Summary
我们描述了一种用于映射酶活性的空间分布的协议, 它能直接在组织样品中生成 nicotinatmide 腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NAD (P) h) + h。
Abstract
在空间和时间内绘制酶活性是理解正常组织和疾病细胞行为的分子基础的关键。原位代谢活性测定可以提供有关组织内代谢活动的空间分布的信息。我们提供了一个详细的协议, 以监测乳酸脱氢酶的活性直接在组织样品。乳酸脱氢酶是一种重要的决定因素, 即食用葡萄糖是否会通过有氧或厌氧糖酵解转化为能量。含有乳酸和 NAD 的溶液被提供给冰冻组织切片。乳酸脱氢酶活性高的细胞将提供的乳酸转化为丙酮酸, 同时将所提供的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD) 转化为 NADH 和质子, 可根据还原nitrotetrazolium 蓝色到 formazan, 这是可视化为蓝色沉淀。我们描述了一个详细的协议, 以监测乳酸脱氢酶活性的小鼠皮肤。应用该协议, 我们发现乳酸脱氢酶活性是高的静态毛囊干细胞在皮肤内。将该协议应用于培养的小鼠胚胎干细胞, 发现培养的胚胎干细胞比小鼠胚胎成纤维细胞有更高的染色。对刚分离的小鼠主动脉的分析显示, 垂直于主动脉的平滑肌细胞染色。所提供的方法可用于空间地映射在冷冻或新鲜组织中产生质子的酶活性。
Introduction
了解组织内酶具有高或低活性的部位, 对于理解发育和生理学是必不可少的。转录或蛋白质水平经常被用作酶活性的替代。虽然这类研究可以提供信息, 但它们并不能为确定酶的活性 (如平移后的修饰、蛋白质复合物的存在或酶的亚细胞定位) 的关键。当酶活性被直接测量, 它经常被监测在匀质蛋白裂解物, 不再包含有关单个细胞的信息, 或在组织内的高或低活动细胞的空间分布。
我们提供了一个详细的协议, 用于映射组织样本中酶活性的空间分布。该方法的基础是早期的研究表明, 四氮唑盐可用于本地化的活动, 脱氢酶, 硝酸和氧化酶在冷冻组织1。利用这些方法, 当质子转移到四氮唑盐2、3时, 就形成了水不溶 formazan。Glucose-6-phosphate 脱氢酶产生的四氮唑和质子, 并已检测到的活动。Glucose-6-phosphate 脱氢酶已监测在欧洲比目鱼肝细胞4, 在肺泡型2细胞的肺5和肾单位的肾脏5。四氮唑盐也被用来监测冷冻组织6中的 transketolase 活性。最近还使用类似的方法来监测相邻幻灯片7上同一组织中多个脱氢酶的活动。
这里我们描述了一种使用四氮唑盐监测乳酸脱氢酶活性的空间分布的方法 (图 1)。乳酸脱氢酶可将糖酵解生成的丙酮酸转化为乳酸, 并逆转反应。乳酸脱氢酶活性是丙酮酸盐进入 tricarboxylic 酸循环的重要决定因素, 与乳酸的分泌有关。血液中的乳酸水平经常被用来诊断一系列疾病, 包括癌症8、9、10, 因为它可以表明疾病或伤害已经损坏的细胞和酶已经释放。
乳酸脱氢酶基因有四: LDHA、LDHB、LDHC 和 LDHD11。LDHA 和 LDHB 被认为是来自早期 LDHA 基因12的重复。LDH 是活跃的聚丙烯和 LDHA 和 LDHB 可以形成 homotetramers 和 heterotetramers 彼此。据报道, LDHA 对丙酮酸有较高的亲和力, 而 LDHB 对乳酸有较高的亲和力, 并优先将乳酸转化为丙酮酸13。LDHA 启动子包含 HIF1α、cMYC 和 FOXM1 转录因子11的绑定站点。此外, 像许多其他酵酶14,15, LDH 可以修改后, 翻译修改。成纤维细胞生长因子受体1可以 phosphorylate LDHA 在 Y10, 促进聚丙烯形成, 或 Y83, 促进 NADH 基质结合16。LDHA 也可以乙酰17。由于这些原因, 对 ldh 活性的完全了解不仅需要监测 ldh 蛋白水平, 还要监控酶的活性。
除了我们在这里提出的方法外, 还使用了其他方法来监测乳酸脱氢酶的活性。乳酸脱氢酶活性可以监测 spectrophotometrically 在匀质蛋白裂解。NADH 乳酸转化为丙酮酸的世代可以根据 340 nm 的吸光度来测定, 而 NADH 的消失可以监测, 因为丙酮酸转化为乳酸18。乳酸脱氢酶活性也受到磁共振成像 (MRI) 监测。13丙酮酸盐可以被管理, 丙酮酸转化为乳酸可以被监测为 [1-13c] 乳酸/[1-13c] 丙酮酸的比例。1-13c] 乳酸/[1-13c] 丙酮酸盐的高比在癌症组织19被观察了。虽然 MRI 的方法可以提供关于正常和疾病组织中乳酸脱氢酶活性的信息, 但方法没有确定特定细胞活动水平所需的分辨率。这里提供的方法可以提供关于在组织区域甚至在单个细胞中乳酸脱氢酶活性的信息。
应用原位活性测定法, 发现在小鼠皮肤毛囊干细胞中乳酸脱氢酶活性高20。我们还利用该方法对培养的胚胎干细胞中乳酸脱氢酶的活性进行了监测, 发现干细胞的活性高于饲养层。最后, 对新鲜小鼠主动脉中乳酸脱氢酶的活性进行了监测, 观察了平滑肌细胞的染色。这里我们描述了一个详细的协议, 以监测冷冻小鼠皮肤乳酸脱氢酶活性。
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Protocol
所描述的所有实验都是由洛杉矶加利福尼亚大学动物保育委员会批准的。
1. 生成冷冻鼠标皮肤的幻灯片
- 弄死小鼠按照制度政策。
注意: 遵循保护服装的制度政策。所有涉及动物的议定书都必须得到机构动物保育委员会的批准。 - 用动物发型剪掉老鼠的头发。
- 用剪刀在皮肤上做切口。使用镊子, 把皮肤从老鼠身上抬开。用剪刀剪掉皮肤部分。
- 用冷冻试剂化合物填充 cryomold (见材料表)。
- 使用针鼻钳将皮肤部分放入填充 cryomolds。东方皮肤, 使组织切片将产生一个横断面的皮肤从表皮到真皮, 皮下组织和肌肉 (图 2)。
注意: 如果可能的话, 将实验和控制鼠标放在同一 cryomold 中, 这样它们就可以被切片到同一张幻灯片上并一起处理。注意不要制造气泡。 - 把 cryomold 放在冰桶里一块干冰的平坦表面上, 让它结冰。继续观察皮肤的方向。必要时进行调整。
注: 处理干冰时应佩戴低温手套。 - 将 cryomolds 转移到-80 摄氏度冷藏库中存放。样品可以在冷冻库中保存约3月, 而不会造成大量的酶活性损失。不要让冰冻切片干燥。
- 使用恒温器在-20 °c, 切片组织创建 7-10 µm 厚为最佳皮肤形态学21。
2. 准备用于染色的幻灯片
- 建立要测试的幻灯片集。包括一个控制滑块, 它将被扣留, 另一张控制滑块将被扣留, 乳酸基。包括先前调查过的冰冻组织块中的阳性对照滑动。
- 在幻灯片上, 或者在处理多张幻灯片时, 通过将幻灯片浸入包含4% 福尔马林的容器中, 将包含4% 福尔马林的皮肤部分的幻灯片简单地固定为5分钟. 吹打1毫升4% 福尔马林。
注意: 该固定将确保皮肤不会剥离从幻灯片在下列过程中, 保持皮肤形态学。
注意: 福尔马林是一种致癌物, 具有危险性;戴上手套, 不要让它接触你的皮肤, 并在化学油烟机上执行这一步骤。 - 用至少1毫升磷酸盐缓冲盐水, pH 值为 7.4, 每张幻灯片用吹打或浸洗的幻灯片。
3. 准备染色液
- 漩涡联合试剂的乳酸脱氢酶活性染色 (50 毫米三 pH 值 7.4, 750 µM NADP, 80 µM 吩 methosulfate (PMS), 600 µM nitrotetrazolium 蓝氯, 30 毫米乳酸) 在适当大小的管取决于染色量解决方案要求。
注: 1 毫升足以完全覆盖一张幻灯片。 - 准备第二个解决方案, 其中所有试剂都存在, 除了 NAD。准备第三个溶液, 除乳酸外, 所有试剂都存在。
4. 在染色液中孵化幻灯片
- 将染色液或控制溶液轻轻地吸管覆盖整个切片的准备好的幻灯片上 (1 毫升足以用于一张幻灯片)。如果将多个幻灯片一起处理, 请同时将所有幻灯片浸入染色液中 (确保容器有足够的解决方案来完全覆盖组织部分)。
- 在一个湿润的环境中孵化的幻灯片在37摄氏度在黑暗中。如果染色液位于幻灯片的顶端, 请将幻灯片放在加湿的环境中以防止蒸发。
5. 监控幻灯片
- 通过目视检查, 监测染色液从透明到蓝色的转换。当样品达到所需的蓝色水平时, 通过去除染色溶液来停止反应。
注意: 对于皮肤, 10 分钟是足够的。时间将取决于器官和酶的活动。 - 用磷酸盐缓冲盐水冲洗吹打 (每张幻灯片都足够1毫升) 或浸泡。
注: 任何将被比较的样品必须在染色溶液中保持相同的时间。
6. Counterstain 和芒特
- 当幻灯片达到适当的蓝色水平时, 吸管 counterstain 到幻灯片上。
注: Counterstains, 使核红色或绿色将提供良好的对比, 蓝色创建的 formazan 沉淀。 - 安装有水或非水安装介质22。一个到三滴 (40-50 µL) 的安装介质是足够的, 取决于大小的封面滑动。
7. 图像幻灯片和量化
- 在光显微镜下的图像幻灯片。在10X、20X 和40X 放大倍数上拍摄实验和控制样本以及所有负控制的照片。
- 用图像分析软件确定不同区域的蓝斑强度。
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Representative Results
我们以前报告的结果,在现场活性测定在老鼠皮肤20。如图 3所示, 我们观察到当上述程序被遵循时, 在毛囊底部毛囊干细胞中乳酸脱氢酶活性较高。这些发现通过荧光活化细胞分选皮肤的毛囊干细胞和确认高乳酸脱氢酶活性的干细胞室与活性检测的排序细胞。
根据我们的发现, 毛囊干细胞具有较高的乳酸脱氢酶活性, 我们扩大了对培养胚胎干细胞的研究。单独或在胚胎干细胞存在下, 对小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层进行分析。为分析培养细胞, 对培养基进行了吸气, 并对细胞进行了简单的固定, 并与乳酸脱氢酶染色溶液一起孵化。与小鼠胚胎成纤维细胞相比, 我们观察到胚胎干细胞中乳酸脱氢酶活性较高 (图 4)。
我们还将染色协议应用于新鲜分离的组织。小鼠依次被解剖切开。这些血管被打开和固定, 以便依次的内腔可以进入。样品用汉克的平衡盐溶液孵化, 含0.5% 卫10分钟, 然后用乳酸脱氢酶染色液10分钟乳酸脱氢酶染色液用于新鲜组织。孵化后, 图像收集, 显示在平滑肌细胞染色 (图 5)。
图 1: 乳酸脱氢酶的化学活性及其检测.乳酸脱氢酶转化乳酸 + NAD 为丙酮酸 + NADH + H+。产生的质子将减少硝基四氮唑到 formazan, 这将形成一个蓝色沉淀。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 在 cryomolds 中定位小鼠皮肤的示意图.鼠标皮肤应在 cryomolds 内, 使每个切口部分将包含整个皮肤从表皮, 真皮, 皮下组织和肌肉的横断面。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 小鼠皮肤乳酸脱氢酶染色显示毛囊干细胞活性高.小鼠皮肤被冷冻在 cryomolds 和孵化乳酸脱氢酶染色溶液含有乳酸。乳酸脱氢酶活性在毛囊干细胞中突出。(A、B)两种小鼠皮肤乳酸脱氢酶活性测定的图像。(C、D)两个图像的控制染色与基质乳酸隐瞒。刻度条 = 50 µm.请点击这里查看这个数字的大版本.
图 4: 培养的小鼠胚胎干细胞中乳酸脱氢酶活性高.对经辐照小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养的小鼠胚胎干细胞进行乳酸脱氢酶活性分析。与成纤维细胞相比, 在干细胞中观察到高活性。小鼠胚胎成纤维细胞表现出相似的染色和不照射水平。图像是以20X 的目标拍摄的。鳞片棒 = 50 µm (A、B、D、E) 小鼠胚胎成纤维细胞和干细胞。(C、F)小鼠胚胎成纤维细胞单独。(丙)图像是在7分钟的孵化后采取染色溶液。(D F)图像是在20分钟的孵化后采取染色溶液。请单击此处查看此图的较大版本.
图 5: 小鼠主动脉周围平滑肌细胞高乳酸脱氢酶活性.依次与安乐死小鼠分离。血管在2% 多聚甲醛固定2分钟, 在1x 磷酸盐缓冲盐水中洗涤 3 x 10 分钟。用汉克的平衡盐溶液与0.5% 的海卫 x 和 3 x 5 分钟在磷酸盐缓冲盐水中冲洗了血管。添加乳酸脱氢酶染色液, 在37°c 培养10分钟的样品, 用1x 磷酸盐缓冲盐水冲洗 3 x 5 分钟。样品在2% 多聚甲醛被修理了1小时, 洗涤了 3 x 5 分钟与1x 磷酸盐缓冲盐水和映像。乳酸脱氢酶溶液, 含乳酸。(B) 乳酸脱氢酶溶液, 无乳酸作为阴性对照。对于每一个部分, 在左边有一个较低的放大图像, 并且指定的区域在右边显示更高的放大倍数。(A、B)全乳酸脱氢酶溶液中含有乳酸, 用于染色。B 是图像 a 中指定区域的放大图像 a. (C、D) 乳酸脱氢酶溶液无乳酸用于染色作为阴性对照。D 是 C 中指定区域的放大图像。a 和 C 被采取了以20X 目标 (鳞片酒吧 = 50 µm) 和 B 和 D 被采取了以40X 目标 (标尺 = 20 µm)。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
这里描述的方法可以用来监测乳酸脱氢酶或其他代谢酶的活性, 产生 NADH 或, 在不同的细胞类型组织内或组织内的不同部分, 随着时间的推移。乳酸脱氢酶是了解干细胞和肿瘤生物学的重要酶, 在单个细胞内监测乳酸脱氢酶活性的能力很可能对这种酶的功能有重要的洞察力。
与其他方法相比, 本议定书的一个重要优点是, 监测酶活性的能力, 而不仅仅是蛋白质丰度, 可以导致更确凿的信息, 不只是在哪里乳酸脱氢酶是现在, 但他们实际上功能。此处描述的方法可以与免疫组化相结合, 以使所选蛋白质的水平 (例如, 细胞谱系标记) 与乳酸脱氢酶活性相同的组织样本确定。与基于 MRI 的乳酸脱氢酶活性监测方法相比, 该协议提供了更大的空间分辨率, 有助于确定组织内具有高酶活性的特定细胞。.与基于荧光基片的新陈代谢方法相比, 所描述的协议检测信号不受荧光1的限制。米勒和合著者通过监测转化为 formazan7, 对五种不同酶的时间依赖性和基质依赖性进行了相似的分析。反应被发现遵循化学计量学原理的酶动力学。米勒和合著者通过与线粒体染色7的联合定位, 来分辨非线粒体酶的线粒体酶。他们使用 5-氰基-23-二 (对甲苯基) 四氮唑氯 (CTC) 作为检测试剂, 其次为亚细胞共定位分析7的共焦显微术。
所描述的方法也有缺点。虽然基于 MRI 的方法可用于活体生物, 但所描述的方法需要冷冻或新鲜的组织。冷冻组织仅适用于几个月, 因为酶的活性随着时间的推移而降低, 即使冷冻。此外, 由于基体提供过剩, 该方法提供了有关 "活动潜力" 假设基板存在。如果基底的水平是有限的, 那么观察到的活动分布可能会偏离生理上发生的活动量。此外, 如果有相同酶的不同亚型, 执行相同的酶活性, 这里提出的方法无法区分它们。例如, 所提出的方法不能区分 LDHA 与 LDHB 的活动。解决这个问题的一种方法是使用基因工程小鼠, 其中单一酶异构体是基因灭活。
我们试验了 PMS, 一个光化学法稳定的电子载体, 介导电子在 NADH 和四氮唑染料之间的转移23。虽然一些科学家报告说, pms 抑制葡萄糖 6-磷酸脱氢酶活性, 发现 pms 无益于5, 我们发现 pms 对酶的定位有价值, 并将其纳入我们的协议。还有一些作者报告使用聚乙烯醇来限制葡萄糖 6-磷酸脱氢酶1的扩散。在我们的实验中, 我们没有发现聚乙烯醇是有益的, 并消除它。
几步对染色的成功是至关重要的。一个重要的问题是确保组织样本正确放置在 cyromolds。皮肤切片应平整, 使切片切过皮肤。此外, 如果要准备多个节, 那么理想的情况是, 如果它们嵌入在同一 cryomold 中, 以便在同一张幻灯片上切片。这将有助于消除由于幻灯片的厚度与恒温器削减的变化。同样重要的是要确保组织仍然保留酶活性。
最好的时间来结束的反应应该有经验的确定。有必要在潜伏期密切监测幻灯片, 并确定适当的时间添加 counterstain 和登上幻灯片的基础上的蓝色污点的强度。如果样品的污渍太轻, 就不可能确定活动的位置。如果样品是 overstained 的, formazan 沉淀就会扩散, 使得很难确定最初处于活动高位的特定区域。
我们预计, 这项议定书将是宝贵的科学家有广泛的问题, 关于新陈代谢的作用。应用包括代谢活动和细胞谱系标记或增殖标记的共同染色, 评估不同酶的贡献与遗传模型, 评估酶活性的亚细胞定位, 监测酶活性在患病组织或发展期间。
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Disclosures
作者没有相互竞争的利益来披露。
Acknowledgments
文森特卡塞尔是丽塔. 艾伦基金会 (http://www.ritaallenfoundation.org) 的弥尔顿 e。这项工作由国家普通医学研究所 R01 GM081686、R01 AR070245、国立医学科学院 R01 GM0866465、Eli & 伊蒂丝广泛的再生医学 & 干细胞研究中心的赠款资助 (玫瑰丘陵和哈尔 Gaba 奖), 虹膜康托妇女健康中心/加州大学洛杉矶分校 CTSI NIH 补助金 UL1TR000124, 白血病淋巴瘤协会, 冲击奖从琼森综合癌症中心到和醋酸。在这份出版物中报告的研究得到了国家卫生研究院国家癌症研究所的支持, P50CA092131 奖号。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。醋酸是伊莱 & 伊蒂丝广泛的再生医学 & 干细胞研究中心的成员, 加州大学洛杉矶分校分子生物学研究所, 加州大学洛杉矶分校生物信息学部门计划。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical instruments | For collecting skin from euthanized mice | ||
| Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5 mm | Fisher Scientific | NC9511236 | For freezing mouse skin |
| Tissue-Tek O.C.T. compound | Fisher Scientific | NC9638938 | For mounting cryomolds |
| Ice bucket | Fisher Scientific | 07-210-106 | |
| Dry Ice | |||
| Polysine Adhesion Slide | Fisher Scientific | 12-545-78 | |
| 4% formalin | Fisher Scientific | 23-245-684 | Dilluted in water |
| phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
| vortex | |||
| Tris base | Fisher Scientific | 23-245-684 | |
| NAD | Sigma-Aldrich | N7004 | |
| Phenazine methosulfate | Sigma-Aldrich | P9625 | |
| Nitrotetrazolium blue chloride | Sigma-Aldrich | N6876 | |
| Lithium L-lactate | Sigma-Aldrich | L2250 | Substrate |
| 37°C incubator (or tissue culture incubator) | |||
| Braziliant! Counter stain | Anatech | 861 | Counter stain |
| Mounting medium | Vector Laboratories | H-5000 | |
| Cover slips for slides | Fisher Scientific | 12-544D | |
| Light microscope |
References
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