Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Kene bağırsaklar tarafından bütün-mount Situ hibridizasyon Microbiota görselleştirme

Published: June 1, 2018 doi: 10.3791/57758
Automatic Translation
1, 2, 3, 3
1Department of Microbial Pathogenesis, Yale University School of Medicine, 2Program in Vertebrate Developmental Biology, Departments of Pediatrics and Genetics, Yale University School of Medicine, 3Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine

Summary

Burada, dağınık şekilde ve geçici kene cesaret bir değiştirilmiş bütün-mount In situ hibridizasyon yaklaşım kullanarak uygun microbiota varlığı değerlendirmek için bir protokol mevcut.

Abstract

Bulaşıcı hastalıklar eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından iletilen insan sağlığı dünya çapında önemli bir tehdit devam. Bu hastalıklar neden patojenleri yok yalıtım modunda vektör kolonize zaman; Bunun yerine, onlar büyük olasılıkla etkileşimleri gut lümen içinde ikamet mikroorganizmalar ile meşgul. Vektör microbiota patojen iletim birkaç vektör kaynaklı hastalıklar için önemli bir rol oynamak için kanıtlanmıştır. Ixodes scapularis kene, Borrelia burgdorferi, dahil olmak üzere birçok insan patojenleri vektör gut yerleşik bakteri kene iletim patojenlerin etkisi olup olmadığını tespit değil. Biz yöntemleri olası türler arası etkileşimler kene gut daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırmak için kene gut ile ilişkili bakteriler bileşimi karakterize için gerektirir. Bütün Dağı in situ kullanarak özellikle bakteriyel tür ile ilişkili RNA transkript görselleştirmek için hibridizasyon bereket ile ilgili nitel veri toplama ve sağlam doku microbiota dağıtımını sağlar. Bu teknik değişiklikler gut microbiota ortamında besleme kene boyunca incelemek için kullanılan ve kene genlerin ifade analiz etmek için de uygulanabilir. Bütün kene boyama hedef RNA dokusunda üç boyutlu yeniden yapılandırma için gerek kalmadan brüt mekansal dağılımı hakkında verim bilgi cesaret ve kez sıralama tabanlı zihnimi karıştıran çevresel kirlenme tarafından daha az etkilenir karmaşık mikrobiyal topluluklar çalışma için sık kullanılan bir yöntem. Genel olarak, bu tekniği daha iyi kullanılabilmesi için değerli bir araç vektör-patojen-microbiota etkileşimleri ve hastalık iletim içindeki rolü anlamak olduğunu.

Introduction

İnsan ve hayvan patojenler eklem bacaklılar vektörel çizimler tarafından aktarılan dünya çapında bulunur ve bulaşıcı hastalıklar yaklaşık % 20 genel olarak1, ama etkili hesap ve çoğu bu patojenlerin karşı güvenli aşı mevcut değildir. Oransal ve hemen hemen tüm metazoans3 sağlık şekillendirme ve microbiome2, topluca bilinen komensal, simbiyotik ve patojen mikroorganizmaların önemli rol anlayışımızı genişletiyor. Şimdi eklem bacaklılar vektörel çizimler patojenlerin Ayrıca gut microbiota liman ve çeşitli vektör kaynaklı patojenler4,5etkilemek için bu vektör ilişkili microbiota gösterilmiştir açıkça anlaşılmaktadır. Eklem bacaklılar microbiome eubacteria, Arkeler, virüsler, ökaryotik mikroplar gibi tek hücreli, nematodlar ve mantarlar6oluşur. Ancak, baskın araştırma odak eubacteria üzerinde nedeniyle, kısmen, işaretleyici genler ve belirli bakteriyel üyelerini tanımlamak için başvuru veritabanları kullanılabilirliğini olmuştur.

Ixodes scapularis, kene vektör Borrelia burgdorferi7, de dahil olmak üzere birden çok insan patojenlerin ile bir odak hastalığının Lyme hastalığı, bir mikrobiyal görselleştirme teknik optimizasyonu amaçlı yapıldı. kene gut microbiota vektör-patojen etkileşimleri bağlamında anlayışımızı geliştirmek. Kene microbiome alanında cevaplanması gereken birkaç soru kalır. Gut kene ve yatay olarak aktarılan patojenler bağlamında gelen patojen arasındaki ilk genişletilmiş karşılaşma sitesidir; Bu nedenle, vektör vektör-patojen etkileşimleri oransal olarak gut microbiota rolünün anlaşılması anlamlı yorumlara ortaya çıkaracaktır. Kene kan yemek sindirim, burada kan yemek bileşenleri alır işlenmesi intracellularly8yer benzersiz bir moduna sahip. Gut lümen görünüşte kene beslemeleri kan yemek içerecek bir gemi olarak hizmet vermektedir ve besin sindirim ve asimilasyon besleme birkaç gün doğmak ve sonrası repletion devam etmek. Kene tarafından besleme sırasında alınan patojenler gut lümen bloodmeal ile birlikte girin ve böylece lümen kene, patojen ve ikamet microbiota arasındaki etkileşimlerin birincil bir site olur. Sindirim repletion ve deri değiştirme iksodid kene ile devam ederken, gut yapısal ve işlevsel değişiklikler9uğrar. Kompozisyon ve gut bakteri mekansal organizasyonu değişen gut çevre ile uyum içinde değişebilir olasılığı mevcuttur. Bu, bu nedenle, yerleşik bakteri tamamen kene, patojen ve gut microbiota etkileşimi anlamak için kene gut mimarisini anlamak önemlidir.

Ana bilgisayar ilişkili microbiota rutin olarak açıklamak için moleküler teknikleri yükseltmek ve bakteriyel 16S ribozomal DNA (rDNA) sıra ile yüksek-den geçerek paralel sıralama stratejileri10 kullanmaktadır. Bu sıralama stratejileri aşmak gerek axenic belirli bakteri kültürleri elde etmek ve tüm bakteriyel Üyeler örnek temsil ayrıntılı bir açıklamasını sağlar. Yine de, bu stratejileri bona fide sakinleri çevre contaminations ayırt etmek için yetersizlik tarafından şaşırmış. Ayrıca, örnekleri, keneler, küçük içinde büyüklük ve bu nedenle düşük microbiota özgü DNA içeren gibi değerlendirmek verir, çevre kirletici amplifikasyon olasılığı artan11 olduğunu ve belirsiz yorumlanmasında sonuçları microbiome kompozisyon. Bu nedenle, belirli uygun bakteri görselleştirme ile birlikte işlev karakterizasyonu tanımlamak ve kene microbiome geçici ve dağınık şekilde ayırt için önemli olacaktır. Bu hedef doğrultusunda, biz bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon kullandı. Bu teknik gen ifade desenleri, organ ve embriyo12,13,-14 değerlendirmek için rutin olarak kullanılan ve ilgi tüm örnek ifade semiquantitative analiz sağlar. Bu doku bölümleri kullanmak ve genellikle kesitli malzeme tüm organları15ifadede tahmin etmek için sayısal bir derleme ile geniş Analizi gerektirir geleneksel in situ hibridizasyon teknikleri farklıdır. Burada bütün Dağı genelde bütün organizmalar12' ye anlamına gelir iken, Bütün Dağı bütün cesaret veya organları belirtir. Kene gut microbiota mimarisini değerlendirmek için bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon yaklaşımı kullanmanın yararları kesişmeyi. Kene gut boyutu16' değişen her çifti, divertikül, 7 çiftlerinden oluşur. Eğer bu divertikül arasında herhangi bir kene biyoloji, bağlamında anladım değil işlevsel farklılıklar microbiota veya kene-patojen etkileşimleri kene. Gut divertikül rüptürü manipülasyonlar, gut microbiota gut lümen veya gevşek gut microbiota kayma lokalizasyonu yanlış yorumlanmasına sonucu ile ilişkili mevcut yerinden. RNA in situ hibridizasyon floresans etiketli daha önce kene gut transkript17 sabitleme ve bireysel gut divertikül sonda hibridizasyon, B. burgdorferi yerelleştirmek üzere açma incelemek için kullanıldığında vardır transkript parafin gömülü tüm keneler18kesit tarafından. Bu her iki yaklaşımın gut microbiota mimari etkilerdi hibridizasyon önce kene dokuların manipülasyon gerektirir.

Bu raporda, Bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) kullanarak uygun kene gut microbiota incelemek için iletişim kuralı biz ayrıntılı olarak tarif. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon varlığı küresel bir anlayış ve belirli gut bakteri gut değişik bölgelerinde bolluk sağlar ve kene gut biyoloji patojen kolonizasyon bağlamında yeni görüşler teşvik ve iletim. Ayrıca, algılama kene gut uygun bakterilerin RNA probları karşı belirli bakteriyel RNA yönetmen kullanımına izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. DNA şablonları hazırlanması

  1. 16S rRNA sıra belirli bakteriyel her cins NCBI veritabanını ve tasarım polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) uyumlu ileri download ve cins özel bölgeler (~ 200-250 baz çifti uzun) daha önce anlatıldığı gibi yükseltmek astar ters 19. RNA probları bakteriyel bazı cinsler için ticari olarak olsa da aynı zamanda açık kaynak veritabanlarının SILVA20,probeBase ve21 22 için çevrimiçi kaynaklar rRNA hedefli oligonükleotid sonda ve astarlar, bakın kullanılabilir.
    Not: Özel-özel cins olan gen bölgeleri seçin ve tasarlanmış astar ilgili bakteriyel cins yükseltmek değil emin olmak önemlidir. Bu gen/cins özel sonda hibridizasyon elde etmek için önemlidir.
  2. Fareler, 24, 48 veya 72 h kene cesaret teşrih ve RNA ve açıklanan önceki23olarak kene bağırsaklar dan cDNA hazırlamak için keneler besleme. PCR şablonuna yükseltmek gibi bir thermocycler kullanarak cins özel amplicons cDNA kullanın. PCR-ürün/amplicon bir aliquot üzerinde % 1.5 özel jel çalıştırın ve amplicon için beklenen boyut görüntüleme sistemi bir jel kullanarak ultraviyole (UV) ışık altında görselleştirme tarafından karşılık geldiğini onaylayın.
  3. Bakteriyel 16S ribozomal RNA amplicon ilgi RNA polimeraz Rehberleri bakteriyofaj polimerazlar (SP6, T7 veya T3) uygun içeren bir piyasada bulunan TA vektör içine (Tablo reçetesi) klon. Amplicon kimliğini ve yön ile ilgili her Rehberleri bir klonu onaylamak için klonlar sıra. Buna göre duygusu veya antianlamlı RNA oluşturmak için seçim organizatörü (Şekil 1) probları belirlemek.
  4. Plazmid 30 µLfor üretici tarafından önerilen sıcaklıklarda 2 h reaksiyon hacmine uygun bir Restriksiyon enzimi ile 1 mg linearize. Enzimleri duygusu veya antianlamlı sonda (Şekil 1) oluşturmak için kullanılması gereken organizatörü göre seçin. 2 µL % 1'özel jel üzerinde Özet tepki görselleştirme tarafından doğrusallaştırma doğrulayın.
  5. Bir piyasada bulunan PCR ürün sütun arıtma kiti kullanılarak sindirilir DNA'ın kalan 28 µL arındırmak ve DNA toplama spektrofotometre tarafından ölçmek.
    Not: Arka plan karşılık gelen antianlamlı sonda çok daha yüksek boyama bazı anlamda probları neden olabilir ve diğer seçenekleri keşfedilmeyi gerekebilir. Alternatif negatif denetimleri örneği veya hibridizasyon kendine özgü bir model verir başka bir robot temsil edilmeyen dizileri kodlama plazmid içerir.

2. Digoxygenin-UTP RNA probları inşaatı

  1. 100 mm UTP, 10 mM digoxygenin-UTP 25 µL ve 10 µL her 100 mM ATP, GTP ve CTP 1,5 mL santrifüj tüpü içinde 7,5 µL birleştirerek nükleotit karışımı hazırlayın.
  2. Vitro transkripsiyon gerçekleştirmek piyasada bulunan T7 veya Sp6 RNA polimeraz kitleri kullanarak, 1 µL nükleotit Mix (adım 2.1) ve 0,25 - kullanarak 1 µg şablonunun DNA. Birim su ile 20 µL kadar getir. Birleştirmek ve spin darbe tüpü hafifçe vur. 2.5-3 h 37 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Sonda inşaat sindirilir plazmid konsantrasyonları 7 ng/µL düşük ama 15-25 ng/µL Bu adım mesafeden tipik konsantrasyonları ile başarılı olmuştur. Transkripsiyon tepki de gecede 37 ° C'de inkübe, ama bu önemli ölçüde RNA verim artırmaz.
  3. DNaz 1 µL ekleyin (2.000 adet/µL) ve 10 dk 37 ° C'de kuluçkaya. 10 dk fazla olamaz veya enzim RNA aşağılayıcı başlayabilir.
  4. Buz gibi 7.5-8 M Lityum klorür 30 µL ve 30 µL RNA çökelti nükleaz ücretsiz soğutulmuş su ekleyin. Karıştırmak için tüp fiske. Yağış RNA gecede-20 ° C'de devam etmek için izin
  5. Santrifüjü 17.000 x g 4 ° C'de 20 dk için de tarafından RNA toplamak Pelet kez 1 mL taze hazırlanmış % 75 etanol dietil pyrocarbonate (DEPC) su ile yıkayın, sonra aralıklarla tekrarlayın.
  6. Kaldırmak ve süpernatant atmak, tüp temiz kağıt havlu üzerine ters çevir ve 10 dk. Resuspend için Pelet nükleaz ücretsiz su kurumasını sağlar. Pelet kolayca görünür durumdaysa, 25 µL resuspend. Pelet içinde 15-20 µL. çok küçük veya görünür değil, resuspend ise RNA konsantrasyon tahmini spektrofotometre tarafından elde etmek.
    Not: 200-500 ng/µL tipik RNA konsantrasyonları arasındadır.

3. görsel olarak RNA RNA saflık değerlendirmek için RNA formaldehit jel elektroforez tarafından probları

Dikkat: Formaldehit bir inhalasyon tehlike teşkil etmektedir; Bu nedenle, RNA jel analiz bir duman Hood için gerekli çözümler üretmek. Etidyum bromür şüpheli bir kanserojen olduğu; özenle hallederim.

  1. % 1 formaldehit özel jel24 daha önce açıklanan ve jel RNases ücretsiz bir jel kutusunda döküm olarak hazırlamak. Serin bir kez, arabellek (1 x bezleri pH 7,0, %5 formaldehit) çalıştıran x 1 jel kutusunu doldurun.
  2. Örnek arabellek (5 µL 400 mg/mL arasında etidyum bromür, bezleri, 35 µL formaldehit ve 100 µL formamide x 20 µL 10) hazırlayın. RNA inceleyebilirsek (adım 2.6) 2 µL örnek arabellek 8 µL ile birleştirin. 10 dk 70 ° C'de kuluçkaya.
  3. RNA yükleme arabellek 5 mL % 50 gliserol, 1 mL % 10 formaldehit, 40 mg bromophenol mavi, 40 mg ksilen cyanol ve 0,5 M EDTA (pH 7.5) 20 µL birleştirerek hazırlayın. Bu arabellek-20 ° C'de kullandıktan sonra saklamak
  4. Yükleme arabelleği 3 µL RNA örnek adım 3.2 ekleyip karıştırın. Örnek tüpler buz üzerinde tutun.
  5. Bütün numune hacmi adım 3.4 jel yükleyin. Bir aliquot tek iplikçikli RNA merdivenin alongside RNA boyutu doğrulamak için yükleyin. Jel 100 V çalıştırmak veya mavi boya jel aşağı yaklaşık % 75'i geçirir dek indirin. Bir jel görüntüleme sistemi kullanarak UV ışık altında RNA görselleştirin.
    Not: Kaliteli RNA prob prob (Şekil 2, lane 1) beklenen boyutuna karşılık gelen bir hareketlilik ile ayrı bir grup olarak görünmesi gerekir. Eğer soruşturma bu kullanılmaması gereken bir yaygın ve smeary band (Şekil 2lane 2) görünür.

4. Gut koleksiyonu ve fiksasyon kene

  1. Zaman ilgi için fareler üzerinde beslenen Ixodes scapularis perileri toplamak.
    Not: Bu teknik amacı gereği, 48 veya 72 s iş için en iyi keneler beslenir.
  2. Kene gelen bağırsak MEMFA (Tablo 1) mümkün olduğunca çok organ hasar kaçınarak bir diseksiyon mikroskop altında bir cam slayt üzerinde incelemek. Bir kene MEMFA 20-30 µL içinde temiz mikroskop slayttaki bir yer. Steril yüksek karbon çelik tıraş bıçağı #11 dilim baş bölge çifti kene kene vücut bırakarak kalkan kullanarak. Gut divertikül ve tükürük bezleri vücut kütikül dışarı itmek için vücut hafifçe bastırın. Tükrük bezleri ve gut ayırmak ve cesareti jilet üzerinde oymak.
  3. Cesaret 500 µL MEMFA içeren bir 1,5 mL tüp içine toplamak. Nazik 1 h için sallanan ile Oda sıcaklığında tüp kuluçkaya veya bir gece 4 ° C'de
    Not: Kene tükürük bezleri de disseke ve benzer şekilde sabit lekeli ve.
  4. Doku yavaşça 1 mL buz gibi % 100 etanol ile 3 kez yıkayarak kurutmak. Santrifüjü doku zarar verebilir gibi doğal olarak her yıkama arasında tüp altına lavabo cesaret ver. Uzun süreli depolama için örnekleri-20 ° C'de % 100 etanol içinde tutmak

5. inşaat kafes örnek sepetleri ve 24-şey sepet tutucu

  1. Dipleri 2 mL veya 5 mL kapalı ısıtmalı tek taraflı jilet bir neşter kullanarak ek alıcı santrifüj tüpleri kesti.
    Dikkat: Bıçak kesim tamamlamadan önce birkaç kez yeniden isitilan gerekebilir.
  2. 110 µm naylon mesh karelerinin biraz yeni tüp açılış daha büyük kesti. Tüp altına mesh iyi bir mühür yapılana kadar onları birlikte hafifçe sıcak bir tabak orta-düşük ateşte basarak bond. Soğumaya bırakın, mesh ve tüp arasında boşluk olduğundan emin olun ve aşırı kafes kenarları kırpın.
  3. Öyle ki adım 5,2 yapılan örnek sepet dudak Hole'da oturmak ve aracılığıyla, nerede örnek sepetleri dipleri oturup ta wells içinde konulduğunda bir set-up verimli değil düşmek bir 24-şey plaka kapak delik kesme kapak delik.
  4. Bu monte sepet tutucu sepetleri bir tabak içinde in situ hibridizasyon Protokolü tamamı için göreli kolaylıkla diğerine aktarmak için kullanın. Bir kuluçka meydana gelen iken, diğer plaka için sonraki yıkama hazırlanan iki 24-şey tabak kullanın.

6. in Situ hibridizasyon: 1. gün (zamanlama: 4-5 h)

  1. Transfer cesareti için örnek sepetleri etiketli, deneysel koşulla ayrılmış ve RNA sonda amaçlanan.
    Not: koşul çoğaltır arasında doğal varyasyon için hesap başına en az 5 cesaret leke.
  2. Yavaşça hava kabarcıkları dokusu içine yavaş yavaş serum fosfat tamponlu %0.1 non-iyonik yüzey aktif (PTw; oranını artırarak tanıtımı önlemek için örnekleri suyla temasa Tablo 1) etanol için yıkar.
    Not: Komple tüm 24-şey sepet sahibi nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığı, aksi belirtilmediği sürece yıkar. Aliquot 500-600 µL yıkama çözümler içine cesaret her sepette tamamen batık her tür sahibinin. RNA yıkımı önlemek için su DEPC tedavi ile tüm çözümleri hazırlayın.
    1. Örnekleri 5 min için 500 µL % 100 etanol içinde yıkayın.
    2. % 75'i örnek sepet başına en az 500 µL hazırlamak, % 50 ve % 25 etanol içinde PTw. örnekleri 5 dakika içinde en yüksek etanol konsantrasyon en düşük hareket her etanol çözüm yıkanmasında tarafından suyla temasa.
    3. 4 kere 5 min için örnekleri PTw içinde yıkayın.
  3. Örnekleri İndinavir K ile permeabilize (10 µg/mL) PTw 5 dk içinde.
  4. Doku hibridizasyon için RNA probları ile hazırlayın.
    1. İki kez 6.2 500 µL trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) her 5 min için nazik ajitasyon ile ortam sıcaklığında 24-şey sepet tutucu (örnekleri Amin-Alerjik bir ortamda korumak için,Tablo 1) açıklandığı gibi örnekleri yıkayın.
    2. Trietanolamin tampon (0.1 M, pH 7,0-8.0) 5 min için örnekleri iki kez 500 µL % 0,25 asetik anhidrit ile tedavi, sonra örnekleri PTw 5 min için iki kez yıkayın.
      Not: Non-spesifik elektrostatik etkileşimler önlemek ve mRNA için sondanın özel bağlayıcı emin olmak çok önemlidir olumlu şarj etkisiz hale getirmek için ücretsiz aminler asetik anhidrit acetylates.
    3. PTw 500 µL % 4 paraformaldehyde ile 20 dk için cesaret düzeltmek, daha sonra 5 kere 5 dk her PTw içinde yıkayın.
    4. 500 µL hibridizasyon arabellek /in titreyen bir su banyosu içinde nazik ajitasyon ile 24-şey sepet sahibi için 1,5-2,5 h 60 ° C'de 24 iyi plaka (Tablo 1) örneklerinde kuluçka tarafından prehybridize. Gün 2 Protokolü (adım 7.1) yeniden kullanmak için prehybridization adım hibridizasyon arabelleği kaydedin.
    5. Sonda hibridizasyon çözümleri RNA sondalar son konsantrasyonu 1 µg/ml hibridizasyon arabellekte sulandrarak hazırlayın.  Kuluçkaya gecede, titreyen bir su banyosu (Tablo 2) nazik ajitasyon ile 60 ° C'de 24-şey sepet tutucu prob hibridizasyon çözümleri ile örnekleri. Hibridizasyon çözüm buharlaşma önlemek için sepet tutucu alüminyum folyo ile rahatça taşıyan plaka kapak.

7. in Situ hibridizasyon: 2. gün (zamanlama: 4.5-5.5 h)

  1. Örnekleri sonda hibridizasyon çözümlerinden kaldırmak ve önceki gün ayrılmış hibridizasyon arabelleğinden içine koyun. 3 min için nazik ajitasyon ile 60 ° C'de kuluçkaya.
    Not: Sonda hibridizasyon çözümleri-20 ° c yeniden kullanım için ilâ 3 kere depolanabilir.
  2. Serum sodyum sitrat arabellek (SSC) x 2 sulandrarak 20 tarafından hazırlamak x SSC DEPC tedavi su (Tablo 1). Örnekleri 3 dk ile 2 x SSC için iki kez, o zaman 2 ile 20 dk için 3 kez yıkayın x SSC 60 ° C'de sonda ve hibridizasyon arabelleği tüm izlerini silmek için.
  3. Bir (20 µg/mL) ve RNase T RNase ile tedavi1 (10 µg/mL) 2 x SSC 37 ° C'de 30 dk için tek kaldırmak için zor durumda RNA prob ücretsiz temsil eden sigara-melezleşmiştir RNA.
  4. 2 ile bir kez yıkama x SSC oda sıcaklığında 10 dakika için. 0,2 hazırlamak sulandrarak 2 tarafından x SSC suda DEPC tedavi x SSC sonra iki kez 0,2 ile yıkayın aşırı RNases kaldırmak için x SSC 60 ° C'de 30 dk için.
  5. Maleik asit tampon (MAB; 500 µL ile iki kez yıkamak Tablo 1) 10 dakikadır her.
  6. 1.5-2 h için çözüm (MAB % 2 engelleme reaktif) engelleme ile örnekleri kuluçkaya.
    Not: Engelleme reaktif çözülmeye zor olabilir; nazik Isıtma dağılmasına yardımcı olur.
  7. Anti-digoxigenin alkalin fosfataz Birleşik 500 µL çözüm engelleme 1:3,000 seyreltme, antikor, engelleme çözüm yerine ve yaklaşık 4 h için oda sıcaklığında veya 4 ° C'de gecede kuluçkaya.

8. in Situ hibridizasyon: 3. gün (zamanlama: bir gecede 6 h)

  1. Örnekleri ile 500 µL MAB aşırı antikor kaldırmak için her 30 dk için en az 5 kez yıkayın.
    Not: Bu yıkama esnektir ve 1-2 h için uzatılabilir veya 3-4 yıkama etkinliği en az düzeyde etkisi ile 4 ° C'de bir gecede yıkama için yerine olabilir.
  2. Alkalen fosfataz arabelleği, pH 9,5 (AP arabellek; ile 5 min için iki kez yıkamak Tablo 1).
  3. Son yıkama chromogenic substrat alkalen fosfataz (Tablo reçetesi) için 500 µL değiştirerek renk reaksiyon başlar. Alüminyum folyo ile örnek plaka kapak ve 3 - 5 s veya 4 ° C'de gece için oda sıcaklığında devam boyama izin Boyama reaksiyonu belirli aralıklarla overstaining önlemek için diseksiyon mikroskop altında doku görüntüleyerek izlemek.
    Not: boyama tamamlandığında, bir mor renk tonu gözlerinin içine mikroskop altında antisens probed örnekleri tarafından algılanabilir ama doku çok karanlık olmak için izin verilmemelidir. Boyama 4 ° C'de çok yavaş devam eder ve en fazla 20-24 saat sürebilir.
  4. 5 dakika içinde 500 µL MAB yıkanmasında tarafından renk reaksiyonu ve ardından doku gecede Bouin'ın çözümde düzeltmek.
    Dikkat: Bouin'ın çözüm bir duman başlıklı işlemek; aşındırıcı bir kanserojen olduğu.

9. in Situ hibridizasyon: 4 gün (zamanlama: 3-3.5 h)

  1. 1 örnek sepet başına en az 7 mL hazırlamak sulandrarak 20 x SSC su DEPC tedavi x SSC. Bouin'ın çözüm 1'örnekleri 4-6 kez % 70 etanol ile yıkayarak çıkarın doku artık sarı olana x SSC.
  2. %1 75, % 50 ve % 25 etanol çözümlerinde örnek sepet başına 500 µL hazırlamak x SSC. Örnekleri 5 min için en yüksek etanol konsantrasyon en düşük için doku rehydrate hareketli her çözümde yıkayın. İki kez 5 dk içinde her 1 yıkama x SSC.
  3. Çamaşır suyu çözüm (Tablo 1) örneklerinde bir duman başlıklı bir lightbox üzerinde 90 dk için kuluçkaya.
    Not: Bu adım herhangi bir pigmentasyon örnekleri veya Bouins eriyik-e doğru var olmak çıkarmak--dan renklendirme sağlar ve sonda sinyal açık görselleştirme için geliştirir.
  4. 1 500 µL iki kez örnekleriyle yıkama x SSC 5 min için.
  5. Çok az hasar bağırsaklarıyla örnek sepet yeni bir 24-şey plaka bir kuyunun içine ters çevirme tarafından yeniden konumlandırmak ve % 70 etanol transfer pipet kullanarak kafes alt aracılığıyla ile yıkayın. -20 ° C'de gerekirse depolar.
  6. Şekil 3' te, gösterildiği gibi birden fazla örnekleri boyama şekillerinin genel bir bakış elde etmek için herhangi bir alan parlak mikroskopla % 70 etanol 24 iyi-plaka ve görünüm cesaret korumak. Şekil 4, Şekil 5' de gösterildiği gibi bireysel cesaret alan parlak mikroskop altında incelemek için, ve Şekil 6, %100 gliserol coverslips altında cesaret dağ. Bir plastik spatula yavaşça en az hasarla doku işlemek için kullanın.
    Not: Gliserol yüksek viskozite doku sıkıştırma tarafından neden olduğu zararlara karşı korunmasına yardımcı olur ve doku daha yüksek büyütme oranlarında en iyi şekilde görüntülenebilir öyle ki divertikül dikkatli konumlandırma sağlar.
  7. Esir alma imge üstünde mikroskop mikroskop belirli görüntü yakalama yazılımı (Tablo reçetesi) kullanarak ve genel bir resim düzenleme yazılımı için TIFF görüntü olarak dışa aktarın. Deneysel tedaviler göreli Boyama farklılıkları ölçmek için genel görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) yükleyin. Görüntüyü analiz yazılımı içinde açın ve boyama piksel yoğunluğu ölçümü ve boyama çubuk grafik araziler hesaplamak için belgili tanımlık öğretim içinde belgili tanımlık bilgisayar yazılımı kullanın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ölçüm ve RNA probları kalitesinin tahmini boyama başlamadan önce kritik öneme sahiptir. Vitro transkripsiyon verimliliği yüksek miktar ve kalite meydana bağlıdır. Biz düzenli olarak RNA probları saflık ve sonda transkripsiyon reaksiyonlar tarafından oluşturulan miktarı doğrulamak için bir formaldehit jel üzerinde görüntülenir. Sondalar parlak, ayrı gruplar (Şekil 2) görünmesi gerekir. RNA konsantrasyon spektrofotometrik ölçümler jel bands görünümü ile de son derece sonda kalite göstergesidir ve ilişkili idi. Böylece, jel görselleştirme adım protokol ile aşinalık elde sonra istenirse atlanabilir. Her iki durumda da yeterli RNA yüksek kalitede üretilen tüm akış yönündeki adımlar sondalar sağlamlık bağlıdır gibi emin olmak önemlidir.

Bu teknik gücü varlığı ya da yokluğu bakteriyel türler, bereket kene akışları olarak zamanla bakterilerin ve yerelleştirme türlerin bütün doku içinde değişiklikler de dahil olmak üzere kene microbiota hakkında geniş gözlemler kolaylaştırmak olduğunu. Bu nedenle, iyisi ortalama bir fikir edinmek için koşul başına en az beş cesaret leke tutar ve dağıtım boyama içinde biraz değişme miktarı normal biyolojik çoğaltır arasında yanı sıra bireysel cesaret ister (Şekil 3), divertikül 7 çiftleri arasında boyama desen. Protokol genel başarısı her koşul için anlam ve antisens örnekleri boyama karşılaştırarak en iyi ölçülür. Anlamda örnekleri, analiz, bu tür için önemli negatif denetimleri mor renk (Şekil 4) için en az olmalıdır. Diğer taraftan, antianlamlı örnekleri hangi yoğunluğunu hedeflenmiş belirli bakteriyel transkript bereket on bağlı olacaktır en az arka plan ile sağlam boyama görüntülenmelidir. Boyama desen doku içinde de bu parametrelere göre değişir. Önemlisi, anlam ve antianlamlı örnekleri aynı süre için doğrudan bu örnekler paralel işlenmesi bu yüzden onları karşılaştırmak için geliştirilmelidir. Overdevelopment renk tepki arka plan boyama, anlam örnekleri antisens (Şekil 5) benzer başladığı yüksek miktarda neden olabilir. Gerçekleştiği bir kez tepki ters yolu olarak belirli iletişim kuralı bu aşamada overstaining, önlemek için özen gösterilmelidir.

Tüm cesaret tamamen her reaktif her adımı sırasında batık emin olmak önemlidir; değişim örnekleri arasında bir artış reaktifler düzensiz maruz olabilir. Tutarı zaman cesaret toplanan önce keneler beslenir da sonuçları üzerinde önemli bir etkisi vardır. Tartılı veya sadece 24 saat beslenir keneler ile çalışmak zor; cesareti vardı da daha kolayca zarar görebilir ve leke değil de (Şekil 6) ve bu yaklaşım şu anda bir kısıtlamadır. 48-72 saat için bu cesur cesaret için 24 h cesaret için daha sonra zaman puan beslenen keneler üzerinden karşılaştırıldığında daha büyük boyutu nedeniyle çalışmak en kolay beslenen keneler da büyük olasılıkla daha sonraki aşamaları o sırasında bakteriyel yük artışlar nedeniyle 24 h beslemeli keneler daha iyi lekeli f besleme. 72-h doku kez kan gelen kahverengi renk tonu hafif bir arka plan vardı ama mor boyama renk tonu (Şekil 4) üzerinde açıkça görülebiliyordu. Cesaretin en iyi düşük büyütmede (5 X veya 10 X) bir alan parlak mikroskop kullanarak tüm doku arasında boyama desenleri görüntülemek için görüntülenebilir. Bütün-dağ dokusu yüksek büyütmede gibi petrol amaç, X 63 görüntüleme amacı karşı slayt tuşuna basın ve doku örnekleri kalınlığı nedeniyle sıkıştırmak gibi doku zarar riski çalışır. Daha yüksek kararlılık düşsel isterseniz, doku kesit için potansiyel incelenmesi gerekir.

Figure 1
Resim 1 . Sonda üretimi için şablon hazırlanması şematik. 16S rRNA amplicon T7 ve Sp6 Rehberleri içeren vektör klonlama bir TA kopyalayın. Siteleri bir veya b vitro transkripsiyon T7 veya Sp6 organizatörü duygusu veya antisens probları sırasıyla üretmek için kullanma için kesmek için enzimleri kullanarak yapı linearize. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2 . RNA yoklama jel elektroforez ile görselleştirme. RNA problar (~ 700 ng) UV ışık altında görüntülenir ve ticari bir jel görüntüleme sistemi kullanarak yansıma bir formaldehit özel jel, electrophoresed. Bir temsilci kaliteli, lane 1; ve kalitesiz RNA prob, lane 2.

Figure 3
Şekil 3 . 48 h beslemeli cesaret bütün-mount situ hibridizasyon temsilcisi bir bakış. Cesaret keneler üzerinden beslenen 48 h antisens RNA ile bir korunmuş 16S ribozomal RNA dizisine tamamlayıcı lekeli fark gut divertikül boyama gösterir. Ölçek çubuğu temsil eden 200 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 . Başarılı temsilcisi görüntüleri tüm- in situ hibridizasyon Ixodes scapularis cesaret içinde monte edin. Belirtilen süreyi için beslenen keneler gelen cesaret lekeli her iki anlamda (negatif kontrol) kullanarak veya antisens RNA sondalar. Antianlamlı probları korunmuş 16S ribozomal RNA dizisi (Evrensel 16S) veya belirli bir bakteriyel cins (belirtildiği gibi) belirli bir 16S RNA dizisi için tamamlayıcı. Enterokok değil sağlam 48 h'de ölçek çubukları temsil 140 µm. boyama verim Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 . Uzun süreli chromogenic reaksiyon zamanı yol non-spesifik boyama için. Bağırsaklar için 48 h beslenen keneler üzerinden bir anlamda RNA sonda veya bir antianlamlı sonda bir korunmuş 16S RNA dizisine tamamlayıcı probed. Doku reaksiyonu durdurmadan önce alkalen fosfataz substrat BM gecede 4 ° C'de ve oda sıcaklığında yaklaşık 4 h için mor ile inkübe. Ölçek çubukları temsil 140 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 . Bütün-mount situ hibridizasyon tartılı kullanarak veya 24 h beslenen kene cesaret. Cesaret tartılı veya 24 h beslemeli keneler üzerinden lekeli anlamda RNA problar kullanarak veya antisens probları korunmuş 16S RNA dizisi veya cins için belirli bir sıra için tamamlayıcı Rickettsia'nin. Antianlamlı örnekleri boyama sonraki zaman noktalarda gözlenen daha az sağlam ve cesareti de daha kolayca zarar görebilir. Ölçek çubukları temsil 60 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Adı Son konsantrasyonları Son pH Depolama notlar
MEMFA 0,1 M BEZLERİ - Oda sıcaklığında
2 mM EGTA
1 mM magnezyum sülfat
%3.7 formaldehit
PBS-ara (PTw) 1 x PBS, % 0,1 ara-20 7.0 Oda sıcaklığında
% 0.1 ara-20
Trietanolamin arabellek 1 x PBS 7.0-8.0 Oda sıcaklığında
0,1 M trietanolamin
Hibridizasyon arabellek % 50 formamide - -20 ° C
5 x SSC
1 mg/mL Torula RNA
100 µg/mL heparin
Denhart'ın çözüm x 1
% 0.1 ara-20
%0.1 DERİ PANTOLON
10 mM EDTA
Maleik asit tampon (MAB) 100 mM Maleik asit 7.0 Oda sıcaklığında
150 mM sodyum klorür
Alkalen fosfataz (AP) arabellek 100 mM Tris 9.5 -20 ° C
50 mM magnezyum klorür
100 mM sodyum klorür
% 0.1 ara-20
5 mM levamisol
Çamaşır suyu çözüm %1 hidrojen peroksit - Taze hazırlamak
%5 formamide
0,5 x SSC

Tablo 1. Yemek tarifleri iletişim kuralında kullanılan çözümler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu bir eklem bacaklılar vektör patojenlerin microbiota çalışmaya bir bütün-mount situ hibridizasyon (WMISH) tekniği ilk kullanmaktır. Bizim iletişim kuralı bir geliştirme Drosophila ve kurbağa embriyosu25,26çalışırdım adapte oldu. Bütün Dağı RNA in situ hibridizasyon gen transkript dağınık şekilde yerelleştirmek için rutin olarak kullanılmıştır ve geçici27 ve transkript görselleştirme parlak alana göre veya floresan mikroskopi yapılabilir. Kene cesaret microbiota tespiti doğru eski benimsedik. Bu hangi baş bölgesi penetrasyon sabitleştirici ve hibridizasyon çözümleri başarılı olmadı izin kaldırıldı tüm keneler kullanarak bütün-mount situ hibridizasyon gerçekleştirmeye çalışır unutmamak gerekir. Burada açıklanan protokol disseke cesaret kullanır ve midgut23yılında bakteriyel kolonizasyon belirli kene proteinler etkilerini incelemek için uygulamaya konmuştur. WMISH elde edilen bilgilerle immünhistokimya için karşılaştırılabilir ama protein ve gen antikor üretimi veya protein ilgi gerektiren değil avantajı vardır. Genomik bilgi reaktifleri WMISH için oluşturmak yeterlidir. WMISH ve balık (floresans in situ hibridizasyon) gen ekspresyonu algılayabilir. Ancak, o bir enzimatik ve Kromojen tabanlı tahlil varlık nedeniyle, WMISH renk geliştirme aktif olarak takip edilebilir ve tepki kadar istenen sinyal devam etmek için izin ve hassasiyet elde avantajı vardır. Bu Otomasyon için tam mükellef ve yüksek üretilen iş biçimine kolayca ölçeklenebilir. Balık ve immünhistokimya aksine, hiçbir kesit gereklidir. WMISH balık üzerinde sadece 2 farklı mRNA'ların veya genlerin aynı anda ele alınması ve sondalar digoxigenin-UTP ve floresein-UTP28gibi farklı nükleotid analogları ile etiketlenmesi gerekir dezavantajdır. Balık ile en fazla 6 farklı mRNA'ların bir tahlil29incelenebilir. Her iki deneyleri karşılaştırılabilir zaman gerektirirken, floresan boyalar maliyetini chromogenic yüzeylerde daha yüksek. WMISH görüntü görselleştirme herhangi bir ışık mikroskobu ile yapılabilir süre balık deneyleri de floresan mikroskop görüntü görselleştirme için gerektirir.

Bu protokol yakından takip çok önemlidir; Ancak, özel dikkat gerektiren bazı adımlar vardır. Diseksiyon midgut doku zarar olmadan kene gelen bazı beceri gerektirir. Gruptakiler pratik ve yeterlik kazanmak için ilave keneler toplamak ihtiyatlı olabilir. Bireysel cesareti (Şekil 3) farklı divertikül içinde boyama heterojenite nedeniyle, bakteriyel bereket kesin kanıtlar türetmek için her gut tüm divertikül incelemek önemlidir. Varlığı, kayma dağıtım ve bereket farklı divertikül içinde belirli bakterilerin kesin bilgi elde etmek için deneysel her koşul için birkaç cesaret (en az 5) işlemek önemlidir. Yüksek kaliteli RNA probları üretiminde etkili doku boyama için önemlidir. Ayrıca o antisens sağlamak için klonlama vektör sonda şablonunda dizisi onaylamak çok önemlidir ve anlamda probları uygun şekilde üretilir. Bir üretken vitro transkripsiyon tepki yeterli şablonu DNA gerektirir; en az 100 ng-var olmak kullanılmış, ancak 0,5 - 1 µg en iyi sonda üretimi için tavsiye edilir.

Örnek sepetleri ve bu iletişim kuralı 24-şey levha boyama işlemi sırasında zarar en aza indirir her yıkama adımında doku doğrudan manipülasyonu önler. Ancak, örnekler hala zaman zaman kaybolması veya zarar görmesi; bağırsaklar dan tartılı veya 24h beslemeli keneler, özellikle, zor görmek ve örnek sepetleri için uzun vadeli bir saklama kabı aktarırken kaybetmek kolay. Bu örnekleri taşıma sırasında ek bakım alınmalıdır. Bu sınırlama nedeniyle, esas olarak 48 ve 72 h beslemeli kene cesaret kullandık. Bu zaman-puan (72 h uzun) bağırsağına kan yemek büyük miktarda varlığı boyama ve görselleştirme kan unu belirsiz arka plan nedeniyle etkilemektedir ve de bir sınırlama bu tekniğin sunar. Probları fluorescently etiketli kullanımı bu sorunu aşmak muhtemeldir.

Boyama yordam en önemli sağlam boyama ve düşük arka plan sinyal arasındaki dengeyi kurmak için olanıdır. İdeal renk geliştirme zamanlaması deneysel koşullarına bağlı olarak değişebilir. Böylece, oda sıcaklığında ve monitör renk gelişim yaklaşık her 30 dakika renk reaksiyonu gerçekleştirmek en iyisidir. Tepki de gecede 4 ° C renk geliştirme yavaşlatmaya devam etmek için ayarlanmış olabilir. Ancak, uzun süre devam Bu reaksiyon değil izin vermek için son derece önemlidir. Boyama reaksiyonu örneklere diseksiyon mikroskop altında incelenmesi gerekir bu yüzden göz göre izlemek zor olabilir. Bir mor renk örnekleri RNA minimal renk tutmak gerekir duygusu ile probed iken antianlamlı RNA ile probed örnekleri üzerinde görünür olmalıdır. RNA probed anlamda örnekleri parlak leke, sorun giderme adımlarını BM mor ile kuluçka süresini azaltmak ve engelleme zaman artan ile başlamalıdır. Bazen anlam probları antianlamlı probları göre anormal derecede yüksek arka plan neden olabilir; Bu gibi durumlarda, farklı bölgelerde genin RNA probları üretmek için dikkate alınması gerekebilir. Verilen örnekte temsil edilmeyen DNA dizileri de negatif kontrol probları oluşturmak için şablon olarak düşünülebilir. Örneğin, bir bölge kene genom veya onun microbiome temsil edilmeyen yeşil flüoresan protein kodlama DNA şablon-ebilmek var olmak kullanmak.

Bu teknik bir sınırlama analizi büyük ölçüde nitel olmasıdır; Ancak, görüntü analiz yazılımı (Tablo reçetesi) her örnek içinde boyama sinyal miktarını ölçmek için kullanılabilir. Bu bakteri türleri çeşitli deneysel koşullarda bolluk yarı kantitatif karşılaştırılması sağlayacak. Bu 3-4 gün tamamlamak için alır zaman alıcı bir iletişim kuralı olmakla birlikte, zahmetli değildir; Her gün eller sadece yaklaşık 3-5 h ortalama zamanı. Ancak, pek çok örnekleri örnek sepetleri ve sahipleri ile paralel işleme yeteneği yüksek üretilen iş analiz için izin verir. Ayrıca, bu işlem piyasada bulunan aletler kullanarak otomatik hale getirilebilir (malzemeler tablo) bu iletişim kuralı bir temel ve rutin bileşeni kullanarak araştırma laboratuvarı piyasada olması bekleniyor Eğer Otomasyon uyumlu platformlar (Tablo reçetesi) daha fazla uygulamalı süresini azaltın.

Açıklanan protokolü kullanarak parlak alan mikroskobu görüntüsü kolorimetrik bir sinyal üretimini sağlayan digoxygenin etiketli probları kullanır. Bir chromogenic substrat melezleşmiştir RNA probları belirli bireysel hedefleri algılamak için kullanılan iken, sonda digoxigenin-UTP gibi farklı nükleotid analogları ile etiketleme tarafından aynı anda birden çok hedef algılamaya mümkündür ve Fluoresein-UTP ve farklı chromogenic yüzeylerde30. Doku örnekleri sonra sırayla digoxigenin ve iki adımı için farklı chromogenic tepkiler ile floresein karşı antikor alkalin fosfataz birleştiğinde ile inkübe. Bu teknik aynı zamanda daha yüksek çözünürlükte görüntüleme confocal mikroskobu31 kullanarak kolaylaştırmak ve farklı renklerde birden fazla probları paralel olarak kullanma seçeneği sağlar fluorescently etiketli probları için adapte olabilir. Bu teknik yalnızca özellikle birkaç mikroorganizmaların bir anda bir örnek olarak değerlendirebilirsiniz. Ancak, çeşitli örnekleri kene microbiota temsil birden fazla mikroorganizmaların adrese yüksek üretilen iş deneyleri içinde değerlendirilebilir.

Son olarak, bu teknik keneler ve onların ilişkili microbiota arasındaki etkileşimler incelenmesi için sınırlı değildir. Sonda tamamlayıcı kene genom içinde ilgi herhangi bir gen için oluşturulan ve bolluk ve yerelleştirme belirli genlerin farklı dokularda incelemek için kullanılan. Kene tükürük bezleri de işlenen ve benzer şekilde gut için analiz edilebilir. Genel olarak, bu teknik mikrobiyal topluluklar diğer eklem bacaklılar hastalık vektör ilgi içinde dinamikleri üzerinde uyum çalışmaları için geniş potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Acknowledgments

Biz içtenlikle Dr. Mustafa Khokha, Yale Üniversitesi, onun laboratuvar kaynaklarının kullanımını sağlamak için teşekkür ederiz. Mükemmel teknik yardım için Bay Ming-Jie Wu için sana şükrediyoruz. EF HHMI dedektif olduğunu. Bu eser bir hediyesi John Monsky ve Jennifer Weis Monsky Lyme hastalığı araştırma fonu tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sefar NITEX Nylon Mesh, 110 micron Amazon 03-110/47
pGEM-T Easy Vector System Promega A1360
Digoxygenin-11-UTP Roche 1209256910
dNTP New England Biolabs  N0447S
DNAse I(RNAse-free) New England Biolabs M0303S
HiScribe SP6 RNA synthesis kit New England Biolabs E2070S
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit New England Biolabs E2040S
Water, RNase-free, DEPC-treated American Bioanalytical AB02128-00500
EDTA, 0.5M, pH 8.0 American Bioanalytical AB00502-01000
Formaldehyde, 37% JT Baker 2106-01
Formamide American Bioanalytical AB00600-00500
EGTA Sigma Aldrich E-4378
DPBS, 10X Gibco 14300-075
Tween-20 Sigma Aldrich P1379-25ML
Proteinase K Sigma Aldrich 3115879001
Triethanolamine HCl Sigma Aldrich T1502-100G
Acetic anhydride Sigma Aldrich 320102-100ML
Paraformaldehyde ThermoScientific/Pierce 28906
SSC, 20X American Bioanalytical AB13156-01000
RNA from torula yeast Sigma Aldrich R3629-5G
Heparin, sodium salt Sigma Aldrich H3393-10KU
Denhardt's Solution, 50X Sigma Aldrich D2532-5ML
CHAPS hydrate Sigma Aldrich C3023-1G
RNase A Sigma Aldrich 10109142001
RNase T1 ThermoScientific  EN0541
Maleic acid Sigma Aldrich M0375-100G
Blocking reagent Sigma Aldrich 11096176001
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Sigma Aldrich 11093274910
Levamisol hydrochloride Sigma Aldrich 31742-250MG
Chromogenic substrate for alkaline phosphatase Sigma Aldrich 11442074001
Bouin's solution Sigma Aldrich HT10132-1L
Hydrogen peroxide Mallinkrodt Baker, Inc 2186-01
Single stranded RNA ladder Ambion -Millenium AM7151
 #11 High-Carbon steel blades  C and A Scientific Premiere #11-9411
Thermocycler BioRad, CA 1851148
Spectrophotometer ThermoScientific  NanoDrop 2000C
Orbital shaker VWR DS-500E Digital Orbital shaker
Shaking water bath BELLCO Glass, Inc Hot Shaker-7746-12110
Gel  documentation system BioRad Gel Doc XR+ Gel documentation system
Bright-field Microscope  Nikon NikonSM2745T
Bright-field Microscope  Zeiss AXIO Scope.A1
Dissection microscope  Zeiss STEMI 2000-C
 Light box VWR 102097-658
PCR purification kit  Qiagen 28104
Image capture software Zeiss Zen lite
Image editing software  Adobe  Adobe Photoshop CS4 version 11.0
Image analysis software National Institutes of Health ImageJ-NIH /imagej.nih.gov/ij/
Automation compatible instrumentation Intavis Bioanalytical Instruments, Tubingen, Germany).  Intavis, Biolane HT1.16v

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leitner, W. W., Wali, T., Kincaid, R., Costero-Saint Denis, A. Arthropod Vectors and Disease Transmission: Translational Aspects. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (11), e0004107 (2015).
  2. Hooper, L. V., Gordon, J. I. Commensal host-bacterial relationships in the gut. Science. 292 (5519), 1115-1118 (2001).
  3. Ley, R. E., Lozupone, C. A., Hamady, M., Knight, R., Gordon, J. I. Worlds within worlds: evolution of the vertebrate gut microbiota. Nature Review Microbiology. 6 (10), 776-788 (2008).
  4. Narasimhan, S., Fikrig, E. Tick microbiome: the force within. Trends in Parasitology. 31 (7), 315-323 (2015).
  5. Weiss, B., Aksoy, S. Microbiome influences on insect host vector competence. Trends in Parasitoly. 27 (11), 514-522 (2011).
  6. Degli Esposti, M., Martinez Romero, E. The functional microbiome of arthropods. PLoS One. 12 (5), e0176573 (2017).
  7. Radolf, J. D., Caimano, M. J., Stevenson, B., Hu, L. T. Of ticks, mice and men: understanding the dual-host lifestyle of Lyme disease spirochaetes. Nature Reviews Microbiology. 10 (2), 87-99 (2012).
  8. Sojka, D., et al. New insights into the machinery of blood digestion by ticks. Trends in Parasitology. 29 (6), 276-285 (2013).
  9. Grigor'eva, L. A. Morphofunctional changes in the midgut of Ixodid ticks during the life cycle. Entomological Review. 90, 405-409 (2010).
  10. Goodrich, J. K., et al. Conducting a microbiome study. Cell. 158 (2), 250-262 (2014).
  11. Salter, S. J., et al. Reagent and laboratory contamination can critically impact sequence-based microbiome analyses. BMC Biology. 12, 87 (2014).
  12. Hemmati-Brivanlou, A., et al. Localization of specific mRNAs in Xenopus embryos by whole-mount in situ hybridization. Development. 110 (2), 325-330 (1990).
  13. Frank, D., Harland, R. M. Transient expression of XMyoD in non-somitic mesoderm of Xenopus gastrulae. Development. 113 (4), 1387-1393 (1991).
  14. Harland, R. M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos. Methods in Cell Biology. 36, 685-695 (1991).
  15. Kernohan, K. D., Berube, N. G. Three dimensional dual labelled DNA fluorescent in situ hybridization analysis in fixed tissue sections. MethodsX. 1, 30-35 (2014).
  16. Sonenshine, D. E. Biology of ticks. , Oxford University Press. (1991).
  17. Narasimhan, S., et al. Gut microbiota of the tick vector Ixodes scapularis modulate colonization of the lyme disease spirochete. Cell Host Microbe. 15 (1), 58-71 (2014).
  18. Hammer, B., Moter, A., Kahl, O., Alberti, G., Gobel, U. B. Visualization of Borrelia burgdorferi sensu lato by fluorescence in situ hybridization (FISH) on whole-body sections of Ixodes ricinus ticks and gerbil skin biopsies. Microbiology. 147 (Pt 6), 1425-1436 (2001).
  19. Harmsen, H. J., Raangs, G. C., He, T., Degener, J. E., Welling, G. W. Extensive set of 16S rRNA-based probes for detection of bacteria in human feces. Applied Environmental Microbiology. 68 (6), 2982-2990 (2002).
  20. Quast, C., et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research. 41 (Database issue), D590-D596 (2013).
  21. Yilmaz, P., et al. The SILVA and "All-species Living Tree Project (LTP)" taxonomic frameworks. Nucleic Acids Research. 42, D643-D648 (2014).
  22. Greuter, D., Loy, A., Horn, M., Rattei, T. probeBase--an online resource for rRNA-targeted oligonucleotide probes and primers: new features 2016. Nucleic Acids Research. 44, D586-D589 (2016).
  23. Narasimhan, S., et al. Modulation of the tick gut milieu by a secreted tick protein favors Borrelia burgdorferi colonization. Nature Communication. 8 (1), 184 (2017).
  24. Bryant, S., Manning, D. L. Formaldehyde gel electrophoresis of total RNA. Methods Molecular Bioliogy. 86, 69-72 (1998).
  25. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98 (2), 81-85 (1989).
  26. Robson, A., Owens, N. D., Baserga, S. J., Khokha, M. K., Griffin, J. N. Expression of ribosomopathy genes during Xenopus tropicalis embryogenesis. BMC Development Biology. 16 (1), 38 (2016).
  27. Khokha, M. K., et al. Techniques and probes for the study of Xenopus tropicalis development. Developmental Dynamics. 225 (4), 499-510 (2002).
  28. Jowett, T., Lettice, L. Whole-mount in situ hybridizations on zebrafish embryos using a mixture of digoxigenin- and fluorescein-labelled probes. Trends in Genetics. 10 (3), 73-74 (1994).
  29. Behnam, F., Vilcinskas, A., Wagner, M., Stoecker, K. A straightforward DOPE (double labeling of oligonucleotide probes)-FISH (fluorescence in situ hybridization) method for simultaneous multicolor detection of six microbial populations. Applied Environmental Microbiology. 78 (15), 5138-5142 (2012).
  30. Pai, V. P., et al. HCN4 ion channel function is required for early events that regulate anatomical left-right patterning in a nodal and lefty asymmetric gene expression-independent manner. Biology Open. 6 (10), 1445-1457 (2017).
  31. Legendre, F., et al. Whole mount RNA fluorescent in situ hybridization of Drosophila embryos. JoVE. (71), e50057 (2013).

Tags

Genetik sayı: 136 eklem bacaklılar kene gut microbiota transkript Bütün-mount In situ hibridizasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., … More

Moss, C. E., Robson, A., Fikrig, E., Narasimhan, S. Visualization of Microbiota in Tick Guts by Whole-mount In Situ Hybridization. J. Vis. Exp. (136), e57758, doi:10.3791/57758 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter