Summary
여기, 우리는 공간 및 일시적으로 틱 용기 수정된 전체 마운트 제자리 교 잡 방법을 사용 하 여 가능한 microbiota의 존재를 평가 하기 위해 프로토콜을 제시.
Abstract
Arthropod 벡터 전송한 전염병 전세계 인간의 건강에 중요 한 위협 계속. 그들은 벡터; 식민지 때 이러한 질병을 일으키는 병원 균 격리에 존재 하지 않는 오히려, 그들은 가능성이 창 자 루멘에 상주 미생물과 상호 작용에 관여. 벡터 microbiota 여러 벡터 품 어진 질병을 위한 병원 체 전송에 중요 한 역할을 증명 되었습니다. 보렐 리아 burgdorferi 를 포함 하 여 여러 가지 인간 병원 체의 벡터 Ixodes scapularis 진드기의 용기에 거주 박테리아 틱 전송 병원 체의 영향 여부는 결정 되지 않습니다. 특성화 틱 용기에 잠재적인 interspecies 상호 작용의 더 나은 이해를 촉진 하기 위하여 틱 용기와 관련 된 박테리아의 구성에 대 한 방법을 요구 합니다. 제자리에 전체-마운트를 사용 하 여 특정 세균 종족과 관련 된 RNA 사본 시각화 하 교 잡 풍부에 관한 질적 데이터의 수집과 microbiota 그대로 조직에의 분포에 대 한 수 있습니다. 이 기술은 틱 먹이의 과정을 통해 본질적인 microbiota 환경에 변화를 검사 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 틱 유전자의 표현 분석에 적용 될 수 있습니다. 3 차원 개조를 위한 필요 없이 조직에 대상 RNA의 총 공간 분포에 대 한 수익률 정보를 내장 전체 눈금의 얼룩이 지 고 덜 자주 confounds 시퀀싱 기반 환경 오염에 의해 영향을 자주 복잡 한 미생물 지역 사회를 공부 하는 데 사용 하는 방법. 전반적으로,이 기술은 벡터-병원 체-microbiota 상호 작용 및 질병 전송에 있는 그들의 역할을 이해 하는 더 나은 하는 데 사용할 수 있는 유용한 도구입니다.
Introduction
Arthropod 벡터에 의해 전송 하는 인간과 가축 병원 체 전세계 발견 된다1, 하지만 효과적인 세계적으로 전염 성 질환의 약 20% 차지 하 고이 병원 균의 대부분에 대 한 안전한 백신은 사용할 수 없습니다. 공생, 공생 그리고 병원 성 미생물, 미생물2, 변조 및 형성 하는 거의 모든 metazoans3 의 상태에서 통칭의 중요 한 역할에 대 한 우리의 이해를 확대 하고있다. 그것은 이제 분명 병원 체의 arthropod 벡터는 또한 본질적인 microbiota 항구 및 이러한 벡터 관련 microbiota 다양 한 벡터 매개로 병원 균4,5에 영향을 보여왔다. Arthropod 미생물 eubacteria, archaea, 바이러스 및 원생 동물, 선 충, 곰 팡이6등 진 핵 미생물의 구성 됩니다. 그러나, 주된 연구 초점에 왔다 eubacteria 인해, 부분적으로, 마커 유전자와 특정 세균 회원을 식별 하기 위해 참조 데이터베이스의 가용성에.
Ixodes scapularis, 보렐 리아 burgdorferi7, 을 포함 한 여러 인간 병원 체의 진드기 벡터에 초점을 맞춘 Lyme 질병의 원인이 되는 대리인의 미생물 시각화 기술 최적화 겨냥 했다 벡터-병원 체 상호 작용의 맥락에서 틱 본질적인 microbiota의 우리의 이해를 향상. 틱 미생물 분야에 답변을 몇 가지 질문에 남아 있다. 용기는 진드기와 가로 옮겨진된 병원 체;의 맥락에서 들어오는 병원 체 사이 첫 번째 확장된 발생의 사이트 따라서, 벡터 본질적인 microbiota 변조 벡터-병원 체 상호 작용에서의 역할을 이해 하는 것은 의미 있는 통찰력 발표할 예정 이다. 진드기는 혈액 식사 소화, 혈액 식사 구성 요소 소요의 처리 장소8침의 독특한 모드. 창 자 루멘 겉보기 틱 피드로 혈액 식사를 포함 하는 그릇 역할 및 영양소 소화 및 동화 먹이의 몇 일 내내 찾다 후 반복 계속. 수 유 기간 동안 틱 인수 병원 균은 bloodmeal 함께 창 자 루멘을 입력 하 고 따라서 루멘 틱, 병원 체, 주민 microbiota 간의 상호 작용의 주 사이트 된다. 소화는 투입 및 Ixodid 틱 탈피를 통해 진행, 용기 구조 및 기능 변경9를 겪 습. 구성과 창 자가 박테리아의 공간 조직 변화 창 환경 콘서트에 다 것입니다. 그것은, 그러므로, 진드기, 병원 체, 본질적인 microbiota의 상호 작용을 완전히 이해 하 틱 용기에 있는 박테리아의 아키텍처를 이해 하는 것이 중요.
정기적으로 호스트 관련 microbiota를 설명 하기 위해 분자 기술을 높은 처리량 병렬 시퀀싱 전략10 증폭 하 고 세균의 16S ribosomal DNA (rDNA) 시퀀스를 사용 합니다. 이 시퀀싱 전략 포위 axenic 문화 특정 박테리아의 샘플에 표시 하는 모든 세균성 회원에 대 한 깊이 있는 설명을 제공 하는 필요. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 전략은 진실 fide 주민에서 환경 오염을 구별 하는 무 능력에 의해 혼동 됩니다. 또한, 수익률 샘플 크기가 작은 고 따라서 낮은 microbiota 특정 DNA를 포함 하는 틱 같은 평가 때 환경 오염 물질의 확대의 가능성 증가11 이며의 모호한 해석 결과 미생물 구성입니다. 특정 실행 가능한 박테리아의 시각화와 함께에서 기능적 특성, 따라서 것입니다 정의 하 고 일시적으로 그리고 공간에 진드기의 미생물을 분별 하는 중요 한. 이 목표를 향해 우리는 교 잡 제자리에 전체 산 RNA의 이용을 했다. 이 기술은 정기적으로 기관과 배아12,,1314 유전자 표현 패턴을 평가 하는 데 사용 되 고 관심의 전체 샘플에 식의 semiquantitative 분석을 허용 한다. 이 전통적인 제자리에서 교 잡 기술을 조직 단면도 활용 하 고 종종 전체 기관15식 예측 계산 어셈블리와 sectioned 물자의 광범위 한 분석을 필요로에서 다릅니다. 전체-마운트는 일반적으로 전체 유기 체12말합니다, 여기 전체 마운트 전체 용기 또는 장기를 말합니다. 틱 본질적인 microbiota의 아키텍처를 평가 하기 위해 교 잡 접근 제자리에 전체 산 RNA를 사용 하 여 장점은 가지각색입니다. 틱 용기 diverticula의 7 쌍 각 쌍 크기16에 다양 한 구성 되어 있습니다. 기능적 차이 하나이 diverticula 중 틱 생물학의 맥락에서 이해 되지 않는다 경우 틱 microbiota 또는 틱-병원 체 상호 작용. 용기 diverticula 파열 용기의 조작 microbiota 창 자 루멘 또는 느슨하게와 관련 된 본질적인 microbiota 공간 지 방화의 오해에 결과 치환 것 이다. 형광 표시 된 RNA 제자리에서 하이브리드는 이전 틱 용기 증명서17 고정 하 고 개별 용기 diverticula 프로브 교 잡 보장 B. burgdorferi 지역화 하 고 개방 하 여 검사 이용 되어 단면 전체 틱 파라핀 포함18녹취 록. 이러한 두 방법 모두 본질적인 microbiota 아키텍처에 영향을 미칠 것 이라고 교 잡 이전 틱 조직의 조작이 필요로 합니다.
이 보고서에서 우리가 자세히 설명 가능한 틱 본질적인 microbiota 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH)를 사용 하 여 검사 하는 프로토콜. 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡의 사용 존재의 세계 이해 및 소화 관의 다른 지역에서 특정 창 자가 박테리아의 풍부 및 틱 용기 생물학 병원 체 식민의 맥락에서 새로운 통찰력을 박차 수 있습니다. 그리고 전송입니다. 또한, RNA 프로브 특정 세균 RNA에 대 한 감독의 사용 틱 용기에 실행 가능한 박테리아의 수 있습니다.
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Protocol
1입니다. DNA 템플렛 준비
- 다운로드 16S rRNA 순서 특정 세균 장군 각 하는 NCBI 데이터베이스 디자인과 연쇄 반응 (PCR) 호환에서 앞으로 역 앞에서 설명한 대로 속 특정 영역 (200 ~ 250 기본 쌍 롱)를 증폭 뇌관 19. 또한 리소스를 참조 오픈 소스 데이터베이스 실바20,21 , probeBase22 온라인 rRNA 타겟 oligonucleotide 조사 및 뇌관, RNA 프로브 일부 세균 속에 대 한 상업적으로 있을 수 있습니다 사용할 수 있습니다.
참고: 특정 특정 속 유전자 영역을 선택 하 여 설계 된 뇌관 관련된 세균 속을 증폭 하지 않습니다 확인 중요 하다. 이것은 교 잡 유전자/장군 전용 프로브를 중요입니다. - 마우스에 24, 48 또는 72 h 틱 용기를 해 부하 고 RNA와 기술된 이전23으로 틱 용기에서 cDNA 준비 진드기 피드. PCR 템플릿으로 사용 cDNA 증폭 속 특정 amplicons thermocycler는을 사용 하 여. 1.5 %agarose 젤에 PCR-제품/amplicon의 약 수를 실행 하 고는 amplicon 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 자외선 (UV) 빛에서 시각화 하 여 예상 되는 크기에 해당 함을 확인 합니다.
- 살 균 소 polymerases (SP6, T7 또는 T3)에 대 한 적합 한 RNA 중 합 효소 발기인을 포함 하는 상용 따 벡터 (자료 테이블)에 박테리아 16S ribosomal RNA amplicon의 클론. 시퀀스는 amplicon의 정체성과 발기인의 각각에 관하여 클론의 방향을 확인 하 클론. 이에 따라, 감각 또는 센스 RNA를 생성 하는 선택의 발기인 프로브 (그림 1)을 결정 합니다.
- 1 mg 최대 30 µLfor 제조업체에서 권장 하는 온도에서 2 h 양의 반응에 적절 한 제한 효소로 플라스 미드의 선형화 제한 효소 감 또는 센스 프로브 (그림 1)을 생성 하기 위해 사용 됩니다 발기인에 따라 선택 합니다. 1 %agarose 젤에 다이제스트 반응의 2 µ L의 시각화 하 여 선형화를 확인 합니다.
- 상업적으로 이용 가능한 PCR 제품 열 정화 키트를 사용 하 여 소화 DNA의 나머지 28 µ L를 정화 하 고 분 광 광도 계에 의해 DNA 농도 계량.
참고: 일부 감각 프로브 배경 해당 센스 프로브 보다 훨씬 높은 얼룩이 발생할 수 있습니다 그리고 다른 옵션을 탐험 할 수 있습니다. 대체 부정적인 컨트롤 샘플 또는 교 잡의 독특한 패턴을 생성 하는 다른 검색에 나타나지 하는 시퀀스를 인코딩 하는 플라스 미드를 포함 됩니다.
2. 건설 Digoxygenin UTP RNA의 프로브
- 100 mM UTP, UTP-10 m m digoxygenin의 25 µ L 및 10 µ L 각 100 m m ATP와 GTP, CTP 1.5 mL 원심 분리기 튜브에서의 7.5 µ L를 결합 하 여 뉴클레오티드 혼합을 준비 합니다.
- 녹음 방송 생체 외에서 수행 상용 T7 또는 Sp6 RNA 중 합 효소 키트를 사용 하 여, 1 µ L의 뉴클레오티드 혼합 (단계 2.1)를 사용 하 여 0.25-1 µ g 템플릿 DNA의. 물으로 20 µ L까지 볼륨을 가져와. 결합 하 고 스핀을 펄스 튜브를 터치 합니다. 2.5-3 h 37 ° C에서 품 어.
참고: 프로브 건설 소화 플라스 미드 농도 7 ng / µ L, 낮은 하지만 전형적인 농도 15-25 ng / µ L에서이 단계에서 성공 했다. 녹음 방송 반응 또한 37 ° C에서 하룻밤 incubated 수 있습니다 하지만이 RNA 생산량을 크게 증가 하지 않습니다. - 1 µ L의 DNase 추가 (2, 000 단위 / µ L)와 10 분 동안 37 ° C에서 품 어. 10 분을 초과 하지 마십시오 또는 효소 RNA 타락을 시작할 수 있습니다.
- 얼음 처럼 차가운 7.5-8 M 리튬 염화의 30 µ L 냉장 nuclease 무료 물에 RNA 침전을 30 µ L를 추가 합니다. 믹스에 튜브를 터치 합니다. -20 ° c.에 하룻밤 사이 진행 하는 RNA의 강 수를 허용
- 4 ° c.에 20 분 동안 17000 x g에서 원심 분리 하 여 RNA를 수집 한번 Diethyl pyrocarbonate (DEPC) 물에서 갓된 75% 에탄올의 1 mL와 펠 릿을 세척 한 다음 원심 분리를 반복 합니다.
- 제거 하 고 삭제는 상쾌한, 깨끗 한 종이 타월에 튜브를 반전 10 분 Resuspend nuclease 무료 물 속에서 펠 릿에 대 한 건조 허용. 쉽게 볼 수 있는 펠 릿 이면 25 µ L에서 resuspend. 펠 릿 매우 작은 또는 표시 되지 않는 경우에 15-20 µ L. resuspend 분 광 광도 계에 의해 RNA 농도의 견적을 얻을.
참고: 일반적인 RNA 농도 범위 200-500 ng / µ L에서.
3. 시각화 RNA의 RNA의 순도 평가 하기 위해 포름알데히드 RNA 젤 전기 이동 법에 의해 조사
주의: 포름알데히드 포즈 흡입 위험; 따라서, 증기 두건에서 RNA 젤 분석에 필요한 솔루션을 생성 합니다. Ethidium 평범한 사람은 의심된 발암 물질; 관심을가지고 처리 합니다.
- 앞서 설명한24 고 캐스팅 RNases의 무료 젤 상자에서 젤 1% 포름알데히드 agarose 젤을 준비 합니다. 일단, 젤 상자를 버퍼 (1 x MOPS pH 7.0, 5% 포름알데히드에서)를 실행 하는 x 1을 채우십시오.
- (5 µ L 400 mg/mL ethidium 평범한 사람, MOPS, 35 µ L 포름알데히드, 및 100 µ L formamide x 20 µ L 10) 샘플 버퍼를 준비 합니다. 샘플 버퍼의 8 µ L에 2 µ L RNA 프로브 (단계 2.6)의 결합. 10 분 동안 70 ° C에서 품 어.
- 5 mL 50% 글리세롤, 1 mL 10% 포름알데히드, 40 mg bromophenol 블루, 40 mg 자일 렌 cyanol, 0.5 M EDTA (pH 7.5)의 20 µ L를 결합 하 여 RNA 선적 버퍼를 준비 합니다. 사용 후-20 ° c.에이 버퍼 저장
- 3.2 단계에서에서 RNA 샘플을 로딩 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 섞으십시오. 얼음에 샘플 튜브를 유지.
- 젤으로 단계 3.4에서 전체 샘플 볼륨을 로드 합니다. RNA의 크기를 확인 하려면 함께 단일 가닥 RNA 사다리의 약 수를 로드 합니다. 100 V에서 젤을 실행 하거나 파란색 염료 마이그레이션합니다 젤 아래에 있는 방법의 약 75% 될 때까지. 자외선 젤 이미징 시스템을 사용 하 여에서 RNA를 시각화 한다.
참고: 좋은 품질 RNA 프로브 프로브 (그림 2, 1 레인)의 예상된 크기에 이동성 이산 대역으로 나타나야 합니다. 경우 조사 무마 하 고 더럽혀진 밴드 (그림 22 차선)이 사용할 수 없는 나타납니다.
4. 틱 용기 수집 및 고정
- 관심의 시간 포인트 마우스에 먹이 Ixodes scapularis 님프를 수집 합니다.
참고:이 기술을 위해 틱 먹이 48 또는 72 h 일을 위한 최고의. - 해 부 현미경, 가능 한 한 많은 기관에 손상을 피하는 유리 슬라이드에 MEMFA (표 1)에 틱에서 용기를 해 부. MEMFA의 20-30 µ L에서 깨끗 한 현미경 슬라이드에 진드기를 놓습니다. 진드기의 시체를 떠나 틱의 연골에서 살 균 높은 탄소 철강 면도기 블레이드 #11 조각 머리 지역의 쌍을 사용 하 여. 부드럽게 용기 diverticula 및 침 샘 몸 표 피 밖으로 시체를 누릅니다. 침 샘 및 용기 고 면도날에 용기를 꺼내서 합니다.
- 500 µ L MEMFA를 포함 하는 1.5 mL 튜브에 배 짱을 수집 합니다. 부드러운 락을 1 시간으로 실내 온도에 튜브를 품 어 또는 4 ° c.에서 하룻밤
참고: 진드기 침 샘 수 있습니다 또한 해 부와 마찬가지로 고정 되며 스테인드. - 부드럽게 1 mL 얼음 100% 에탄올으로 3 회 세척 하 여 조직을 탈수. 하자 각 씻어 사이의 튜브의 아래쪽에 자연스럽 게 침 몰 하는 배 짱으로 원심 분리는 조직 손상 될 수 있습니다. 장기 저장에 대 한 샘플에서에서 계속 100% 에탄올-20 ° c.
5. 건설의 메쉬 샘플 바구니와 24-잘 바구니 홀더
- 바닥 2 mL 또는 5 mL 메스에 온수는 단일 양 날 면도날을 사용 하 여 스냅인 가기 원심 분리기 튜브를 잘라.
주의: 블레이드의 컷이 완료 되기 전에 여러 번 재가 열 될 필요가 있습니다. - 새로운 튜브 오프닝 보다 약간 더 큰 110 µ m 나일론 메시의 사각형 컷. 눌러 그들 함께 가볍게 뜨거운 접시에 매체 낮은 열에 좋은 물개 때까지 튜브의 하단에 메쉬를 본드. 식, 메쉬 튜브 사이의 틈새가 없는지 확인 하 고 초과 메쉬 가장자리 주위를 잘라.
- 잘라 구멍 24-잘 접시의 표지에는 단계 5.2에서 만든 샘플 바구니의 입술은 구멍에 앉아 되지가을 통해, 저조한 때 그들은에 배치 됩니다 샘플 바구니의 바닥 줄곧 우물에서에서 앉을 것 이다 설정 합니다 덮개에 있는 구멍.
- 이 장착된 바구니 홀더를 사용 하 여 상대적으로 쉽게에 제자리 교 잡 프로토콜의 전체에 대 한 다른 한 접시에서 바구니를 전송. 2 개의 24-잘 접시를 사용 하 여 한 부 화 수행 하는 동안 다른 접시 다음 세척에 대 한 준비가 되어 있도록.
6. 제자리에서 교 잡: 하루 1 (타이밍: 4-5 h)
- 전송 용기를 샘플 바구니를 분류, 실험 조건으로 구분 하며 RNA 프로브.
참고: 조건 복제 중 자연 변화에 대 한 계정 당 최소 5 배 짱 얼룩. - 부드럽게 점차적으로 0.1% 비 이온 계면 활성 제 (PTw;와 인산 염 버퍼 염 분의 비율을 증가 시켜 조직에 기포를 소개 하지 않으려면 샘플 리하이드레이션 표 1) 세척에서의 에탄올
참고: 별도로 명시 하지 않는 한 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 모든 세척 완료. 각 바구니에 용기가 완전히 빠져들 것 같은 소유자의 각 잘으로 세척 솔루션의 aliquot 500-600 µ L. DEPC 처리 물 RNA 저하를 방지 하기 위해 모든 솔루션을 준비 합니다.- 500 µ L 100% 에탄올에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오.
- 75%의 샘플 바구니 당 적어도 500 µ L를 준비, 50% 및 25% 에탄올 PTw. 가장 낮은 가장 높은 에탄올 농도에서 이동 각 에탄올 용액에 5 분 동안 세척 하 여 샘플을 Rehydrate.
- PTw에 4 시간 5 분 대 한 샘플을 씻으십시오.
- 가수분해 k 샘플 permeabilize (10 µ g/mL) 5 분 PTw에.
- RNA 프로브와 교 잡 조직 준비.
- 6.2 500 µ L triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0)에서 각 5 분 부드러운 동요와 주위 온도에 24-잘 바구니 홀더 아민 없는 환경에서 샘플을 유지 하기 위해 (표 1)에 설명 된 대로 두 번 샘플을 씻으십시오.
- Triethanolamine 버퍼 (0.1 m M, pH 7.0-8.0) 각, 5 분 동안에 500 µ L 0.25%의 아세트산 무수 물으로 두 번 샘플 처리 후 샘플 PTw 5 분에 두 번 세척.
참고: 아세트산 무수 물 acetylates 프로브를 mRNA의 특정 바인딩 일반적인 정전기 상호 작용을 방지 하는 중요 한 포지티브 차지 무력화 무료 아민. - PTw에 500 µ L 4 %paraformaldehyde 20 분에 대 한 용기를 수정 후 5 분 동안 PTw에 5 번을 씻어.
- 500 µ L 교 잡 버퍼 /in 떨고 물 욕조에 부드러운 동요와 60 ° C에서 1.5-2.5 h 24 잘 플레이트 (표 1)에 24-잘 바구니 홀더에에서 샘플을 배양 하 여 prehybridize. 주 2 프로토콜 (단계 7.1)에 재사용 prehybridization 단계에 사용 되는 교 잡 버퍼를 저장 합니다.
- 1 µ g/mL의 최종 농도에 교 잡 버퍼에서 RNA 프로브를 diluting 하 여 프로브 교 잡 솔루션을 준비 합니다. 솔루션과 프로브 교 잡에 60 ° C에서 24-잘 바구니 홀더 떨고 물 목욕 (표 2)에서 하룻밤 부드러운 동요와 함께 샘플을 품 어. 하이브리드 솔루션의 증발을 방지 하기 위해 알루미늄 호 일을 가진 석판 바구니 홀더를 들고 접시 커버.
7. 제자리에서 교 잡: 하루 2 (타이밍: 4.5-5.5 h)
- 프로브 교 잡 솔루션에서 샘플을 제거 하 고 전날에서 예약된 교 잡 버퍼에 그들을 배치. 3 분에 대 한 부드러운 동요와 60 ° C에서 품 어.
참고: 프로브 솔루션 저장 될 수 있습니다 다시-20 ° C에서 최대 3 번 교 잡. - Diluting 20 염 분 나트륨 구 연산 염 버퍼 (SSC) x 2를 준비 DEPC 처리 물 (표 1)에서 x SSC. 샘플 두 번 SSC, x 2와 3 분 후 3 번 2 20 분 동안 씻어 프로브와 교 잡 버퍼의 모든 흔적을 제거 하려면 60 ° C에서 x SSC.
- RNase A (20 µ g/mL)와 RNase T 치료 단일 제거를 37 ° C에서 30 분 동안 SSC 좌초 RNA 프로브 무료 대표 2 x에서1 (10 µ g/mL) 비-때 교배 RNA.
- 2와 함께 한 번 세척 실 온에서 10 분 동안 x SSC. 0.2 준비 diluting 2 x SSC x SSC DEPC 처리 물에 다음 0.2로 두 번 씻어 제거 초과 RNases를 60 ° C에서 30 분 동안 x SSC.
- 두 번의 maleic 산 버퍼 (MAB; 500 µ L로 씻어 표 1) 10 분 각각에 대 한
- 차단 솔루션 (2% 차단 시 약에서 MAB) 1.5-2 h와 함께 샘플을 품 어.
참고: 차단 시 수 분해; 부드러운 난방 해산 에이즈. - 안티 digoxigenin 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활용 500 µ L 차단 솔루션 1:3,000 희석에 항 체의와 차단 솔루션을 장착 하 고 약 4 시간 실내 온도에 또는 4 ° C에서 밤새 품 어.
8. 현장에서 교 잡: 3 일 (타이밍: 하룻밤에 6 h)
- 5 번 이상 각 500 µ L 초과 항 체를 제거 하는 MAB와 30 분 대 한 샘플을 씻으십시오.
참고: 이러한 세척은 유연 하며 1-2 h, 연장 될 수 있습니다 또는 3-4 세척 효능에 최소한의 영향으로 4 ° C에서 한 하룻밤 세척에 대 한 대체 될 수 있습니다. - 알칼리 성 인산 가수분해 효소 버퍼, pH 9.5 (AP 버퍼; 5 분 동안 두 번 씻어 표 1)입니다.
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (자료 테이블)에 대 한 비 기판의 500 µ L를 마지막 세척을 대체 하 여 발 색 반응을 시작 합니다. 알루미늄 호 일 샘플 접시를 커버 하 고 3-5 h 또는 4 ° c.에 하룻밤 실 온에서 진행 하는 얼룩 착 색 반응을 주기적으로 보고 모니터링할 overstaining 피하려고 해 현미경 조직.
참고: 완료 되는 얼룩, 자주색 색조 antisense 조사 샘플, 현미경에서 눈으로 감지 하지만 매우 어두운 될 조직 수 없다는. 얼룩이 4 ° C에서 매우 느리게 진행 하 고 20-24 h까지 걸릴 수 있습니다. - 500 µ L MAB, 5 분 동안 세척 하 여 발 색 반응을 중지 한 후 하룻밤 Bouin의 솔루션에는 조직을 수정.
주의: 처리 연기 후드; Bouin의 솔루션 그것은 부식성 발암 물질입니다.
9. 현장에서 교 잡: 하루 4 (타이밍: 3-3.5 h)
- 적어도 7 mL 당 1의 샘플 바구니 준비 diluting 20 x SSC x SSC DEPC 처리 물에. 1에서 4 ~ 6 배 70% 에탄올과 샘플을 세척 하 여 제거 하는 Bouin의 솔루션 x SSC 조직 노란색 이상 될 때까지.
- 준비 하는 1에서 75%, 50% 및 25% 에탄올 솔루션의 샘플 바구니 당 500 µ L x SSC. 높은 에탄올 농도에서 낮은 조직 rehydrate 하 이동 각 솔루션에 5 분에 대 한 샘플을 씻으십시오. 5 분 동안 두 번 씻어 각에 1 x SSC.
- 증기 두건에서 라이트 박스에 90 분 동안 표 백제 해결책 (표 1)에서 샘플을 품 어.
참고:이 단계 샘플 또는 제거할 Bouins 솔루션에서 채색에 어떤 염색을 허용 하 고 명확한 시각화에 대 한 프로브 신호를 향상 시킵니다. - 샘플 1의 500 µ L 두 번 씻어 5 분 x SSC.
- 새로운 24-잘 접시의 우물에 샘플 바구니를 반전 하 여 최소한의 피해와 배 짱을 재배치 하 고 전송 피 펫을 사용 하 여 메쉬 바닥을 통해 70% 에탄올으로 씻어. 필요한 경우에-20 ° C에서 저장 합니다.
- 그림 3, 와 같이 여러 샘플의 얼룩 패턴에 대 한 개요를 어떤 밝은 분야 현미경으로 24 잘 플레이트 및 보기에 70% 에탄올에 용기를 유지. 그림 4, 그림 5와 같이 개별 내장 밝은 분야 현미경 검사를, 및 그림 6, coverslips에서 100% 글리세롤에 배 짱을 탑재. 플라스틱 주걱을 사용 하 여 부드럽게 조작 하는 최소한의 손상으로 조직.
참고: 글리세롤의 높은 점도 압축에 의해 조직 손상 으로부터 보호 하 고 있습니다 조직 더 높은 배율에서 최적으로 볼 수 있습니다 그런 diverticula의 주의 위치. - 현미경 현미경 특정 이미지 캡처 소프트웨어 (테이블의 재료)를 사용 하 여 이미지를 Tiff 이미지는 일반 이미지 편집 소프트웨어를 수출 합니다. 실험적 치료 상대 얼룩 차이 척도를 일반 이미지 분석 소프트웨어 (자료 테이블)를 다운로드 합니다. 분석 소프트웨어 내에서 이미지를 열고 소프트웨어 지침을 사용 하 여 픽셀은 얼룩의 강도 측정 하는 얼룩의 히스토그램 플롯을 계산 합니다.
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Representative Results
측정 및 RNA 프로브의 품질의 평가 얼룩이 지기 전에 중요 하다. 생체 외에서 전사 효율 높은 양과 DNA 템플렛의 품질에 따라 달라 집니다. 우리는 정기적으로 RNA 프로브 프로브 녹음 방송 반응에 의해 생성 된의 양과 순도 확인 하는 포름알데히드 젤에 시각. 프로브는 밝은, 개별 밴드 (그림 2)으로 표시 되어야 합니다. RNA 농도의 spectrophotometric 측정 되었고 높은 검색 품질을 나타내는 상관 젤에 악대의 외관을 잘. 따라서, 젤 시각화 단계 프로토콜 친숙 달성 되었습니다 일단 원하는 경우 누락 될 수도 있습니다. 어느 쪽이 든, 모든 다운스트림 단계 시험의 견고성에 따라 높은 품질의 충분 한 RNA 생성 되도록 중요 하다.
이 기술은의 힘은 세균성 종, 틱 피드로 시간이 지남에 따라 박테리아의 전체 조직 내의 종의 지역화 변경의 유무를 포함 하 여 틱 microbiota에 대 한 광범위 한 관찰을 용이 하 게 이다. 금액 및 유통 얼룩에 일부 유사 이므로 개별 내장 (그림 3), diverticula의 7 쌍 중 뿐만 아니라 생물 복제 중 정상, 얼룩 평균의 아이디어를 얻을 조건 당 적어도 5 배 짱 좋습니다. 얼룩 패턴. 프로토콜의 전반적인 성공은 최고의 각 조건에 대 한 감각과 antisense 샘플의 얼룩이 지를 비교 하 여 측정 됩니다. 분석의이 유형에 대 한 중요 한 부정적인 컨트롤 감각 샘플 자주색 색깔 (그림 4)에 최소한의 있어야 합니다. 반대로, 센스 샘플 강력한 얼룩 최소한의 배경으로, 강도는 특정 세균 성적 대상의 풍부에 따라 달라 집니다 표시 됩니다. 조직 내의 얼룩 패턴 또한 이러한 매개 변수에 따라 달라질 수 있습니다. 중요 한 것은, 감각과 센스 샘플 해야 합니다 개발 시간의 동일한 금액에 대 한 직접 이러한 샘플 병렬로 처리 한다 그들을 비교할 수 있을. 색 반응의 사이프러스 높은 양의 배경 얼룩, 감각 샘플 antisense (그림 5) 유사 하 시작 될 수 있습니다. 특정 해야 주의 프로토콜에서이 단계에서 overstaining을 피하기 위해 일단 발생 반응 반전 수 없습니다으로.
모든 용기 완벽 하 게 모든 단계; 각 시 약에 잠긴 ㄴ 다는 것을 확인 하는 것이 중요 샘플에서 변형 증가 시 약에 고르지 못한 노출 될 수 있습니다. 양을 시간 또한 결과에 큰 영향 있다 진드기 용기 수집 하기 전에 먹이. Unfed 또는 24 시간 동안 먹이 틱; 작동 하기 어려웠다 내장도 더 쉽게 손상 되었고 얼룩이 되지 않았다 (그림 6)을 잘 하 고이 이번에이 방법의 제한 사항입니다. 틱 48-72 h 했다 틱 나중 시간 포인트에서 24 h. 배 짱에 대 한 먹이에서 배 짱에 비해 이러한 배 짱의 큰 크기 때문에, 작동 하는 가장 쉬운 먹이 또한 증가 나중 단계 o 동안 세균성 부담으로 인해 24의 h 먹이 틱 보다 더 스테인드 f 먹이입니다. 72-h 조직은 종종 했다 혈액에서 갈색 색조의 약간의 배경 하지만 색조 (그림 4)에 명확 하 게 표시 했다 보라색 얼룩. 용기가 가장 낮은 확대 (5 X 또는 10 X) 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 얼룩 패턴을 볼 수를 볼 수 있습니다. 오일 목표 X 63와 같이 더 높은 확대, 전체 마운트 조직 보기 목표는 슬라이드에 대 한 누르고 압축 샘플의 두께 인 조직으로 조직 손상의 위험이 실행 됩니다. 높은 해상도 이미지, 필요한 경우 조직 단면에 대 한 가능성을 시험 한다.
그림 1 . 프로브 생성을 위한 서식 파일 준비의 도식. S p 6와 T7 발기인을 포함 하는 벡터를 복제 하는 TA에 16S rRNA amplicon 클론. 제한 효소를 사용 하 여 사이트 , 또는 b 시험관에 전사 Sp6 또는 T7 발기인을 사용 하 여 감지 또는 antisense 프로브를 각각 생성 하 잘라 구문 선형화 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 젤 전기 이동 법에 의해 RNA 프로브의 시각화. RNA 프로브 (~ 700 ng) 포름알데히드 agarose 젤, UV 빛에서 시각 및 상업 젤 이미징 시스템을 사용 하 여 몇 군데에 electrophoresed 했다. 대표적인 좋은 품질, 레인 1; 그리고 품질이 RNA 프로브, 레인 2.
그림 3 . 48 h 먹이 배 짱의 교 잡 제자리에 전체 산에 대 한 대표적인 개요. 틱에서 배 짱 먹이 대 한 보존된 16S ribosomal RNA 순서에 무료 antisense RNA로 얼룩진 48 h 직감 diverticula의 차동 얼룩 보여줍니다. 눈금 막대 나타냅니다 200 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 성공의 대표 이미지 전체 마운트에 제자리 교 잡 Ixodes scapularis 용기에. 내장 지정 된 시간 동안 먹이 틱에서 어느 감각 (부정적인 제어)를 사용 하 여 스테인드 했다 또는 antisense RNA 프로브. 센스 프로브 보존된 16S ribosomal RNA 순서 (범용 16) 또는 특정 특정 세균 속에 (서) 16S RNA 순서를 보완 했다. Enterococcus 48 h. 규모 바 대표 140 µ m.에 강력한 얼룩 양보를 하지 않았다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5 . 일반적인 얼룩이 지기에 장기간된 비 반응 시간 리드. 틱 48 h 동안 먹이에서 내장 감각 RNA 조사 또는 보존된 16S RNA 순서에 무료 한 센스 조사 조사 했다. 조직 반응 중지 하기 전에 알칼리 성 인산 가수분해 효소 기질 BM 4 ° C에서 하룻밤 그리고 약 4 시간 실 온에서 보라색으로 알을 품는. 스케일 바 대표 140 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6 . 제자리에 전체 산 교 잡을 사용 하 여 unfed 또는 24 시간 먹이 틱 용기. Unfed 또는 24 h 먹이 틱에서 내장 감각 RNA 프로브를 사용 하 여 스테인드 했다 또는 antisense 보존된 16S RNA 시퀀스 또는 시퀀스 속에 보완 조사 리케차. 센스 샘플에 얼룩이 덜 나중 시간 포인트에서 보다 강력한 이며 용기는 또한 더 쉽게 손상. 스케일 바 대표 60 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 최종 농도 | 최종 pH | 스토리지 노트 |
| MEMFA | 0.1 M MOPS | - | 실내 온도 |
| 2mm EGTA | |||
| 1 m m 마그네슘 황산 염 | |||
| 3.7% 포름알데히드 | |||
| PBS-트윈 (PTw) | 1 x PBS, 0.1% 트윈-20 | 7.0 | 실내 온도 |
| 0.1% Tween 20 | |||
| Triethanolamine 버퍼 | 1 x PBS | 7.0-8.0 | 실내 온도 |
| 0.1 M triethanolamine | |||
| 교 잡 버퍼 | 50% formamide | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 mg/mL Torula RNA | |||
| 100 µ g/mL 헤 파 린 | |||
| Denhart의 솔루션 x 1 | |||
| 0.1% Tween 20 | |||
| 0.1% 챕 스 | |||
| 10 mM EDTA | |||
| Maleic 산 버퍼 (MAB) | 100 mM maleic 산 | 7.0 | 실내 온도 |
| 150 m m 염화 나트륨 | |||
| 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 버퍼 | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| 50 m m 마그네슘 염화 물 | |||
| 염화 나트륨 100 m m | |||
| 0.1% Tween 20 | |||
| 5 m m levamisol | |||
| 표 백제 솔루션 | 1%의 과산화 수소 | - | 신선한 준비 |
| 5% formamide | |||
| 0.5 x SSC |
표 1입니다. 프로토콜에 사용 되는 솔루션의 조리법입니다.
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Discussion
이것은 병원 체의 arthropod 벡터의 microbiota 공부를 제자리에 전체 산 교 잡 (WMISH) 기술 처음으로 사용. 우리의 프로토콜 개발 개구리 배아25,26와 초파리 에서 공부 하는 데 사용 하나에서 적응 시켰다. 공간적 유전자 성적표를 지역화 하 전체 산 RNA 제자리에서 교 잡 일상적으로 사용 하 고 밝은 필드 또는 형광 현미경 검사 법에 의해 일시적으로27 및 증명서의 시각화 할 수 있습니다. 우리는 틱 용기에 microbiota의 검색으로 전을 채택 했습니다. 그것은 제자리에 전체 산 교 잡 머리 지역 정착 액 및 교 잡 솔루션의 침투 하지 못했습니다 수 있도록 제거 되었습니다 전체 틱을 사용 하 여 수행을 시도 하는 것이 중요. 여기에 설명 된 프로토콜 해 부 용기를 활용 하 고 midgut23에 세균성 식민지에 특정 진드기 단백질의 효과 연구를 구현 되었습니다. WMISH에서 가져온 정보 immunohistochemistry 비교 하지만 단백질 및 유전자에 항 체의 생성 또는 관심사의 단백질을 요구 하지 않기의 이점이 있다. 게놈 정보는 WMISH에 대 한 고 시 약을 생성 하기에 충분 합니다. WMISH와 생선 (형광 제자리 교 잡에서) 유전자 발현을 검색할 수 있습니다. 그러나, 효소 및 chromogen 기반 시험 되 고, 그것 때문에 WMISH 컬러 개발을 적극적으로 모니터링할 수 있습니다, 그리고 반응을 원하는 신호까지 진행을 허용 및 감도 달성 이점이 있다. 그것은 완전히 자동화 의무가 이며 높은 처리량 형식으로 쉽게 확장 가능. 물고기와 달리 immunohistochemistry, 아무 구분이 필요 합니다. 물고기를 통해 WMISH의 단점은 단지 2 다른 mRNAs 또는 유전자 동시에 해결할 수 있습니다 및 프로브 digoxigenin UTP 및 fluorescein UTP28등 다른 뉴클레오티드 유사 체로 붙일 필요. 물고기, 6 다른 mRNAs까지 수 검사 한 분석 결과29에. 두 분석 비교 시간이 필요, 형광 염료의 비용 비 기판의 그것 보다 더 높은 있습니다. 물고기 분석 또한 필요 형광 현미경 이미지 시각화를 위한 어떤 가벼운 현미경 WMISH 이미지 시각화를 수행할 수 있지만 합니다.
그것은 프로토콜 밀접 하 게; 다음은 중요 한 그러나, 특별 한 주의 필요로 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 해 부는 조직 손상 없이 진드기에서 midgut의 일부 손 재주를 요구 한다. 그것은 신중 하 게 연습 하는 해 고 능력 얻을 여분의 틱을 수집 수 있습니다. 개별 용기 (그림 3)의 다른 diverticula에 얼룩의 성분으로 인해 세균 풍부의 결정적인 증거를 파생 각 직감의 모든 diverticula 검사 중요 하다. 그것은 또한 각 실험 조건에 대 한 존재, 공간 배급, 및 다른 diverticula 내 특정 박테리아의 풍부에 결정적인 정보를 얻기 위하여 여러 내장 (5 이상)를 처리 하는 것이 중요. 높은-품질 RNA 프로브의 생산은 또한 효과적인 조직 얼룩에 중요 한. 그것은 또한 그 antisense 되도록 클로닝 벡터에 프로브 서식 파일의 순서를 확인 하는 중요 한 고 감각 프로브 적절 하 게 생성 됩니다. 생산적인 생체 외에서 녹음 방송 반응 필요 충분 한 서식 파일 DNA; 최소 100 ng를 사용할 수 있습니다, 하지만 0.5-1 µ g 최적의 프로브 생성을 위해 권장 됩니다.
샘플 바구니와 24-잘 접시가 프로토콜에서을 사용 하 여 착 색 하는 과정에서 피해를 최소화 모든 세척 단계에서 조직의 직접 조작을 방지 합니다. 그러나, 샘플은 종종 분실 또는 손상 된; unfed 또는 24 h 먹이 틱에서 용기는 특히, 잃을 때 장기 스토리지 컨테이너 샘플 바구니에서 전송 하기 쉽고 어려운 볼 수 있습니다. 이러한 샘플을 처리 하는 동안 추가 치료를 고려 해야한다. 이 제한으로 인해 주로 48 및 72 h 먹이 틱 용기 사용 했습니다. 많은 양의 혈액이 시간 포인트 (72 h 이상) 용기에 식사의 존재 얼룩 및 혈액 식사에서 일반적인 배경으로 인해 시각화를 방해 하 고 또한이 기술의 한계를 선물 한다. 그것은 가능성이 붙일 표시 된 프로브를 사용 하 여가이 문제를 우회 수 있습니다.
얼룩 절차의 가장 중요 한 측면 강력한 얼룩 및 낮은 배경 신호 사이의 균형을 확립 하는 것입니다. 이상적인 색상 개발의 타이밍은 실험 조건에 따라 달라질 수 있습니다. 따라서, 실내 온도 및 모니터 색상 개발 약 매 30 분에 발 색 반응을 수행 하기 위해 최상 이다. 반응 색상 개발 속도를 4 ° C에서 밤새 진행 설정할 수 있습니다. 그러나, 그것은 오랫동안 진행이 반응 하도록 하지 매우 중요입니다. 착 반응 해 부 현미경 샘플을 시험 한다 그래서 눈, 모니터링 하는 데 어려울 수 있습니다. 자주색 색조 샘플 조사 센스 RNA와 RNA 최소한의 색상을 유지 해야 하는 감각과 샘플 조사 하는 동안에 표시 되어야 합니다. 감각 RNA 조사 샘플 밝은 얼룩, 경우 문제 해결 단계 BM 보라색으로 부 화 시간 단축 및 차단 시간 시작 한다. 때로는 감각 프로브; 센스 프로브에 비해 anomalously 높은 백그라운드를 발생할 수 있습니다. 이러한 경우에는 유전자의 다른 지역 RNA 프로브를 생성에 대 한 고려 해야 합니다. DNA 순서는 주어진된 샘플에 나타나지 부정적인 제어 프로브를 생성 하기 위해 템플릿으로 고려할 수 있습니다. 예를 들어 DNA 템플렛 인코딩 틱 게놈 또는 그 미생물에 대표 되지 녹색 형광 단백질의 영역을 활용할 수 있습니다.
이 기술의 한 가지 한계는 분석은 크게 질적; 그러나, 이미지 분석 소프트웨어 (자료 테이블) 얼룩 신호 각 샘플에서의 양을 측정 사용 될 수 있습니다. 이 다양 한 세균성 종 다른 실험 조건에서의 풍요로 움의 반 정량적 비교가 하게된다. 이 시간이 걸리는 프로토콜을 완료 하려면 3-4 일 소요, 그것은 힘 드는; 각 하루 실습 시간은 평균 약 3-5 h만 이다. 그러나, 샘플 바구니와 소유자의 사용과 동시에 많은 샘플을 처리 하는 능력은 높은 처리량 분석에 대 한 수 있습니다. 또한,이 프로세스 자동화할 수 있습니다 상업적으로 사용 가능한 도구를 사용 하 여 (테이블의 재료) 경우이 프로토콜은 근본 적이 고 일상적인 구성 요소를 사용 하 여 연구 실험실의 상용 될 것으로 예상 된다 더 자동화 호환 플랫폼 (자료 테이블) 실습 시간을 줄일.
설명된 프로토콜 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 몇 군데 수 색도계 신호의 생산을 허용 하는 digoxygenin 표시 된 프로브 사용 하 여. 우리 한 비 기판 교배 RNA 프로브 개별 대상에 특정 검색 활용, 하는 동안 그것은 또한 digoxigenin UTP 같은 다른 뉴클레오티드 유사 체와 프로브를 라벨에 의해 동시에 여러 개의 목표를 감지 하 고 fluorescein UTP 그리고 다른 비 기판30. 조직 샘플 digoxigenin 및 fluorescein, 두 단계에 대 한 다른 비 반응에 대 한 알칼리 성 인산 가수분해 효소 결합 된 항 체와 함께 순차적으로 다음 incubated 수 있습니다. 이 기술은 또한 높은-해상도 이미징 confocal 현미경 검사 법31 를 사용 하 여 촉진 수 있습니다 동시에 서로 다른 색상의 여러 개의 프로브를 사용 하 여 옵션을 제공 하 고 붙일 레이블 프로브에 맞게 수 있습니다. 이 기술은 특히만 한 번에 하나의 샘플에서 몇 가지 미생물을 평가할 수 있습니다. 그러나, 여러 샘플 틱 microbiota에 나타낼 수 있는 여러 미생물을 해결 하기 위해 높은 처리량 분석에서 평가 될 수 있다.
마지막으로,이 기술은 진드기 및 그들의 관련된 microbiota 사이의 상호 작용의 수사에 국한 되지 않습니다. 프로브 눈금 게놈 내의 관심사의 어떤 유전자를 보완 생성 고 풍부 및 다른 조직에 특정 한 유전자의 지역화를 검사 하는 데 사용 될 수 있습니다. 진드기의 침 샘도 처리 하 고 용기에 마찬가지로 분석 수 있습니다. 전반적으로,이 기술은 관심사의 다른 arthropod 질병 벡터 내에서 미생물 지역 사회 역동성에 적응 연구에 대 한 광범위 한 가능성이 있다.
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Disclosures
저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 진심으 그의 실험실 자원의 사용을 제공 하기 위한 닥터 무스타파 Khokha, 예일 대학, 감사 합니다. 우리는 우수한 기술 지원 씨 밍-지 우에 게 감사입니다. EF는 HHMI 탐정입니다. 이 작품은 존 Monsky와 제니퍼 Weis Monsky 라임 병 연구 기금에서 선물에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
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