Summary
Гигантские инфузории, пятно Stentor, система для изучения регенерации и заживление ран. Мы представляем процедуры для установления Stentor клеточных культур от единичных клеток или фрагменты клеток, вызывая регенерации клеток резки, химически стимулирования регенерации membranellar группы и устные аппарата, обработки изображений и анализа клеток Регенерация.
Abstract
Клетки нуждаются в том иметь возможность восстановить их частей, чтобы оправиться от внешних возмущений. Одноклеточные ресничастая Stentor пятно это отличная модель организма учиться заживление и регенерацию клеток последующих. Геном Stentor стали доступны недавно, наряду с современной молекулярной биологии методы, такие как RNAi. Эти инструменты позволяют изучить сингл клеточной регенерации на молекулярном уровне. В первом разделе протокола охватывает создание Stentor клеточных культур от единичных клеток или фрагменты клеток, а также общие руководящие принципы для поддержания Stentor культур. Культивирование Stentor в больших количествах позволяет использовать ценные инструменты, как биохимия, последовательности и масс-спектрометрии. В последующих разделах протокола охватывают различные подходы для стимулирования регенерации в "Стентор". Вручную резки клетки с иглой стекла позволяет изучать регенерации клеток больших частей, в то время как лечение клетки с мочевина или сахароза позволяет изучать регенерации конкретных структур, расположенных в передней конце ячейки. Предоставляется метод для визуализации отдельных регенерации клеток, а также Рубрика для постановки и анализа динамики регенерации. Весь процесс восстановления разделен на три этапа. Посредством визуализации динамики популяции клеток через этапы прогрессирования, свидетельствует неоднородность времени регенерации.
Introduction
Клетки не являются простые сумки ферментов, но довольно сложных машин, чьи компоненты тщательно масштабируется до нужного размера и расположены в четко определенных позициях. Морфогенез отдельных клеток представляет собой ключевой процесс в клетке и биологии развития, но ее молекулярный механизм неизвестных1,2. В то время как некоторые клетки культивировали напоминают капли, одноклеточные организмы может иметь чрезвычайно сложную архитектуры, подтверждается комплекс корковых структур, видели в инфузории3,4.
Наиболее extreme пример высокоструктурированных ячейки пожалуй Stentor пятно, гигантских heterotrichous ресничастая отдаленно связанные с Tetrahymena и Парамеции. Стентор является длиной 1 мм и покрыт с более чем 100 продольными полосами синего пигмента, чередующихся с рядами ресничек, организованный Параллельные стеки микротрубочек лент, которые работают длина всей ячейки. Ячейка является воронкообразные (рис. 1), с membranellar полосами и устные аппарат (OA) на передний конец и holdfast, которое придает ячейки подложки на своем заднем конце. В дополнение к ясно передней задней полярности клетки также показывает отличительные хиральная патронирования, таким образом, что расстояние между рядами цилиарной постепенно увеличивается в направлении по часовой стрелке. Это приводит к сплошности, где узкие строка отвечает максимально строку и этот регион клеточной поверхности, известный как Локус полосой контраст, может вызывать образование второго набора структур переднего конца когда привитым другой ячейки5, делая это формально эквивалентно Шпеман Организатор. Таким образом, все основные процессы развития биологии у их аналогов в Stentor: axiation, модель формирования и индукции. В эмбрион эти процессы управляются судьба различия между различными ячейками, но в Stentor, они должны определяться судьбой различия между различными регионами в одной ячейке. Что определяет различия между регионами в рамках Stentor является тайной.
Если отрезать любой частью Stentor , Пропавшая часть клетки могут регенерировать приносить нормальной клетки в течение нескольких часов. Если ячейка разрезать пополам, или даже на гораздо меньшие куски, каждый кусок реорганизуются в ячейку нормальный перспективных, но меньше и восстанавливает надлежащей пропорциональности между клеток частей6,7. Даже мелкие фрагменты, 1/64й размер оригинального ячейки, способны восстанавливаться в небольшой, но обычно пропорции ячейку, а затем растут в полный размер6. Стентор таким образом представляет уникальную возможность для изучения механизмов органеллы размер масштабирование и клеток роста регулирования с использованием хирургические методы, которые обычно применяются на уровне тканей или всей организмов.
Одним из свойств Stentor , что позволяет ей восстанавливаться от широкий спектр хирургических операций является, что он содержит один nodulated одной (рис. 1) с около 50 000 копий всего генома8. До тех пор, как клетки фрагмент содержит по крайней мере один macronuclear узел, он имеет возможность полностью восстановить. Другое свойство лежащие в основе способности регенерации Stentorявляется ее удивительные способности заживления раны. Хотя многие типы клеток способны исцеление их раны9, Stentor возможность оправиться от чрезвычайной спектр физического возмущения. Пример восстановления Stentor от резкого возмущений, вместе с методами для визуализации цитоплазматических потока в Stentor10 ранее сообщалось. Эти методы позволяют исследования как ранение и последующей регенерации влияют на физическое состояние цитоплазме.
Огромный размер stentor, способность Чрезвычайный регенерации и тот факт, что она проявляется многие из развития явлений, видели в многоклеточные зародыши (например, организаторы, axiation и кучность) привлекла многие биологи развития во время к концу прошлого века, в том числе Томас Хант Морган7. В течение 50 и 60 подходы в микрохирургии продемонстрировали поразительное спектр восстановительных и морфогенетических процессов в этом одиночный celled организм11. Однако как система модель молекулярной биологии лишь недавно был разработан Stentor . В течение последних нескольких лет геном Stentor был секвенирован и собрал8, и способ возмущают экспрессии генов с помощью РНК-интерференции, кормления был развитых12.
Одна из причин, что Stentor был разработан модельный организм для современной молекулярной биологии только недавно был сложности выращивания больших культур из-за его длительного клеточного цикла (от 3 до 5 дней). Однако современные геномных и proteomic методы требуют меньше материала, чем они привыкли, и объем одной ячейки Stentor достаточна для этих методов, даже не прибегая к сверхчувствительная методы, которые были разработаны для анализа сингл клетки, которые намного меньше, чем "Стентор". Статья 1 протокола подробно процедура создания большой культуры из одной клетки "Стентор" . Такой же подход может использоваться для создания большой культуры из фрагмента клеток, полученные путем разрезания ячейки. Раздел 1 также обеспечивает руководящие принципы для поддержания здорового Stentor культур более длительных периодов времени. Статья 2 протокола предоставляет методологию для стимулирования регенерации клеток путем разрезания клетки вручную с помощью иглы, стекла. Статья 3 протокола посвящена двух методов стимулирования регенерации конкретных клеточных структур (membranellar группы и устных аппарат): лечение клетки с мочевина или сахароза приводит к пролить эти структуры, следуют их Регенерация. Статья 4 протокола подробно метод для визуализации отдельных регенерации клеток более длительных периодов времени. Раздел 4 заканчивается с описанием на этапах регенерации и советы на анализ динамики регенерации.
Protocol
1. культивирование "Стентор" и создание Stentor культур от единичных клеток или фрагменты клеток
- Подготовьте Хламидомонада показало культуры для использования в качестве пищи для Stentor.
- Получите Хламидомонада показало клетки от коммерческого поставщика (Таблица материалов).
- Создать 500 мл жидкого культуры Хламидомонада показало в коммерчески доступных СМИ крана с помощью стерильных13.
- Держите культуры Хламидомонада под лампой в концентрации около насыщения (при O.D. около 1) путем разбавления его с TAP СМИ дважды в неделю.
Примечание: Хламидомонада культуры можно выращивать в шейкере. - Регулярно проверяйте ли Хламидомонада культура здорового, поместив падение культуры на слайде, покрывая его с coverslip, а также проверки его под микроскопом на 40 кратном.
Примечание: Не используйте культуру для Stentor кормления, если она загрязнена с бактериями или Хламидомонада клетки, объединяются в кластеры. Если происходит одно из этих проблем, начните новую культуру Хламидомонада .
- Получите "Стентор" пятно клетки от коммерческого поставщика (Таблица материалов).
- Если клетки Stentor требуются от их естественной среде обитания, собирают их из пруда, озера или реки11.
- Для сбора Stentor от пруда, озера или реки, найти область с некоторыми растительности, где вода является относительно спокойной, тенистые и ясно.
Примечание: Существует более высокую вероятность нахождения Stentor в тех местах, где растет ряски. - Соберите по крайней мере в 2 Л воды в контейнере, который легко сливать.
- После того, как детрита и частиц поселились в нижней части контейнера, аккуратно заполните несколько меньшие контейнеры для изучения для Stentor, ждет несколько секунд после каждой коллекции для детрит поселиться в большой контейнер.
- После завершения сбора образцов на месте переместить в новое место, по крайней мере в 10 метров и повторить коллекции образцов там.
Примечание: Не каждый пруд имеет население Stentor , поэтому несколько прудов должны отбираться. - Возвращение с образцов в лабораторию и передавать воду из контейнеров в отдельных Петри.
- В каждой чашке Петри Поиск для Stentor под стереомикроскопом с косой свет в 5 крат. Передача отдельных клеток Stentor , с помощью пипетки 1 мл раствора в скважину стекла пятна пластины, содержащие по крайней мере 100 мкл коммерчески доступных пастеризованное родниковой воды (PSW).
Примечание: Stentor клетки имеют труба как форма, когда они подключены к подложке (рис. 1). Плавательный Stentor клетки менее расширенная, чем клеток подложкой (1 видео). - Вымойте Stentor в PSW по крайней мере 3 x. Выполните стирок, удалив около 90% из воды из колодца, сохраняя Stentor клетки в колодец, затем, добавляя 500 мкл PSW в колодец.
Примечание: Перед началом работы Stentor с помощью пипетки с пипеткой советы 10 мкл или меньше, сократить около 0,5 мм от конца кончика пипетки с ножницами, чтобы избежать, ранив клетки из-за сдвига, которые создаются как крупноклеточный протекает через слишком маленький совет ОП сударственных.
- Для сбора Stentor от пруда, озера или реки, найти область с некоторыми растительности, где вода является относительно спокойной, тенистые и ясно.
- Подготовьте Хламидомонада перед каждым кормлением "Стентор".
- Передача 1 мл Хламидомонада культуры, подготовленных как шаг 1.1 в пробки microcentrifuge 1,5 мл. Центрифуга в 2095 x g на 3 мин.
- Удалить супернатант и высокомобильна гранулы в 1 мл PSW. Центрифуга в 2095 x g на 3 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 500 мкл PSW.
Примечание: Таким образом, промывают и концентрированные Хламидомонада будет именоваться «подготовленные Хламидомонада» в следующих шагах. TAP СМИ вредно для Stentor, таким образом мытья Хламидомонада до кормления Stentor имеет важное значение.
- Если требуются клоновых Stentor культуры, запустите культуры из отдельных Stentor ячейку или ячейки фрагмент.
- Так как отдельные клетки Stentor не хорошо растут в PSW, подготовьте кондиционером СМИ фильтром стерилизации 500 мкл СМИ из существующих, здоровые Stentor культуры.
- Перевести 500 мкл кондиционером СМИ в один из скважин место стеклянной пластины.
- Передача одного Stentor в колодец пластину пятно стекла, содержащие кондиционером СМИ. Использовать как мало среды как можно сделать перевод.
- Накормить каждого Stentor 5 мкл подготовленных Хламидомонада каждые 48 ч. Когда Stentor разделить, подсчитать количество ячеек в колодец и 5 мкл подготовленных Хламидомонада в клетку.
- Держите Stentor в затененном месте, так как клетки чувствительны к свету (например, в прозрачные пластиковые коробки, покрытые бумажные полотенца).
- Обмен Stentor среднего в колодец с свежими кондиционером среднего каждые 96 ч.
- Подготовьте свежие кондиционером СМИ как шаг 1.5.1.
- Сделайте все клетки Stentor отсоединить от нижней части скважины, мягко вверх и вниз дозирование жидкости в скважине.
- Тщательно удалить жидкость из хорошо с помощью пипетки 1 мл, убедившись, что все клетки остаются в колодец. Добавьте 500 мкл свежие кондиционером СМИ в колодец.
- Когда количество клеток в колодце превышает 20, переместите ячейки больших контейнера, например, широкий рот стеклянную банку.
- Добавьте 20 мл PSW в газобетона широкий рот стеклянную банку.
Примечание: Автоклавирование посуды для Stentor могут быть заменены тщательной стирки и полоскания. - Тщательно Пипетка СМИ вверх и вниз в хорошо чтобы отсоединить все клетки в нижней части скважины. Собрать все клетки Stentor , с помощью кончика пипетки 1 мл и аккуратно перенести их в стеклянную банку.
- Добавьте 20 мл PSW в газобетона широкий рот стеклянную банку.
- Не затягивайте крышки на баночки с Stentor культур, чтобы обеспечить достаточный доступ воздуха.
- Добавьте PSW банку каждые 48 ч чтобы Stentor плотность около 20 клеток/мл. Оцените плотность клеток, глаз.
Примечание: в качестве альтернативы, используйте 1 мл пипетки пузырь воздуха в банку, чтобы клетки отсоединить от стен, пипетку до 1 мл культуры и подсчитать количество ячеек в наконечник пипетки. - Каждые 48 ч, канал подготовил Хламидомонада Stentor культур в банки (см. шаг 1.4). Начните с кормления культуры с 200 мкл подготовленных Хламидомонада. Как увеличивается объем культуры, постепенно увеличивайте количество подготовленных Хламидомонада используется для кормления до 1 мл.
- Когда культура объем достигает около 90% вместимости банку, передачи культуры в большой контейнер.
- Пипетка культуры внутри сосуда, вверх и вниз, с 1 мл пипетки для отсоединения Stentor из стекла.
- Все содержимое банку налейте 2-Кубок стеклянной посуде.
- Ополосните кувшин с около 25 мл PSW в 2-cup стекла контейнер для сбора оставшиеся Stentor.
- Поддерживать здоровый культур в 2-Кубок стеклотары.
- Кормите Stentor культур 2 мл подготовленных Хламидомонада на 100 мл культуры каждые 4-5 дней. Добавьте PSW стеклотары каждые 4-5 дней держать Stentor плотность на около 20 клеток/мл.
Примечание: 450 мл является максимальный объем средств, которые проводит 2-Кубок контейнер. - Раз в неделю, осмотрите культур под 5 X рассекает микроскопом для коловраток, грибков и других роста. Чтобы продлить здоровье культуры, удалите загрязняющие микроорганизмы вместе с аномально формы и бесцветные клетки Stentor , с помощью пипетки 1 мл.
- Когда контейнер стекла составляет около 90% полный, Сплит культуры.
- Добавьте 25 мл PSW в стеклянной таре. Чтобы отключить Stentor из стекла вверх и вниз используйте 25 мл пипетку для пипетки. Перемещение около 50% культуры в новый контейнер 2-cup стекла.
- Добавить 25 мл PSW обеих культур и продолжения двух культур, как описано в этом разделе протокола.
Примечание: Поскольку Stentor клетки чувствительны к высокой температуре, поддерживать температуру при 25 ° C или ниже в комнате, где хранятся культур. Кроме того культур может храниться в инкубаторе. Обратитесь к таблице 1 для устранения неполадок Stentor культивирования.
- Кормите Stentor культур 2 мл подготовленных Хламидомонада на 100 мл культуры каждые 4-5 дней. Добавьте PSW стеклотары каждые 4-5 дней держать Stentor плотность на около 20 клеток/мл.
2. стимулирования регенерации клеток Stentor резки
- Использовать съемник иглы сделать несколько иглы из капиллярных трубок с помощью программы следующим образом: тепло - 735, тянуть - 100, скорость - 110, время - 150, давление - 400.
- Приготовляют раствор 4% метилцеллюлоза в 50 мл PSW.
- Добавить 1 g метилцеллюлоза (вязкость: 1500 cP) до 50 мл PSW.
- Инкубируйте на 4 ° C для по крайней мере 8 h для упрощения расторжении метилцеллюлоза.
- Метилцеллюлоза 4% раствор храните при комнатной температуре.
- Подготовьте место стеклянной пластины для хранения фрагменты клеток после выполнения сокращений.
- Фильтр стерилизовать СМИ от здоровой культуры, 500 мл на месте пластины стекла также необходимо.
- Передачи 500 мл стерилизованных средств массовой информации в каждом из скважин необходимо.
- Собирать один здоровый Stentor (имеющие форму определенного труба, яркие сине зеленый цвет и не большие вакуоли) в 2 мкл капли и разместить его на coverslip или слайд. 2 мкл метилцеллюлоза 4% (рис. 2). Пусть Stentor замедлить до резки (2 видео).
- Держите стеклянных иглу как параллельно поверхности резки как можно предотвратить, поломке иглы.
- С помощью стерео, рассекает микроскопом, найдите кончик иглы стекла и переместить его ближе к ячейке (рис. 3A). Наблюдать за Stentor контракт после контакта с иглой (рис. 3B и C).
Примечание: Если ячейка находится в ориентации, что делает, отделяя переднего конца от заднего конца трудной, поверните его очень осторожно с на стороне иглы. - Аккуратно нажмите на контрактной основе Stentor с на стороне иглы стекло Вырезать ячейку в двух(рис. 3D и E, 3 видео). Перемещение двух фрагментов, помимо обеспечения того, чтобы не цитоплазматических связь между ними, чтобы избежать фрагмент Фьюжн (Рисунок 3F).
- Проверьте, имеют ли обоих фрагментов по крайней мере один macronuclear узел путем изучения фрагменты под микроскопом рассечения с косой освещения.
Примечание: Наличие по крайней мере один macronuclear узел имеет важное значение для выживания клетки. Ячейка может пролить его пленкой (прозрачной оболочки) наряду с сине зеленый пигмент, во время или после разреза. В большинстве случаев это не повлияет на долгосрочную жизнеспособность клеток. - Переместите фрагменты в скважинах стеклянной пластины пятно, подготовленный в шаге 2.3.
- Вырежьте несколько ячеек, потому что часть разреза клетки не будет восстанавливаться.
- Если выполняет несколько сокращений в одной сессии, замените стеклянных иглу, когда он становится тяжело с покрытием Stentor остатков или когда нарушается его кончика. Кроме того чистые иглы, протрите его осторожно на куске кремния прокладки.
Примечание: Иглы стекло может использоваться для нескольких сеансов резки клеток. - Держите пластину пятно стекла с фрагменты клеток в камере влажности.
- Перейти к разделу 4 протокола для сведения о визуализации и интерпретации результатов Стентор регенерации.
3. заставить регенерации Membranellar группы и устные аппарата сахарозы или мочевины лечения
- Membranellar группы и устных аппарат удаление с помощью сахарозы
- Подготовка 25% раствор сахарозы в PSW.
- Добавьте 500 мкл 25% сахарозы в PSW пробки microcentrifuge с крышкой оснастку.
- Подготовка 3 microcentrifuge труб колпачками оснастки с 1 мл PSW в каждой тюбике для мытья клетки после лечения сахарозы.
- Сбор 30-60 Stentor клеток в 1 мл их культуры средств массовой информации в отдельном microcentrifuge трубку с помощью пипетки 1 мл (рис. 4, стрелка A).
- Соберите все клетки от трубки в 125 мкл заключительного тома с помощью 200 мкл пипетки в одном тираже. Перевести их на трубе с 500 мкл 25%-ая сахароза (подготовленных на шаге 3.1.2) для получения 625 мкл раствора сахарозы 20% (Рисунок 4, стрелка B). Запустите секундомер.
- Инкубируйте Stentor 20% раствора сахарозы и Флик спин пробки microcentrifuge в стойке за 1 мин.
- Собрать все ячейки в одном тираже (отрегулировать пипетку для 200 мкл максимум возможностей для легче коллекции).
- Держите клетки в наконечник пипетки, пока Секундомер показывает 2 мин сахарозы лечения.
- Извлечь Stentor в одной из труб microcentrifuge подготовлен на шаге 3.1.3 (рис. 4, стрелка C). Флик спин трубы в стойке.
- Вымойте клетки, два раза, один раз в каждом из двух оставшихся microcentrifuge пробирки, содержащие PSW подготовленную на этапе 3.1.3 (рис. 4, стрелки, D и E).
Примечание: Метод сбора клеток сингл дро не важно между стирок. - Перейдите к раздел 4 протокола для сведения о визуализации и интерпретации динамики Stentor регенерации (рис. 4, стрелки, F и G).
- Membranellar группы и устных аппарат удаления с помощью мочевины
- Приготовляют раствор 4% мочевины в PSW.
- Добавьте 300 мкл 4% мочевины в PSW пробки microcentrifuge с крышкой оснастку.
- Подготовка 3 microcentrifuge труб колпачками оснастки, содержащие 1 мл PSW в каждой тюбике для мытья клетки после лечения мочевины.
- Сбор 30-60 Stentor клеток в 1 мл их культуры средств массовой информации в отдельном microcentrifuge трубку с помощью пипетки 1 мл (рис. 4, стрелка A).
- Соберите все клетки от трубки в 300 мкл заключительного тома с помощью пипетки 1 мл в одном тираже. Перевести их на трубе с 300 мкл 4% мочевины (подготовленных на шаге 3.2.2) для получения 600 мкл 2% раствор мочевины (рис. 4, стрелка B). Запустите секундомер.
- Инкубируйте Stentor в 2% раствор мочевины и Флик спин пробки microcentrifuge в стойке за 1 мин.
- Соберите все ячейки в одном тираже.
- Держите клетки в наконечник пипетки, пока Секундомер показывает 2 мин мочевины лечения.
- Извлечь Stentor в одной из труб microcentrifuge подготовлен на шаге 3.2.3 (рис. 4, стрелка C). Флик спин трубы в стойке.
- Вымойте клетки, два раза, один раз в каждом из двух оставшихся microcentrifuge пробирки, содержащие PSW подготовленную на этапе 3.2.3 (рис. 4, стрелки, D и E).
Примечание: Метод сбора клеток сингл дро не важно между стирок. - Перейдите к раздел 4 протокола для сведения о визуализации и интерпретации динамики Stentor регенерации (рис. 4, стрелки, F и G).
4. обработки изображений и анализа регенерации клеток
- Если с помощью микроскопа вертикально, используйте висит метод капли для регенерации изображения отдельных клеток.
- Положите 100 мкл PSW в хорошем месте стеклянной пластины.
- Изолировать 1 Stentor ячейки в 4 мкл культуры средств массовой информации (СМИ, что они находятся в), с помощью 10 или 20 мкл Пипетка. Депозит капелька в середине2 coverslip 22 x 22 мм (рис. 5).
Примечание: Если клетки которые вредны 1) (аномально формы или сильно vacuolated) или 2) по-прежнему имеют membranellar полосы или устные аппараты (для химической обработки экспериментов), не следует использовать для визуализации. - Организовать 4 больше капель Stentor в культуре СМИ вокруг предыдущих капелька, оставляя достаточно места между каплями.
- Инвертировать coverslip с каплями и осторожно поместите его над колодцем пластину пятно стекла, к которому PSW была добавлена в шаге 4.1.
- Примечание: PSW в скважине сведет к минимуму испарения капель (рис. 5).
- Подготовьте остальные ячейки для воображения, следуя шаги 4.1.1 - 4.1.4.
- Изображения регенерации клетки под микроскопом с резолюцией желаемое время. Кроме того соблюдайте регенерации, с использованием рассечения стерео Микроскоп.
Примечание: Восстановление начнется сразу же после резки ячейки или обращения с мочевина или сахароза. Однако видны новые устные структур составят около 3 ч после начала регенерации.
- Для каждой точки времени назначьте одного из трех этапов регенерации каждую из ячеек. Для этого сравнения каждой ячейки на представителя изображения, иллюстрирующие стадии (рис. 4 и рис. 6).
- Назначьте Stage 1 клетки, которые не имеют membranellar группа еще (рис. 6A).
- Назначьте этап 2 клетки с membranellar полосами.
Примечание: Membranellar группа появляется 3-6 ч после лечения (рис. 4, рис. 6B). В самом конце этого этапа дополнительные кривизны заднего конца membranellar группы будет отображаться непосредственно перед устные зачаток появляется. - Назначьте ячейки с устной зачаток стадии 3.
Примечание: Устные зачаток является invagination, появляясь 6-8 ч после лечения в конце заднего membranellar группы (рис. 4, рис. 6 c и 6 D). Регенерация завершается, когда клетки имеют membranellar band в их передней конец и характерным труба форма клеток (рис. 4, рис 6E). Большинство клеток Stentor полностью восстанавливаются в течение 8-9 ч с момента начала регенерации.
- Участок процент клеток в каждом из этапов регенерации для каждой точки времени в виде участка штабелироваться поле (рис. 7).
Примечание: Этот тип участка позволяет визуализации динамики регенерации в популяции клеток.
Representative Results
Стентор культур были надежно установлены и поддерживаются с отдельными ячейками или фрагменты клеток, используя раздел 1 протокола. Представитель пример большой здоровой культуры показан на видео 1.
Ход времени регенерации была измерена в Stentor , с помощью метода лечения сахарозы для инициирования регенерации, описанные в шаг 3.1, в сочетании с изображений и метода анализа, обсуждаются в разделе 4 (рис. 7). Этот участок указывает, что существует один час долго распространение в времени, занятого населения клеток для достижения любой конкретной стадии. Этот тип анализа позволяет исследование временной гетерогенности в процессе регенерации в популяции регенерации клеток.
Ниже приводится краткая информация о времени регенерации, что до настоящего времени наблюдается после десятки сахарозы лечения (рис. 4 и рис. 6). Этап 1 — когда Stentor клетки выглядят как слезы без каких-либо membranellar группы (этот этап начинается сразу же после вымывания сахарозы). Этот этап длится 3-6 ч. 2 этап, когда группа membranellar появляется и растет (3-6 ч после лечения сахарозы). Этот этап длится 3-4 ч. 3 стадии, когда устные зачаток появляется в конце заднего membranellar группы (6-8 ч после лечения сахарозы), и обе структуры двинулась к переднего конца ячейки. Этот этап длится 1-2 ч. Когда группа membranellar и устные аппарат достиг переднего конца ячейки, это указано завершение регенерации. Ячейка принял характерная Stentor труба как форма. Клетки были полностью восстановленный 8-9 ч после лечения сахарозы.
Рисунок 1. Снимок Stentor. Группа membranellar и устные аппарата указаны на передней конца ячейки. Holdfast находится в заднем конце ячейки. Стентор одной — nodulated. Сытый Stentor имеет зеленый пищи вакуолей, содержащие главным образом Хламидомонада. Линейки-0.5 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Установка резки Stentor . Клетки резка выполняется вручную манипулируя Стеклянный иглу глядя на ячейку с помощью коммерчески доступных рассечения стерео Микроскоп. Папиросной бумаги призван обеспечить на белом фоне, чтобы увидеть клетки лучше. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
На рисунке 3. Снимки 3 Видео иллюстрирующие как сократить Stentor с стеклянной иглой. (A) A Stentor непосредственно перед игла коснется его. (B) A Stentor нежно сжал между иглой и стекла слайд. (C) A контракт Stentor реагировать силой иглы. (D) A Stentor сокращаются, осторожно нажав на ячейку с на стороне иглы. (E) A Stentor теперь пополам, но не разделены. (F) два Stentor фрагменты. Шкалы бар-0,25 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Схематическая визуализация раздела 3 и статьи 4 протокола. Это иллюстрированное протокол для выполнения сахарозы или мочевины лечение и наблюдение регенерации клеток. Время, указанное на нижней панели измеряется от начала мыть 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Установки для обработки изображений и/или прямого наблюдения регенерации с прямо микроскопом. В каждом 4 капли мкл висит от coverslip есть одна ячейка, прохождения регенерации. Воды в скважинах стеклянной пластины пятно ограничивает испарения капель. Эта установка позволяет после регенерации нескольких ячеек одновременно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Снимки Stentor в каждом этапе группы membranellar и устные аппарат регенерации. (A) 1 этап характеризуется фигуру слезинки подобных клеток и отсутствие membranellar группы. (B) этап 2 характеризуется внешний вид группы membranellar, структура, основанная на реснички, которая бьет непрерывно. Membranellar полос, отмеченные белыми пунктирными линиями в панели B - д (C и D) этап 3 характеризуется внешний вид устного зачаток (отмечены стрелкой). Устные зачаток выглядит как invagination в конце заднего membranellar группы. Устные зачаток будет затем двигаться вверх к передней ячейки стать устные аппарат. Регенерации (E) завершена, когда ячейка принял характеристику Stentor труба как форма, и устные аппарат (отмечены стрелкой) увеличился на передней конца ячейки. Шкалы бар-0,25 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Штабелироваться поле участка показаны как пропорции клеток во всех этапах регенерации после лечения сахарозы изменяет временем. Диаграмма показывает неоднородность в отношении сроков регенерации этапов в рамках населения регенерации клеток. «Обл. конец» указывает на завершение регенерации. Количество клеток: 28. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1. Пример здоровой культуры Stentor . Как правило если культура – это концентрированный, рекомендуется разделять культуру. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 2. Замедление Stentor с метилцеллюлоза. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Видео 3. Резка Stentor. Отдельные клетки могут быть вручную нарезать несколько под стерео, рассекает микроскопом, нажав Стеклянный иглу через ячейку. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| Проблема с культурой | Возможные средства правовой защиты | Возможные предупреждения |
| Культура является перегружены коловраток или других больших организмов. | Удалите столько Stentor максимально в новой культуры блюдо. Затем промойте клетки три раза. | Тщательно вымойте Stentor , получив их, даже при покупке их от коммерческого поставщика. |
| Культура поражены грибком или других мелких организмов. | Определить угол где есть наименее Stentor. В этой области удалить столько средств массовой информации как можно скорее без удаления многих "Стентор" и добавить в новой PSW. Смесь осторожно, но тщательно distrubute вторжение организмы. Пропустить следующего кормления и Stentor будет есть их. | Понаблюдать за культурой регулярно и удалить небольшие загрязнения путем обмена СМИ для свежих PSW. |
| Стентор возлагают друг на друга. | Разбить культуры, что концентрация составляет менее 20 клеток/мл. | Сплит культур чаще. |
| Стентор клетки спаривания. | Кормите каждые 4 дня вместо каждые 5 дней. | |
| Культура имеет много темных отходов материала. | Удалите как можно больше темного материала, отходы Stentor , как можно не снимая клетки. Если Stentor привязаны к темный материал, Пипетка вверх и вниз, освободить Stentor клетки от их отходов и затем удалить СМИ с отходами без удаления клеток. Или удалить эти "Стентор" и кормить соответственно меньше. | Корма Stentor 1 мл меньше пищи на 100 мл культуры. |
| Нездоровый вид (vacuolated/раздутые или округлые) Stentor. | Удалить столько средств массовой информации как можно скорее без удаления многих Stentor клетки и добавить новые PSW. | Регулярно обмениваться средствами массовой информации. |
Таблица 1. Руководство по устранению неполадок для культивирования "Стентор".
Discussion
Культивирование Stentor представляет ряд проблем. Во-первых выполнять эксперименты, которые требуют большое количество клеток, необходимо поддерживать большое количество Stentor культур, как культуры, стать нездоровым, когда Stentor концентрация превышает 20 клеток/мл. Во-вторых организмов, которые могут загрязнять Stentor культур часто делят быстрее, чем "Стентор" и подавить культуры (общие загрязнителем является коловраток). Таким образом необходимо периодически проверяйте культуры под микроскопом и удаления загрязнений. Иногда новой культуры необходимо начинать с небольшого числа вручную спасены от загрязненных культуры клеток. Это увеличивает время, необходимое для поддержания здорового Stentor культур. В-третьих расширение одну ячейку в 400 мл культуры требует по крайней мере один месяц, поскольку Stentor клеточный цикл составляет 3-5 дней. В-четвертых в отличие от других моделей инфузории, Stentor редко идут в форму кисты, и они не могут быть заморожены.
Важным аспектом культивирования Stentor является выбор соответствующего питания организма. Ранее были описаны различные методы для культивирования "Стентор" . Один из них предлагает использовать обезжиренного молока культуры бактерий, которые затем кормить "Стентор". Такой метод эффективен при культивировании Stentor; Однако применение геномных технологий требует чистой образцов, чтобы избежать путаницы в результате геномной считывает из неопределенного пищи организмов. С помощью текущего протокола, Stentor может быть выращен в массы и, потому что последовательными их питание, Хламидомонада, присутствие геномной загрязнения из организма пищи можно обнаружить и контролируемых для. По неизвестным причинам татарским пришлось пополнить его запасы, вернувшись к где он нашел Stentor раньше. С нынешним протоколом мы были в состоянии держать Stentor лет.
Регенерация эксперименты с Stentor как правило просты, но есть несколько критических деталей, чтобы иметь в виду. Что касается раздела 2, резка Stentor клетки в половине может быть освоен в минутах. Мастеринг расширенные процедуры микрохирургии Stentor может потребоваться неделя практики. Во время выполнения мочевина или сахароза лечения (раздел 3), если в начале изображения Большинство клеток до сих пор их membranellar полос, увеличить время инкубации на 10-30 s для когда сахарозы лечение проводится следующая. Не увеличивают время лечения сахарозы за 3 мин инкубации, потому что это приведет к гибели клеток.
Визуализационная диагностика Stentor регенерации требует методов изображения большие клетки более длительных периодов времени. Метод обработки изображений, подробно изложены в разделе 4 может использоваться только с вертикально микроскопа. Если вместо этого доступен инвертированным микроскопом, клетки размещаются на слайд или coverslip в небольших камерах. Одним из способов является создание камеры из вазелина и крышка с другой coverslip для предотвращения испарения. Кроме того, можно сделать камеру для отдельной ячейки, сделав отверстие с Дырокол желаемого размера 1 x 1 см2 площади крепежного элемента кремния (таблица материалов), размещение прокладку на coverslip, положив клетки в камере и охватывающих в палату с другой coverslip. При визуализации, если не в правильной ориентации наблюдать характерные особенности каждого этапа регенерации Stentor , коснитесь плиты прочно для того, чтобы сделать ячейку контракта. Смотреть продлить для идентификации этапа регенерации клеток (полное расширение занимает около 45 s). Если ячейка находится все еще в неправильно ориентации, повторите нажатие. Изображения, показано на рисунке 1 и на рисунке 6 были приняты микроскопом стерео зум; Однако все подробно может быть эксперименты с использованием 5 X рассекает стерео Микроскоп.
Еще одна проблема, помимо культивирования и визуализации Stentor является отслеживание регенерации, в частности количество времени, необходимого для определения этапов. Если регенерации клеток прекрасно ориентируется с регионом устные зачаток ясно видны, идентификации этапа занимает несколько секунд. Иногда однако, Stentor ячейка находится в предотвращение четкое назначение этапа регенерации, таким образом принимая больше времени для определения ориентации. Значительное количество времени, необходимого для стадии отдельных регенерации клеток может задержать количественной оценки всех регенерации клеток, тем самым уменьшая временной точность постановки и требующих наблюдателя ждать и повторно изображения клетки после этого переехал Новая ориентация. Следовательно этот эксперимент является трудоемким и время. По этим причинам было бы весьма желательно разработать автоматизированные методы для обнаружения Stentor клетки и назначение этапы регенерации в данных видео микроскопии. Это также позволит более воспроизводимость экспериментов, увеличивается размер выборки и удаления человека предвзятости.
Появление высокочувствительный геномных и протеомических методами начал положить исследований единичных клеток в досягаемости. Для такого анализа одноклеточных гигантский размер ячейки Stentor делает желательным испытуемого для доказательства в концепция экспериментов. Для таких экспериментов можно культивирование Stentor является основополагающим, и так описанные здесь методы должны играть роль в дальнейшем развитии более передовых методов одной ячейки.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана гранта NIH R01 GM113602 (WFM) и NSF 1144247 (AL). Мы признаем, Марк Slabodnick и Натали Киркленд для разработки первоначальных версий некоторых из этих протоколов и информативные дискуссии. Мы благодарим Карина Perlaza и Грейсон Льюис для критических чтении рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stentor coeruleus live culture | Carolina Biological Supply | 131598 | |
| Chlamydomonas reinhardtii on agar | Carolina Biological Supply | 152040 | |
| Pasteurized springwater, 1-quart bottle | Carolina Biological Supply | 132458 | |
| Methyl cellulose, 1500 cP | Millipore Sigma | M0387 | |
| Pyrex glass spot plate | Fisher Scientific | 13748B | |
| Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL | Carolina Biological Supply | 715740 | |
| 2-cup glass container with glass lid | Pyrex | 1095600 | |
| CultureWell silicone sheet material | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Kimwipes | Kimberly Clark | 34155 | |
| Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube | Denville | C2170 | |
| Cover Glass | Fisher finest | 12-548-B | |
| TAP Growth Media, optimized for Chlamydomonas culture | ThermoFisher | A1379801 | |
| Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm | Grace Bio Labs | 664475 | |
| Petrolatum, Petroleum Jelly, White | Spectrum | P1037 | |
| Borosilicate glass capillary tubes. OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm. |
Sutter Instrument | B120-90-10 | |
| Needle puller P-87 | Sutter Instrument | ||
| Stemi 2000 stereo microscope | Zeiss | ||
| Axiozoom V16, stereo zoom microscope | Zeiss |
References
- Kirschner, M., Gerhart, J., Mitchison, T. Molecular "vitalism". Cell. 100 (1), 79-88 (2000).
- Shulman, J. M., St Johnston, D. Pattern formation in single cells. Trends in Cell Biology. 9 (12), M60-M64 (1999).
- Wloga, D., Frankel, J. From molecules to morphology: cellular organization of Tetrahymena thermophila. Methods in Cell Biology. 109, 83-140 (2012).
- Frankel, J. Pattern Formation: Ciliate Studies and Models. , Oxford University Press. Oxford. (1989).
- Tartar, V. Grafting experiments concerning primordium formation in Stentor coeruleus. Journal of Experimental Zoology Part A. 131 (1), 75-121 (1956).
- Lillie, F. R. On the smallest parts of Stentor capable of regeneration; a contribution on the limits of divisibility of living matter. Journal of Morphology. 12 (1), 239-249 (1896).
- Morgan, T. H. Regeneration of proportionate structures in Stentor. The Biological Bulletin. 2 (6), 311-328 (1901).
- Slabodnick, M. M., et al. The macronuclear genome of Stentor coeruleus reveals tiny introns in a giant cell. Current Biology. 27 (4), 569-575 (2017).
- Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells: How single cells heal membrane ruptures and restore lost structures. Science. 356 (6342), 1022-1025 (2017).
- Slabodnick, M., Prevo, B., Gross, P., Sheung, J., Marshall, W. Visualizing cytoplasmic flow during single-cell wound healing in Stentor coeruleus. Journal of Visualized Experiments. 82 (82), 50848 (2013).
- Tartar, V. Biology of Stentor. , Pergammon Press. Oxford. (1961).
- Slabodnick, M. M., et al. The kinase regulator mob1 acts as a patterning protein for stentor morphogenesis. PLOS Biology. 12 (5), e1001861 (2014).
- Harris, E. The Chlamydomonas sourcebook: Introduction to Chlamydomonas and its laboratory use. 1, Academic Press. Cambridge. (2009).
