Metoder for studier av gjenfødelse Stentor

Summary

Den gigantiske ciliate, Stentor coeruleus, er et utmerket system å studere regenerasjon og sårtilheling. Vi presenterer prosedyrer for å etablere Stentor cellekulturer fra enkeltceller eller cellen fragmenter, inducing regenerering av skjæring celler, kjemisk inducing gjenfødelse membranellar band og oral apparater, bildebehandling og analyse for celle regenerering.

Abstract

Cellene trenger for å kunne generere sine deler å gjenopprette fra eksterne forstyrrelser. Den encellede ciliate Stentor coeruleus er en utmerket modell organisme til å studere sårheling og påfølgende celle gjenfødelse. Stentor genomet ble tilgjengelig nylig, sammen med moderne molekylærbiologi metoder, for eksempel RNAi. Disse verktøyene gjør det mulig å studere én celle regenerering på molekylært nivå. Den første delen av protokollen dekker etablere Stentor cellekulturer fra enkeltceller eller cellen fragmenter, sammen med generelle retningslinjer for å opprettholde Stentor kulturer. Dyrking Stentor i store mengder tillater bruk av verdifulle verktøy som biokjemi, sekvensering og massespektrometri. Etterfølgende avsnittene protokollen dekker ulike tilnærminger til inducing fornyelse i Stentor. Manuelt klippe celler med et glass nål kan studere fornyelse av store celle deler, mens behandling av celler med sukrose eller urea kan studere fornyelse av spesifikke strukturer i den fremre delen av cellen. En metode for bildebehandling regenerating enkeltceller tilbys, sammen med en rubrikk for staging og analysere dynamikken i gjenfødelse. Hele prosessen med gjenfødelse er delt i tre faser. Ved å visualisere dynamikken i utviklingen av en populasjon av celler gjennom stadier, er heterogenitet i gjenfødelse timing demonstrert.

Introduction

Celler er ikke enkel poser av enzymer, men ganske komplekse maskiner med komponenter er nøye skalert til riktig størrelse og arrangert i veldefinerte posisjoner. Morphogenesis for enkeltceller representerer en viktig prosess i cellen og utviklingsbiologi, men dens molekylær mekanikk er ukjent^1,2. Mens noen kulturperler celler ligne blobs, kan encellede organismer ha svært komplisert arkitektur, eksemplifisert ved komplekse kortikale mønstrene sett i ciliates^3,4.

Kanskje er det mest ekstreme eksempelet på en svært strukturerte celle Stentor coeruleus, en gigantisk heterotrichous ciliate fjernt beslektet til Tetrahymena og Paramecium. Stentor er 1 mm lang og er dekket med mer enn 100 langsgående striper av blå pigment alternerende med rader av flimmerhårene organisert av parallelle stabler av microtubule bånd som kjører lengden på hele cellen. Cellen er trompet-formet (figur 1), med membranellar band og et muntlig apparat (OA) på fremre enden og en holdfast som festes cellen til underlaget i den bakre enden. I tillegg til klart anterior-posterior polaritet viser cellen også en særegen chiral mønstre, slik at avstanden mellom ciliary gradvis økning i retning med klokken. Dette resulterer i en diskontinuitet hvor raden smaleste møter den bredeste raden, og denne regionen på celleoverflaten, kjent som locus stripe kontrast, kan indusere dannelsen av det andre settet av fremre delen strukturer når podet på en annen celle⁵, gjør det formelt tilsvarer Spemanns assistent. Dermed alle nøkkelprosesser i utviklingsbiologi har sine analogs i Stentor: axiation, mønster dannelse og induksjon. I et embryo, disse prosessene er drevet av skjebnen forskjeller mellom ulike celler, men i Stentor, de må bli drevet av skjebnen forskjellene mellom forskjellige områder i én celle. Hva definerer forskjellene mellom områdene i Stentor er et mysterium.

Hvis noen del av Stentor er kuttet av, kan den manglende brikken i cellen regenerere for å gi en normal celle i løpet av timer. Hvis en celle er kuttet i to eller inn i mye mindre biter, hver brikke omorganiserer i en normal-ser men mindre celle og gjenoppretter riktig forholdsmessighet mellom cellen deler^6,7. Selv små fragmenter, 1/64^th størrelsen på den opprinnelige cellen, kan regenerere i en liten, men normalt proporsjonert celle, og deretter vokser til full størrelse⁶. Stentor dermed presenterer en unik mulighet til å studere mekanismer for organelle størrelse skalering og celle vekst regulering med kirurgiske metoder som vanligvis brukes på vev eller hele organismer.

En av egenskapene til Stentor at den kan regenerere fra en rekke kirurgiske operasjoner er at den inneholder en enkel nodulated macronucleus (figur 1) med om lag 50.000 kopier av hele genomet⁸. Så lenge en celle fragment inneholder minst én macronuclear node, har den evnen å regenerere fullt. En annen egenskap underliggende Stentorgjenfødelse evne er uhyre sårhelende evnen. Selv om mange celletyper kan healing deres sår⁹, er Stentor kjøpedyktig komme seg fra et ekstraordinært utvalg av fysiske forstyrrelser. Et eksempel på Stentor utvinning fra en drastisk forstyrrelsene, sammen med metodene for å visualisere cytoplasmatiske flyt i Stentor¹⁰ tidligere rapportert. Disse metodene kan studere hvordan såret og påfølgende gjenfødelse påvirker den fysiske tilstanden på cytoplasma.

Stentorstor størrelse, ekstraordinære gjenfødelse evne og det faktum at det manifesterer mange utviklingsmessige fenomener i flercellet embryo (som arrangørene, axiation og mønstre) tiltrukket mange utviklingsmessige biologer under begynnelsen av forrige århundre, inkludert Thomas Hunt Morgan⁷. I løpet av 50 og 60-tallet demonstrerte Mikrokirurgiske tilnærminger en oppsiktsvekkende rekke regenererende og Morfogenetiske prosesser i denne encellet organisme¹¹. Men har Stentor blitt utviklet som et molekylærbiologi modellsystem nylig. I løpet av de siste årene, genomet av Stentor ble sekvensert og samlet⁸, og metoden å forurolige genuttrykk bruker RNAi av fôring var utviklet¹².

En av grunnene til at Stentor ble utviklet i en modell organisme for moderne molekylærbiologi bare nylig var vanskelighetene med voksende store kulturer på grunn av sin lange cellen syklus (3-5 dager). Men krever moderne genomic og proteomic metoder mindre materialer enn de pleide, og volumet av en enkeltcelle i Stentor er tilstrekkelig for disse metodene, selv uten resorting å ultrasensitive metoder som ble utviklet for analyse av én celler som er mye mindre enn Stentor. Del 1 av protokollen detaljer prosedyren for å etablere en stor kultur fra en enkeltcelle i Stentor . Samme tilnærming kan brukes til å etablere en stor kultur fra en celle fragment oppnådd ved å kutte en celle. Del 1 gir også retningslinjene for å opprettholde sunt Stentor kulturer over lengre tid. Del 2 av protokollen gir metodikken for inducing celle regenerering ved å kutte cellene manuelt med et glass nål. Del 3 av protokollen er dedikert til to metoder for å indusere fornyelse av bestemt celle strukturer (membranellar band og oral apparater): behandle cellene med sukrose eller urea fører til utgytelsen av disse strukturene, etterfulgt av deres regenerering. Del 4 av protokollen detaljer en metode for avbilding av regenererende enkeltceller over lengre tid. Del 4 ender med en beskrivelse av stadiene av gjenfødelse og tips om analyse av gjenfødelse dynamics.

Protocol

1. dyrking Stentor og etablere Stentor kulturer fra enkeltceller eller cellen fragmenter

1. Forberede Chlamydomonas reinhardtii kultur som mat for Stentor.
   1. Få Chlamydomonas reinhardtii celler fra en kommersiell leverandør (Tabell for materiale).
   2. Etablere en 500 mL væske kultur av Chlamydomonas reinhardtii i kommersielt tilgjengelig trykk media bruker steril teknikk¹³.
   3. Hold Chlamydomonas kulturen under en lampe i en konsentrasjon nær metning (på OD ca 1) ved å fortynne den med trykk media to ganger i uken.
      Merk: Chlamydomonas kultur kan dyrkes i en shaker.
   4. Sjekk om Chlamydomonas kulturen er sunn ved å plassere en dråpe kultur på et lysbilde, dekker den med en dekkglassvæske og sjekke det under et mikroskop på 40 X forstørrelse.
      Merk: Ikke bruk kultur for Stentor fôring hvis det er forurenset med bakterier eller Chlamydomonas cellene samles i klynger. Hvis noen av disse problemene oppstår, starte en ny Chlamydomonas kultur.
2. Få Stentor coeruleus celler fra en kommersiell leverandør (Tabell for materiale).
3. Hvis Stentor cellene trengs fra deres naturlige habitat, samle dem fra dammen, innsjøen eller elven¹¹.
   1. For å samle Stentor fra en dam, finner innsjø eller elven et område med noen vegetasjon hvor vannet er relativt rolig, skyggefulle og tydelig.
      Merk: Det er en høyere sannsynlighet for å finne Stentor på steder hvor duckweed vokser.
   2. Samle minst 2 L vann i en beholder som er lett å øse fra.
   3. Når detritus og partikler har utlignet til bunnen av beholderen, forsiktig fylle noen mindre beholdere for å undersøke for Stentor, venter på noen få sekunder etter hver samling for detritus å bosette seg i stort beholderen.
   4. Når samlingen av prøvene er fullført på et sted, flytte til en ny plassering som er minst 10 m unna og gjenta samlingen av prøvene der.
      Merk: Ikke alle dammen har Stentor innbyggere, så flere dammer må prøves.
   5. Tilbake med prøvene til lab og overføre vannet fra beholdere til individuelle Petri retter.
   6. I hver Petriskål, søke etter Stentor under en stereomicroscope med skrå lys på 5 X forstørrelse. Overføre personlige Stentor celler ved hjelp av en 1 mL pipette i et godt av et glass spotplate inneholder minst 100 µL av kommersielt tilgjengelig pasteurisert våren vann (PSW).
      Merk: Stentor celler har en trompet-liknende figur når de er festet til et substrat (figur 1). Svømming Stentor celler er mindre utbygget enn cellene festet til et substrat (Video 1).
   7. Vask Stentor i PSW minst 3 x. Utføre vasker ved å fjerne ca 90% av vann fra brønnen samtidig Stentor celler i brønnen, etterfulgt av å legge 500 µL av PSW i brønnen.
      Merk: Før du tar Stentor med Pipetter med pipette-spisser 10 µL eller mindre må kutte ca 0,5 mm på slutten av pipette spissen med saks å unngå såret cellene på grunn av skjær krefter som genereres som en stor celle renner gjennom for lite av en tips-op ening.
4. Forberede Chlamydomonas før hver fôring av Stentor.
   1. Overføre 1 mL av Chlamydomonas kultur forberedt som trinn 1.1 i en 1,5 mL microcentrifuge tube. Sentrifuge 2,095 x g i 3 minutter.
   2. Fjerne nedbryting og resuspended pellet i 1 mL av PSW. Sentrifuge 2,095 x g for 3 min. Fjern nedbryting og resuspend pellet i 500 µL av PSW.
      Merk: Dermed vasket og konsentrert Chlamydomonas vil bli referert til som "forberedt Chlamydomonas"i fremgangsmåten. Trykk media er skadelig for Stentor, dermed vaske Chlamydomonas før fôring Stentor er viktig.
5. Hvis det kreves en klonal Stentor kultur, starte kulturen fra en enkelt Stentor celle eller en celle fragment.
   1. Siden Stentor enkeltceller ikke vokser i PSW, forberede betinget media av filteret sterilisering 500 µL av medier fra en eksisterende, sunn Stentor kultur.
   2. Overføre 500 µL betinget medier til en av brønnene i en flekk glassplate.
   3. Overføre en Stentor inn i brønnen av glass spot plate som inneholder betinget media. Bruk som liten medium som mulig for å gjøre overføringen.
   4. Feed hver Stentor 5 µL av forberedt Chlamydomonas hver 48 timer. Når Stentor deler, teller antall celler i godt og legge 5 µL av forberedt Chlamydomonas per celle.
   5. Holde Stentor i et skyggefullt sted siden cellene er følsomme for lys (for eksempel i klar plast bokser dekket med tørkepapir).
   6. Utveksle Stentor medium i brønnen med fersk betinget medium hver 96 h.
      1. Forberede frisk betinget medier som i trinn 1.5.1.
      2. Gjøre alle Stentor celler koble fra bunnen av brønnen ved forsiktig pipettering væsken opp og ned i brønnen.
      3. Nøye Sug opp væske fra det godt med en 1 mL pipette, sørge for at alle cellene forblir i brønnen. Legg til 500 µL av fersk betinget media i brønnen.
   7. Når celler i brønnen overstiger 20, flytte cellene til en større beholder, for eksempel en bred munn glasskrukke.
      1. Legge til 20 mL PSW i en autoklaveres bred munn glasskrukke.
         Merk: Autoklavering av glass for Stentor kan erstattes med forsiktig vask og skylling.
      2. Nøye Pipetter media opp og ned i brønnen kobler alle cellene fra bunnen av brønnen. Samle alle Stentor celler ved hjelp av en 1 mL pipette tips og forsiktig overføre dem til glasskrukke.
   8. Ikke trekk dekslene på glassene med Stentor kulturer, å tillate tilgang til luft.
   9. Legge til PSW glasset hver 48 timer for å holde Stentor tetthet på 20 celler/mL. Beregne tettheten av celler av øyet.
      Merk: Alternativt bruke en 1 mL pipette til boble luft i glasset lage celler koble fra veggene, pipette opp 1 mL av kulturen, og teller hvor mange celler i pipette spissen.
   10. Hver 48 h, feed forberedt Chlamydomonas Stentor kulturer i glass (se trinn 1.4). Start med fôring kulturen med 200 µL av forberedt Chlamydomonas. Som volumet av kulturen gradvis øke mengden forberedt Chlamydomonas brukes for fôring opptil 1 mL.
   11. Når kultur volum når omtrent 90% av glasset og kapasitet, overføring kulturen til en større beholder.
       1. Pipetter kulturen inne i glasset, opp og ned med en 1 mL pipette koble Stentor fra glasset.
       2. Hell hele innholdet i glasset i en 2-cup glassbeholder.
       3. Skyll glasset med ca 25 mL av PSW i 2-cup glassbeholder å samle de gjenværende Stentor.
6. Vedlikeholde sunn kulturer i 2-cup Glassbeholdere.
   1. Mate Stentor kulturer 2 mL forberedt Chlamydomonas per 100 mL kultur hver 4-5 dager. Legg PSW i beholderen glass hver 4-5 dager for å holde Stentor tetthet på 20 celler/mL.
      Merk: 450 mL er det maksimale volumet en 2-cup beholder holder.
   2. En gang i uken, inspisere kulturer under 5 ganger dissekere mikroskop for Wrotek, sopp og andre vekst. For å forlenge helse kultur, fjerne skadelige mikroorganismer sammen med unormalt formet og fargeløs Stentor celler ved hjelp av en 1 mL pipette.
   3. Når beholderen glass er ca 90% full, dele kultur.
      1. Legg til 25 mL PSW glass container. Bruk en 25 mL Pipetter til pipette opp og ned koble Stentor fra glasset. Flytt ca 50% av kulturen i en ny 2-cup glass container.
      2. Legg 25 mL PSW til begge kulturer og fortsette å opprettholde de to kulturene som beskrevet i denne delen av protokollen.
         Merk: Siden Stentor celler er følsomme for høy temperatur, opprettholde temperaturen ved 25 ° C eller lavere i rommet der kulturer holdes. Kulturer kan også holdes i en inkubator. Se tabell 1 for feilsøking av Stentor dyrking.

2. inducing regenerering av kutte Stentor celler

1. Bruk en nål avtrekker for å gjøre flere pinner fra kapillær rør ved hjelp av programmet som følger: varme - 735, pull - 100, hastighet - 110, tid - 150, trykk - 400.
2. Forberede en 4% methylcellulose løsning i 50 mL av PSW.
   1. Legge 1 g av methylcellulose (viskositet: 1500 cP) til 50 mL av PSW.
   2. Inkuber ved 4 ° C i minst 8 timer å gjøre oppløsningen av methylcellulose.
   3. Hold 4% methylcellulose løsning ved romtemperatur.
3. Forberede en spot glassplate lagring cellen fragmenter etter utføre kutt.
   1. Filteret sterilisere medier fra en sunn kultur, 500 mL per glass spotplate godt som trengs.
   2. Overføre 500 mL sterilisert media i hver av behov.
4. Samle en sunn Stentor (å ha en definert trompet form, levende blå-grønn farge og ingen store vacuoles) i en 2 µL dråpe og plassere den på en dekkglassvæske eller et lysbilde. Legg 2 µL av 4% methylcellulose (figur 2). La Stentor tregere før klippe (Video 2).
5. Hold glass nålen som parallelt skjæring overflate som mulig å forhindre bryte nålen.
6. Bruker en stereo dissekere mikroskop, Finn spissen av glass nålen og flytte den nærmere cellen (figur 3A). Observere Stentor kontrakten ved kontakt med nålen (figur 3B og C).
   Merk: Hvis cellen er i en retning som gjør løsnet den fremre delen fra den bakre enden vanskelig, rotere det veldig forsiktig med siden av nålen.
7. Trykk forsiktig på den avtalte Stentor med side av glass nålen å kutte cellen i to (figur 3D og E Video 3). Flytte to fragmenter fra hverandre slik at det er ingen cytoplasmatiske forbindelse mellom dem, for å unngå fragment fusion (figur 3F).
8. Sjekk om begge fragmenter har minst én macronuclear node hver ved å undersøke fragmenter under dissecting mikroskop med skrå belysning.
   Merk: Å ha minst én macronuclear node er viktig for celle overlevelse. Cellen kan kaste sin pellicle (gjennomsiktig skall) sammen med blågrønt pigment under eller etter kuttet. I de fleste tilfeller vil dette ikke påvirke den langsiktige levedyktigheten til cellen.
9. Flytte fragmenter i brønner av en spot glassplate i trinn 2.3.
10. Kutte flere celler fordi en brøkdel av de utklipte cellene ikke vil regenerere.
11. Hvis utføre flere kutt i én økt, erstatte glass nålen når det blir tungt belagt med Stentor rester eller når sine tips er brutt. Alternativt, rengjør nålen ved å tørke den forsiktig på et stykke silisium avstand.
    Merk: Glass nåler kan brukes for celle kutte økter.
12. Hold øye glassplaten med cellen fragmenter i en fuktighet kammer.
13. Videre til del 4 av protokollen for detaljer om bildebehandling og tolkning av Stentor gjenfødelse resultater.

3. inducing regenerering av Membranellar Band og Oral apparater av sukrose eller Urea behandling

1. Membranellar band og oral apparater fjerning ved hjelp av sukrose
   1. Forberede en 25% løsning av sukrose i PSW.
   2. Legg til 500 µL av 25% sukrose i PSW i et microcentrifuge rør med en snap cap.
   3. Forberede 3 microcentrifuge rør med snapin caps med 1 mL PSW i hver retning vaske cellene etter sukrose behandling.
   4. Samle 30-60 Stentor celler i 1 mL av deres kultur medier i et separat microcentrifuge rør med en 1 mL pipette (Figur 4, pilen A).
   5. Samle inn alle cellene fra røret i 125 µL siste volum ved å bruke en 200 µL pipette enkelt uavgjort. Overføre dem til røret med 500 µL av 25% sukrose (forberedt i trinn 3.1.2) for å få 625 µL av 20% sucrose løsning (Figur 4, pilen B). Starte en stoppeklokke.
   6. Inkuber Stentor i 20% sucrose løsning og flick-rotere microcentrifuge røret i stativet for 1 min.
   7. Samle alle cellene i et enkelt trekk (Juster pipette 200 µL maks kapasitet for enklere samling).
   8. Holde cellene i pipette spissen til stoppeklokken viser 2 min sukrose behandling.
   9. Løse ut Stentor til en av microcentrifuge rør i trinn 3.1.3 (Figur 4, pilen C). Flick-spin røret i stativet.
   10. Vask cellene to ganger, en gang i hver av de to gjenværende microcentrifuge rør som inneholder PSW forberedt i trinn 3.1.3 (Figur 4, piler D og E).
       Merk: Enkelt trekk cellen teknikk er ikke viktig mellom vasker.
   11. Videre til del 4 av protokollen for detaljer om bildebehandling og tolkning av Stentor gjenfødelse dynamics (Figur 4, piler F og G).
2. Membranellar band og oral apparater fjerning med urea
   1. Forberede en løsning av 4% urea i PSW.
   2. Legge til 300 µL av 4% urea i PSW i et microcentrifuge rør med en snap cap.
   3. Forberede 3 microcentrifuge rør med snapin caps som inneholder 1 mL av PSW i hver retning for vask cellene etter urea behandling.
   4. Samle 30-60 Stentor celler i 1 mL av deres kultur medier i et separat microcentrifuge rør med en 1 mL pipette (Figur 4, pilen A).
   5. Samle inn alle cellene fra røret i 300 µL siste volum ved hjelp av en 1 mL pipette enkelt uavgjort. Overføre dem til røret med 300 µL av 4% urea (forberedt i trinn 3.2.2) for å få 600 µL av 2% urea løsning (Figur 4, pilen B). Starte en stoppeklokke.
   6. Inkuber Stentor i denne 2% urea løsning og flick-rotere microcentrifuge røret i stativet for 1 min.
   7. Samle alle cellene i et enkelt trekk.
   8. Holde cellene i pipette spissen til stoppeklokken viser 2 min urea behandling.
   9. Løse ut Stentor til en av microcentrifuge rør i trinn 3.2.3 (Figur 4, pilen C). Flick-spin røret i stativet.
   10. Vask cellene to ganger, en gang i hver av de to gjenværende microcentrifuge rør som inneholder PSW forberedt i trinn 3.2.3 (Figur 4, piler D og E).
       Merk: Enkelt trekk cellen teknikk er ikke viktig mellom vasker.
   11. Videre til del 4 av protokollen for detaljer om bildebehandling og tolkning av Stentor gjenfødelse dynamics (Figur 4, piler F og G).

4. imaging og analyserer celle regenerering

1. Hvis bruker en oppreist mikroskop, bruker hengende slippverktøy metoden å image gjenoppbyggingen individuelle celler.
   1. Sette 100 µL av PSW i et godt av en spot glassplate.
   2. Isolere 1 Stentor celle i 4 µL av kultur medier (media at de er i), bruker en 10 eller 20 µL pipetter. Innskudd slippverktøyet i en 22 x 22 mm² dekkglassvæske (figur 5).
      Merk: Hvis cellene som er 1) usunn (unormalt formet eller tungt vacuolated) eller 2) fortsatt har membranellar band eller muntlig apparatene (for kjemisk behandling eksperimenter), ikke bruk for bildebehandling.
   3. Ordne 4 mer dråper av Stentor i kultur media rundt forrige slippverktøyet, stund innlevering nok plass mellom dråpene.
   4. Inverter dekkglassvæske med dråper og forsiktig plassere den over av glass spotplate som PSW ble lagt til i trinn 4.1.
   5. Merk: PSW i brønnen vil minimere fordampning av dråper (figur 5).
   6. Forberede de gjenværende cellene for bildebehandling ved å følge fremgangsmåten 4.1.1 - 4.1.4.
   7. Bilde regenerating cellene under et mikroskop med ønsket tid oppløsning. Alternativt, observere fornyelse ved hjelp av dissecting stereo mikroskop.
      Merk: Regenerasjon vil starte umiddelbart etter celle kutte eller behandling med sukrose eller urea. Imidlertid vil synlige nye muntlig strukturer danne ca 3 h etter gjenfødelse.
2. For hvert punkt, kan du tilordne én av de tre gjenfødelse trinnene til hver av cellene. Dette kan du sammenligne hver celle representant bildene illustrerer stadier (Figur 4 og figur 6).
   1. Tilordne fase 1 til cellene som ikke har et membranellar band ennå (figur 6A).
   2. Tilordne fase 2 til cellene med membranellar band.
      Merk: En membranellar band vises 3-6t etter behandling (Figur 4, figur 6B). På slutten av denne scenen vises en ekstra krumning av den bakre enden av membranellar bandet like før en muntlig primordium vises.
   3. Tilordne Stage 3 til cellene med en muntlig primordium.
      Merk: En muntlig primordium er en invagination vises 6-8 h etter behandling i den bakre enden av membranellar bandet (Figur 4, figur 6C og 6 D). Regenereringen er fullført når cellene har en membranellar bånd deres fremre delen og karakteristiske trompet celle figuren (Figur 4, figur 6E). De fleste Stentor celler genereres fullt innen 8-9 timer siden starten av gjenfødelse.
3. Tegne inn prosentandelen av celler i hver av de gjenfødelse stadiene for hvert punkt i form av et stablet boksen plott (figur 7).
   Merk: Denne typen tomten kan effekten av gjenfødelse dynamikken i en populasjon av celler.

Representative Results

Stentor kulturer har vært pålitelig etableres og vedlikeholdes fra enkeltceller eller cellen fragmenter med del 1 av protokollen. Et representativt eksempel på en stor sunn kultur vises i Video 1.

Time course of regenerering ble målt i Stentor med metoden sukrose behandling for å starte fornyelse i trinn 3.1, bildebehandling og analyse metoden diskutert i del 4 (figur 7). Denne handlingen viser at det er en en-timers-lange spredning i tiden befolkningen i cellene til noe bestemt tidspunkt. Denne typen analyse kan studiet av timelige heterogenitet i gjenfødelse prosessen i en befolkning på regenerere celler.

Følgende er en oppsummering av gjenfødelse beregner det har blitt observert så langt etter dusinvis av sukrose behandlinger (Figur 4 og figur 6). Trinn 1 er når Stentor celler ligne teardrops uten noen membranellar band (dette stadiet starter umiddelbart etter sukrose bleke). Dette stadiet varer for 3-6 h. fase 2 er når en membranellar band vises og vokser (3-6 h etter sukrose behandling). Dette stadiet varer for 3-4 h. Stage 3 er når en muntlig primordium vises nederst i bakre membranellar bandet (6-8 h etter sukrose behandling), og begge strukturer flyttes mot den fremre delen av cellen. Dette stadiet varer i 1-2 h. Når både membranellar bandet og muntlig apparatet nådd den fremre delen av cellen, indikerte dette regenereringen er fullført. Cellen har vedtatt karakteristiske Stentor trompet-liknende figur. Celler var helt Spartments 8-9 h etter sukrose behandling.

Figur 1. Øyeblikksbilde av Stentor. Membranellar bandet og muntlig apparatet vises i den fremre delen av cellen. På holdfast er den bakre enden av cellen. Stentor macronucleus er nodulated. En velfødde Stentor har grønn mat vacuoles som inneholder hovedsakelig Chlamydomonas. Skala bar er 0,5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Stentor kutte oppsett. Celle kutte utføres manuelt manipulere et glass nålen mens du ser på cellen med et kommersielt tilgjengelig dissecting stereo mikroskop. Formålet med vev papiret er å gi den hvite bakgrunnen du cellene bedre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Øyeblikksbilder av Video 3 illustrerer hvordan å skjære et Stentor med et glass nål. (A) A Stentor umiddelbart før nålen berører den. (B) en Stentor presset forsiktig mellom en nål og glass lysbilde. (C) A kontrakt Stentor reagerer på styrken av nålen. (D) A Stentor skjæring ved forsiktig å trykke på cellen med siden av nålen. (E) A Stentor nå kuttet i to, men atskilt ikke. (F) to Stentor fragmenter. Skala bar er 0,25 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4. Skjematisk visualisering av del 3 og del 4 av protokollen. Dette er en illustrert protokoll for sukrose eller urea behandling og observasjon av celle gjenfødelse. Tidspunktet som er angitt i det nedre panelet måles fra begynnelsen av vask 1. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Oppsettet for bildebehandling og/eller direkte observasjon av gjenfødelse med en oppreist mikroskopet. I hver 4 µL slippverktøy hengende fra dekkglassvæske, er det en celle under gjenfødelse. Vann i brønnene i stedet glassplaten begrenser fordampning av dråpene. Dette oppsettet kan etter fornyelse av cellene i parallell. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 6. Øyeblikksbilder av Stentor i hver fase av membranellar bandet og oral apparater gjenfødelse. (A) trinn 1 er preget av en tåre-lignende celle form og fravær av bandet membranellar. (B) trinn 2 er preget av utseendet på membranellar bandet en flimmerhårene-basert struktur som slår kontinuerlig. Membranellar band er merket med hvite stiplede linjer i paneler B - D. (C og D) Stage 3 er preget av utseendet på muntlig primordium (merket med en pil). Muntlige primordium ser ut som en invagination i den bakre enden av membranellar bandet. Den muntlige primordium flyttes deretter opp mot det fremre cellen blir oral apparater. (E) regenereringen er fullført når cellen har vedtatt karakteristiske Stentor trompet-liknende figur, og muntlig apparatet (merket med en pil) har økt i den fremre delen av cellen. Skala bar er 0,25 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Stablet boksen plott som viser hvor andelen celler i alle faser av etter sukrose behandling dataendringer over tid. Plottet viser heterogenitet i timingen av gjenfødelse faser i en befolkning på regenerating celler. "Reg. end" angir regenereringen er fullført. Antall celler: 28. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1. Eksempel på en sunn Stentor kultur. Generelt, hvis en kultur er dette konsentrert, dele kultur anbefales. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 2. Sakker Stentor med methylcellulose. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Video 3. Kutte Stentor. Individuelle celler kan bli manuelt kuttet i stykker under en stereo dissekere mikroskopet ved å trykke en glass nål gjennom cellen. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Problem med kultur	Mulig løsning	Mulig forebygging
Kultur er overveldet av Wrotek eller andre store organismer.	Fjerne så mange Stentor som mulig i en ny kultur parabol. Deretter vaskes cellene tre ganger.	Vask Stentor når du mottar dem, selv når du kjøper dem fra en kommersiell leverandør.
Kultur er overveldet av sopp eller andre små organismer.	Identifisere et hjørne der det er minst Stentor. I dette området, fjerne så mye media som mulig uten å fjerne mange Stentor og sammenlegge inne ny PSW. Bland forsiktig men grundig å distrubute invadere organismer. Hopp over neste mating og Stentor vil spise dem.	Observere kulturen regelmessig og fjerne små forurensninger ved å utveksle media for fersk PSW.
Stentor legger oppå hverandre.	Dele kultur slik at konsentrasjonen er mindre enn 20 celler/mL.	Delt kulturer oftere.
Stentor celler er parring.	Feed hver 4 dager i stedet for hver 5 dager.
Kultur har mange mørke avfall.	Fjern så mye av mørke materialet, Stentor avfall, som mulig uten å fjerne cellene. Hvis Stentor er knyttet til mørke materialet, Pipetter opp og ned for å frigi Stentor cellene fra deres avfall og deretter fjerne media avfallet uten å fjerne cellene. Eller fjerne disse Stentor og mate tilsvarende mindre.	Feed Stentor 1 mL mindre mat per 100 mL kultur.
Usunn utseende (vacuolated/oppsvulmet eller avrundet) Stentor.	Fjern medier så mye som mulig uten å fjerne mange Stentor celler og legge til nye PSW.	Utveksle media regelmessig.

Tabell 1. Feilsøkingsguide for dyrking Stentor.

Discussion

Dyrking Stentor presenterer en rekke utfordringer. Først for å utføre eksperimenter som krever stort antall celler, trenger man å opprettholde et stort antall Stentor kulturer, som kulturer blir usunn når Stentor konsentrasjon overstiger 20 celler/mL. Andre organismer som kan forurense Stentor kulturer ofte dele raskere enn Stentor og overvelde kultur (en vanlig miljøgifter er Wrotek). Derfor er det nødvendig å inspisere kulturen under et mikroskop med jevne mellomrom og fjerne forurensninger. Noen ganger må en ny kultur startes fra et lite antall celler reddet manuelt fra en forurenset kultur. Dette øker tiden det tar å opprettholde sunn Stentor kulturer. Tredje krever utvide en enkeltcelle i en 400 mL kultur minst en måned fordi Stentor celle syklus er 3-5 dager. Fjerde, i motsetning til andre modellen ciliates, Stentor sjelden gå inn cyste skjemaet og de kan ikke bli frosset.

En viktig del av dyrking Stentor er valg av en riktig mat organisme. Ulike metoder for dyrking Stentor ble beskrevet tidligere. En av dem foreslår for å bruke skummet melk til kultur bakterier som mater Stentor. Slike en teknikk er effektive i dyrking Stentor; Imidlertid krever bruk av genomisk teknikker ren prøver å unngå forvirring fra genomisk leser fra udefinert mat organismer. Bruker gjeldende protokollen, Stentor kan dyrkes i massen og fordi maten, Chlamydomonas, har blitt sekvensert, tilstedeværelse av genomisk forurensning fra mat organismen kan oppdages og kontrollert. For ukjente årsaker måtte Tartar fylle hans aksjer ved å returnere til hvor han fant Stentor før. Med gjeldende protokollen, har vi kunnet holde Stentor i år.

Gjenfødelse eksperimenter med Stentor er generelt grei, men det er noen viktige detaljer å tenke. I forhold til del 2, kutte Stentor celler i halvparten kan være mestret i minutter. Mastering mer avanserte mikrokirurgi prosedyrer for Stentor kan kreve en uke med trening. Mens utfører en sukrose eller urea behandling (del 3), hvis i begynnelsen av imaging de fleste cellene fremdeles har sine membranellar band, øke inkubasjon tid ved 10-30 s når sukrose behandling utføres neste. Ikke Øk av sukrose behandling utover 3 min incubation fordi det vil resultere i celledød.

Imaging av Stentor krever gjenfødelse metoder å bilde store celler over lengre tid. Tenkelig metoden beskrevet i punkt 4 kan bare brukes med en oppreist mikroskop. Hvis en invertert mikroskopet er tilgjengelig i stedet, kan deretter celler plasseres på et lysbilde eller dekkglassvæske i små rom. En metode er å skape et kammer av vaselin og dekk med en annen dekkglassvæske å hindre fordampning. Eventuelt et kammer for enkeltceller kan gjøres ved å lage et hull med et hull av ønsket størrelse i en 1 x 1 cm-² for silisium spacer (tabell for materiale), plassere mellomlegget på en dekkglassvæske, legger celler i kammeret , og dekker kammer med en annen dekkglassvæske. Når imaging, hvis Stentor ikke er i riktig retning å observere de karakteristiske trekk ved hvert trinn i gjenfødelse, trykk platen fast for å gjøre cellen kontrakten. Se cellen utvide for å identifisere fasen av gjenfødelse (full forlengelse tar ca 45 s). Hvis cellen er i feil retning, gjenta å peke. Bildene som vises i figur 1 og figur 6 ble tatt av stereo zoom mikroskop; men kan alle eksperimentene detaljert utføres med en 5 X dissekere stereo mikroskop.

En annen utfordring foruten dyrking og imaging Stentor er sporing av gjenfødelse, spesielt hvor mye tid er nødvendig for å identifisere stadier. Hvis regenerating cellen er orientert med regionen i den muntlige primordium synlig, tar identifikasjon av scenen noen sekunder. Noen ganger, men er Stentor cellen i en retning hindre klar tildeling av gjenfødelse scenen, dermed tar mer tid å identifisere. Den betydelige mengden tid å stage enkeltceller regenerating kan forsinke kvantifisering av alle regenerating celler, dermed redusere timelige presisjonen for staging og krever observatøren vente og re-image cellen etter at den er flyttet til en ny retning. Derfor er dette eksperimentet både tid og arbeidsintensiv. For disse grunner, ville det være svært ønskelig å utvikle automatiserte metoder for å oppdage Stentor celler og tilordne stadier av gjenfødelse video mikroskopi data. Dette vil også gi rom for mer reproduserbar eksperimenter, øker utvalgsstørrelsen og fjerning av menneskelig bias.

Fremveksten av svært følsom genomic og proteomic metoder har begynt å sette studier av enkeltceller til nå. For slike encellede analyser gjør gigantiske størrelsen på en Stentor celle det en ønskelig test emne for proof-of-concept eksperimenter. For slike eksperimenter å være mulig, dyrking Stentor grunnleggende og så metodene som er beskrevet her bør spille en rolle i videre utvikling av mer avanserte encellede teknikker.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stentor coeruleus live culture	Carolina Biological Supply	131598
Chlamydomonas reinhardtii on agar	Carolina Biological Supply	152040
Pasteurized springwater, 1-quart bottle	Carolina Biological Supply	132458
Methyl cellulose, 1500 cP	Millipore Sigma	M0387
Pyrex glass spot plate	Fisher Scientific	13748B
Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL	Carolina Biological Supply	715740
2-cup glass container with glass lid	Pyrex	1095600
CultureWell silicone sheet material	Grace Bio Labs	664475
Kimwipes	Kimberly Clark	34155
Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube	Denville	C2170
Cover Glass	Fisher finest	12-548-B
TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture	ThermoFisher	A1379801
Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm	Grace Bio Labs	664475
Petrolatum, Petroleum Jelly, White	Spectrum	P1037
Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.	Sutter Instrument	B120-90-10
Needle puller P-87	Sutter Instrument
Stemi 2000 stereo microscope	Zeiss
Axiozoom V16, stereo zoom microscope	Zeiss