिश्तेदार आसानी के साथ । २ २४-अच्छी तरह से प्लेट का प्रयोग करें ताकि एक मशीन हो रही है, दूसरे प्लेट अगले धोने के लिए तैयार है ।

6. सीटू में संकरण: दिन 1 (समय: 4-5 ज)

  1. प्रायोगिक शर्त और इरादा आरएनए जांच से अलग, लेबल नमूना टोकरी को हिंमत स्थानांतरण ।
    नोट: हालत प्रति कम से 5 हिंमत दाग को दोहराने के बीच प्राकृतिक भिंनता के लिए खाते में ।
  2. reहाइड्रेट के नमूने धीरे से ऊतक में हवा के बुलबुले शुरू करने से बचने के साथ-साथ ०.१% गैर-ईओण surfactant (PTw के साथ फॉस्फेट बफर खारा के अनुपात में वृद्धि; तालिका 1) में इथेनॉल को बहाकर.
    नोट: पूर्ण कोमल आंदोलन के साथ परिवेश के तापमान पर 24-अच्छी तरह से टोकरी धारक में सभी बहाकर जब तक अंयथा उल्लेख किया । Aliquot ५००-६०० µ एल के प्रत्येक कुआं में धोने समाधान के l इस तरह कि प्रत्येक टोकरी में हिंमत पूरी तरह से जलमग्न हैं । आरएनए क्षरण को रोकने के लिए DEPC-इलाज पानी के साथ सभी समाधान तैयार करें ।
    1. ५०० µ एल १००% इथेनॉल में 5 मिनट के लिए नमूने धो लो ।
    2. ७५%, ५०%, और PTw में 25% इथेनॉल के प्रति नमूना टोकरी में कम से ५०० µ एल तैयार करें । प्रत्येक इथेनॉल समाधान में 5 मिनट के लिए धुलाई द्वारा नमूनों reहाइड्रेट, सबसे कम करने के लिए सबसे अधिक इथेनॉल एकाग्रता से चलती ।
    3. PTw में 5 मिनट प्रत्येक के लिए 4 बार नमूने धो लें ।
  3. Proteinase K (10 µ g/mL) के साथ नमूनों को PTw में 5 मिनट के लिए Permeabilize ।
  4. आरएनए जांच के साथ संकरण के लिए ऊतक तैयार करें ।
    1. दो बार के रूप में 24 में ६.२ में वर्णित के रूप में अच्छी तरह से टोकरी धारक में 5 मिनट के लिए कोमल आंदोलन प्रत्येक ५०० µ एल triethanolamine बफर (०.१ मीटर, पीएच ७.०-८.०) (तालिका 1) में नमूने को बनाए रखने के नमूनों को धो एक अमीन-मुक्त वातावरण ।
    2. ५०० µ एल ०.२५% triethanolamine बफर में एसिटिक एनहाइड्राइड के साथ दो बार नमूनों का इलाज (०.१ एम, पीएच ७.०-८.०) 5 मिनट के लिए प्रत्येक, तो नमूने धो दो बार PTw में 5 मिनट के लिए प्रत्येक ।
      नोट: एसिटिक एनहाइड्राइड acetylates मुक्त करने के लिए सकारात्मक आरोप है, जो गैर विशिष्ट इलेक्ट्रोस्टैटिक बातचीत को रोकने और mRNA को जांच के विशिष्ट बाध्यकारी सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है बेअसर है ।
    3. PTw में ५०० µ l 4% paraformaldehyde के साथ 20 मिनट के लिए हिंमत ठीक है, तो 5 मिनट प्रत्येक के लिए PTw में 5 बार धो लो ।
    4. Prehybridize ५०० µ l संकरण बफर में नमूनों की मशीन द्वारा 24 खैर टोकरी धारक में 24 अच्छी तरह से प्लेट (तालिका 1) १.५-२.५ h के लिए ६० ° c में एक मिलाते हुए पानी स्नान में कोमल आंदोलन के साथ. दिन 2 प्रोटोकॉल (चरण ७.१) में पुन: उपयोग करने के लिए prehybridization चरण के लिए उपयोग किया गया संकरण बफ़र सहेजें ।
    5. संकरण बफर में कमजोर आरएनए जांच द्वारा जांच संकरण समाधान तैयार करने के लिए 1 µ g/एमएल के अंतिम एकाग्रता । एक मिलाते हुए पानी स्नान (तालिका 2) में रात भर कोमल आंदोलन के साथ ६० डिग्री सेल्सियस पर 24-अच्छी तरह से टोकरी धारक में जांच संकरण समाधान के साथ गर्मी नमूने ।   संकरण समाधान के वाष्पीकरण को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पंनी के साथ आराम से टोकरी धारक ले थाली कवर ।

7. In सीटू संकरण: दिन 2 (समय: ४.५-५.५ h)

  1. जांच संकरण समाधानों से नमूने निकालें और उंहें पिछले दिन से आरक्षित संकरण बफ़र में रखें । 3 मिनट के लिए कोमल आंदोलन के साथ ६० डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    नोट: जांच संकरण समाधान 3 बार तक पुनः प्रयोग के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  2. कमजोर 20x एसएससी द्वारा 2x खारा सोडियम साइट्रेट बफर (एसएससी) DEPC-इलाज पानी (तालिका 1) में तैयार करें । 2x एसएससी के साथ 3 मिनट के लिए दो बार नमूनों धो, तो ६० डिग्री सेल्सियस पर 2x एसएससी के साथ 20 मिनट के लिए 3 बार जांच और संकरण बफर के सभी निशान को दूर करने के लिए ।
  3. RNase के साथ इलाज एक (20 µ जी/एमएल) और RNase टी1 (10 µ g/एमएल) 2x एसएससी में ३७ ° c पर 30 मिनट के लिए मुक्त गैर-संकरी आरएनए का प्रतिनिधित्व करने वाले एकल असहाय आरएनए जांच को दूर करने के लिए ।
  4. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 2x एसएससी के साथ एक बार धो लें । DEPC-इलाज पानी में कमजोर 2x एसएससी द्वारा 0.2 x एसएससी तैयार है, तो अतिरिक्त RNases को दूर करने के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 0.2 एक्स एसएससी के साथ दो बार धो लो ।
  5. दो बार नर एसिड बफर के ५०० µ एल के साथ धो (मॉब; तालिका 1) 10 मिनट के लिए प्रत्येक ।
  6. १.५-2 एच के लिए समाधान अवरुद्ध (मॉब में 2% अवरुद्ध एजेंट) के साथ मशीन नमूने ।
    नोट: अवरुद्ध एजेंट भंग करने के लिए मुश्किल हो सकता है; कोमल ताप एड्स विघटन.
  7. एंटी-digoxigenin alkaline फॉस्फेट के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें-संयुग्मित ५०० µ एल एंटीबॉडी के एक 1 पर: 3000 कमजोर पड़ने समाधान रोकने में और लगभग 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस रात भर में गर्मी ।

8. सीटू संकरण में : 3 दिन (समय: 6 घंटे रात के लिए)

  1. ५०० µ एल मॉब अतिरिक्त एंटीबॉडी को दूर करने के लिए 30 मिनट के साथ प्रत्येक के लिए कम से कम 5 बार नमूने धो लें ।
    नोट: इन बहाकर लचीला कर रहे है और 1-2 ज, या 3-4 धोया करने के लिए बढ़ाया जा सकता है प्रभावकारिता पर कम प्रभाव के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर एक रात धोने के लिए प्रतिस्थापित किया जा सकता है ।
  2. दो बार alkaline फॉस्फेट बफर के साथ 5 मिनट के लिए धो, पीएच ९.५ (एपी बफर; तालिका 1) ।
  3. alkaline फॉस्फेट के लिए chromogenic सब्सट्रेट के ५०० µ l के साथ पिछले धोने की जगह से रंग प्रतिक्रिया शुरू (सामग्री की). एल्यूमीनियम पंनी के साथ नमूना प्लेट को कवर और 3-5 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के दाग आगे बढ़ना करते हैं । दाग से बचने के लिए एक विदारक माइक्रोस्कोप के नीचे ऊतक को देखने के द्वारा आवधिक प्रतिक्रिया की निगरानी करें ।
    नोट: जब धुंधला पूरा हो गया है, एक बैंगनी रंग antisense में आंख से माइक्रोस्कोप के तहत जांच नमूनों में पता लगाने है, लेकिन ऊतक बहुत अंधेरा हो जाने की अनुमति नहीं दी जानी चाहिए । 4 डिग्री सेल्सियस पर बहुत धीरे से आगे बढ़ना और 20-24 h तक लग सकता है ।
  4. ५०० µ l मॉब में 5 मिनट के लिए धुलाई द्वारा रंग प्रतिक्रिया बंद करो, तो Bouin के समाधान में रातोंरात ऊतक ठीक ।
    चेतावनी: एक धुएं डाकू में है Bouin समाधान संभाल; यह एक राक यलो है ।

9. सीटू में संकरण: दिन 4 (समय: 3-३.५ ज)

  1. DEPC-उपचारित पानी में कमजोर 20x एसएससी द्वारा 1x एसएससी का नमूना टोकरी प्रति कम 7 मिलीलीटर तैयार करें । 1x एसएससी में ७०% इथेनॉल के साथ 4 से 6 बार के नमूने धोने से Bouin का समाधान निकालें जब तक ऊतक पीला नहीं है ।
  2. ७५%, ५०% की नमूना टोकरी प्रति ५०० µ एल तैयार है, और 25% 1x एसएससी में इथेनॉल समाधान । प्रत्येक समाधान में 5 मिनट के लिए नमूने धो, उच्चतम इथेनॉल एकाग्रता से सबसे कम करने के लिए ऊतक निर्जलीकरण के लिए चलती । 1x एसएससी में 5 मिनट प्रत्येक के लिए दो बार धो लो ।
  3. ९० मिनट के लिए ब्लीच समाधान (तालिका 1) में नमूनों की मशीन एक धुएं के हुड में एक लाइटबॉक्स पर ।
    नोट: यह कदम Bouins समाधान से नमूने या रंगाई में किसी भी रंजकता हटाया जा करने के लिए और स्पष्ट दृश्य के लिए जांच संकेत को बढ़ाता है की अनुमति देता है ।
  4. 5 मिनट के लिए 1x एसएससी के ५०० µ एल के साथ दो बार नमूनों को धो लें ।
  5. एक नए 24-अच्छी तरह से प्लेट और एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग कर नीचे मेष के माध्यम से ७०% इथेनॉल के साथ धोने के एक कुआं में नमूना टोकरी पलटने से ंयूनतम क्षति के साथ हिंमत को स्थानांतरित । यदि आवश्यक हो तो-20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत ।
  6. चित्रा 3में दिखाए गए के रूप में कई नमूनों की धुंधला पैटर्न के एक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए, 24 अच्छी तरह से प्लेट और किसी भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ देखने में ७०% इथेनॉल में हिंमत को बनाए रखने । के रूप में एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के तहत व्यक्ति हिंमत की जांच के रूप में चित्रा 4, चित्रा 5, और चित्रा 6, coverslips के तहत १००% ग्लिसरॉल में हिंमत माउंट । एक प्लास्टिक रंग का उपयोग करने के लिए धीरे ंयूनतम क्षति के साथ ऊतक हेरफेर ।
    नोट: ग्लिसरॉल के उच्च चिपचिपापन संपीड़न द्वारा नुकसान से ऊतक की रक्षा में मदद करता है और diverticula की सावधान स्थिति ऐसी है कि ऊतक उच्च आवर्धन पर बेहतर देखा जा सकता है की अनुमति देता है ।
  7. माइक्रोस्कोप विशिष्ट छवि पर कब्जा सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) और एक सामांय छवि संपादन सॉफ्टवेयर के लिए झगड़ा छवियों के रूप में निर्यात का उपयोग कर माइक्रोस्कोप पर छवियों पर कब्जा । प्रयोगात्मक उपचार के बीच रिश्तेदार धुंधला अंतर यों तो, एक सामांय छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) डाउनलोड । विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर छवि खोलें और धुंधला के पिक्सेल तीव्रता मापने के लिए और धुंधला के हिस्टोग्राम भूखंडों की गणना करने के लिए सॉफ्टवेयर के भीतर निर्देशों का उपयोग करें ।

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Representative Results

आरएनए जांच की गुणवत्ता के माप और अनुमान धुंधला शुरू करने से पहले महत्वपूर्ण हैं । इन विट्रो में प्रतिलेखन दक्षता राशि और डीएनए टेम्पलेट की गुणवत्ता पर अत्यधिक निर्भर करता है । हम नियमित रूप से प्रतिलेखन प्रतिक्रियाओं द्वारा उत्पन्न जांच की शुद्धता और राशि की पुष्टि करने के लिए एक formaldehyde जेल पर आरएनए जांच की कल्पना की । जांच उज्ज्वल, असतत बैंड के रूप में प्रकट होना चाहिए (चित्रा 2) । आरएनए एकाग्रता की स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक माप जांच की गुणवत्ता के अत्यधिक संकेत थे और जेल पर बैंड की उपस्थिति के साथ अच्छी तरह से संबंधित थे । इस प्रकार, जेल दृश्य चरण छोड़ दिया जा सकता है अगर वांछित एक बार प्रोटोकॉल के साथ परिचित प्राप्त किया गया है । किसी भी तरह से, यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि पर्याप्त आरएनए उच्च गुणवत्ता का उत्पादन किया जाता है, के रूप में सभी बहाव कदम जांच की मजबूती पर निर्भर करता है ।

इस तकनीक की ताकत टिक microbiota के बारे में व्यापक टिप्पणियों को सुविधाजनक बनाने में है, उपस्थिति या जीवाणु प्रजातियों की अनुपस्थिति सहित, समय के साथ बैक्टीरिया की बहुतायत में परिवर्तन के रूप में टिक फ़ीड, और पूरे ऊतक के भीतर प्रजातियों के स्थानीयकरण. धुंधला राशि और वितरण में कुछ भिन्नता जैविक प्रतिकृति के बीच सामान्य है और साथ ही व्यक्तिगत हिम्मत (चित्रा 3) के diverticula के 7 जोड़े के बीच, इसलिए, यह सबसे अच्छा है करने के लिए औसत की एक विचार पाने के लिए हालत प्रति कम से पांच हिम्मत दाग पैटर्न धुंधला । प्रोटोकॉल की समग्र सफलता का सबसे अच्छा अर्थ के दाग और प्रत्येक शर्त के लिए antisense नमूनों की तुलना द्वारा गेज है । नब्ज नमूनों, इस प्रकार के विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण नकारात्मक नियंत्रण, कोई बैंगनी रंग (चित्रा 4) के लिए न्यूनतम होना चाहिए. इसके विपरीत, antisense नमूने मजबूत न्यूनतम पृष्ठभूमि के साथ धुंधलाना प्रदर्शित करना चाहिए, की तीव्रता जो विशिष्ट बैक्टीरियल टेप की बहुतायत पर निर्भर करेगा लक्षित किया जा रहा है । ऊतक के भीतर धुंधला पैटर्न भी इन मापदंडों के आधार पर भिंन होगा । महत्वपूर्ण बात, नब्ज और antisense नमूने समय की एक ही राशि के लिए विकसित किया जाना चाहिए ताकि सीधे उनकी तुलना करने में सक्षम हो, तो इन नमूनों समानांतर में संसाधित किया जाना चाहिए. रंग प्रतिक्रिया के अधिक विकास पृष्ठभूमि धुंधला, जहां नब्ज नमूने antisense (चित्रा 5) के समान दिखना शुरू की एक उच्च राशि में परिणाम कर सकते हैं । विशेष देखभाल प्रोटोकॉल में इस कदम पर लिया जाना चाहिए से बचने के लिए, के रूप में वहां कोई रास्ता नहीं प्रतिक्रिया रिवर्स है एक बार ऐसा होता है ।

यह सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है कि सभी हिंमत हर कदम के दौरान पूरी तरह से प्रत्येक एजेंट में जलमग्न हैं; नमूने भर में भिंनता में वृद्धि रिएजेंट के लिए असमान जोखिम के कारण हो सकता है । समय की राशि है कि टिक की हिंमत से पहले खिलाया जाता है एकत्र कर रहे है भी परिणाम पर एक महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है । ticks कि unfed थे या केवल 24 घंटे के लिए खिलाया के साथ काम करना मुश्किल था; हिंमत भी अधिक आसानी से क्षतिग्रस्त थे और अच्छी तरह से दाग नहीं था (चित्रा 6) और इस समय इस दृष्टिकोण की एक सीमा है । ४८-७२ h के लिए फेड ticks के साथ काम करने के लिए सबसे आसान थे, कारण इन हिंमत के बड़े आकार के लिए जब से हिंमत की तुलना में 24 घंटे बाद समय अंक से भी 24 एच से बेहतर दाग-फेड ticks, संभवतः बाद के चरणों के दौरान बैक्टीरियल बोझ में वृद्धि के कारण से हिम्मत के लिए तंग आ गया हे च खिला । ७२-एच ऊतक अक्सर खून से भूरे रंग की एक छोटी सी पृष्ठभूमि था, लेकिन बैंगनी धुंधला रंग पर स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा था (चित्रा 4) । हिंमत सबसे अच्छा कम आवर्धन पर देखा जाता है (5x या 10x) के लिए पूरे एक उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप का उपयोग कर ऊतक भर में धुंधला पैटर्न देखने में सक्षम हो । इस तरह के एक 63X तेल उद्देश्य के साथ के रूप में उच्च आवर्धन पर पूरे माउंट ऊतक देखना, उद्देश्य स्लाइड के खिलाफ प्रेस और नमूनों की मोटाई के कारण ऊतक सेक के रूप में ऊतक को नुकसान पहुंचाने का खतरा चलाता है । यदि उच्च रिज़ॉल्यूशन इमेजिंग वांछित है, ऊतक की धारा के लिए संभावित जांच की जानी चाहिए ।

Figure 1
चित्र 1 . जांच पीढ़ी के लिए खाका तैयार करने की योजनाबद्ध । क्लोन T7 और Sp6 प्रवर्तकों युक्त एक टा क्लोनिंग वेक्टर में 16S rRNA amplicon । Linearize प्रतिबंध एंजाइमों का उपयोग करने साइटों में कटौती करने के लिए एक या बी के लिए इन विट्रो प्रतिलेखन T7 या Sp6 प्रमोटर का उपयोग करने के लिए भावना या antisense जांच क्रमशः उत्पंन करते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . जेल ट्रो द्वारा आरएनए जांच के दृश्य । आरएनए जांच (~ ७०० एनजी) एक formaldehyde agarose जेल पर electrophoresed थे, यूवी प्रकाश के तहत visualized, और एक वाणिज्यिक जेल इमेजिंग प्रणाली का उपयोग कर imaged । एक प्रतिनिधि अच्छी गुणवत्ता, लेन 1; और गरीब गुणवत्ता आरएनए जांच, लेन 2.

Figure 3
चित्र 3 . ४८ एच फेड हिंमत की सीटू संकरण में पूरे माउंट का एक प्रतिनिधि सिंहावलोकन । ४८ एच के लिए खिलाया ticks से हिंमत antisense आरएनए एक संरक्षित 16S के पूरक के साथ सना हुआ राइबोसोमल आरएनए अनुक्रम आंत diverticula के अंतर धुंधला पता चलता है. स्केल बार का प्रतिनिधित्व करता है २०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4 . Ixodes scapularis हिंमत में सीटू संकरण में सफल पूरे-माउंट के प्रतिनिधि छवियां । समय की संकेत राशि के लिए खिलाया ticks से हिंमत या तो भावना (नकारात्मक नियंत्रण) या antisense आरएनए जांच का उपयोग दाग थे । Antisense जांच एक संरक्षित 16S राइबोसोमल आरएनए अनुक्रम (यूनिवर्सल 16S) या एक 16S आरएनए अनुक्रम एक विशेष जीवाणु जीनस के लिए विशिष्ट (के रूप में संकेत) के पूरक थे । Enterococcus मजबूत धुंधला ४८ ज. पैमाने सलाखों में नहीं उपज १४० µm. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए प्रतिनिधित्व करते हैं ।

Figure 5
चित्र 5 . लंबे समय तक chromogenic प्रतिक्रिया समय गैर विशिष्ट धुंधला करने के लिए सुराग । ४८ घंटे के लिए फेड ticks से हिंमत एक भावना आरएनए जांच या एक antisense जांच एक संरक्षित 16S आरएनए अनुक्रम के पूरक के साथ जांच की थी । ऊतक alkaline फॉस्फेट सब्सट्रेट बीएम बैंगनी के साथ 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर और फिर प्रतिक्रिया को रोकने से पहले के बारे में 4 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर था । स्केल बार्स १४० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6 . पूरे- सीटू में संकरण unfed या 24 फेड टिक हिंमत का उपयोग कर माउंट । unfed या 24 एच फेड ticks से हिंमत भावना आरएनए जांच या antisense एक संरक्षित 16S आरएनए अनुक्रम या जीनस Rickettsia के लिए विशिष्ट अनुक्रम के पूरक जांच का उपयोग दाग रहे थे । antisense नमूनों में धुंधला बाद में समय बिंदुओं पर मनाया तुलना में कम मजबूत है और हिम्मत भी अधिक आसानी से क्षतिग्रस्त कर रहे हैं । स्केल बार्स ६० µm का प्रतिनिधित्व करते हैं । इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

नाम अंतिम सांद्रता अंतिम पीएच संग्रहण नोट्स
MEMFA ०.१ एम MOPS - कमरे के तापमान
2 मिमी EGTA
1 मिमी मैग्नीशियम सल्फेट
३.७% formaldehyde
पंजाबियों के बीच (PTw) 1x पंजाबियों, ०.१% के बीच-20 ७.० कमरे के तापमान
०.१% के बीच-20
Triethanolamine बफर 1x पंजाब ७.०-८.० कमरे के तापमान
०.१ एम triethanolamine
संकरण बफर ५०% formamide - -20 डिग्री सेल्सियस
5x एसएससी
1 मिलीग्राम/एमएल Torula आरएनए
१०० µ g/मिलि हेपरिन
1x Denhart का समाधान
०.१% के बीच-20
०.१% लोग
10 एमएम EDTA
पुरुष एसिड बफर (मॉब) १०० मिमी नर एसिड ७.० कमरे के तापमान
१५० mM सोडियम क्लोराइड
क्षारीय फॉस्फेट (एपी) बफर १०० मिमी Tris ९.५ -20 डिग्री सेल्सियस
५० mM मैग्नीशियम क्लोराइड
१०० mM सोडियम क्लोराइड
०.१% के बीच-20
5 मिमी levamisol
ब्लीच समाधान 1% हाइड्रोजन पेरोक्साइड - नए सिरे से तैयार
5% formamide
0.5 x एसएससी

तालिका 1. प्रोटोकॉल में प्रयुक्त समाधानों की रेसीपी ।

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Discussion

यह एक पूरे का पहला प्रयोग है सीटू संकरण (WMISH) तकनीक में माउंट रोगज़नक़ों के एक सन्धिपाद वेक्टर के microbiota का अध्ययन करने के लिए । हमारे प्रोटोकॉल Drosophila में और मेंढक भ्रूण25,26में विकास का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल एक से अनुकूलित किया गया था । पूरे सीटू संकरण में माउंट आरएनए नियमित रूप से जीन टेप स्थानीयकरण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है और अस्थायी27 और टेप के दृश्य उज्ज्वल क्षेत्र द्वारा या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा किया जा सकता है. हमने टिक हिम्मत में microbiota का पता लगाने की दिशा में पूर्व में अपनाया है. यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि सीटू में पूरे-माउंट संकरण में पूरे टिकरों का उपयोग करने का प्रयास किया जा रहा है जिसमें प्रमुख क्षेत्र को निर्धारण और संकरण समाधानों के प्रवेश की अनुमति देने के लिए निकाला गया था, सफल नहीं रहा । प्रोटोकॉल यहां वर्णित विच्छेदन हिंमत का इस्तेमाल किया गया है और बैक्टीरियल औपनिवेशीकरण पर विशिष्ट टिक प्रोटीन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए midgut23में लागू कर दिया गया है । WMISH से प्राप्त जानकारी immunohistochemistry के लिए तुलनीय है, लेकिन प्रोटीन और एंटीबॉडी के जीन या ब्याज के प्रोटीन की पीढ़ी की जरूरत नहीं का लाभ है । जीनोमिक जानकारी WMISH के लिए रिएजेंट जनरेट करने के लिए पर्याप्त है । दोनों WMISH और मछली (सीटू संकरण में प्रतिदीप्ति) जीन एक्सप्रेशन का पता लगा सकते हैं । हालांकि, यह एक एंजाइमी और chromogen आधारित परख होने के कारण, WMISH लाभ है कि रंग का विकास सक्रिय रूप से निगरानी की जा सकती है, और प्रतिक्रिया जब तक वांछित संकेत और संवेदनशीलता हासिल की है आगे बढ़ने की अनुमति दी है । यह पूरी तरह से स्वचालन के लिए उत्तरदायी है और आसानी से उच्च प्रवाह प्रारूप करने के लिए स्केलेबल है. मछली और immunohistochemistry के विपरीत, कोई अनुभाग नहीं की आवश्यकता है । मछली पर WMISH का नुकसान यह है कि केवल 2 अलग mRNAs या जीन एक साथ संबोधित किया जा सकता है और की आवश्यकता होगी कि जांच ऐसे digoxigenin-UTP और fluorescein-UTP28के रूप में विभिंन न्यूक्लियोटाइड के अनुरूप के साथ लेबल किया जाएगा । मछली के साथ, 6 अलग mRNAs को एक परख29में जांच की जा सकती है । जबकि दोनों परख तुलनीय समय की आवश्यकता होती है, प्रतिदीप्ति रंजक की लागत chromogenic सब्सट्रेट की तुलना में अधिक कर रहे हैं । मछली परख भी छवि दृश्य के लिए एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप की आवश्यकता होती है, जबकि WMISH छवि दृश्य किसी भी प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है ।

यह महत्वपूर्ण है कि प्रोटोकॉल बारीकी से पीछा किया जाता है; हालांकि, वहां कुछ कदम है कि विशेष रूप से देखभाल की आवश्यकता है । ऊतक को नुकसान पहुँचाए बिना टिक से midgut के विच्छेदन कुछ निपुणता की आवश्यकता है । विच्छेदों का अभ्यास करने और प्रवीणता प्राप्त करने के लिए अतिरिक्त टिकर एकत्रित करना विवेकपूर्ण हो सकता है । व्यक्तिगत हिंमत (चित्रा 3) के विभिंन diverticula में दाग के विविधता के कारण, यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक पेट के सभी diverticula की जांच करने के लिए बैक्टीरियल बहुतायत के निर्णायक सबूत प्राप्त है । यह भी कई हिंमत प्रक्रिया करने के लिए महत्वपूर्ण है (कम से कम 5) प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए उपस्थिति, स्थानिक वितरण, और विभिंन diverticula के भीतर विशिष्ट बैक्टीरिया की बहुतायत पर निर्णायक जानकारी प्राप्त करने के लिए । उच्च गुणवत्ता आरएनए जांच का उत्पादन भी प्रभावी ऊतक धुंधला करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह भी क्लोनिंग में जांच टेम्पलेट के अनुक्रम की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है वेक्टर सुनिश्चित करने के लिए कि antisense और नब्ज जांच उचित उत्पन्न कर रहे हैं. एक उत्पादक इन विट्रो प्रतिलेखन प्रतिक्रिया पर्याप्त डीएनए टेंपलेट की आवश्यकता है; १०० एनजी का एक ंयूनतम इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन ०.५-1 µ g इष्टतम जांच पीढ़ी के लिए सिफारिश की है ।

इस प्रोटोकॉल में नमूना टोकरी और 24 अच्छी तरह से प्लेटों का उपयोग हर धोने कदम है, जो धुंधला प्रक्रिया के दौरान नुकसान को कम कर देती है पर ऊतक के प्रत्यक्ष हेरफेर से बचा जाता है । हालांकि, नमूने अभी भी कभी कभार खो या क्षतिग्रस्त हैं; unfed या 24 के बीच से हिंमत-फेड ticks, विशेष रूप से, देखने के लिए मुश्किल है और जब नमूना टोकरी से एक लंबी अवधि के भंडारण कंटेनर को स्थानांतरित खोने के लिए आसान है । इन नमूनों को संभालते समय अतिरिक्त देखभाल की जानी चाहिए । इस सीमा के कारण, हम मुख्य रूप से इस्तेमाल किया है ४८ और ७२ एच-फेड टिक हिम्मत । इन समय में हिंमत में रक्त भोजन की बड़ी मात्रा की उपस्थिति-अंक (७२ से अधिक घंटे) धुंधला और रक्त भोजन से गैर विशिष्ट पृष्ठभूमि के कारण दृश्य के साथ हस्तक्षेप और भी इस तकनीक की एक सीमा प्रस्तुत करता है । यह संभावना है कि फ्लोरोसेंट लेबल जांच का उपयोग इस मुद्दे को दरकिनार हो सकता है ।

धुंधला प्रक्रिया का सबसे महत्वपूर्ण पहलू मजबूत धुंधला और कम पृष्ठभूमि संकेत के बीच संतुलन स्थापित करने के लिए है । आदर्श रंग विकास के समय प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर भिंन हो सकते हैं । इस प्रकार, यह सबसे अच्छा है कमरे के तापमान पर रंग प्रतिक्रिया प्रदर्शन और रंग विकास की निगरानी लगभग हर 30 मिनट । प्रतिक्रिया भी सेट किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर आगे बढ़ना करने के लिए धीमी रंग विकास । हालांकि, यह इस प्रतिक्रिया लंबे समय के लिए आगे बढ़ने नहीं करने के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण है । दाग प्रतिक्रिया आंख से निगरानी करने के लिए मुश्किल हो सकता है, तो नमूने एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत जांच की जानी चाहिए । एक बैंगनी टिंट antisense आरएनए के साथ जांच नमूनों पर दिखाई जानी चाहिए, जबकि नमूनों भावना आरएनए के साथ जांच की न्यूनतम रंग बनाए रखना चाहिए. यदि नब्ज आरएनए-जांच नमूने चमकीले दाग, समस्या निवारण चरण बीएम बैंगनी के साथ मशीन समय को कम करने और अवरुद्ध समय में वृद्धि के साथ शुरू कर देना चाहिए । कई बार नब्ज जांच antisense जांच की तुलना में anomalously उच्च पृष्ठभूमि पैदा कर सकता है; इन मामलों में, जीन के विभिंन क्षेत्रों में आरएनए जांच पैदा करने के लिए विचार किया जा सकता है । डीएनए अनुक्रम किसी दिए गए नमूने में प्रतिनिधित्व नहीं भी नकारात्मक नियंत्रण जांच उत्पंन करने के लिए टेंपलेट्स के रूप में माना जा सकता है । उदाहरण के लिए, एक डीएनए ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का एक क्षेत्र एंकोडिंग टेंपलेट, टिक जीनोम या इसके microbiome में प्रतिनिधित्व नहीं, का उपयोग किया जा सकता है ।

इस तकनीक की एक सीमा है कि विश्लेषण काफी हद तक गुणात्मक है; हालांकि, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका) प्रत्येक नमूने में संकेत धुंधला की मात्रा को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह विभिन्न जीवाणु प्रजातियों की बहुतायत के एक अर्द्ध मात्रात्मक तुलना विभिन्न प्रयोगात्मक स्थितियों के तहत की अनुमति होगी । हालांकि यह एक समय लेने वाली प्रोटोकॉल है कि 3-4 दिन के लिए पूरा लेता है, यह श्रमसाध्य नहीं है; हर दिन हाथ पर समय के बारे में केवल 3-5 औसत पर एच है । हालांकि, नमूना टोकरी और धारकों के उपयोग के साथ समानांतर में कई नमूनों की प्रक्रिया करने की क्षमता उच्च प्रवाह विश्लेषण के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस प्रक्रिया को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर स्वचालित किया जा सकता है (सामग्री की तालिका) यदि इस प्रोटोकॉल के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध का उपयोग करके अनुसंधान प्रयोगशाला के एक आवश्यक और नियमित घटक होने की उंमीद है स्वचालन-संगत प्लेटफार्मों (सामग्री की तालिका) और हाथ समय पर कम करने के लिए.

वर्णित प्रोटोकॉल digoxygenin का उपयोग करता है लेबल जांच है कि एक वर्णमिति संकेत है कि चमकदार क्षेत्र माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर छवि हो सकता है के उत्पादन की अनुमति । जब तक हम एक chromogenic सब्सट्रेट का उपयोग किया है संकरी आरएनए जांच व्यक्तिगत लक्ष्य के लिए विशिष्ट का पता लगाने के लिए, यह भी digoxigenin-UTP जैसे विभिन्न न्यूक्लियोटाइड सादृश्य के साथ जांच लेबल द्वारा एक साथ कई लक्ष्यों का पता लगाने के लिए संभव है, और fluorescein-UTP और अलग chromogenic सब्सट्रेट30. ऊतक के नमूनों तो दो कदम के लिए अलग chromogenic प्रतिक्रियाओं के साथ, क्षारीय फॉस्फेट-digoxigenin और fluorescein के खिलाफ एंटीबॉडी युग्मित के साथ क्रमिक रूप से गर्मी हो सकती है । इस तकनीक को भी फ्लोरोसेंट के लिए अनुकूलित किया जा सकता है लेबल जांच, जो उच्च संकल्प इमेजिंग का उपयोग करने की सुविधा हो सकता है फोकल माइक्रोस्कोपी31 और समानांतर में विभिंन रंगों की कई जांच का उपयोग करने का विकल्प प्रदान करते हैं । इस तकनीक को केवल विशेष रूप से एक नमूना में एक समय में कुछ सूक्ष्मजीवों का आकलन कर सकते हैं । हालांकि, कई नमूनों में उच्च प्रवाह परख का आकलन किया जा सकता है पता करने के लिए एकाधिक सूक्ष्मजीवों कि टिक microbiota में प्रतिनिधित्व किया जा सकता है ।

अंत में, इस तकनीक ticks और उनके संबद्ध microbiota के बीच बातचीत की जांच करने के लिए सीमित नहीं है । जांच टिक जीनोम के भीतर ब्याज की किसी भी जीन के पूरक उत्पंन किया जा सकता है और बहुतायत और विभिंन ऊतकों में विशिष्ट जीन के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया । टिक की लार ग्रंथियों को भी संसाधित किया जा सकता है और आंत के लिए इसी तरह का विश्लेषण । कुल मिलाकर, इस तकनीक के हित के अंय सन्धिपाद रोग वैक्टर के भीतर माइक्रोबियल समुदायों की गतिशीलता पर अध्ययन करने के लिए अनुकूलन के लिए व्यापक क्षमता है ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम ईमानदारी से अपने प्रयोगशाला संसाधनों का उपयोग प्रदान करने के लिए डॉ मुस्तफा खोखा, येल विश्वविद्यालय, धंयवाद । हम श्री मिंग के आभारी हैं-उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए Jie वू । EF एक HHMI अन्वेषक है । इस काम के जॉन Monsky और जेनिफर वेट्स Monsky लाइम रोग अनुसंधान कोष से एक उपहार द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron Amazon 03-110/47
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360
Digoxygenin-11-UTP Roche 1209256910
dNTP New England Biolabs  N0447S
DNAse I(RNAse-free) New England Biolabs M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit New England Biolabs E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated American Bioanalytical AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502-01000
Formaldehyde, 37% JT Baker 2106-01
Formamide American Bioanalytical AB00600-00500
EGTA Sigma Aldrich E-4378
DPBS, 10X Gibco 14300-075
Tween-20 Sigma Aldrich P1379-25ML
Proteinase K Sigma Aldrich 3115879001
Triethanolamine HCl Sigma Aldrich T1502-100G
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102-100ML
Paraformaldehyde ThermoScientific/Pierce 28906
SSC, 20X American Bioanalytical AB13156-01000
RNA from torula yeast Sigma Aldrich R3629-5G
Heparin, sodium salt Sigma Aldrich H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X Sigma Aldrich D2532-5ML
CHAPS hydrate Sigma Aldrich C3023-1G
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
RNase T1 ThermoScientific  EN0541
Maleic acid Sigma Aldrich M0375-100G
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase Sigma Aldrich 11442074001
Bouin's solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Hydrogen peroxide Mallinkrodt Baker, Inc 2186-01
Single stranded RNA ladder Ambion -Millenium AM7151
 #11 High-Carbon steel blades  C and A Scientific Premiere #11-9411
Thermocycler BioRad, CA 1851148
Spectrophotometer ThermoScientific  NanoDrop 2000C
Orbital shaker VWR DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath BELLCO Glass, Inc Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system BioRad Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope  Nikon NikonSM2745T
Bright-field Microscope  Zeiss AXIO Scope.A1
Dissection microscope  Zeiss STEMI 2000-C
 Light box VWR 102097-658
PCR purification kit  Qiagen 28104
Image capture software Zeiss Zen lite
Image editing software  Adobe  Adobe Photoshop CS4 version 11.0
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आनुवंशिकी १३६ अंक सन्धिपाद टिक आंत microbiota प्रतिलिपि पूरे-सीटू संकरण में माउंट
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Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., … More

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., Narasimhan, S. Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (136), e57758, doi:10.3791/57758 (2018).

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