Summary
ここでは、空間的そして一時的変更されたホール マウント in situ ハイブリダイゼーションのアプローチを使用して目盛り根性で実行可能な微生物叢の存在を評価するためにプロトコルを提案します。
Abstract
節足動物ベクトルによる伝染病は、世界中の人間の健康に重大な脅威をもたらすし続けます。これらの病気を引き起こしている病原体は、彼らはベクトル; を植民地化するとき、単独では存在しません。むしろ、腸内腔の常駐微生物との相互作用に従事する可能性が高い。ベクトル内の細菌叢は、いくつかの媒介性疾患の病原体の感染に重要な役割を再生する実証されています。イクソデススカプラリス目盛り、ボレリアブルグドルフェリを含むいくつかの人間の病原体のベクトルの腸内常在細菌病原体のダニの伝送に影響を与えるかどうかは未定です。ティックの腸内で潜在的な種間相互作用の理解を容易にするダニ腸に関連付けられている細菌の組成を特徴付けるための方法が必要です。その場で全部マウントの使用特定の細菌種に関連付けられている RNA 転写産物を視覚化する交配できます豊かさに関する質的データの収集とそのまま組織の細菌叢の分布。この技術は、ダニの餌にわたって腸内細菌叢の環境の変化を調べるため、ティック遺伝子の発現を分析にも適用できます。三次元再構成を必要とせず、組織の標的 RNA の総空間分布については収量をガッツ全目盛りの染色としばしば混同法を用いた環境汚染の影響が小さい複雑な微生物群集を研究する頻繁に使用されるメソッド。全体的にみて、この手法はより良いするために使用できる貴重なツール ベクトル病原細菌の相互作用とその病気の感染における役割を理解します。
Introduction
節足動物ベクトルによって送信される人間と家畜の病原体が世界中1、しかし効果的な感染症の約 20% のグローバル アカウントし、安全なワクチンこれらの病原体のほとんどはご利用いただけません。総称マイクロバイ2、調節、およびほぼすべての多細胞動物3健康を形成して共生、環境共生・病原性微生物の重要な役割の私達の理解を拡大しています。今、またハーバー腸内細菌の病原体の節足動物ベクトル多様な媒介性病原体4,5に影響を与えるこれらのベクター関連微生物叢が示されていることが明らかです。節足動物のマイクロバイ真正細菌、古細菌、ウイルス、原虫、線虫、菌類6などの真核微生物で構成されます。ただし、優勢な研究の焦点されている真正細菌のため、一部では、マーカー遺伝子と細菌の特定のメンバーを識別するために参照データベースの可用性に。
イクソデススカプラリス、ボレリアブルグドルフェリ7,を含む複数の人間の病原体のベクターの目盛りを中心とライム病の病原微生物の可視化技術の最適化を目指したベクトル ・病原菌相互作用のコンテキストでティック腸内細菌の私達の理解を改善しています。ティック マイクロバイ フィールドで答えるべきいくつかの疑問が残っています。腸は、目盛りと水平方向に移された病原体; のコンテキストで受信の病原体との間の最初の拡張の出会いのサイトしたがって、ベクトル ・病原菌相互作用を調節することでベクトル腸内細菌の役割を理解すると、意味のある洞察が明らかになります。マダニは、吸血消化、血液の食事コンポーネントは処理場所8では細胞内のユニークなモードを持っています。栄養の消化と同化餌の数日中に結果として起きるの後補充や腸の内腔は一見ティック フィードとして血液の食事を含む容器として機能します。給餌中にダニによって取得した病原体に入る、吸血と共に腸内腔と内腔になるダニ、病原体、および常駐細菌間の相互作用のプライマリ サイト。消化の補充と脱皮マダニを通過、腸は構造と機能の変化9を経る。組成と腸内細菌の空間組織も変化する腸内環境とのコンサートでは異なる可能性が高いです。したがって、完全にダニ、病原体と腸内細菌の相互作用を理解する目盛りの腸内常在細菌のアーキテクチャを理解することが重要です。
ホスト関連付けられている細菌叢を日常的に記述するため分子技術は、増幅し、細菌の 16S リボソーム DNA (rDNA) をシーケンスに高スループット並列シーケンス戦略10を利用します。これらのシーケンスの戦略は、特定の細菌の無菌共生栽培を取得し、サンプルで表される細菌のすべてのメンバーの詳細な説明を提供する必要を回避します。それにもかかわらず、このような戦略は、善意の住民から環境汚染を区別する無力によって混同されます。さらに、サンプル サイズが小さいと、それゆえ低細菌固有の DNA が含まれているダニなどの評価の結果、環境汚染物質の増幅の可能性増加11とのあいまいな解釈の結果マイクロバイ組成物。特定の細菌の可視化と組み合わせて機能解析、したがって、重要になりますを定義し、時間的、空間的にダニのマイクロバイを識別します。私たちはこの目標に向かって交配その場全体マウント RNA を利用しました。このテクニックは、日常的に使用して臓器および胎仔の12,13,14の遺伝子発現パターンを評価する、目的の全体標本上式の半定量分析を可能します。これは交配技術従来の in situティッシュ セクションを利用し断面計算アセンブリ全体の臓器15で式を予測する材料の広範な解析は往々 に異なります。全体マウント一般的に全体の生物12を参照しますが、ここで全部マウントは全体の内臓や器官を指します。ティック腸内微生物叢のアーキテクチャを評価するために交配アプローチその場全体マウント RNA を使用する利点は、多重。ティック腸憩室の 7 ペア サイズ16の各ペアで構成されます。機能の違いこれら憩室の間で、いずれはダニの生物学の文脈で理解されていない場合は、細菌やダニ ・病原菌相互作用をチェックします。破裂腸憩室腸の操作は細菌叢腸内腔や腸内細菌叢の空間定位の誤解の結果と緩く関連付けられている内に存在を転置します。蛍光標識 RNAの in situハイブリダイゼーションを修正し、個々 の腸憩室プローブの交配を確保し、ボレリアをローカライズするティック腸成績17を調べる以前に利用されています。18全体ダニのパラフィン包埋の区分により成績証明書。これらの両方のアプローチでは、腸内細菌叢のアーキテクチャに影響を及ぼす交配前にティック組織の操作必要があります。
このレポートでその場で全部マウント交配 (WMISH) を使用して実行可能な目盛り腸内細菌を調べるプロトコル詳細に述べる。全体マウント RNAの in situハイブリダイゼーションの使用により、存在の国際理解と腸内のさまざまな地域で特定の腸内細菌の豊かさと病原体の植民地化のコンテキストでティック腸の生物学への新しい洞察に拍車をかける可能性があります。トランス ミッション。さらに、特定の細菌 RNA に対して指示される RNA プローブの使用が目盛りの腸内細菌の検出を可能します。
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Protocol
1. DNA のテンプレートの準備
- NCBI データベースと設計ポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の互換性の 16S rRNA シーケンスの特定を各細菌属前方ダウンロードし、逆に前述のとおり属固有領域 (200 ~ 250 塩基対長) を増幅するプライマー19しますまたリソースを参照、オープン ソース データベース シルバ20,21と probeBase22オンライン rRNA をターゲットとしたオリゴヌクレオチド プローブやプライマーのいくつか細菌属の RNA プローブが商業的にすることができる。使用可能です。
注: それは特定する固有属の遺伝子領域を選択し、設計されたプライマーは関連細菌属を増幅していないことを確認することが重要です。これは、遺伝子/属特異的プローブの交配を取得する重要です。 - マウス、24、48、72 時間目盛りの内臓を解剖し、RNA と説明以前23としてダニ内臓からの cDNA を準備、ダニをフィードします。Pcr のテンプレートとして使用して cDNA を増幅属固有 amplicons、たちを使用しています。1.5% の agarose のゲルの PCR の製品/私アンプリコンの因数を実行し、増幅がゲルのイメージング システムを用いた紫外 (UV) 光の下での可視化による予想されるサイズに対応することを確認します。
- バクテリオファージのポリメラーゼ (T3、T7 SP6) に適した RNA ポリメラーゼ プロモーターを含む市販 TA ベクトル (材料表) に関心の細菌の 16S リボソーム RNA 増幅を複製します。私アンプリコンのアイデンティティとプロモーターのそれぞれに対してクローンの方向性を確認するためクローンをシーケンスします。これに基づき、意味またはアンチセンス RNA を生成する任意のプロモーター プローブ (図 1) を決定します。
- 最大 30 µLfor メーカーの推奨温度で 2 h の反応量の適切な制限の酵素が付いているプラスミッドの 1 mg をリニア化します。センスやアンチセンス プローブ (図 1) を生成するために利用されるプロモーターに基づく制限酵素を選択します。1% アガロースゲルのダイジェスト反応の 2 μ L の可視化による線形化を確認します。
- 市販 PCR 製品カラム精製キットを使用して消化の DNA の残りの 28 μ L を浄化し、分光光度計によって DNA 濃度を定量化します。
注: いくつかの感覚のプローブは背景汚損対応するアンチセンス プローブよりはるかに高いを引き起こすかもしれないし、他のオプションは検討する必要があります。代替の否定的なコントロールには、プラスミド シーケンス サンプルまたは交配の特徴的なパターンを生成する別のプローブに表示されませんが含まれます。
2. Digoxygenin UTP RNA プローブの構築
- 100 mM utp ケーブルは、10 mM digoxygenin-UTP、25 μ、10 μ L 各 100 mM ATP、GTP、CTP ・ 1.5 mL 遠心管中の 7.5 μ L を組み合わせることによりヌクレオチドの組合せを準備します。
- In vitro転写を行う市販 T7 または Sp6 RNA ポリメラーゼのキットを使用して、1 μ L のヌクレオチドの組合せ (ステップ 2.1) と 0.25 - を使用してテンプレート DNA の 1 μ g。水で 20 μ L にボリュームをもたらします。組み合わせて、スピンをパルス チューブをフリックします。2.5-3 h の 37 ° C で孵化させなさい。
注: プローブの建設は 7 ng/μ L の低消化プラスミド濃度が 15-25 ng/μ L からこのステップの範囲で典型的な濃度で成功しています。37 ° C で一晩培養したも転写反応も可能性がありますが、RNA の収穫は大幅上昇しません。 - DNase の 1 μ L を追加 (2,000 単位/μ L) し、37 ° c 10 分間加温します。10 分を超えることはありませんまたは酵素が RNA を低下し始めます。
- 冷たい 7.5 8 M 塩化リチウムの 30 μ と 30 μ L の RNA を沈殿させ冷蔵ヌクレアーゼ フリー水を追加します。ミックス チューブをフリックします。-20 ° C で一晩続行する RNA の沈殿物を許可します。
- 4 ° C で 20 分 17,000 × g で遠心分離によって RNA を収集します。ジエチル pyrocarbonate (DEPC) 水で作りたての 75% のエタノールの 1 mL の 1 回餌を洗浄し、遠心分離を繰り返します。
- 削除し上澄みを廃棄、きれいなペーパー タオルの上にチューブを反転し、乾かしますの 10 分は、ヌクレアーゼ フリー水でペレットを再懸濁します。ペレットが簡単に表示されている場合は、25 μ L で再懸濁します。ペレットは 15-20 μ L で再懸濁します非常に小さいまたは表示されていない場合は、分光光度計による RNA 濃度の推定値を取得します。
注: 典型的な RNA 濃度範囲 200-500 ng/μ L から。
3. RNA の可視化プローブ RNA の純度を評価するためにホルムアルデヒド RNA ゲル電気泳動
注意: ホルムアルデヒド ポーズ吸入の危険性;したがって、ヒューム フードの RNA のゲルの分析に必要なソリューションを生成します。臭化エチジウムは疑わしい発癌物質;取り扱いに注意。
- 前述の24 RNases の無料ジェル ボックスでゲルをキャストと 1% のホルムアルデヒド agarose のゲルを準備します。後は、冷却は、連続したバッファー (ph 7.0 では、5% のホルムアルデヒド 1 モップ x) x 1 ジェル ボックスを入力します。
- (5 μ L 400 mg/mL エチジウム ブロマイド、モップ、35 μ L のホルムアルデヒドおよび 100 μ L ホルムアミド x 20 μ L 10) サンプル バッファーを準備します。サンプル バッファーの 8 μ L で 2 μ L の RNA プローブ (ステップ 2.6) を組み合わせます。70 の ° c で 10 分間インキュベートします。
- 0.5 M の EDTA (pH 7.5) の 20 μ L、40 mg キシレンシアノール 40 mg ブロモフェノール ブルー 1 mL 10% ホルムアルデヒド 5 mL 50% グリセロールを組み合わせることにより RNA の読み込みバッファーを準備します。使用後は、-20 ° C でこのバッファーを格納します。
- ステップ 3.2 からの RNA のサンプルにローディングバッファーの 3 μ L を加え、混ぜます。氷の上のサンプル チューブを保ちます。
- ステップ 3.4 からゲルにサンプル全体ボリュームを読み込みます。RNA のサイズを確認して横の単一座礁させた RNA はしごの因数をロードします。100 V でゲルを実行またはブルーの染料移行ゲル道の約 75% まで下げます。紫外線ゲルのイメージング システムを使用しての下で RNA を視覚化します。
注: 質の良い RNA プローブは、プローブ (図 2、レーン 1) の予想サイズに対応する機動性と離散バンドとして表示されます。場合は、プローブは、ディフューズ成分とべたつくバンドとして (図 2、レーン 2) これは使用しないでください表示されます。
4. 腸のコレクションおよび固定をチェックします。
- 興味の時間ポイントのマウスに与えているイクソデススカプラリスニンフを収集します。
注: この手法のため、ダニの供給 48 または 72 h 仕事最高。 - MEMFA (表 1) にできるだけ多くの臓器への損傷を避けて解剖顕微鏡の下でスライド ガラスにダニから腸を解剖します。MEMFA の 20-30 μ L のきれいな顕微鏡スライドのチェックを入れます。ダニの体を残しての目盛りの板で滅菌、高炭素鋼かみそりの刃 #11 スライス頭部領域のペアを使用します。腸憩室と唾液腺体キューティクルをプッシュする体を軽く押します。唾液腺と腸を分離し、かみそりの刃で内臓をかき出します。
- 500 μ L MEMFA を含む 1.5 mL チューブに内臓を収集します。室温 1 時間穏やかな揺動でチューブを孵化させなさいまたは 4 ° C で一晩
注: ダニ唾液腺がまた解剖同様に固定・染色します。 - 1 mL 冷たい 100% エタノールで 3 回を優しく洗浄することにより、組織を脱水します。洗うたび間管の底に自然にシンク根性をように遠心分離組織に損傷を与える可能性があります。長期保存のため 100% エタノールに-20 ° C でのサンプルを維持する.
5. メッシュ サンプル バスケットおよび 24 ウェル バスケットのホルダーの建設
- メスの温水片刃かみそりの刃を使用してスナップ トップ遠心チューブ 2 mL または 5 mL から底をカットします。
注意: ブレードは、カットが完了する前に数回を再加熱する必要があります。 - 新しい管開口部よりわずかに大きい 110 μ m ナイロン メッシュの正方形をカットします。チューブの底にメッシュを軽く押すことによってそれら一緒にホット プレートの上に中弱火で良いシールが行われるまでボンドします。冷ます、メッシュとチューブの間に隙間がないことを確認、エッジの周りの余分なメッシュをトリミングします。
- ステップ 5.2 で作ったサンプル バスケットの唇が穴に座るし、どこに置かれるとき、井戸ですべての方法サンプル バスケットの底が座りますセットアップを降伏、落ちないように 24 ウェル プレートのカバーに穴を開ける、カバーの穴。
- その場で交配のプロトコルの全体のための相対的な容易さとの 1 つのプレートからでバスケットを転送するのにこの装備バスケットのホルダーを使用します。2 24 ウェル プレートを使用すると、1 つの培養が行われている他の板は次の洗濯の準備します。
6 in Situハイブリダイゼーション: 1 日目 (タイミング: 4-5 h)。
- 転送ガッツ ラベル サンプル バスケット、実験条件で区切られ、RNA プローブを意図しました。
注: レプリケート中で自然の変化を考慮して条件あたり少なくとも 5 ガッツを汚します。 - 優しく徐々 に 0.1% 非イオン性界面活性剤 (PTw; とリン酸緩衝生理食塩水の割合を増やすことによって組織に気泡を導入することを避けるためにサンプルを水分補給します。表 1)エタノール洗浄中。
メモ: は、特に断らない限り穏やかな攪拌と常温 24 ウェル バスケットのホルダーのすべて洗浄を完了します。それぞれのバスケットにガッツが完全に浸漬のようなホルダーを各ウェルに洗浄溶液の分注 500-600 μ L。DEPC 処理水を RNA の劣化を防ぐためにすべてのソリューションを準備します。- 5 分サンプルを 500 μ L 100% エタノールで洗います。
- 75% のサンプル バスケットあたり少なくとも 500 μ L を用意し、50% と 25% エタノールの PTw。 最高のエタノール濃度から最下位への移動、それぞれのエタノール溶液で 5 分間洗浄によるサンプルを水分補給。
- PTw の各 5 分の 4 回サンプルを洗います。
- プロティナーゼ K のサンプルを permeabilize (10 μ G/ml) 5 分 PTw の。
- RNA プローブの交配のための組織を準備します。
- 6.2 500 μ L トリエタノールアミン バッファー (0.1 M, pH 7.0-8.0) で各 5 分の穏やかな攪拌と常温 24 ウェル バスケットのホルダーでアミン無料環境のサンプルを維持する (表 1) で説明したように 2 回のサンプルを洗います。
- 5 分ごとに、トリエタノールアミン バッファー (0.1 M, pH 7.0-8.0) で 2 回と 500 μ L 0.25% 酢酸無水サンプルを治療して PTw 5 分で 2 回サンプルを洗ってください。
注: 無水酢酸は、非固有静電相互作用を防止し、mRNA へのプローブの特定のバインドするためには、正の電荷を中和するために遊離アミンをアセチルします。 - PTw で 500 μ L 4% パラホルムアルデヒドで 20 分ガッツを固定して 5 分 PTw の 5 回を洗ってください。
- 500 μ L の交配バッファー/in 揺れ水浴の穏やかな撹拌で 60 ° C で 1.5 2.5 h 24 well プレート (表 1) で 24 ウェル バスケットのホルダーのサンプルをインキュベートし prehybridize します。日 2 プロトコル (手順 7.1) で再利用する prehybridization のステップに使用する交配バッファーを保存します。
- 最終濃度 1 μ G/ml の交配バッファー内の RNA プローブを希釈してハイブリダイゼーション プローブを準備します。 振動水浴 (表 2) で一晩穏やかな撹拌で 60 ° C で 24 ウェル バスケットのホルダー交配プローブとサンプルをインキュベートします。ハイブリダイゼーション溶液の蒸発を防ぐためにアルミ箔をぴったりとバスケットのホルダーを運ぶプレートをカバーします。
7. in Situハイブリダイゼーション: 2 日目 (タイミング: 4.5 5.5 h)
- プローブの交配から、サンプルを削除し、前の日から予約交配バッファーに配置します。3 分間穏やかな撹拌で 60 ° C で孵化させなさい。
注: プローブの交配のソリューションは、3 回まで再利用のための-20 ° C で保存可能性があります。 - 希釈 20 生理食塩水ナトリウム クエン酸バッファー (SSC) x 2 を準備 DEPC 処理水 (表 1) に x SSC。SSC は、x 2 と 3 分の 2 回、3 回 2 と 20 分のためのサンプルを洗うプローブとハイブリダイゼーション バッファーのすべてのトレースを削除する 60 ° C で x SSC。
- (20 μ g/ミリリットル) と RNase T RNase と治療1 (10 μ G/ml) 2 x の 37 ° C で 30 分間の 1 つを削除する SSC 鎖 RNA プローブ無料を表す非交配 RNA。
- 2 を一度洗って室温で 10 分間 x SSC。0.2 を準備希釈 2 x SSC DEPC 処理水で x SSC、0.2 で二回洗って余分な RNases を削除する 60 ° C で 30 分間 x SSC。
- マレイン酸バッファー (MAB; の 500 μ L で 2 回洗う表 1)10 分ごと。
- ソリューション (2 %mab のブロッキング試薬) に 1.5-2 時間ブロックのサンプルをインキュベートします。
注: ブロッキング試薬は溶解; することは困難することができます。穏やかな加熱溶解を支援します。 - ブロッキング液に置き換えて反ジゴキシゲニン アルカリ性ホスファターゼ共役 500 μ L のソリューションをブロックで 1:3,000 希釈抗体、または 4 ° C で約 4 時間室温で一晩インキュベートします。
8 しますin Situハイブリダイゼーション: 日 3 (タイミング: 一晩に 6 h)。
- 少なくとも 5 回 500 μ L 余分な抗体を削除する MAB で各 30 分のサンプルを洗います。
注: これらの洗浄は柔軟性があり、1-2 時間に延長されます。 または 3-4 洗浄効果に最小限の影響で 4 ° C で一晩ワンウォッシュの代わりになるかもしれない。 - アルカリホスファターゼ バッファー、pH 9.5 (AP バッファーで 5 分間 2 回洗浄表 1)。
- 最後の洗浄を 500 μ L のアルカリホスファターゼ (材料表) の発色基質に置き換えることによって色の反応を開始します。アルミ箔でサンプル プレートをカバーさせ、3-5 h または 4 ° C で一晩室温で染色Overstaining を避けるために解剖顕微鏡下で組織を表示することによって染色反応を定期的に監視します。
注: 染色が完了すると、紫色の濃淡はアンチセンス プローブ顕微鏡でサンプルの目によって検出が、組織は非常に暗くなりできません。染色 4 ° C で非常にゆっくりと進むし、20-24 h までかかることがあります。 - MAB、500 μ L で 5 分間洗浄による呈色反応を停止し、一晩 Bouin のソリューションで組織を修正します。
警告: 処理発煙のフード; Bouin のソリューション腐食性発癌物質です。
9. in Situハイブリダイゼーション: 4 日目 (タイミング: 3 3.5 h)
- サンプル 1 バスケットあたり少なくとも 7 ml 希釈 20 x SSC DEPC 処理水で x SSC。1 で 4 倍から 6 倍の 70% エタノール サンプルを洗浄することにより Bouin のソリューションを削除 x SSC 組織が黄色されなくなるまで。
- 1 で 75%、50%、25% のエタノール溶液のサンプル バスケットあたり 500 μ L を準備 x SSC。各ソリューションでは、組織を水分補給を最下位に最高のエタノール濃度から移動で 5 分サンプルを洗います。洗って 2 回 5 分間各で 1 x SSC。
- ヒューム フードのライト ボックスに 90 分の漂白剤溶液 (表 1) のサンプルをインキュベートします。
注: この手順サンプルまたは削除する Bouins ソリューションから色で、色素沈着ができ明確に可視化のためのプローブ信号を強化します。 - 1 の 500 μ L で 2 回サンプルを洗って 5 分の x SSC。
- 新しい 24 ウェル プレートのウェルにサンプル バスケットの反転によって最小限の被害でガッツに移動し、転送ピペットを使用してメッシュ底を 70% エタノールで洗浄します。必要な場合は、-20 ° C で保存します。
- 図 3,のように複数のサンプルの染色パターンの概要を取得するには、明視野顕微鏡と 24 ウェル プレートとビューの 70% エタノールにガッツを維持します。図 4図 5に示すように、明るいフィールド顕微鏡下で個々 の内臓を調べると図 6coverslips の下で 100% のグリセロールのガッツをマウントします。プラスチック製のヘラを使用して、最小限の損傷組織を優しく操作します。
注: グリセロールの高粘度圧縮によるダメージから組織を保護するのに役立ちます、組織は高倍率に最適表示できるように憩室の注意位置決めできます。 - 顕微鏡顕微鏡特定のイメージ キャプチャ ソフトウェア (資材表) を使用してイメージをキャプチャし、一般的な画像編集ソフトウェアに Tiff イメージとしてエクスポートします。実験的治療の相対的な染色の違いを定量化するには、汎用画像解析ソフト (材料表) をダウンロードします。解析ソフトウェア内の画像を開き、染色のピクセル強度を測定し、染色のヒストグラム ・ プロットを計算するソフトウェアの手順を使用します。
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Representative Results
測定および RNA プローブの質の評価、染色を開始する前に重要です。In vitro転写効率量と DNA のテンプレートの質に大きく依存します。我々 は日常的に純度と転写反応によって生成されたプローブの量を確認するホルムアルデヒドのゲルの RNA プローブを可視化。プローブは、明るい、離散バンド (図 2) として表示されます。RNA 濃度の吸光光度測定では、ゲルのバンドの出現とよく高いプローブの品質の指標と相関があった。したがって、プロトコルに精通していることができた後ゲル可視化手順を省略可能性があります。どちらにしても、プローブの堅牢性に依存するすべての後工程として、高品質の十分な RNA が生成されることを確認することが重要です。
この方法の長所は、バクテリア、ダニ フィードとして時間の経過とともに細菌の豊かさと種全体の組織内での局在の変化の有無を含めダニ細菌についての広範な観察を容易にです。染色の量と分布にいくつかのバリエーション、生物的複製の間でだけでなく、個々 の内臓 (図 3) の憩室の 7 ペアのうち通常したがって、1 つの平均のアイデアを得るための条件、少なくとも 5 つのガッツを染色する最適です。染色パターン。プロトコルの全体的な成功が最高の条件ごとにセンスとアンチセンス サンプル染色を比較することによって正確に測る。感覚のサンプルは、分析のこのタイプの重要なマイナス コントロールがない紫の色 (図 4) を最小限に抑えて必要です。逆に、強度が対象となっている特定の細菌転写の豊富さによって異なります、最小限の背景を持つ堅牢な染色アンチセンスのサンプルが表示されます。また、組織内の染色パターンはこれらのパラメーターによって異なります。重要なは、これらのサンプルは、並列で処理される必要がありますので、それらを直接比較することができるために時間の同量のため、センスとアンチセンス サンプルを開発されなければなりません。呈色反応乱開発は、染色、意味サンプルがアンチセンス (図 5) のようにして開始の背景の高額になります。特定注意が必要プロトコルのこのステップで、overstaining を避けるために、一度発生するとそれに反応を逆にする方法はありません。
すべての内臓は完全にすべての段階各試薬に浸漬されていることを確認することが重要試薬に不均一な露出のサンプルの間で変動の増加可能性があります。量時間の結果に重要な影響を持って勇気を収集する前に目盛が供給されることも。タテツツガムシまたはのみ 24 時間供給されたタイマー刻み; で動作するように困難であったガッツより簡単に破損しても、染色されませんでした (図 6) をよくし、この時点でこの方法の制限です。48-72 時間後の時点から 24 時間内臓を供給するタイマー刻みからガッツと比較されたときこれらの内臓の大きいサイズのために、使用する最も簡単なを供給するダニも後の段階 o 中細菌負荷の増加のため、24 h 給電のダニより染色f を供給します。72 h 組織頻繁血から、茶色の色合いの微妙な背景があったが、色合い (図 4) をはっきりと見える紫の染色だった。ガッツは最高 (5 倍や 10 倍) 明視野顕微鏡を使用して全体の組織全体にわたる染色パターンを表示することができる低倍率で表示されます。石油目的 X 63 と高倍率を全取り付ける組織を表示目的スライドに対してプレスし、圧縮サンプルの厚さによる組織、組織の損傷のリスクを実行します。高解像度の画像が必要な場合ティッシュの可能性を検討すべき。
図 1.プローブの生成のためのテンプレートの準備のスケマティック。T7 および Sp6 のプロモーターを含むベクターにクローニング TA に 16S rRNA 増幅を複製します。サイト、またはb T7 または Sp6 のプロモーターを使用してそれぞれの意味やアンチセンス プローブを生成する生体外のトランスクリプションのために切断する制限酵素を使用して、構成をリニア化します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.ゲル電気泳動による RNA プローブの可視化します。RNA プローブ (~ 700 ng) ホルムアルデヒドの agarose のゲル、UV 光の下で可視化し、イメージング システム商業ゲルを使ってイメージ化に electrophoresed いた。代表的な良質、レーン 1;・質の悪い RNA プローブ、レーン 2。
図 3.その場で全部マウント 48 h 給電内臓の交配の代表的な概要。タイマー刻みからガッツ供給アンチセンス RNA で保存された 16S リボソーム RNA 配列に相補的な染色 48 h 腸憩室の差動汚損を示しています。スケール バーを表します 200 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.成功の代表的なイメージの全体はイクソデススカプラリス根性での in situハイブリダイゼーションをマウントします。タイマー刻み時間の指定された量の供給からガッツはどちらの意味 (マイナス コントロール) を使用して染色されたまたはアンチセンス RNA プローブします。アンチセンス プローブされた保存された 16S リボソーム RNA シーケンス (ユニバーサル 16S) または (とおり) 特定細菌属に固有 16S RNA シーケンスに補足。腸球菌は、48 h スケール バー表す 140 μ m. で堅牢な染色を降伏していないこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5.非特異染色につながる長時間発色反応。48 時間飼育タイマー刻みからガッツいた感覚 RNA プローブまたは保存された 16S RNA 配列に相補的なアンチセンス プローブとプローブ。反応を停止する前に組織アルカリホスファターゼ基質 BM 紫 4 ° C で一晩放置、約 4 時間室温でし。スケール バーを表す 140 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6.全体マウントの in situハイブリダイゼーションを使用してタテツツガムシか 24 時間供給目盛り内臓。未吸血または 24 h 給電のタイマー刻みから内臓感覚 RNA プローブを用いた染色またはアンチセンス プローブ保存 16S RNA シーケンスまたは属に固有のシーケンスに補足リケッチア。アンチセンスのサンプルで染色後時点での観測より堅牢性の低いですが、勇気もより簡単に破損しています。スケール バーを表す 60 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | 最終濃度 | 最終 pH | ストレージ ・ ノート |
| MEMFA | 0.1 M モップ | - | 部屋の温度 |
| 2 mM グリコールエーテルジアミン四酢酸 | |||
| 1 mM 硫酸マグネシウム | |||
| 3.7% のホルムアルデヒド | |||
| PBS トゥイーン (PTw) | 1x PBS、0.1% Tween 20 | 7.0 | 部屋の温度 |
| 0.1% Tween 20 | |||
| トリエタノールアミン バッファー | 1x PBS | 7.0 8.0 | 部屋の温度 |
| 0.1 M トリエタノールアミン | |||
| 交配バッファー | 50% ホルムアミド | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 mg/mL トルラ RNA | |||
| 100 μ g/mL のヘパリン | |||
| Denhart のソリューション x 1 | |||
| 0.1% Tween 20 | |||
| 0.1% チャップス | |||
| 10 mM EDTA | |||
| マレイン酸バッファー (MAB) | 100 mM マレイン酸 | 7.0 | 部屋の温度 |
| 塩化ナトリウム 150 mM | |||
| アルカリフォスファターゼ (AP) バッファー | 100 mM トリス | 9.5 | -20 ° C |
| 50 mM の塩化マグネシウム | |||
| 塩化ナトリウム 100 mM | |||
| 0.1% Tween 20 | |||
| 5 mM levamisol | |||
| 漂白剤溶液 | 1% 過酸化水素 | - | 新鮮な準備します。 |
| 5% ホルムアミド | |||
| 0.5 x SSC |
表 1。プロトコルで使用される解決のレシピ。
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Discussion
これは病原体の節足動物ベクトルの微生物叢を勉強する全体マウントの in situハイブリダイゼーション (WMISH) 技術の最初の使用。我々 のプロトコルは、カエル胚25,26、ショウジョウバエの研究に使われたから適応されました。全体マウント RNAの in situハイブリダイゼーションは、日常的に空間的の遺伝子の転写をローカライズに使用されている、一時的27と成績証明書の可視化することができる明るいフィールドまたは蛍光顕微鏡による。ティック腸内微生物叢の検出に向けて前者を採用しました。全体ダニの頭部が定着剤とハイブリダイゼーション溶液の浸透は成功しなかったように削除されましたを用いた全体マウントの in situハイブリダイゼーションを実行しようとするに注意してくださいすることが重要です。ここで説明されているプロトコルは、切り裂かれた根性を利用して、23中腸内細菌の植民地化の特定のダニのタンパク質の効果を研究する実装されています。WMISH から得られる情報は免疫組織化学的に匹敵するが興味の蛋白質または蛋白質および遺伝子に抗体の生成を必要としないという利点があります。ゲノム情報は、WMISH の試薬を生成するのに十分です。WMISH と魚 (蛍光 in situ ハイブリダイゼーション) は、遺伝子発現を検出できます。ただし、酵素と発色に基づくアッセイをあることに起因 WMISH 利点がある、発色は積極的に監視することができますと反応は所望信号まで進行させて感度を達成しました。オートメーションに完全に従う義務がある、高スループット形式に拡張が容易です。魚や免疫組織化学と違って断面は必要ありません。魚 WMISH の欠点はのみ 2 つの異なる Mrna または遺伝子同時に対処することができます、ジゴキシゲニン UTP とフルオレスセイン UTP28など異なるヌクレオチド アナログ プローブがラベルを付けることが必要になります。魚、6 異なる Mrna まで調べることができます 1 つの試金29。両測定法には、匹敵する時間が必要ですが、蛍光染料のコストは chromogenic 基板よりも高くなっています。魚の試金必要も蛍光顕微鏡画像可視化のための光顕微鏡 WMISH 画像の表示を実行できます。
プロトコルが密接の続いていることが重要です。ただし、特に注意が必要ないくつかの手順があります。組織を損傷することがなく目盛りから腸の解剖には、いくつかの器用さが必要です。それは、解剖の練習し、能力を得るために余分なダニを収集するが賢明かもしれません。個々 の内臓 (図 3) の異なる憩室で染色の不均一性による細菌の豊かさの決定的な証拠を取得する各腸の憩室をすべてを調べることが重要です。また、プレゼンス、空間分布と異なる憩室内にある特定の細菌の豊かさに決定的な情報を得るために各実験条件のいくつかガッツ (少なくとも 5) を処理することが重要です。質の高い RNA プローブの生産は効果的な組織染色も欠かせません。また、そのアンチセンスを確保するためのクローニング ベクトルにプローブ テンプレートの順序を確認することが重要だし、意味プローブは適切に生成されます。生産的な生体外のトランスクリプション反作用は必要十分なテンプレート DNA;最低 100 ng を使用可能性があります、しかし、0.5 ~ 1 μ g は推奨プローブの最適生成のため。
サンプル バスケットとこのプロトコルで 24 ウェル プレートの使用は、染色のプロセス中に被害を最小にするすべての洗浄段階で組織の直接的な操作を回避できます。ただし、サンプルは、まだ時折紛失、または破損しました。または 24 時間給電未吸血マダニから内臓特にを参照してくださいすることは困難とサンプル バスケットから長期貯蔵容器へ移すときを失いやすい。これらのサンプルを処理しながら追加注意する必要があります。この制限のため主に 48 および 72 h 供給目盛り根性を使用しました。(72 時間以上) これらの時間ポイントで内臓の血液の食事の大規模な量の存在は染色や血液の食事から非固有バック グラウンドによる可視化と干渉し、この手法の限界について述べる。蛍光標識プローブを使用可能性がありますこの問題を回避する可能性が高いです。
汚損プロシージャの最も重要な側面は、堅牢な染色と低バック グラウンド信号のバランスを確立することです。理想的な色の開発のタイミングは、実験条件によって異なります。したがって、部屋の温度とモニター発色約 30 分毎に色の反応を実行することをお勧めします。反応は、カラー開発を遅らせるための 4 ° C で一晩処理もセットアップ可能性があります。ただし、長い間進むこの反応しないように非常に重要です。染色の反応は、サンプルは解剖顕微鏡で調べる必要がありますので、目で監視することは困難ことができます。紫色の濃淡がサンプル プローブ センス RNA は、最小限の色を保持する必要がありますと、アンチセンス rna プローブのサンプルに表示されます。センス RNA プローブ サンプルは鮮やかな染色する場合、トラブルシューティング手順 BM purple とインキュベーション時間の短縮とブロックの時間を増やすことで始めます。時々 意味プローブは、アンチセンス プローブ; に比べて異常に高い背景を引き起こす可能性これらの場合、遺伝子の異なった地域は RNA プローブを生成するために考慮される必要があります。ある特定のサンプルに表されていない DNA シーケンスはまた陰性コントロール プローブを生成するテンプレートと思われます。たとえば、目盛りゲノムまたはそのマイクロバイに表されていない緑の蛍光蛋白質の地域を符号化 DNA テンプレートを利用できます。
この技法の制限の 1 つは分析は大きく質的;ただし、各サンプルの染色の信号の量を測定する画像解析ソフト (資材表) を使用可能性があります。これは異なる実験条件下で様々 な菌種の豊かさの半定量的な比較をできるようになります。これは時間のかかるプロトコルを完了する 3-4 日かかりますが、骨の折れる; です。各日の実践時間は平均約 3-5 時間です。ただし、サンプル バスケットとホルダーの使用と並行して多くのサンプルを処理する能力は、高いスループット分析のためことができます。市販の楽器を使用してこのプロセスを自動化することができますさらに、(材料表)かどうか、このプロトコルは、不可欠であり、ルーチン コンポーネントを使用して、研究所の市販をされる予定ですさらにオートメーション互換プラットフォーム (材料表) は、ハンズオン時間を短縮します。
記述されていたプロトコル明視野顕微鏡を使ってイメージ化されることができる比色信号の生産を許可するワサビダイコンのプローブを使用します。私たちは、個々 のターゲット プローブのハイブリダイズした RNA を検出する発色基質 1 つを利用して、それはまたジゴキシゲニン UTP などの異なるヌクレオチド アナログ プローブのラベル化による複数のターゲットを同時に検出することが可能とフルオレスセイン UTP と異なる chromogenic 基板30。アルカリ脱燐酸化酵素結合抗体ジゴキシゲニン、フルオレセイン、2 つの手順の異なる発色反応と合わせて組織サンプルが順番に培養することができます。この手法は、31共焦点顕微鏡を用いた高解像度イメージングを容易にし並列でさまざまな色の複数のプローブを使用してのオプションを提供することがあります蛍光標識プローブの適応もあります。この手法はのみ 1 つのサンプルで一度にいくつかの微生物を評価できます。ただし、いくつかのサンプルは、ダニ細菌叢で表すことができます複数の微生物を対処するための高スループット試金で評価できます。
最後に、この手法はダニとその関連付けられている細菌間の相互作用の調査に制限ではありません。ティック ゲノム内の興味の任意の遺伝子に相補的なプローブを生成され、豊かさと異なったティッシュの特定の遺伝子の局在を調べるために使用可能性があります。ダニの唾液腺を処理し、腸に同様に分析できます。全体的にみて、この手法では、関心の他の節足動物媒介内微生物群集の動態に関する研究への適応の広範な可能性があります。
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Disclosures
著者はある利益相反を開示します。
Acknowledgments
彼の実験室のリソースの使用を提供する私たち心から感謝博士ムスタファ ・ Khokha、エール大学。優れたテクニカル サポートに呉明傑氏に感謝しております。EF は HHMI 捜査官です。この作品は、ジョン ・ Monsky、ジェニファー ヴァイス Monsky ライム病研究基金からの贈り物によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
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