Summary
Le géant cilié, Stentor coeruleus, est un excellent système pour étudier la régénération et la guérison des plaies. Nous présentons des procédures pour établir des cultures de cellules de Stentor de cellules individuelles ou des fragments de cellules, induisant la régénération de cellules de coupe, chimiquement induisant la régénération de la bande de membranellar et appareil oral, imagerie et analyse des cellules régénération.
Abstract
Les cellules doivent être capables de régénérer leurs pièces à récupérer des perturbations externes. Les unicellulaires ciliés Stentor coeruleus est un organisme d’excellent modèle pour étudier la cicatrisation et la régénération des cellules suivantes. Le génome de Stentor est devenu disponible récemment, ainsi que les méthodes de la biologie moléculaire moderne, tels que l’ARNi. Ces outils permettent d’étudier la régénération de cellules individuelles au niveau moléculaire. La première section du protocole couvre des cultures de cellules de Stentor établissant des cellules individuelles ou des fragments de cellules, ainsi que des directives générales pour le maintien des cultures de Stentor . Culture de Stentor en grande quantité permet l’utilisation des outils précieux comme la biochimie, séquençage et spectrométrie de masse. Les sections suivantes du protocole couvrent différentes approches pour induire la régénération à Stentor. Couper manuellement les cellules avec une aiguille de verre permet d’étudier la régénération des pièces de grandes cellules, tout en traitant les cellules avec saccharose ou urée permet d’étudier la régénération de structures spécifiques, situé à l’extrémité antérieure de la cellule. Une méthode d’imagerie des cellules régénératrices individuelles est fournie, ainsi qu’une rubrique pour la mise en scène et l’analyse de la dynamique de la régénération. L’ensemble du processus de régénération est divisé en trois étapes. En visualisant la dynamique de la progression d’une population de cellules à travers les étapes, l’hétérogénéité dans la distribution de la régénération est démontrée.
Introduction
Les cellules ne sont pas simples sacs d’enzymes, mais plutôt très complexes machines dont les composants sont soigneusement mis à l’échelle à la bonne taille et disposés dans des positions bien définies. La morphogénèse des cellules individuelles représente un processus clé dans la cellule et de la biologie du développement, mais son mécanisme moléculaire est inconnu1,2. Alors que certaines des cellules ressemblent à des objets BLOB, organismes unicellulaires peuvent avoir extrêmement compliquées architectures, illustrées par les patrons corticales complexes chez les ciliés3,4.
Peut-être l’exemple le plus extrême d’une cellule très structurée est Stentor coeruleus, un géant eurytèles cilié vaguement apparenté à Tetrahymena et Paramecium. Stentor est 1 mm de long et est recouvert de plus de 100 bandes longitudinales de pigment bleu alternant avec des rangées de cils organisés par piles parallèles de rubans de microtubules qui courent le long de toute la cellule. La cellule est en forme de trompette (Figure 1), avec une bande de membranellar et un appareil oral (OA) à son extrémité antérieure et un pied qui s’adapte sur la cellule du substrat à son extrémité postérieure. En plus de la polarité de claire antéro-postérieur, la cellule montre également une structuration chirale distincte, tels que l’espacement entre les lignes ciliaires progressivement augmente dans le sens horaire. Cela se traduit par une discontinuité à l’intersection de la ligne plus étroite la ligne plus large et cette région de la surface cellulaire, connu comme le locus de contraste rayure, peut induire la formation de la deuxième série de structures de l’extrémité antérieure lorsque greffé sur une autre cellule5, ce qui en fait officiellement équivalent à organisateur de Spemann. Ainsi, tous les principaux processus de biologie du développement ont leurs analogues dans Stentor: axiation formation du patron et induction. Dans un embryon, ces processus sont conduits par des différences de destin entre différentes cellules, mais à Stentor, ils doivent être pilotées par des différences de destin entre les différentes régions au sein d’une seule cellule. Ce qui définit les différences entre les régions au sein de Stentor est un mystère.
Si une partie quelconque de Stentor est coupée, la pièce manquante de la cellule peut se régénérer pour produire une cellule normale en quelques heures. Si une cellule est coupé de moitié, ou même en très petits morceaux, chaque pièce se réorganise dans une cellule d’apparence normale mais en plus petite et restaure bonne proportionnalité entre cellule pièces6,7. Même de petits fragments, 1/64ème la taille de la cellule d’origine, sont capables de se régénérer dans une cellule petite mais normalement proportionnée et puis passer à la taille6. Stentor a ainsi présente une occasion unique d’étudier les mécanismes des organites taille mise à l’échelle et la cellule de régulation de la croissance en utilisant des méthodes chirurgicales qui sont généralement appliqués au niveau des tissus ou des organismes entiers.
Une des propriétés de Stentor qui lui permet de se régénérer d’un large éventail d’opérations chirurgicales est qu’elle contient un seul nodulées macronucleus (Figure 1) avec environ 50 000 copies du génome entier8. Tant qu’un fragment de cellule contenait au moins un nœud macronucléaire, il a la capacité de se régénérer complètement. Une autre propriété qui sous-tendent la capacité de régénération de Stentorest sa prodigieuse capacité de cicatrisation. Bien que plusieurs types de cellules sont capables de guérir leurs blessures9, Stentor est capable de récupérer d’une gamme extraordinaire de perturbations physiques. Un exemple de Stentor rétablissement après une perturbation radicale, ainsi que les méthodes de visualisation des flux cytoplasmique dans Stentor10 ont été rapportées. Ces méthodes permettent l’étude de l’effet de régénération comment blessant et suivantes de l’état physique du cytoplasme.
La taille énorme de stentor, la capacité de régénération extraordinaire et le fait qu’elle manifeste beaucoup des phénomènes du développement chez les embryons multicellulaires (tels que les organisateurs, axiation et structuration) a attiré de nombreux biologistes du développement au cours de le tournant du siècle dernier, dont Thomas Hunt Morgan7. Durant les années 50 et 60, les approches microchirurgicales face a montré un tableau saisissant des processus régénératifs et morphogénétiques dans cet organisme unicellulaire11. Toutefois, Stentor a été développé comme un système modèle de biologie moléculaire que récemment. Au cours des dernières années, le génome de Stentor a été séquencé et assemblé8, et la méthode pour perturber l’expression des gènes à l’aide d’Arni en se nourrissant était développé12.
Une des raisons que Stentor a été transformé en un organisme modèle pour la biologie moléculaire moderne seulement récemment était la difficulté de plus en plus de grandes cultures en raison de son long cycle de cellules (3 à 5 jours). Cependant, les méthodes modernes de génomiques et protéomiques nécessitent moins de matériel qu’ils ont utilisé pour, et le volume d’une seule cellule de Stentor est suffisant pour ces méthodes, même sans recourir à des méthodes ultrasensibles qui ont été développées pour l’analyse du single cellules qui sont plus petits que Stentor. L’article 1 du protocole détaille la procédure pour l’établissement d’une grande culture d’une seule cellule de Stentor . La même approche peut servir à établir une culture grande d’un fragment de cellules obtenue en coupant une cellule. Article 1er stipule également les lignes directrices pour le maintien des cultures saines de Stentor sur de longues périodes de temps. Article 2 du protocole prévoit la méthodologie induisant la régénération cellulaire en coupant les cellules manuellement avec une aiguille de verre. L’article 3 du protocole est dédié à deux méthodes d’induction de la régénération des structures de cellule spécifique (membranellar band et oral appareils) : traitant les cellules avec saccharose ou urée conduit à l’effusion de ces structures, suivies de leur régénération. L’article 4 du protocole détaille une méthode pour l’imagerie de cellules régénératrices individuelles sur de longues périodes de temps. L’article 4 se termine par la description des phases de régénération et de conseils sur l’analyse de la dynamique de la régénération.
Protocol
1. culture de Stentor et établir les Cultures de cellules individuelles ou des Fragments de cellules de Stentor
- Préparer Chlamydomonas reinhardtii culture à utiliser comme nourriture pour Stentor.
- Cellules de Chlamydomonas reinhardtii provenir d’un fournisseur commercial (Table des matières).
- Établir une culture liquide 500 mL de Chlamydomonas reinhardtii dans les médias de robinet disponibles dans le commerce à l’aide de la technique de stérilisation des13.
- Conserver la culture de Chlamydomonas sous une lampe à une concentration proche de la saturation (à diamètre extérieur d’environ 1) par dilution avec robinet médias de deux fois par semaine.
Remarque : La culture de Chlamydomonas peut être cultivée sur un agitateur. - Vérifiez régulièrement si la culture de Chlamydomonas est saine en plaçant une goutte de culture sur une diapositive, couvrir avec un lamelle couvre-objet et vérifier au microscope au grossissement de X 40.
Remarque : Ne pas utiliser la culture pour Stentor alimentation si elle est contaminée par des bactéries ou si Chlamydomonas cellules sont regroupées en grappes. Si un des ces problèmes se produit, démarrez une nouvelle culture de Chlamydomonas .
- Cellules de Stentor coeruleus provenir d’un fournisseur commercial (Table des matières).
- Si les cellules de Stentor sont nécessaires dans leur habitat naturel, leur rassemblement d’un étang, lac ou rivière,11.
- Pour collecter les Stentor d’un étang, lac ou rivière, trouver une zone avec une végétation où l’eau est relativement calme, ombragé et claire.
Remarque : Il y a une probabilité plus élevée de trouver Stentor aux endroits où pousse les lentilles d’eau. - Recueillir au moins 2 L d’eau dans un contenant facile à verser de.
- Après que les détritus et les particules sont sont installés au fond du récipient, remplir doucement quelques petits contenants pour examiner pour Stentor, attendez quelques secondes après chaque collection pour les détritus pour s’installer dans le grand conteneur.
- Une fois terminée la collecte d’échantillons à un endroit, déplacer vers un nouvel emplacement qui est au moins 10 mètres et le prélèvement d’échantillons, il le répète.
Remarque : Non chaque étang a une population de Stentor , ainsi que plusieurs étangs peuvent devoir être échantillonnés. - Retour avec les échantillons au laboratoire et transférer de l’eau dans les conteneurs dans des boîtes de Pétri.
- Dans chaque boîte de Pétri, recherchez Stentor sous un stéréomicroscope avec lumière rasante au grossissement de X 5. Transfert des cellules individuelles de Stentor , à l’aide d’une pipette 1 mL dans un puits d’une plaque de verre spot contenant au moins 100 µL d’eau disponible dans le commerce pasteurisé (PSW).
Remarque : Les cellules de Stentor ont une forme trompette lorsqu’ils sont attachés à un substrat (Figure 1). Les cellules de Stentor de natation sont moins étendues que celle des cellules attachés à un substrat (vidéo 1). - Laver de Stentor dans PSW au moins 3 x. Effectuer les lavages en enlevant environ 90 % de l’eau du puits, tout en gardant les cellules de Stentor dans le puits, suivie d’ajouter 500 µL de PSW dans le puits.
Remarque : Avant de manipuler de Stentor , à l’aide de pipettes avec des pointes de pipette de 10 µL ou plus petits, couper environ 0,5 mm de l’extrémité de l’embout de la pipette avec des ciseaux pour éviter de blesser les cellules à cause des forces de cisaillement qui sont générés comme une grande cellule traverse trop petite d’un op de pointe vation.
- Pour collecter les Stentor d’un étang, lac ou rivière, trouver une zone avec une végétation où l’eau est relativement calme, ombragé et claire.
- Préparer Chlamydomonas avant chaque tétée de Stentor.
- Transférer 1 mL de la culture de Chlamydomonas préparée comme étape 1.1 dans un tube de microtubes de 1,5 mL. Centrifuger à 2 095 x g pendant 3 min.
- Retirez le surnageant et remis en suspension le culot dans 1 mL de PSW. Centrifuger à 2 095 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et Resuspendre le culot dans 500 µL de PSW.
Remarque : Ainsi, lavé et concentré Chlamydomonas sera considérée comme une « préparé Chlamydomonas» dans les étapes suivantes. Médias de robinet est nuisible à Stentor, donc lavage Chlamydomonas avant que Stentor l’alimentation est importante.
- Si une culture de Stentor clonale est nécessaire, commencez la culture d’une cellule individuelle de Stentor ou un fragment de cellule.
- Étant donné que les cellules individuelles de Stentor ne poussent pas bien en PSW, préparer les milieux conditionnés par filtre stérilisant 500 µL de médias d’une culture de Stentor existante, en bonne santée.
- Transférer 500 µL de milieux conditionnés à un puits d’une plaque de verre de spot.
- Transférer un Stentor dans le puits de la plaque de verre spot contenant les milieux conditionnés. Utiliser comme moyen peu possible d’effectuer le transfert.
- Nourrir chaque µL de Stentor 5 de prêt Chlamydomonas toutes les 48 h. Lorsque Stentor divisez, compter le nombre de cellules dans le puits et ajouter 5 µL de prêt Chlamydomonas par cellule.
- Maintenez Stentor à l’ombre car les cellules sont sensibles à la lumière (par exemple, dans des boîtes en plastique transparent recouvert de serviettes en papier).
- L’échange moyen de Stentor dans le puits avec un milieu conditionné frais toutes les 96 h.
- Préparer les milieux conditionnés frais comme à l’étape 1.5.1.
- Faire toutes les cellules de Stentor de se détacher du fond du puits en pipettant doucement également le liquide monte et descend dans le puits.
- Soigneusement aspirer le liquide de la bien en utilisant une pipette 1 mL, en s’assurant que toutes les cellules restent dans le puits. Ajouter 500 µL de milieux conditionnés frais dans le puits.
- Lorsque le nombre de cellules dans le puits est supérieure à 20, déplacer les cellules vers un pot plus grand, par exemple, un pot de verre de large-bouche.
- Ajouter 20 mL de PSW dans un bocal en verre stérilisés à l’autoclave de large-bouche.
Remarque : Autoclave de la verrerie de Stentor peut être remplacé par prudent de lavage et de rinçage. - Soigneusement Pipetter médias monter et descendre dans le puits afin de détacher toutes les cellules du fond du puits. Collecter toutes les cellules de Stentor , à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL et transférer doucement sur le bocal en verre.
- Ajouter 20 mL de PSW dans un bocal en verre stérilisés à l’autoclave de large-bouche.
- Ne pas serrer les couvercles sur les pots avec des cultures de Stentor , pour permettre un accès suffisant à l’air.
- Ajouter PSW dans le récipient toutes les 48 h pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules/mL. Estimer la densité des cellules de le œil.
Note : Également utiliser une pipette de 1 mL à air bulle dans le bol pour fabriquer des cellules se détacher des parois, pipette de 1 ml de la culture et de compter le nombre de cellules dans l’embout de la pipette. - Toutes les 48 h, aliments préparés Chlamydomonas à Stentor de cultures en pots (voir étape 1.4). Commencez par nourrir la culture avec 200 µL de prêt Chlamydomonas. Quand le volume de la culture augmente, graduellement augmenter le montant de prêt Chlamydomonas utilisé pour l’alimentation à 1 mL.
- Lorsque le volume de la culture a atteint environ 90 % de la capacité de la Jarre, transfert de la culture dans un pot plus grand.
- Pipetter la culture à l’intérieur du pot, de haut en bas, avec une pipette de 1 mL pour détacher le verre de Stentor .
- Versez tout le contenu du bol dans un récipient de 2 tasses.
- Rincer le bol environ 25 mL de PSW dans le récipient de 2 tasses pour recueillir les restants de Stentor.
- Maintenir les cultures saines dans des contenants de 2 tasses.
- Se nourrissent de Stentor cultures 2 mL de prêt Chlamydomonas par 100 mL de culture tous les 4-5 jours. Ajouter PSW pour le récipient en verre, toutes les 4-5 jours pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules/mL.
Remarque : 450 mL est le volume maximum qu'est titulaire d’un récipient de 2 tasses. - Une fois par semaine, inspecter les cultures sous une 5 X binoculaire pour les rotifères, les champignons et autre croissance. Pour prolonger la santé de la culture, supprimer des micro-organismes contaminants ainsi que les cellules anormalement en forme et sans couleur de Stentor à l’aide d’une pipette 1 mL.
- Lorsque le récipient en verre est environ 90 % de la pleine, diviser la culture.
- Ajouter 25 mL de PSW dans le récipient en verre. Utiliser une pipette à la pipette de 25 mL haut et en bas pour détacher le verre de Stentor . Déplacer environ 50 % de la culture dans un nouveau conteneur de 2 tasses.
- Ajouter 25 mL de PSW dans les deux cultures et continuer à maintenir les deux cultures comme décrit dans cette section du protocole.
Remarque : Étant donné que les cellules de Stentor sont sensibles aux températures élevées, maintenir la température à 25 ° C ou plus bas dans la salle où les cultures sont conservées. Par ailleurs, les cultures peuvent être conservés dans un incubateur. Référer au tableau 1 pour le dépannage de culture de Stentor .
- Se nourrissent de Stentor cultures 2 mL de prêt Chlamydomonas par 100 mL de culture tous les 4-5 jours. Ajouter PSW pour le récipient en verre, toutes les 4-5 jours pour maintenir la densité de Stentor à environ 20 cellules/mL.
2. induisant la régénération de cellules de Stentor de coupe
- Utiliser un extracteur à aiguille pour faire plusieurs aiguilles des tubes capillaires en utilisant le programme comme suit : chaleur - 735, pull - 100, - 110, temps - 150, pression - 400.
- Préparer une solution de méthylcellulose 4 % dans 50 mL de PSW.
- Ajouter 1 g de méthylcellulose (viscosité : cP 1500) à 50 mL de PSW.
- Incuber à 4 ° C pendant au moins 8 h afin de faciliter la dissolution de méthylcellulose.
- Conserver 4 % méthylcellulose solution à température ambiante.
- Préparer une plaque de verre de place pour stocker les fragments de cellules après avoir effectué les découpes.
- Filtre stériliser les médias d’une culture saine, 500 mL par verre plaque spot bien nécessaire.
- Transférer 500 mL des médias stérilisé dans chacun des puits nécessaires.
- Recueillir une saine Stentor (ayant une forme de trompette définis, vibrant couleur bleu-vert et sans grandes vacuoles) dans une goutte de 2 µL et posez-le sur une lamelle couvre-objet ou de la diapositive. Ajouter 2 µL de méthylcellulose à 4 % (Figure 2). Laissez Stentor ralentir avant de couper (Video 2).
- Tenez l’aiguille de verre comme parallèle à la surface de coupe que possible pour empêcher que l’aiguille casse.
- À l’aide d’une chaîne stéréo binoculaire, recherchez la pointe de l’aiguille de verre et déplacez-le plus près à la cellule (Figure 3 a). Respecter le contrat de Stentor au contact avec l’aiguille (Figure 3 b et C).
Remarque : Si la cellule est dans une orientation qui permet de séparer l’extrémité antérieure de l’extrémité postérieure difficile, tournez-le doucement le côté de l’aiguille. - Appuyez doucement sur le contrat de Stentor avec la face de l’aiguille de verre pour couper la cellule en deux(Figure 3D et E, vidéo 3). Déplacez les deux fragments apart assurant qu’il n’y a aucun lien cytoplasmique entre eux, afin d’éviter la fusion du fragment (Figure 3F).
- Vérifier si les deux fragments ont au moins un nœud macronucléaire chaque en examinant les fragments sous un microscope à dissection avec éclairage oblique.
Note : Ayant au moins un nœud macronucléaire est essentiel pour la survie des cellules. La cellule peut apporter sa pellicule (coque transparente) ainsi que le pigment bleu-vert, pendant ou après la coupe. Dans la plupart des cas, cela n’affectera pas la viabilité à long terme de la cellule. - Déplacer les fragments dans des puits d’une plaque de verre spot préparé à l’étape 2.3.
- Couper plusieurs cellules parce qu’une fraction des cellules coupées ne régénérera pas.
- Si vous effectuez des coupes multiples en une seule séance, remplacer l’aiguille de verre lorsqu’elle est fortement recouverte avec des résidus de Stentor ou lorsque sa pointe est cassée. Vous pouvez également nettoyer l’aiguille en l’essuyant doucement sur un morceau de l’entretoise de silicium.
Remarque : Aiguilles de verre peuvent être utilisés pour plusieurs sessions de découpage de cellule. - Garder la plaque spot en verre avec des fragments de cellules dans une chambre humide.
- Passez à la Section 4 du protocole pour plus de détails sur l’imagerie et l’interprétation des résultats de la régénération de Stentor .
3. induisant la régénération des Membranellar bande et Oral appareil de saccharose ou de traitement de l’urée
- Membranellar band et oral enlèvement d’appareils à l’aide de saccharose
- Préparer une solution de 25 % de saccharose en PSW.
- Ajouter 500 µL de 25 % de sucrose dans PSW dans un tube de microcentrifuge avec un bouchon de pression.
- Préparer 3 tubes de microcentrifuge avec snap caps avec 1 mL de PSW dans chaque tube pour laver les cellules après traitement de saccharose.
- Prélever des cellules de Stentor de 30 à 60 dans 1 mL de leur milieux de culture dans un tube de microcentrifuge distinct à l’aide d’une pipette de 1 mL (Figure 4, flèche A).
- Collecter toutes les cellules du tube dans le volume final de 125 µL en utilisant une pipette µL 200 en un seul tirage au sort. Transférez-les sur le tube avec 500 µL de 25 % de sucrose (préparé à l’étape 3.1.2) pour obtenir 625 µL de solution de sucrose à 20 % (Figure 4, flèche B). Déclencher un chronomètre.
- Incuber Stentor dans cette solution de sucrose à 20 % et flick-spin le tube de microcentrifuge dans le panier pendant 1 min.
- Collecter toutes les cellules dans un seul tirage au sort (ajuster la pipette à capacité maximale de 200 µL de collection plus facile).
- Gardez les cellules à l’embout de la pipette jusqu'à ce que le chronomètre affiche 2 min de traitement de saccharose.
- Éjecter Stentor dans un des tubes de microcentrifuge préparées à l’étape 3.1.3 (Figure 4, flèche C). Flick-spin le tube dans le panier.
- Laver les cellules deux fois plus, une fois dans chacun des deux restant des microtubes à centrifuger contenant PSW préparées à l’étape 3.1.3 (Figure 4, flèches, D et E).
Remarque : Tirage unique cellule collection technique n’est pas important entre les lavages. - Passez à la Section 4 du protocole pour plus de détails sur l’imagerie et l’interprétation de la dynamique de la régénération Stentor (Figure 4, flèches, F et G).
- Membranellar band et oral enlèvement d’appareils à l’aide d’urée
- Préparer une solution d’urée de 4 % à PSW.
- Ajouter 300 µL de 4 % d’urée dans PSW dans un tube de microcentrifuge avec un bouchon de pression.
- Préparer 3 tubes de microcentrifuge avec snap caps contenant 1 mL de PSW dans chaque tube pour laver les cellules après le traitement de l’urée.
- Prélever des cellules de Stentor de 30 à 60 dans 1 mL de leur milieux de culture dans un tube de microcentrifuge distinct à l’aide d’une pipette de 1 mL (Figure 4, flèche A).
- Collecter toutes les cellules du tube dans le volume final de 300 µL à l’aide d’une pipette 1 mL en un seul tirage au sort. Transférez-les sur le tube avec 300 µL de 4 % d’urée (préparé à l’étape 3.2.2) pour obtenir 600 µL de solution de 2 % d’urée (Figure 4, flèche B). Déclencher un chronomètre.
- Incuber Stentor dans cette solution 2 % d’urée et flick-spin le tube de microcentrifuge dans le panier pendant 1 min.
- Collecter toutes les cellules dans un seul tirage au sort.
- Gardez les cellules à l’embout de la pipette jusqu'à ce que le chronomètre affiche 2 min de traitement de l’urée.
- Éjecter Stentor dans un des tubes de microcentrifuge préparées à l’étape 3.2.3 (Figure 4, flèche C). Flick-spin le tube dans le panier.
- Laver les cellules deux fois plus, une fois dans chacun des deux restant des microtubes à centrifuger contenant PSW préparées à l’étape 3.2.3 (Figure 4, flèches, D et E).
Remarque : Tirage unique cellule collection technique n’est pas important entre les lavages. - Passez à la Section 4 du protocole pour plus de détails sur l’imagerie et l’interprétation de la dynamique de la régénération Stentor (Figure 4, flèches, F et G).
4. imagerie et analyse de la régénération cellulaire
- Si à l’aide d’un microscope vertical, utilisez la pendaison méthode de gouttelettes à la régénération des cellules individuelles d’image.
- Mettre 100 µL de PSW dans un puits d’une plaque de verre de spot.
- Isoler 1 cellule de Stentor dans 4 µL de milieux de culture (les médias qu’ils ont), à l’aide d’un 10 ou 20 µL Pipeter. Déposer la goutte au milieu d’une lamelle de2 22 x 22 mm (Figure 5).
Remarque : Si les cellules qui sont 1) malsain (anormalement en forme ou fortement vacuolisées) ou 2) conservent les bandes membranellar ou appareils oraux (pour des expériences de traitement chimique), ne pas utiliser pour l’imagerie. - Organiser des gouttelettes plus 4 de Stentor dans les milieux de culture autour de la goutte précédente, tout en laissant suffisamment d’espace entre les gouttes.
- Inverser la lamelle couvre-objet avec des gouttelettes et placez-le délicatement sur le puits de la plaque de verre spot auxquelles PSW a été ajouté à l’étape 4.1.
- Remarque : PSW dans le puits réduira au minimum l’évaporation des gouttelettes (Figure 5).
- Préparer les cellules restantes pour l’imagerie en suivant les étapes 4.1.1 - 4.1.4.
- Les cellules régénératrices sous un microscope avec la résolution de la durée souhaitée de l’image. Vous pouvez également observer la régénération à l’aide d’un microscope stéréo à dissection.
Remarque : La régénération commence immédiatement après la coupe de la cellule ou un traitement avec saccharose ou de l’urée. Cependant, des structures orales nouveau visibles formeront environ 3 h après le début de la régénération.
- Pour chaque point dans le temps, assignez l’une des trois phases de régénération à chacune des cellules. Pour ce faire, comparez chaque cellule pour les images représentatives illustrant les étapes (Figure 4 et Figure 6).
- Attribuer 1 stade aux cellules qui n’ont pas encore une bande de membranellar (Figure 6 a).
- Assigner étape 2 pour les cellules avec une bande de membranellar.
Remarque : Il apparaît une bande de membranellar 3-6 h après le traitement (Figure 4, Figure 6 b). À la fin de cette étape, une courbure supplémentaire de l’extrémité postérieure de la bande de membranellar s’affiche juste avant un oral primordium apparaît. - Assigner étape 3 pour les cellules avec un primordium par voie orale.
Remarque : Un primordium orale est une invagination apparaissant 6 à 8 heures après le traitement à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar (Figure 4, Figure 6 et 6 D). La régénération est terminée lorsque les cellules ont une bande de membranellar à leur extrémité antérieure et la forme des cellules trompette caractéristique (Figure 4, 6E de la Figure). La plupart des cellules de Stentor sont entièrement régénérés dans les 8 et 9 h depuis le début de la régénération.
- Tracer le pourcentage de cellules dans chacune de ces étapes de régénération pour chaque point de temps sous la forme d’un empilement boîte à moustaches (Figure 7).
Remarque : Ce type de tracé permet la visualisation de la dynamique de la régénération dans une population de cellules.
Representative Results
Cultures de Stentor ont été mis en place et maintenus à partir de cellules individuelles ou des fragments de cellules à l’aide de l’article 1 du protocole fiable. Un exemple représentatif d’une culture saine grand est sur la vidéo 1.
L’évolution temporelle de la régénération a été mesurée à Stentor , à l’aide de la méthode de traitement de saccharose pour lancer la régénération décrite à l’étape 3.1, combiné avec l’imagerie et la méthode d’analyse a examiné à la Section 4 (Figure 7). Ce diagramme indique qu’il y a un écart d’un heure-long dans le temps par la population de cellules pour atteindre n’importe quel stade particulier. Ce type d’analyse permet l’étude de l’hétérogénéité temporelle dans le processus de régénération dans une population de régénération des cellules.
Ce qui suit est un résumé des propos de régénération qui a été observée à ce jour après des dizaines de traitements de saccharose (Figure 4 et Figure 6). Étape 1 est quand des cellules de Stentor ressemblent teardrops sans n’importe quelle bande de membranellar (cette étape démarre immédiatement après le lavage de saccharose). Cette étape dure de 3 à 6 h. Stage 2 est quand une bande de membranellar apparaît et développe (3 à 6 h après traitement de saccharose). Cette étape dure de 3-4 h. stade 3 est quand un primordium orale apparaît à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar (6-8 h après traitement de saccharose), et les deux structures sont déplacés vers l’extrémité antérieure de la cellule. Cette étape dure pendant 1-2 h. Lorsque les bandes membranellar et l’appareil oral atteint l’extrémité antérieure de la cellule, ceci indique la fin de la régénération. La cellule a adopté la forme caractéristique de trompette comme Stentor . Les cellules sont complètement régénérée 8-9 h après traitement de saccharose.
La figure 1. Instantané de Stentor. La bande de membranellar et de l’appareil par voie orale est indiqués à l’extrémité antérieure de la cellule. Le pied est à l’extrémité postérieure de la cellule. Macronucleus Stentor est nodulés. Un bien nourris, Stentor a verts alimentaire vacuoles contenant principalement Chlamydomonas. Barre d’échelle est 0,5 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Réglage de coupe Stentor . Coupe de la cellule est réalisée en manipulant manuellement une aiguille de verre tout en regardant la cellule à l’aide d’un microscope stéréo dissection disponible dans le commerce. Le papier de soie vise à fournir le fond blanc pour voir les cellules mieux. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 3. Instantanés de 3 vidéo illustrant comment couper un Stentor avec une aiguille de verre. (A) A Stentor immédiatement avant que l’aiguille touche il. (B) un Stentor a légèrement coincé entre une lame de verre et l’aiguille. (C) A contracté de Stentor en réaction à la force de l’aiguille. (D) A Stentor à couper en appuyant doucement sur la cellule avec le côté de l’aiguille. (E) A Stentor maintenant coupé en deux, mais pas séparés. Deux fragments de Stentor (F). Barre d’échelle est 0,25 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Visualisation schématique de l’article 3 et article 4 du protocole. Il s’agit d’un protocole illustré pour l’exécution de saccharose ou de traitement d’urée et d’observation de la régénération cellulaire. L’heure indiquée dans le panneau inférieur est mesurée depuis le début du cycle de lavage 1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Le programme d’installation pour l’observation d’imagerie et/ou directe de régénération avec un microscope vertical. Dans chaque goutte de 4 µL suspendus de la lamelle couvre-objet, il y a une cellule en cours de régénération. L’eau dans les puits de la plaque de verre spot limite l’évaporation des gouttelettes. Cette configuration permet à la suite de la régénération des cellules multiples en parallèle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
La figure 6. Instantanés de Stentor dans chaque étape de la bande de membranellar et la régénération de l’appareil buccale. (A) phase 1 se caractérise par une forme de larme cellule et l’absence de la bande de membranellar. (B) stade 2 se caractérise par l’apparition de la bande de membranellar, une structure axée sur les cils qui bat en permanence. Membranellar bandes sont marqués avec des lignes pointillées blanches en panneaux B - D. (C et D) étape 3 se caractérise par l’apparition du primordium orale (marqué d’une flèche). Primordium oral ressemble à une invagination à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar. Le primordium orale sera ensuite vers le haut vers la partie antérieure de la cellule pour devenir l’appareil oral. (E) la régénération est terminée lorsque la cellule a adopté la caractéristique forme trompette Stentor et l’appareil oral (marqué d’une flèche) s’est élargi à l’extrémité antérieure de la cellule. Barre d’échelle est 0,25 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7. Empilés affichage de boîte intrigue comment les proportions des cellules à tous les stades de la régénération après traitement de saccharose change au fil du temps. Le graphique montre l’hétérogénéité du calendrier des étapes de la régénération dans une population de cellules régénératrices. « Reg » indique l’achèvement de la régénération. Le nombre de cellules : 28. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Vidéo 1. Exemple d’une culture de Stentor en bonne santé. En règle générale, si une culture est-ce concentré, fractionnement de la culture est recommandée. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo 2. Ralentissement de Stentor avec la méthylcellulose. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
Vidéo de 3. Coupe Stentor. Les cellules individuelles peuvent être coupés manuellement en plusieurs morceaux sous une stéréo binoculaire en appuyant sur une aiguille de verre à travers la cellule. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
| Problème avec la culture | Recours possible | Prévention possible |
| La culture est submergée par les rotifères ou d’autres grands organismes. | Eliminez autant de Stentor que possible dans une autre boite de culture. Puis laver les cellules trois fois. | Laver soigneusement les Stentor lors de la réception, même quand leur achat auprès d’un fournisseur commercial. |
| La culture est submergée par les champignons ou autres petits organismes. | Identifier un coin où il y a le moins Stentor. Dans ce domaine, retirer autant que possible sans enlever beaucoup de Stentor et ajouter à nouveau PSW. Mélanger doucement, mais bien à distrubute les organismes envahisseurs. Ignorez la prochaine tétée et Stentor mangeront leur. | Observez la culture régulièrement et retirer les petits contaminants en échangeant des médias aux frais PSW. |
| Stentor permettent de poser sur le dessus de l’autre. | Diviser la culture afin que la concentration est inférieure à 20 cellules/mL. | Diviser les cultures plus souvent. |
| Cellules de Stentor sont accouplement. | Nourrir tous les 4 jours au lieu de tous les 5 jours. | |
| La culture a beaucoup de déchets sombre. | Enlevez autant de la matière sombre, déchets de Stentor , possible sans enlever les cellules. Si Stentor sont attachés à la matière sombre, Pipetter haut et en bas pour libérer les cellules de Stentor de leurs déchets et puis retirez le support avec les déchets sans supprimer les cellules. Ou, retirer ces Stentor et nourrir en conséquence moins. | Alimentation de Stentor 1 mL moins de nourriture par 100 mL de la culture. |
| Aspect malsain (vacuolisés/gonflé ou arrondi) Stentor. | Retirer autant que possible sans enlever plusieurs cellules de Stentor et ajouter nouveau PSW. | Échanger régulièrement les médias. |
Le tableau 1. Guide de dépannage pour la culture de Stentor.
Discussion
Culture de Stentor présente un certain nombre de défis. Tout d’abord, pour réaliser des expériences qui nécessitent un grand nombre de cellules, il faut maintenir un grand nombre de cultures de Stentor , en tant que cultures devenus insalubres lorsque la concentration de Stentor dépasse 20 cellules/mL. Deuxièmement, les organismes qui peuvent contaminer les cultures de Stentor souvent divisent plus rapidement que Stentor et submergent la culture (un contaminant commun est rotifères). Ainsi, il est nécessaire d’inspecter la culture sous un microscope périodiquement et de supprimer les contaminants. Occasionnellement, une nouvelle culture doit être démarré à partir d’un petit nombre de cellules a sauvé manuellement d’une culture contaminée. Cela augmente le temps nécessaire pour maintenir les cultures saines de Stentor . Troisièmement, l’expansion une cellule unique dans une culture de 400 mL exige au moins un mois parce que Stentor cell cycle est de 3 à 5 jours. Quatrièmement, contrairement à d’autre modèle ciliés, Stentor rarement entrer dans la forme de kyste et ils ne peuvent pas être figés.
Un aspect important de la culture de Stentor est la sélection d’un organisme d’une alimentation appropriée. Diverses méthodes de culture de Stentor ont été décrites précédemment. L’un d’eux suggère d’utiliser du lait écrémé pour des bactéries de culture qui se nourrissent alors de Stentor. Cette technique est efficace dans la mise en culture de Stentor; application de techniques génomiques exige toutefois des échantillons purs pour éviter la confusion résultant de la génomique se lit d’organismes alimentaires non défini. En utilisant le protocole actuel, Stentor peuvent être cultivés en masse et, parce que leur nourriture, Chlamydomonas, a été séquencé, la présence de contamination génomique de l’Organization de nourriture peut être détectée et contrôlée pour. Pour des raisons inconnues, tartare dû reconstituer ses stocks en retournant à où il a trouvé Stentor avant. Avec le protocole actuel, nous avons pu garder de Stentor pour années.
Expériences de régénération avec Stentor sont généralement simples, mais il y a quelques détails essentiels à garder à l’esprit. En ce qui concerne l’article 2, coupe de Stentor dans la moitié des cellules peuvent être maîtrisées en quelques minutes. Maîtriser les procédures de microchirurgie plus avancées de Stentor peut exiger une semaine de pratique. Tout en effectuant un traitement de saccharose ou de l’urée (Section 3), si au début de l’imagerie, la plupart des cellules ont encore leurs bandes membranellar, augmenter le temps d’incubation de 10 à 30 s pour quand le traitement de saccharose est effectué ensuite. N’augmentez pas le temps de traitement de saccharose au-delà de 3 min d’incubation parce qu’elle se traduira par la mort des cellules.
Imagerie de Stentor régénération exige des méthodes pour les grosses cellules image sur de longues périodes de temps. La méthode d’imagerie, détaillée dans la Section 4 peut seulement être utilisée avec un microscope vertical. Si un microscope inversé est disponible au lieu de cela, des cellules peuvent être placés sur une diapositive ou une lamelle couvre-objet en petites chambres. Une méthode consiste à créer une chambre de gelée de pétrole et de la couverture avec une autre lamelle couvre-objet pour éviter l’évaporation. Par ailleurs, une chambre pour une cellule individuelle peut être faite en faisant un trou avec un poinçon de trou de la taille souhaitée en 1 x 1 cm2 carrés de l’entretoise de silicium (Table des matières), placer l’entretoise sur un lamelle couvre-objet, mettre des cellules dans la chambre et couvrant la chambre avec une autre lamelle. Quand l’imagerie, si Stentor ne sont pas dans le bon sens à observer les caractéristiques de chacune des étapes de la régénération, taper la plaque fermement pour rendre le contrat de la cellule. Regardez la cellule étendre afin d’identifier la phase de régénération (extension complète prend environ 45 s). Si la cellule est toujours dans la mauvaise orientation, répéter la mise sur écoute. Les images montrées dans la Figure 1 et Figure 6 ont été prises par un microscope stéréo zoom ; Cependant, toutes les expériences détaillées peuvent être effectuées à l’aide d’un 5 X binoculaire stéréo.
Un autre défi en plus de culture et d’imagerie de Stentor est le suivi de la régénération, plus précisément la quantité de temps nécessaire pour identifier les étapes. Si la régénération cellulaire est parfaitement orientée avec la région du primordium orale bien visible, identification de l’étape prend quelques secondes. Parfois, cependant, la cellule de Stentor est dans une orientation empêchant l’attribution précise des stade de régénération, ainsi prendre plus de temps à identifier. La quantité importante de temps nécessaire au stade des cellules régénératrices individuelles pourraient retarder la quantification des rejets de toutes les cellules régénératrices, diminuant ainsi la précision temporelle de la mise en scène et exiger l’observateur d’attendre et de recréer l’image sur la cellule après qu’il a déménagé à une nouvelle orientation. Par conséquent, cette expérience est temps et demande beaucoup de travail. Pour ces raisons, il serait hautement souhaitable d’élaborer des méthodes automatisées pour détecter les cellules de Stentor et assignant les étapes de la régénération de données vidéo microscopie. Il permettrait aussi d’autres expériences reproductibles, augmente dans la taille de l’échantillon et l’enlèvement de partialité humaine.
L’émergence de méthodes génomiques et protéomiques hautement sensibles a commencé à mettre des études des cellules individuelles dans reach. Pour ces analyses unicellulaires, la taille géante d’une cellule de Stentor permet un cobaye souhaitable pour des expériences de validation. Pour de telles expériences possible, cultivant Stentor est fondamentale, et si les méthodes décrites ici devraient jouer un rôle dans le développement de techniques plus avancées de cellule unique.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la subvention de NIH R01 GM113602 (WFM) et NSF 1144247 (AL). Nous reconnaissons Mark Slabodnick et Natalie Kirkland pour développer les versions initiales de certains de ces protocoles et informatives. Nous remercions Karina Perlaza et Greyson Lewis pour une lecture critique du manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
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