Summary
Aqui, apresentamos um protocolo para espacial e temporalmente, avaliar a presença de microbiota viável nas entranhas de carrapato usando uma abordagem de hibridação in situ de montagem todo modificado.
Abstract
Doenças infecciosas transmitidas por vetores artrópodes continuam a ser uma ameaça significativa para a saúde humana em todo o mundo. Os patogénios causadores dessas doenças, não existem isoladamente quando colonizam o vetor; em vez disso, eles provavelmente se envolvem em interações com microorganismos residentes no lúmen do intestino. A microbiota do vetor tenha demonstrada que desempenham um papel importante na transmissão de patógeno para várias doenças transmitidas por vetores. Se bactérias residentes no intestino do carrapato Ixodes scapularis , o vetor de diversos patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi, influenciam a transmissão de carrapato de patógenos não é determinado. Precisamos métodos para caracterizar a composição das bactérias associadas com o instinto de carrapato para facilitar uma melhor compreensão dos potenciais interações entre espécies no intestino carrapato. Usando toda a montagem em situ hibridização Visualizar transcritos de RNA associados a determinada espécie bacteriana permite a recolha de dados qualitativos sobre a abundância e a distribuição da microbiota no tecido intacto. Esta técnica pode ser usada para examinar as mudanças no meio de microbiota do intestino ao longo da escala de alimentação e também pode ser aplicada para analisar a expressão de genes de carrapato. Coloração de carrapato todo coragem rendimento informações sobre a distribuição espacial bruta do alvo do RNA no tecido sem a necessidade de reconstrução tridimensional e é menos afetada pela contaminação ambiental, que muitas vezes confunde o sequenciamento baseado métodos frequentemente utilizados para o estudo de comunidades microbianas complexas. Em geral, esta técnica é uma ferramenta valiosa que pode ser usado para melhor compreender a microbiota-vetor-patógeno interações e seu papel na transmissão da doença.
Introduction
Humanos e gado patógenos transmitidos por artrópodes são encontrados em todo o mundo e representam cerca de 20% das doenças infecciosas globalmente1, mas eficaz e seguras vacinas contra a maioria desses patógenos não estão disponíveis. Nossa compreensão do importante papel dos microorganismos comensais, simbióticos e patogénicos, conhecidos coletivamente como o microbiome2, na modulação e moldar a saúde de quase todos os metazoários3 está se expandindo. Agora é evidente que os artrópodes vetores de patógenos também abrigam a microbiota do intestino e estes microbiota associada vetor foram mostrados para influenciar diversos patógenos vetor4,5. O artrópodes microbiome é composto de eubacteria, archaea, vírus e micróbios eucariontes como protozoários, nematoides e fungos6. No entanto, o foco de investigação predominante tem sido em eubacteria devido, em parte, à existência de genes marcadores e bancos de dados de referência para identificar membros bacterianos específicos.
Com foco em Ixodes scapularis, o vetor de escala de vários patógenos humanos incluindo Borrelia burgdorferi7, o agente causador da doença de Lyme, a otimização de uma técnica de visualização microbiana visava melhorar a nossa compreensão da microbiota do intestino carrapato no contexto das interações de vetor-patógeno. Várias questões permanecem para ser respondida no campo microbiome carrapato. O intestino é o local do primeiro encontro estendido entre o carrapato e o patógeno recebido no contexto de patógenos transferidos horizontalmente; Portanto, compreender o papel da microbiota do intestino vector em modulação interações vetor-patógeno irá revelar ideias significativas. Carrapatos têm um modo exclusivo de digestão da refeição de sangue, onde o processamento de farinha de sangue componentes leva intracelular Coloque8. O lúmen do intestino, aparentemente, serve como um recipiente para conter a refeição de sangue como os feeds de carrapato e assimilação e digestão de nutrientes ensue ao longo de vários dias de alimentação e continuam repletion pós. Os patógenos adquiridos pelo carrapato durante a alimentação entram o lúmen do intestino junto com a farinha de sangue e o lúmen torna-se assim um local principal de interações entre o carrapato, patógeno e microbiota residente. Como digestão prossegue através do repletion e carrapato Ixodid muda, o intestino sofre alterações estruturais e funcionais9. A composição e a organização espacial das bactérias do intestino também é susceptível de variar em concerto com o meio de intestino a mudança. É, portanto, importante compreender a arquitetura de bactérias residentes no intestino carrapato para compreender inteiramente a interação de carrapato, patógeno e microbiota do intestino.
Técnicas moleculares para descrever a microbiota associado anfitrião rotineiramente utilizam estratégias de sequenciamento paralelo elevado-throughput10 para amplificar e sequência de ADN ribossómico de 16S bacteriano (rDNA). Estas estratégias de sequenciamento contornar a necessidade de obter axénica culturas de bactérias específicas e fornecer uma descrição detalhada de todos os membros bacterianas representada na amostra. No entanto, tais estratégias são confundidas pela incapacidade de distinguir as contaminações ambientais de residentes de bona fide . Além disso, quando avaliar amostras, tais como carrapatos, que são pequenos em tamanho e, portanto, contenham baixa microbiota específica DNA produz, a probabilidade de amplificação dos contaminantes ambientais é o aumento de11 e resulta na interpretação ambígua de Microbiome composição. Caracterização funcional em conjunto com a visualização de determinadas bactérias viáveis, portanto, será fundamental para definir e discernir a microbiome do tique-taque, temporalmente e espacialmente. Para atingir este objectivo, aproveitamos a toda a montagem do RNA em situ da hibridação. Esta técnica é usada rotineiramente para avaliar padrões de expressão de genes em embriões e órgãos12,13,14 e permite análise semiquantitativa de expressão ao longo de toda a amostra de interesse. Isso difere do tradicional em situ hibridização as técnicas que utilizam cortes de tecido e muitas vezes exigem extensa análise do material seccionado com uma montagem computacional para prever a expressão em todo os órgãos15. Enquanto toda a montagem geralmente se refere a toda organismos12, aqui toda a montagem refere-se a toda coragem ou órgãos. As vantagens de usar a conjunto de montagem do RNA em situ hibridização abordagem para avaliar a arquitetura da microbiota do intestino de carrapato são múltipla. O intestino do carrapato é composto de 7 pares de divertículos, cada par variando em tamanho16. As diferenças funcionais, se algum, entre esses divertículos, não são compreendidas no contexto da biologia de carrapato, assinale a microbiota ou carrapato-patógeno interações. Manipulações do intestino que rompem os divertículos de intestino deslocaria a microbiota presente no lúmen do intestino ou os associados frouxamente o intestino e resultar em erros de interpretação da localização espacial da microbiota. Fluorescência-etiquetada do RNA em situ hibridização tem sido utilizada anteriormente para examinar o carrapato intestino transcrições17 fixação e abrindo divertículos de intestino individuais para garantir a hibridização da sonda e localizar b. burgdorferi transcrições secionando parafina toda carrapatos18. Ambas essas abordagens exigem manipulações dos tecidos carrapato antes da hibridização que afetaria a arquitetura de microbiota do intestino.
Neste relatório, descrevemos em detalhe o protocolo para examinar a escala viável gut microbiota usando toda a montagem em situ da hibridação (WMISH). O uso de toda a montagem do RNA em situ da hibridação permite um entendimento global da presença e abundância de bactérias do intestino específicas nas diferentes regiões do intestino e pode estimular novos insights sobre biologia de intestino carrapato no contexto da colonização do patógeno e transmissão. Além disso, a utilização de sondas de RNA dirigida contra RNA bacteriano específico permite a detecção de bactérias viáveis no intestino carrapato.
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Protocol
1. elaboração de modelos de DNA
- Download a sequência de 16S rRNA específica para cada gêneros bacterianos do NCBI design e banco de dados de cadeia polimerase (PCR) compatível para a frente e reverter as primeiras demão que vão amplificar regiões específicas de gêneros (~ 200-250 pares de base long), conforme descrito anteriormente 19. também referir os código-fonte aberto bancos de dados SILVA20,21 e probeBase22 recursos online para pontas de prova do oligonucleotide rRNA-alvo e primers, como sondas de RNA para alguns gêneros de bactérias podem ser comercialmente disponível.
Nota: É importante selecionar regiões do gene que são específicos para específicos gêneros e certifique-se de que projetado primeiras demão não amplificar gêneros bacterianos relacionados. Isto é crítico para obter a hibridização da sonda de gêneros/gene-específico. - Alimente os carrapatos para 24, 48 ou 72 h em ratos, dissecar a coragem de carrapato e preparar RNA e cDNA de guts carrapato como descrito anteriormente23. Uso de cDNA como modelo para PCR amplificar amplicons de gêneros específicos usando um thermocycler. Executar uma parte alíquota do PCR-produto/amplicon em um gel de agarose 1,5% e confirmar que o amplicon corresponde o tamanho esperado pela visualização sob luz ultravioleta (UV), usando um sistema de imagem de gel.
- Clone o bacteriano 16S RNA ribossomal amplicon de interesse em um vetor de TA comercialmente disponível (Tabela de materiais) contendo RNA polimerase promotores apropriados para polymerases do bacteriófago (SP6, T7 ou T3). Sequenciar os clones para confirmar a identidade do amplicon e a direcionalidade do clone em relação a cada um dos promotores. Com base nisso, determine que o promotor de escolha para gerar sentido ou RNA antisenso sondas (Figura 1).
- Linearizar 1 mg do plasmídeo com uma enzima de restrição apropriada em um volume de reação de até 30 µLfor 2 h à temperatura recomendada pelo fabricante. Escolha as enzimas de restrição baseadas o promotor que será utilizado para gerar o sentido ou antisentida sonda (Figura 1). Verifique se a linearização por visualização de 2 µ l de reação de síntese em um gel de agarose 1%.
- Purificar as restantes 28 μL de DNA digerido usando um comercialmente disponível kit de purificação de coluna de produto do PCR e quantificar a concentração de DNA por Espectrofotômetro.
Nota: Algumas sondas de sentido podem causar coloração de fundo muito maior do que a sonda antisentida correspondente e outras opções podem precisar de ser explorado. Controles negativos alternativos incluem plasmídeos codificação sequências não representadas na amostra ou outra sonda que produz um padrão distinto de hibridização.
2. construção de sondas de RNA Digoxygenin-UTP
- Prepare a mistura de nucleótidos combinando 7,5 µ l de 100mm UTP, 25 µ l de 10mm digoxygenin-UTP e 10 µ l de cada de 100mm ATP, GTP, CTP e num tubo de centrífuga 1,5 mL.
- Executar em vitro transcrição usando comercialmente disponível T7 ou Sp6 RNA polimerase kits, usando 1 µ l da mistura do nucleotide (passo 2.1) e 0,25 - 1 µ g do modelo de DNA. Trazer o volume até 20 µ l com água. Agite o tubo para combinar e rotação do pulso. Incube a 37 ° C para 2,5-3 h.
Nota: A construção da sonda foi bem sucedida com plasmídeo digerido concentrações tão baixas quanto 7 ng / µ l, mas concentrações típicas a esta distância de passo de 15-25 ng / µ l. A reação de transcrição pode também ser incubada durante a noite a 37 ° C, mas isto não aumenta significativamente o rendimento de RNA. - Adicione 1 µ l de DNase (2.000 unidades / µ l) e incubar a 37 ° C por 10 min. Não exceda 10 min, ou a enzima pode começar a degradar o RNA.
- Adicione 30 µ l de cloreto de lítio gelada 7,5-8 M e 30 µ l de água livre de nuclease refrigerada para precipitar o RNA. Agite o tubo para misturar. Permitir que a precipitação do RNA para prosseguir durante a noite a-20 ° C.
- Recolher o RNA por centrifugação a 17.000 x g por 20 min a 4 ° C. Lavar o sedimento com 1 mL de etanol a 75% acabadas em água de pyrocarbonate (DEPC) dietílico e, em seguida, repita a centrifugação.
- Remover e descartar o sobrenadante, inverter o tubo em uma toalha de papel limpa e deixe para secar por 10 min. resuspenda o pellet em água livre de nuclease. Se o pellet é facilmente visível, resuspenda em 25 µ l. Se o sedimento é muito pequeno ou não visível, Ressuspender em 15-20 µ l. obter uma estimativa da concentração de RNA por Espectrofotômetro.
Nota: RNA típica concentrações variam de 200-500 ng / µ l.
3. visualização do RNA sondas pela electroforese do Gel do RNA formaldeído para avaliar a pureza de RNA
Cuidado: Formaldeído representa um risco de inalação; Portanto, gere as soluções necessárias para a análise do gel do RNA em uma coifa. Brometo de etídio é um suspeito cancerígeno; Manuseie com cuidado.
- Prepare um gel de agarose 1% formaldeído como descrito anteriormente24 e lançar o gel em uma caixa de gel livre de RNases. Legal, uma vez que preencha a caixa de gel com 1x tampão (1 x MOPS em pH 7,0, 5% de formaldeído) em execução.
- Prepare o tampão de amostra (5 µ l 400 mg/mL o brometo de ethidium, 20 µ l 10 x MOPS, 35 µ l formaldeído e 100 µ l formamida). Combine 2 µ l de sonda RNA (passo 2.6) com 8 µ l de tampão de amostra. Incube a 70 ° C durante 10 min.
- Prepare RNA carregando Buffer combinando glicerol 50% de 5 mL, 1 mL 10% de formaldeído, 40mg de bromofenol, 40mg xileno cianol e 20 µ l de EDTA 0,5 M (pH 7,5). Após o uso, guarde esse buffer a-20 ° C.
- Adicionar 3 µ l de tampão de carregamento para a amostra de RNA de passo 3.2 e misture. Manter os tubos de amostra no gelo.
- Carrega o volume de toda a amostra de passo 3.4 no gel. Carrega uma alíquota de escada de single-stranded RNA ao lado para verificar o tamanho do RNA. Funcione o gel a 100 V ou baixe até o corante azul migra aproximadamente 75% da descida do gel. Visualize o RNA sob luz UV, usando um sistema da imagem latente do gel.
Nota: Uma sonda de RNA de boa qualidade deve aparecer como uma banda discreta com uma mobilidade correspondente para o tamanho esperado da sonda (Figura 2, faixa 1). Se a sonda aparece como uma banda difusa e manchada com (Figura 2faixa 2) e que isso não deve ser usado.
4. escala Gut coleção e fixação
- Colete Ixodes scapularis ninfas que alimentaram em ratos para os pontos de tempo de interesse.
Nota: Para efeitos desta técnica, carrapatos alimentados por 48 ou 72 h trabalho melhor. - Disse o intestino do carrapato em MEMFA (tabela 1) em uma corrediça de vidro sob um microscópio de dissecação, evitando danos ao órgão, tanto quanto possível. Coloque uma marca em uma corrediça do microscópio limpa em 20-30 µ l de MEMFA. Usando um par de alto-carbono lâmina de barbear estéril aço #11 fatia da região da cabeça com o escudo do tique-taque, deixando o corpo do carrapato. Pressione suavemente o corpo para empurrar os divertículos de intestino e glândulas salivares para fora a cutícula do corpo. Separar as glândulas salivares e intestino e colher as entranhas sobre a lâmina de barbear.
- Colete a coragem em um tubo de 1,5 mL contendo 500 µ l MEMFA. Incubar o tubo em temperatura ambiente com balanço suave por 1h ou overnight a 4 ° C.
Nota: As glândulas salivares do carrapato também e podem ser dissecadas e similarmente manchadas. - Desidrate o tecido lavando suavemente 3 vezes com 1 mL de etanol a 100% gelada. Deixe a coragem afundar naturalmente para o fundo do tubo entre cada lavagem, centrifugação pode danificar o tecido. Para armazenamento a longo prazo, manter as amostras em etanol 100% a-20 ° C.
5. construção de malha amostra cestas e titular da cesta 24-poço
- Corte a parte de baixo de 2 mL ou 5 mL tubos de centrífuga de agarrar-parte superior usando uma lâmina de barbear com arestas único aquecida em um bisturi.
Cuidado: A lâmina pode precisar de ser reaquecido várias vezes antes de terminar o corte. - Corte quadrados de uma malha de nylon 110 µm ligeiramente maior do que a nova abertura do tubo. Bond a malha para o fundo do tubo, pressionando-os juntos levemente em um prato quente em fogo médio-baixo até que seja feita uma boa vedação. Deixe esfriar, garantir que não haja lacunas entre a malha e o tubo e corte malha em excesso em torno das bordas.
- Faça furos na tampa de uma placa de 24 tal que o lábio do cesto de amostra feita no passo 5.2 irá sentar-se no buraco e não cair, rendendo uma armadilha onde as partes inferiores das cestas amostra se sentará lá em poços quando eles são colocados na buracos na capa.
- Use este suporte de cesto montado para transferir cestas de uma placa para outra com relativa facilidade para a totalidade do protocolo em situ da hibridação. Use duas placas de 24 poços, para que enquanto uma incubação ocorre, a outra chapa é preparada para a próxima lavagem.
6. hibridação in Situ : dia 1 (tempo: 4-5 h)
- Coragem de transferência de rotulado cestas de amostra, separados por condição experimental e se destina a sonda de RNA.
Nota: Mancha de pelo menos 5 coragem por condição para contabilizar a variação natural entre repetições. - Hidratar as amostras com cuidado para evitar a introdução de bolhas de ar no tecido, gradualmente aumentando a proporção de fosfato-salino com 0,1% de tensoativo não-iônico (PTw; A tabela 1) para etanol nas lavagens.
Nota: Complete todos os lava no suporte do cesto 24-bem à temperatura ambiente com agitação suave a menos que indicado o contrário. Alíquotas de 500-600 µ l das soluções de lavagem em cada poço do titular tal que coragem em cada cesto está completamente submersos. Prepare todas as soluções com água tratada DEPC para prevenir a degradação de RNA.- Lave as amostras por 5 min em 500 µ l 100% de etanol.
- Preparar pelo menos 500 µ l por cesta de amostra de 75%, 50% e 25% de etanol no PTw. Re-hidratar as amostras por lavagem por 5 min em cada solução de etanol, movendo-se para o mais baixo da maior concentração de etanol.
- Lave as amostras 4 vezes por 5 min cada no PTw.
- Permeabilize as amostras com Proteinase K (10 µ g/mL) no PTw por 5 min.
- Prepare o tecido para a hibridização com as sondas de RNA.
- Lave as amostras duas vezes como descrito em 6.2 no suporte do cesto 24-bem à temperatura ambiente com agitação suave por 5 min em buffer de trietanolamina 500 µ l (0,1 M, pH 7.0-8.0) (tabela 1) para manter as amostras em um ambiente livre de amina.
- Tratar as amostras duas vezes com 500 µ l 0,25% ácido acético anidrido no buffer de trietanolamina (0,1 M, pH 7.0-8.0) por 5 min cada e, em seguida, lavar as amostras duas vezes no PTw por 5 min cada.
Nota: O anidrido acético acetylates aminas gratuito para neutralizar a carga positiva, que é fundamental para evitar interações eletrostáticas não-específica e certifique-se de ligação específica da sonda para mRNA. - Corrigir a coragem por 20 min com paraformaldeído de 4% 500 µ l no PTw e, em seguida, lavar 5 vezes no PTw por 5 min cada.
- Prehybridize por incubar as amostras em 500 µ l hibridização /in reserva o titular 24-bem cesta em prato bem 24 (tabela 1) para o 1,5-2,5 h a 60 ° C com agitação suave em um tremendo banho de água. Salve o tampão de hibridização, usado para a etapa de prehybridization para reutilizar no protocolo 2 dia (passo 7.1).
- Prepare soluções de hibridização da sonda diluindo-se sondas de RNA em tampão de hibridização para uma concentração final de 1 µ g/mL. Incubar amostras com soluções de hibridização da sonda no suporte do cesto 24-bem a 60 ° C com agitação suave durante a noite em um tremendo banho de água (tabela 2). Cobrir a placa carregando o titular cesta confortavelmente com folha de alumínio para evitar a evaporação da solução de hibridação.
7. hibridação in Situ : dia 2 (Timing: 4.5-5.5 h)
- Remover as amostras de soluções de hibridização da sonda e colocá-los para o buffer de hibridização reservada do dia anterior. Incube a 60 ° C, com agitação suave para 3 min.
Nota: Soluções de hibridização da sonda podem ser armazenadas a-20 ° C para reutilização até 3 vezes. - Prepare 2 x tampão citrato de sódio-solução salina (SSC), diluindo 20 x SSC na água tratada DEPC (tabela 1). Lavar as amostras, duas vezes por 3 min com 2 x SSC e, em seguida, 3 vezes por 20 min com 2 x SSC a 60 ° C para remover todos os vestígios de buffer de sonda e hibridação.
- Tratar com RNase A (20 µ g/mL) e RNase T1 (10 µ g/mL) em 2x SSC por 30 min a 37 ° C para remover único encalhado sonda RNA representando livre não-hibridizadas RNA.
- Lave uma vez com 2 x SSC por 10 min à temperatura ambiente. Preparar 0.2 x SSC por diluição 2 x SSC na água tratada DEPC, Então lave duas vezes com 0.2 x SSC por 30 min a 60 ° C para remover o excesso RNases.
- Lave duas vezes com 500 µ l de tampão de ácido maleico (MAB; A tabela 1) para cada 10 min.
- Incube as amostras com bloqueio de solução (2% bloqueio reagente no MAB) para 1,5 a 2 h.
Nota: O reagente de bloqueio pode ser difícil de dissolver; aquecimento suave auxilia a dissolução. - Substitua a solução bloqueio anti-Digoxigenina alcalina fosfatase-conjugado 500 µ l do anticorpo a uma diluição de 1:3,000 em solução de bloqueio e incubar à temperatura ambiente por cerca de 4 h ou a 4 ° C durante a noite.
8. hibridação in Situ : dia 3 (Timing: 6 h durante a noite)
- Lave as amostras de pelo menos 5 vezes por 30 min cada com 500 µ l MAB para remover o excesso anticorpo.
Nota: Estas lavagens são flexíveis e podem ser prorrogadas para h 1-2, ou 3-4 lavagens podem ser substituídas por uma lavagem durante a noite a 4 ° C, com impacto mínimo sobre a eficácia. - Lave duas vezes por 5 min com buffer de fosfatase alcalina, pH 9.5 (tampão de AP; A tabela 1).
- Começa a reação de cor, substituindo a última lavagem com 500 µ l de substrato cromogênico para fosfatase alcalina (Tabela de materiais). Cobrir a placa da amostra com papel alumínio e deixe a coloração proceder à temperatura ambiente por 3 - 5 h ou durante a noite a 4 ° C. Monitore periodicamente a reação de coloração, exibindo o tecido sob um microscópio dissecação para evitar overstaining.
Nota: Quando a coloração é completa, uma tonalidade roxa é detectável pelo olho nas amostras antisentido-sondado sob o microscópio, mas o tecido não devem tornar-se muito escuro. Coloração prossegue lentamente a 4 ° C e pode demorar até 20-24 h. - Parar a reação de cor por lavagem por 5 min em 500 µ l do MAB, em seguida, corrigir o tecido durante a noite em solução de Bouin.
Atenção: Lidar com a solução do Bouin em uma coifa; é um carcinógeno corrosivo.
9. hibridação in Situ : dia 4 (Timing: 3-3.5 h)
- Preparar pelo menos 7 mL por cesta de amostra de 1 x SSC por diluição 20 x SSC na água tratada DEPC. Remover a solução do Bouin por lavar as amostras de 4 a 6 vezes com etanol 70% em 1 x SSC até que o tecido não é mais amarelo.
- Preparar 500 µ l por cesta de amostra das soluções de etanol 75%, 50% e 25% em 1 x SSC. Lave as amostras por 5 min em cada solução, movendo-se da maior concentração de etanol para a mais baixa para Re-hidratar o tecido. Lave duas vezes por 5 min cada 1 em x SSC.
- Incube as amostras na solução de água sanitária (tabela 1) para 90 min em uma mesa de luz em uma coifa.
Nota: Este passo permite que qualquer pigmentação na coloração da solução de Bouins a ser removido ou amostras e aumenta o sinal de sonda para visualização clara. - Lavar as amostras duas vezes com 500 µ l de 1 x SSC por 5 min.
- Realocar as entranhas com danos mínimos, invertendo-se o cesto de amostra num poço de uma nova placa de 24 e lavagem com etanol 70% através do fundo de malha usando uma pipeta de transferência. Armazenar a-20 ° C, se necessário.
- Para obter uma visão geral dos padrões de coloração de amostras múltiplas, como mostrado na Figura 3,, manter a coragem em etanol a 70% no 24-placa e vista com qualquer microscópio de campo claro. Para examinar a coragem individual sob um microscópio de campo claro, conforme mostrado na Figura 4, Figura 5, e Figura 6, montar a coragem em 100% glicerol sob as lamelas. Use uma espátula de plástico para manipular suavemente o tecido com danos mínimos.
Nota: A alta viscosidade do glicerol ajuda a proteger o tecido de danos por compressão e permite o posicionamento cuidadoso dos divertículos, tais que o tecido pode ser visto de forma otimizada em ampliações. - Capturar imagens no microscópio usando software de captura de imagem específica do microscópio (Tabela de materiais) e exportar como Tiff imagens para uma software de edição de imagem genérica. Para quantificar as diferenças relativas de coloração entre os tratamentos experimentais, baixe um software de análise de imagem genérico (Tabela de materiais). Abra a imagem dentro do software de análise e siga as instruções dentro do software para medir a intensidade do pixel da coloração e computar parcelas de histograma da coloração.
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Representative Results
A medição e avaliação da qualidade das sondas RNA são essenciais antes de iniciar a coloração. In vitro a transcrição eficácia depende altamente a quantidade e a qualidade do modelo de DNA. Nós rotineiramente visualizado as sondas de RNA em um gel de formaldeído para verificar a pureza e a quantidade de sonda gerada pelas reações da transcrição. As sondas devem aparecer como bandas brilhantes, discretas (Figura 2). Espectrofotométricas medições de concentração de RNA foram altamente indicativos de qualidade de sonda e correlacionados com a aparência das bandas no gel. Assim, a etapa de visualização de gel pode ser ignorada se desejado, uma vez que a familiaridade com o protocolo tenha sido atingida. De qualquer forma, é importante assegurar que o RNA suficiente de alta qualidade é produzido, como todas as etapas a jusante dependem da robustez das sondas.
A força desta técnica é para facilitar a amplas observações sobre a microbiota do carrapato, incluindo a presença ou ausência de espécies bacterianas, mudanças na abundância de bactérias ao longo do tempo como os feeds de carrapato e localização de espécies dentro do tecido inteiro. Uma variação de coloração, quantidade e distribuição é normal entre réplicas biológicas, bem como entre os 7 pares de divertículos de coragem individual (Figura 3), portanto, é melhor ficar manchado pelo menos cinco coragem por condição para ter uma ideia da média padrão de coloração. O sucesso global do protocolo é melhor aferido, comparando a coloração das amostras sentido e antisentido para cada condição. As amostras de sentido, controles negativos importantes para este tipo de análise, devem ter mínima para nenhuma cor roxa (Figura 4). Por outro lado, amostras antisentidas devem exibir coloração robusto com fundo mínimo, a intensidade da qual dependerá a abundância das transcrições bacterianas específicas a ser alvo. O coloração padrão dentro do tecido também irá variar com base nestes parâmetros. Importante, o sentido e antisentidas amostras devem ser desenvolvidas para a mesma quantidade de tempo para poder comparar diretamente, então estas amostras devem ser processadas em paralelo. Superdesenvolvimento da reação de cor pode resultar em uma quantidade elevada de fundo de coloração, onde as amostras de sentido começam a se parecer com o antisentido (Figura 5). Particular cuidado neste passo no protocolo para evitar overstaining, como não há nenhuma maneira de reverter a reação, uma vez que ele ocorre.
É crucial garantir que todas as tripas são totalmente submerso em cada reagente durante cada etapa; um aumento na variação entre amostras pode ser devido à exposição desigual para os reagentes. A quantidade de tempo que os carrapatos são alimentados antes de coragem é coletada também tem um efeito significativo sobre os resultados. Carrapatos que foram mal-pago ou apenas alimentados por 24 h eram difíceis de trabalhar; coragem também eram mais facilmente danificados e não manchou bem (Figura 6) e é uma limitação dessa abordagem neste momento. Carrapatos, alimentados por 48-72 h foram mais fáceis de trabalhar, devido ao maior tamanho essas tripas quando comparado à coragem dos carrapatos alimentados durante 24 h. coragem de pontos de tempo mais tarde também manchado melhores que 24 carrapatos h-alimentados, possivelmente devido a aumentos na carga bacteriana durante o o estágios posterior f alimentação. O tecido de 72-h muitas vezes tinha um pequeno fundo de tonalidade marrom de sangue, mas a coloração púrpura era claramente visível sobre a tonalidade (Figura 4). Coragem é melhor visualizada em baixa ampliação (5x ou 10x) para poder visualizar os padrões de coloração em todo o tecido inteiro usando um microscópio de campo claro. Visualizar toda a montagem tecido na maior ampliação, como com um 63 X objetivo de óleo, corre o risco de danificar o tecido, como o objetivo seria pressionar contra o slide e comprimir o tecido devido a espessura das amostras. Se desejar imagens de resolução mais alta, o potencial para o seccionamento de tecido deve ser examinado.
Figura 1 . Esquemático de preparação de modelo para geração de sonda. Clone o 16S rRNA amplicon em um TA clonagem vetor contendo promotores T7 e Sp6. Linearizar a construção usando enzimas de restrição para cortar em sites a ou b para a transcrição em vitro usando o promotor T7 ou Sp6 para gerar sentido ou antisentido sondas respectivamente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 . Visualização da sonda RNA por eletroforese em gel. Sondas de RNA (~ 700 ng) foram electrophoresed em um gel de agarose de formaldeído, visualizado sob luz UV e cuja imagem usando um gel comercial sistema de imagem. Um representante de boa qualidade, pista 1; e sonda de RNA de má qualidade, pista 2.
Figura 3 . Uma visão representativa de toda a montagem em situ da hibridação de 48 h-alimentados coragem. Coragem de carrapatos alimentados por 48 h manchado com antisense RNA complementar a uma sequência de RNA ribossomal 16S conservada mostra coloração diferencial de divertículos de intestino. Barra de escala representa 200 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 . Imagens representativas da bem sucedida montagem toda a hibridação in situ em Ixodes scapularis coragem. Coragem de carrapatos alimentados para a quantidade indicada de tempo foram coradas usando qualquer sentido (controle negativo) ou sondas antisentido RNA. Antisentido sondas foram complementares para uma sequência de RNA ribossomal 16S conservada (16S Universal) ou uma sequência de RNA 16S específica para um determinado género bacteriano (conforme indicado). Enterococcus não deu mancha robusto em 48 h. escala barras representam 140 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5 . Tempo de reação cromogênico prolongado leva a mancha não específica. Coragem de carrapatos alimentados durante 48 h foram analisadas com uma sonda de RNA de sentido ou uma sonda antisentida complementar a uma sequência de RNA 16S conservada. O tecido foi incubado com o substrato de fosfatase alcalina BM roxo durante a noite a 4 ° C e em seguida em temperatura ambiente por cerca de 4 h antes de parar a reação. Barras de escala representam 140 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 . Toda a montagem em situ da hibridação usando mal-pago ou 24h alimentado carrapato coragem. Coragem de mal-pago ou 24 h-alimentados carrapatos foram coradas usando sondas de RNA de sentido ou antisentido sondas complementares a uma sequência de RNA 16S conservada ou uma sequência específica para o gênero Rickettsia. A coloração nas amostras antisentidas é menos eficiente do que o observado nos pontos de tempo posteriores e coragem é também mais facilmente danificados. Barras de escala representam 60 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Concentrações finais | PH final | Notas de armazenamento |
| MEMFA | 0.1 MOPS DE M | - | Temperatura ambiente |
| 2mm EGTA | |||
| sulfato de magnésio 1 mM | |||
| 3,7% de formaldeído | |||
| PBS-Tween (PTw) | 1X PBS, 0.1% Tween-20 | 7.0 | Temperatura ambiente |
| 0.1% Tween-20 | |||
| Buffer de trietanolamina | 1X PBS | 7.0-8.0 | Temperatura ambiente |
| 0.1 trietanolamina M | |||
| Tampão de hibridização | Formamida 50% | - | -20 ° C |
| 5 x SSC | |||
| 1 mg/mL Torula RNA | |||
| heparina de 100 µ g/mL | |||
| 1 x solução do Denhart | |||
| 0.1% Tween-20 | |||
| 0,1% CHAPS | |||
| 10 mM de EDTA | |||
| Tampão de ácido maleico (MAB) | ácido maleico de 100mm | 7.0 | Temperatura ambiente |
| cloreto de sódio de 150 mM | |||
| Buffer de fosfatase alcalina (AP) | 100 mM Tris | 9.5 | -20 ° C |
| cloreto de magnésio 50 mM | |||
| cloreto de sódio de 100 mM | |||
| 0.1% Tween-20 | |||
| levamisol 5 mM | |||
| Solução de água sanitária | 1% de peróxido de hidrogênio | - | Prepare fresco |
| 5% formamida | |||
| 0.5 x SSC |
Tabela 1. Receitas de soluções utilizadas no protocolo.
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Discussion
Este é o primeiro uso de uma técnica de hibridização (WMISH) toda a montagem em situ para estudar a microbiota de um vetor de artrópodes de patógenos. Nosso protocolo foi adaptado de um usado para estudar o desenvolvimento em Drosophila e em embriões de rã25,26. Toda a montagem do RNA em situ hibridização tem sido usada rotineiramente para localizar transcritos do gene espacialmente e temporalmente27 e visualização das transcrições podem ser feitos por campo claro ou por microscopia fluorescente. Nós adotamos o antigo para a deteção da microbiota nas entranhas do carrapato. É importante notar que as tentativas de executar toda a montagem em situ da hibridação usando todo carrapatos em que região da cabeça foi removida para permitir a penetração do fixador e hibridação soluções não foi bem sucedida. O protocolo descrito aqui utiliza dissecada coragem e foi implementado para estudar os efeitos das proteínas específicas do carrapato na colonização bacteriana no intestino23. Informações obtidas de WMISH é comparáveis a imuno-histoquímica, mas tem a vantagem de não exigir a geração de anticorpos para o gene e proteína ou proteína de interesse. Informações genômicas são suficientes para gerar os reagentes para WMISH. Ambos WMISH e peixe (fluorescência hibridação in situ) pode detectar a expressão do gene. No entanto, devido a ser um ensaio enzimático e baseada no cromogénio, WMISH tem a vantagem de que o desenvolvimento de cor pode ser monitorado ativamente e a reação é permitida proceder até o sinal desejado e sensibilidade é conseguida. É totalmente passível de automação e é facilmente escalável para formato de alta produtividade. Ao contrário do peixe e imuno-histoquímica, nenhum corte é necessária. A desvantagem de WMISH sobre os peixes é que apenas 2 diferentes mRNAs ou genes podem ser abordados simultaneamente e exigiriam que sondas ser rotulado com os análogos de nucleotídeo diferente como Digoxigenina-UTP e fluoresceína-UTP28. Com peixes, até 6 diferentes mRNAs podem ser examinados em um ensaio de29. Enquanto ambos os ensaios exigem tempo comparáveis, o custo da fluorescência corantes são maior do que a dos substratos cromogênico. Ensaios de peixe também exigiria um microscópio de fluorescência para visualização de imagens, enquanto a visualização de imagens WMISH pode ser executada com qualquer microscópio de luz.
É fundamental que o protocolo é seguido de perto; no entanto, existem algumas etapas que requerem uma atenção especial. Dissecação do intestino do carrapato sem danificar o tecido requer alguma destreza. Pode ser prudente coletar carrapatos extras para praticar as dissecções e ganhar proficiência. Devido a heterogeneidade de coloração em diferentes divertículos de coragem individual (Figura 3), é importante examinar todos os divertículos de cada instinto para derivar a evidência conclusiva de abundância bacteriana. Também é importante processar vários coragem (pelo menos 5) para cada condição experimental, a fim de obter as informações conclusivas sobre a presença, distribuição espacial e abundância de bactérias específicas dentro diferentes divertículos. Produção de sondas de RNA de alta qualidade também é fundamental para a coloração do tecido eficaz. É crucial confirmar também a sequência do modelo do vetor de clonagem para garantir essa antisentido sonda e sondas sentido adequadamente são geradas. Uma reação de transcrição produtivo em vitro requer suficiente DNA modelo; um mínimo de 100 ng pode ser usado, mas 0,5 - 1 µ g é recomendado para geração de sonda ideal.
O uso de cestas de amostra e placas de 24 poços neste protocolo evita a manipulação direta do tecido em cada etapa de lavagem, o que minimiza os danos durante o processo de coloração. No entanto, as amostras são ainda ocasionalmente perdidas ou danificadas; coragem de carrapatos mal-pago ou 24h-alimentados, em particular, é difíceis de ver e fácil de perder ao transferir das cestas de amostra para um recipiente de armazenamento a longo prazo. Adicionais deve ter cuidado ao manipular estas amostras. Devido a esta limitação, nós usamos principalmente coragem de 48 e 72 h-alimentados carrapato. A presença de grandes quantidades de farinha de sangue, as tripas nestes pontos de tempo (mais de 72 h) interfere com a coloração e visualização devido ao fundo específico na refeição de sangue e também apresenta uma limitação dessa técnica. É provável que o uso de sondas fluorescente-etiquetadas pode contornar esse problema.
O aspecto mais importante do processo de coloração é estabelecer o equilíbrio entre a coloração robusto e sinal de baixo fundo. O tempo de desenvolvimento de cor ideal pode variar dependendo das condições experimentais. Assim, recomenda-se realizar a reação de cor na temperatura ambiente e monitorar o desenvolvimento de cor aproximadamente a cada 30 min. A reação também pode ser configurada para prosseguir durante a noite a 4 ° C, para retardar o desenvolvimento de cor. No entanto, é extremamente crítico para não deixar esta reação prosseguir por muito tempo. A reação de coloração pode ser difíceis de acompanhar a olho nu, para que as amostras devem ser examinadas sob um microscópio de dissecação. Uma tonalidade roxa deve ser visível em amostras analisadas com RNA antisenso, enquanto as amostras analisados com sentido RNA deve manter cor mínima. Se as amostras de RNA-sondado sentido mancham brilhantemente, etapas de solução de problemas deve começar com a redução do tempo de incubação com BM roxo e aumentar o tempo de bloqueio. Às vezes sentido sondas podem causar fundo anormalmente elevado em comparação com as sondas antisentidas; nestes casos, as regiões diferentes do gene podem ter que ser considerado para a geração de sondas de RNA. Sequências de DNA não representadas numa determinada amostra também podem ser consideradas como modelos para gerar testes de controlo negativo. Por exemplo, um modelo de DNA codificação uma região da proteína verde fluorescente, não representada no genoma de carrapato ou sua microbiome, pode ser utilizado.
Uma limitação dessa técnica é que a análise é em grande parte qualitativa; no entanto, o software de análise de imagem (Tabela de materiais) poderia ser usado para medir a quantidade de sinal de coloração em cada amostra. Isso permitiria que uma comparação semi-quantitativa da abundância de várias espécies bacterianas em diferentes condições experimentais. Enquanto este é um protocolo demorado que leva 3-4 dias para completar, não é trabalhoso; cada dia hora hands-on é apenas cerca de 3-5 h em média. No entanto, a capacidade de processar muitas amostras em paralelo com o uso da amostra cestas e suportes permite a análise de alta produtividade. Além disso, este processo pode ser automatizado usando instrumentos disponíveis comercialmente (tabela de materiais) se este protocolo é esperado para ser uma rotina e essencial componente do laboratório de pesquisa usando comercialmente disponível plataformas de automação-compatível (Tabela de materiais) para mais reduzem o tempo de hands-on.
O protocolo descrito faz uso de sondas de digoxygenin-etiquetadas que permitem a produção de um sinal colorimétrico, que pode ser fotografada usando microscopia de campo claro. Enquanto nós ter utilizado um substrato cromogénico para detectar o RNA hibridizada sondas específicas para alvos individuais, também é possível detectar múltiplos alvos simultaneamente através da marcação de sondas com análogos de nucleotídeos diferentes, tais como Digoxigenina-UTP e fluoresceína-UTP e diferentes substratos cromogênico30. As amostras de tecido podem ser incubadas então sequencialmente com fosfatase alcalina-acoplados anticorpos contra Digoxigenina e fluoresceína, com reações cromogênica diferentes para as duas etapas. Esta técnica também pode ser adaptada para sondas fluorescente-etiquetadas, que podem facilitar a imagem de alta resolução utilizando microscopia confocal31 e fornecer a opção de usar várias sondas de cores diferentes em paralelo. Esta técnica pode apenas especificamente avaliar alguns microorganismos simultaneamente em uma amostra. No entanto, várias amostras podem ser avaliadas em ensaios de alta produtividade para abordar vários microorganismos que podem ser representados na microbiota do carrapato.
Finalmente, esta técnica não é limitada para a investigação das interações entre carrapatos e sua microbiota associado. Sondas complementares para qualquer gene de interesse dentro do genoma de carrapato podem ser geradas e usadas para examinar a abundância e a localização de genes específicos em diferentes tecidos. As glândulas salivares do carrapato também podem ser processadas e analisadas da mesma forma para o intestino. Em geral, esta técnica tem amplo potencial de adaptação a estudos sobre a dinâmica das comunidades microbianas dentro de outros vetores de doenças artrópodes de interesse.
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Disclosures
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos sinceramente Dr. Mustafa Khokha, Yale University, para proporcionar a utilização dos seus recursos de laboratório. Agradecemos ao Sr. Wu Ming-Jie excelente assistência técnica. EF é um investigador HHMI. Este trabalho foi apoiado por um presente do John Monsky e Jennifer Weis Monsky fundo de pesquisa de doença de Lyme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron | Amazon | 03-110/47 | |
| pGEM-T Easy Vector System | Promega | A1360 | |
| Digoxygenin-11-UTP | Roche | 1209256910 | |
| dNTP | New England Biolabs | N0447S | |
| DNAse I(RNAse-free) | New England Biolabs | M0303S | |
| HiScribe SP6 RNA synthesis kit | New England Biolabs | E2070S | |
| HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England Biolabs | E2040S | |
| Water, RNase-free, DEPC-treated | American Bioanalytical | AB02128-00500 | |
| EDTA, 0.5M, pH 8.0 | American Bioanalytical | AB00502-01000 | |
| Formaldehyde, 37% | JT Baker | 2106-01 | |
| Formamide | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E-4378 | |
| DPBS, 10X | Gibco | 14300-075 | |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-25ML | |
| Proteinase K | Sigma Aldrich | 3115879001 | |
| Triethanolamine HCl | Sigma Aldrich | T1502-100G | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 320102-100ML | |
| Paraformaldehyde | ThermoScientific/Pierce | 28906 | |
| SSC, 20X | American Bioanalytical | AB13156-01000 | |
| RNA from torula yeast | Sigma Aldrich | R3629-5G | |
| Heparin, sodium salt | Sigma Aldrich | H3393-10KU | |
| Denhardt's Solution, 50X | Sigma Aldrich | D2532-5ML | |
| CHAPS hydrate | Sigma Aldrich | C3023-1G | |
| RNase A | Sigma Aldrich | 10109142001 | |
| RNase T1 | ThermoScientific | EN0541 | |
| Maleic acid | Sigma Aldrich | M0375-100G | |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Sigma Aldrich | 11093274910 | |
| Levamisol hydrochloride | Sigma Aldrich | 31742-250MG | |
| Chromogenic substrate for alkaline phosphatase | Sigma Aldrich | 11442074001 | |
| Bouin's solution | Sigma Aldrich | HT10132-1L | |
| Hydrogen peroxide | Mallinkrodt Baker, Inc | 2186-01 | |
| Single stranded RNA ladder | Ambion -Millenium | AM7151 | |
| #11 High-Carbon steel blades | C and A Scientific Premiere | #11-9411 | |
| Thermocycler | BioRad, CA | 1851148 | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific | NanoDrop 2000C | |
| Orbital shaker | VWR | DS-500E Digital Orbital shaker | |
| Shaking water bath | BELLCO Glass, Inc | Hot Shaker-7746-12110 | |
| Gel documentation system | BioRad | Gel Doc XR+ Gel documentation system | |
| Bright-field Microscope | Nikon | NikonSM2745T | |
| Bright-field Microscope | Zeiss | AXIO Scope.A1 | |
| Dissection microscope | Zeiss | STEMI 2000-C | |
| Light box | VWR | 102097-658 | |
| PCR purification kit | Qiagen | 28104 | |
| Image capture software | Zeiss | Zen lite | |
| Image editing software | Adobe | Adobe Photoshop CS4 version 11.0 | |
| Image analysis software | National Institutes of Health | ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/ | |
| Automation compatible instrumentation | Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany). | Intavis, Biolane HT1.16v |
References
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